CN104076142A - 微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途 - Google Patents
微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104076142A CN104076142A CN201410079698.0A CN201410079698A CN104076142A CN 104076142 A CN104076142 A CN 104076142A CN 201410079698 A CN201410079698 A CN 201410079698A CN 104076142 A CN104076142 A CN 104076142A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorescent microsphere
- target substance
- pad
- film
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明公开微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途，其特征在于：包括底板，在底板上方从左端到右端依次设有样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水纸，所述样品吸收垫的右端压贴住结合垫的左端，结合垫的右端压贴住层析膜的左端，所述吸水纸的左端压贴住层析膜的右端，构成侧向层析检测结构；所述层析膜上从左到右制备有检测线和质控线；结合垫由聚酯纤维膜和设置在该聚酯纤维膜上标记了不同配体的多种荧光微球构成，层析膜由硝酸纤维膜及设置在该硝酸纤维膜上包含可特异结合靶标物质的不同配体的多条检测线构成。本发明可以同时对多种微量标靶物质进行多重联检，各显示结果之间无交叉反应，相互独立，显著提高了检测的灵敏度和准确性，操作快速简便，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗有着重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途，适用于微量靶标物质的荧光检测。属于生物检测技术领域。
背景技术
目前在微量靶标物质检测中，常用到高效液相色谱法、化学发光法、酶联免疫分析及侧向和渗滤层析等方法。其中，高效液相色谱法、化学发光法及酶联免疫法技术虽然准确可靠，但是操作过程复杂，耗时长，需特殊设备和专业人员，不易在基层医疗机构和现场普及。而侧向层析法操作简单快速、成本低，只需肉眼检测或简单仪器便可判读结果可作为疾病或违禁添加物检测的初步筛检方法。侧向层析技术常见的标记物有胶体金、胶体硒、乳胶、明胶等，其中运用最普遍且成功的标记物是胶体金，但胶体金免疫层析法灵敏度不高，受背景影响大，尤其是在检测全血或含色素的标本时，胶体金和血液的红色背景相近，容易对结果判读造成干扰。而且，胶体金试纸条市场已经趋向成熟与饱和，国内企业总体产能已经超过全球市场需求，基础科研领域没有获得质上的突破，出现大量的同质化科研课题，多种新技术都未能成功大规模应用。另外，虽然新标记和材料技术已崭露头角，但技术应用还不够成熟，无法大规模应用，有很些技术难题还有待继续研究攻克。
发明内容
本发明的目的之一，是为了提供微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条，它利用层析和荧光检测原理，通过制成条状结构，可随时携带对样品进行检测。
本发明的目的之二，是为了提供微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的制备方法。
本发明的目的之二，是为了提供微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的用途。
本发明的目的之一可以通过以下技术方案达到：
微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条，其结构特点在于：包括底板，在底板上方从左端到右端依次设有样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水纸，所述样品吸收垫的右端压贴住结合垫的左端，结合垫的右端压贴住层析膜的左端，所述吸水纸的左端压贴住层析膜的右端，构成侧向层析检测结构；所述层析膜上从左到右制备有检测线和质控线；结合垫由聚酯纤维膜和设置在该聚酯纤维膜上标记了不同配体的多种荧光微球构成，层析膜由硝酸纤维膜及设置在该硝酸纤维膜上包含可特异结合靶标物质的不同配体的多条检测线构成。
本发明的目的之一还可以通过以下技术方案达到：
进一步地，所述检测线的数量可以大于二条；所述底板可以采用不吸水性的PVC材料制成。
进一步地，所述荧光微球的粒径为20-400nm、激发波长为350-505nm、发射波长为440-515nm。
本发明能经激发光源如便携式验钞笔，紫外灯等激发荧光微球后直接通过肉眼或检测仪器判读定性结果，且各显示结果之间无交叉反应，相互独立。具有结构简单、灵敏度高和使用方便的特点。
本发明的目的之二可以通过以下技术方案达到：
微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备结合垫；将不同微量靶标物质的特异配体通过物理吸附或化学偶联的方式标记在不同荧光微球上，制备标记了不同配体的多种荧光微球，并按比例将其喷涂在聚酯纤维膜上，制得结合垫；
2）制备层析膜，将可特异结合靶标物质的不同配体喷涂到硝酸纤维膜上制成多条检测线，同时，将抗配体的抗体包被成质控线，制成层析膜；
3）按规格准备好底板、样品吸收垫和吸水纸；
4）按规格在底板上依次搭接样品吸收垫、结合垫、层析膜及吸水纸，并按规格剪切宽度，制成微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条。
本发明的目的之二还可以通过以下技术方案达到：
进一步地，所述检测条上的配体为同一配体或不同配体对的夹心模式，用于检测样品中的靶标物质。
进一步地，在层析过程中，若样品中含有待测靶标物质，靶标物质与荧光微球结合进行配体反应，形成“荧光微球-配体-靶标物质”三体复合物。
进一步地，层析进行到层析膜时，检测线包被的另一或同一特异性配体可捕获包含靶标物质的三体复合物，进一步形成“荧光微球-配体-靶标物质-包被配体”双配体夹心复合物。
本发明的目的之三可以通过以下技术方案达到：
微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的用途，其特征在于：用于对样品的微量靶标物质的荧光检测，检测方法包括以下步骤：
1）往检测条的样品吸收垫上加入待测样本，反应5-20min；
2）通过激发光源照射层析膜表层，在质控线和检测线上的荧光微球经激发光源激发后，可直接肉眼观察或采用侧向层析荧光检测系统检测质控线和检测线上是否发出荧光条带，由此判读结果：
2-）若检测线和质控线出现荧光条带，判定为样品阳性反应；
2-2）若检测线出现荧光条带，质控线无显示，则判定为结果无效，需更换新检测条从步骤1）开始；
2-3)若检测线和质控线均无荧光条带显示，判定为结果无效，需更换新检测条从步骤1）开始。
本发明的目的之三还可以通过以下技术方案达到：
进一步地，所述激发光源可以为验钞笔，或紫外灯。
进一步地，所述侧向层析荧光检测系统为可以检测荧光微球发射波长的检测设备。
本发明具有如下突出的有益效果：
1、本发明基于双配体夹心模式对微量靶标物质进行多重联检，通过将不同靶标物质特异性配体分别标记在不同荧光微球上并按比例喷涂在结合垫上，再在不同检测线上包被针对不同靶标物质的（同一或另一）特异性配体，以及在质控制线上包被针对微球上标记配体的抗体，制备成微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条，在采用荧光微球提高检测灵敏度的同时，可同时对多种微量标靶物质进行联检，检测对象灵活性高，且各显示结果之间无交叉反应，相互独立，显著提高了检测的灵敏度和准确性，同时节约检测样本，实现微量样本多指标高灵敏性联合检测。
2、本发明检测条为体积小的条状结构，携带方便，在需要对样品进行检测时，只需往检测条的样品吸收垫上加入待测样本，反应5-20min；经激发光源照射激发后，可直接肉眼观察或采用侧向层析荧光检测系统检测质控线和检测线是否有荧光条带出现，可对结果进行判读，操作快速简便，显示结果之间无交叉反应，准确性好，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗有着重要的意义。
附图说明
图1为是本发明检测条的结构图。
图2是本发明内部结构图。
图3-图9是具体实施例1的检测结果示意图。
图10-图15是具体实施例2的检测结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步的详细描述：
具体实施例1：
参照图1和图2，本实施例涉及的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条，包括底板1，在底板1上方从左端到右端依次设有样品吸收垫2、结合垫3、层析膜4和吸水纸5，所述样品吸收垫2的右端压贴住结合垫3的左端，结合垫3的右端压贴住层析膜4的左端，所述吸水纸5的左端压贴住层析膜4的右端，构成侧向层析检测结构；所述层析膜4上从左到右制备有检测线4-1和质控线4-2；结合垫3由聚酯纤维膜和设置在该聚酯纤维膜上标记了不同配体的多种荧光微球构成，层析膜4由硝酸纤维膜及设置在该硝酸纤维膜上包含可特异结合靶标物质的不同配体的多条检测线构成。
本实施例中：所述检测线4-1的数量大于二条；所述底板1采用不吸水性的PVC材料制成。所述荧光微球的粒径为20-400nm、激发波长为350-505nm、发射波长为440-515nm。
参照图3-图9，本实施例为通过制备禽流感病毒H5、H7、H9亚型三联检荧光微球侧向层析条，来对禽流感病毒H5、H7、H9亚型进行多重联检并判读结果，其制备方法包括以下步骤：
1）通过物理吸附分别将抗禽流感病毒H5、H7、H9亚型的小鼠单抗标记到不同的荧光微球上，制备得三种标记不同抗体的荧光微球，并将按比例混匀，喷涂在聚酯纤维膜上，制成结合垫；
2）再分别将可特异结合抗禽流感病毒H5、H7、H9亚型的小鼠单抗喷涂到硝酸纤维膜上制成3条不同的检测线，同时将抗鼠多抗包被成质控线，制成层析膜；
3）制备样品吸收垫，并在底板上依次搭接样品吸收垫、结合垫、层析膜及吸水纸，并剪切适当宽度，则制成为禽流感病毒H5、H7、H9亚型三联检的荧光微球侧向层析检测条。
在所述步骤1）中，荧光微球结合垫的制备步骤如下：
1-1）首先取9mg荧光聚苯乙烯微球（粒径100nm，购于美国Life technologies公司，最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为515nm），10000g离心10min，收集沉淀；
1-2）用10倍微球体积的0.2M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤沉淀，10000g离心15min，900μl0.2M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解沉淀，使微球终浓度为10mg/ml；
1-3）分别将75μg经0.01M pH7.4PBS（磷酸盐缓冲液）稀释的抗禽流感病毒H5、H7、H9亚型小鼠单抗逐滴加入到荧光微球中，室温放置30min；
1-4）加入浓度为1%的牛血清白蛋白封闭荧光微球上未结合抗体的位点，室温放置过夜；
1-5）在4℃的温度下，取8000g步骤1.4）的荧光微球离心40min，收集沉淀，用0.05M pH9.0Tris-HCl缓冲液洗涤离心后，用0.05M pH9.0Tris-HCl缓冲液（含1%牛血清白蛋白、0.02%NaN3、0.1%PVA、0.9%NaCl、10%蔗糖和0.1%TritonX-100）复溶沉淀至起始体积，即为制备好的分别标记抗禽流感病毒H5、H7、H9亚型小鼠单抗的荧光微球。
1-6）将聚酯纤维素膜剪切成0.7*30cm的规格并按照4μl/cm的量，浸泡在步骤1.5）所制得的溶液中，然后在37℃干燥30-60min，置于干燥环境备用。
另外，在步骤2）中，所述层析膜的制备方法为用0.01M pH7.4PBS稀释抗禽流感病毒H5、H7、H9亚型小鼠单抗的浓度为3mg/ml，分别将其喷涂在NC膜上不同位置，作为联合检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的检测线；用0.01M pH7.4PBS调节抗鼠多抗的浓度为2mg/ml，将其喷涂在层析膜上作为质控线。4条线的喷膜量均为1.5μl/cm，两线相隔6mm，质控线距离层析膜一端1cm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。
经过步骤1）和2）后，通过步骤3）的方法最终制得所述检测条，步骤3）的具体步骤如下：
3-1）将聚酯纤维素膜用0.05M pH9.0Tris-HCl缓冲液（含1%牛血清白蛋白，1%吐温20，0.01%TritonX-100，10%蔗糖）浸泡处理，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。
3-2）在PVC底板上依次搭接样品吸收垫、荧光微球结合垫、层析膜和吸水纸，组装完成后剪切成3mm的宽度，即成为荧光微球侧向层析检测条。
在使用检测卡对样品进行禽流感病毒H5、H7、H9亚型进行多重联检荧光微球侧向层析检测时，根据以下步骤进行检测并判读：
1）将待检测样品经MDCK细胞（犬肾细胞）和鸡胚培养的禽流感病毒H5、H7、H9亚型的细胞培养物进行噬斑法定量分别为1.2×107PFU/ml，5.8×106PFU/ml和1.4×106PFU/ml，按2倍倍比稀释待检；
2）将100μl上述培养物样品稀释后分别或一起加入样品吸收垫，再加入0.01MpH7.4PBS促进层析流动，于室温反应5-20min；
3）通过激发光源照射层析膜表层，在质控线和检测线上的荧光微球经激发光源激发后，可直接肉眼观察或采用侧向层析荧光检测系统检测质控线和检测线是否发出荧光条带，由此判读结果：
3-1）如图3所示，第一检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为禽流感病毒H5亚型阳性；
3-2）如图4所示，第二检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为禽流感病毒H7亚型阳性；
3-3）如图5所示，第三检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为禽流感病毒H9亚型阳性；
3-4）如图6所示，第一、二检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为禽流感病毒H5和H7亚型阳性；
3-5）如图7所示，所有检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为禽流感病毒H5和H7亚型阳性；
3-6）如图8所示，所有检测线出现荧光条带现象，由于质控线无绿色荧光现象，结果判定无效，应更换新的检测条，重新从步骤2）开始执行；
3-7）如图9所示，所有检测线和质控线均无出现荧光条带现象，结果判定无效，应更换新的检测条，重新从步骤2）开始执行。
优选的是，步骤3）中所述激发光源可以为验钞笔，或紫外灯，或可激发微球荧光的其它光源。所述侧向层析荧光检测系统为可以检测荧光微球发射波长的检测设备，例如ESEQuant定量侧向层析检测系统（天根生化科技（北京）有限公司）。
本发明的工作原理：
本发明是通过静电作用，在层析膜的多条（不少于2条）检测线上分别包被一种针对不同靶标物质的特异性配体，同时将同一（或另一）特异配体偶联到荧光微球上。而层析膜质控线包被针对荧光微球标记上标记的配体的抗体。加入待测样品时，荧光微球标记的配体重新水化并与样品相互反应，在毛细管的扩散作用下沿着吸水纸方向移动。若样品中含有待测靶标物质，层析过程中，靶标物质与荧光微球结合的配体反应，形成“荧光微球-配体-靶标物质”3体复合物，再移行至层析膜时，检测线包被的同一（或另一）特异性配体可捕获包含靶标物质的3体复合物，进一步形成“荧光微球-配体-靶标物质-包被配体”双配体夹心复合物，使荧光纳米微球富集在检测线。在激发光源激发下出现肉眼可见的荧光条带，该颜色的强弱与样本中的抗原浓度成正比，而过量的标记配体的荧光微球则继续移行至质控线被捕获，同样在特定光源激发下出现荧光条带。若样品中没有靶标物质，无法形成“荧光微球-配体-靶标物质”3体复合物，检测线无荧光条带，但质控线仍会出现荧光条带。
具体实施例2：
参照图10-图15，本实施例为通过分别标记沙门氏菌，志贺氏菌，绿脓杆菌，肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌特异的噬菌体的五种荧光微球，制备成食源性致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌五联检荧光微球侧向层析检测条，然后对沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌的培养样品进行检测并进行结果判读，其特征在于制备方法包括以下步骤：
1）通过物理吸附分别将以上五种病原体的特异的噬菌体标记到不同的荧光微球上， 制备得五种标记不同噬菌体的荧光微球，并将按比例混匀，喷涂在聚酯纤维膜上，制成结合垫；
2）再分别将以上五种病原体的噬菌体喷涂到硝酸纤维膜上制成五条不同的检测线，同时将抗鼠多抗包被成质控线，制成层析膜；
3）制备样品吸收垫，并在底板上依次搭接样品吸收垫、结合垫、层析膜及吸水纸，并剪切适当宽度，则制成沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌五联检荧光微球侧向层析检测条。
在所述步骤1）中，荧光微球结合垫的制备步骤如下：
1-1）首先取15mg荧光聚苯乙烯微球（粒径40nm，购于美国Life technologies公司，最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为515nm），10000g离心10min，收集沉淀；
1-2）用10倍微球体积的0.2M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤沉淀，10000g离心15min，750μl0.2M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解沉淀，使微球终浓度为20mg/ml；
1-3）分别将120μg经0.01M pH7.2PBS（磷酸盐缓冲液）稀释的沙门氏菌，志贺氏菌，绿脓杆菌，肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌特异的噬菌体逐滴加入到荧光微球中，室温放置40min；
1-4）加入15%牛血清白蛋白封闭荧光微球上未结合抗体的位点，使其终浓度为2%，室温放置过夜；
1-5）在4℃的温度下，取8000g步骤1.4）的荧光微球离心50min，收集沉淀，用0.05M pH9.0Tris-HCl缓冲液洗涤离心后，沉淀用0.05M pH9.0Tris-HCl缓冲液（含2%牛血清白蛋白、0.02%NaN3、0.1%PVA、0.9%NaCl、10%蔗糖和0.1%TritonX-100）复溶沉淀至起始体积，即为制备好的分别标记沙门氏菌，志贺氏菌，绿脓杆菌，肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌特异的噬菌体的荧光微球。
1-6）将聚酯纤维素膜剪切成0.7*30cm的规格并按照4μl/cm的量，浸泡步骤1.5）所制得的溶液中，然后在37℃干燥30-60min，置于干燥环境备用。
另外，在步骤2）中，所述层析膜的制备方法为用0.01M pH7.2PBS稀释沙门氏菌，志贺氏菌，绿脓杆菌，肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌特异的噬菌体的浓度为3mg/ml，分别将其喷涂在层析膜上不同位置，作为联合检测沙门氏菌，志贺氏菌，绿脓杆菌，肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌的检测线；用0.01M pH7.2PBS调节鼠抗噬菌体多抗的浓度为3mg/ml，将其喷涂在层析膜上作为质控线。6条线的喷膜量均为1.0μl/cm，每两线相隔5mm，质控线距离层析膜一端1cm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。
经过步骤1）和2）后，通过步骤3）的方法最终制得所述检测条，步骤3）具体步骤如下：
3-1）将玻璃纤维膜用0.05M pH9.0Tris-HCl缓冲液（含2%牛血清白蛋白，1%吐温20，0.01%TritonX-100，10%蔗糖）浸泡处理，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用。
3-2）在PVC底板上依次搭接样品吸收垫、荧光微球结合垫、层析膜和吸水纸，组装完成后剪切成3mm的宽度，即成为荧光微球侧向层析检测条。
所述荧光微球侧向层析检测条的结构特征在于：包括底板1，在底板1上方从左端到右端依次设有样品吸收垫2、结合垫3、层析膜4和吸水纸5，所述样品吸收垫2的右端压贴住结合垫3的左端，结合垫3的右端压贴住层析膜4的左端，所述吸水纸5的左端压贴住层析膜4的右端，构成侧向层析检测结构。
进一步地，所述层析膜4上从左到右制备有检测线4-1和质控线4-2。所述检测线的数量不小于2条。所述底板1采用不吸水性的PVC材料制成。
在使用检测卡对样品进行食源性致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌多重联检荧光微球侧向层析检测时，根据以下步骤进行检测并判读：
1）将待检测样品经专用培养基扩增培养的沙门氏菌（6.8×107CFU/ml），志贺氏菌（3.1×107CFU/ml），绿脓杆菌（1.4×107CFU/ml），肠出血型大肠杆菌O157（4.6×107CFU/ml）和副溶血弧菌（2.7×107CFU/ml）的培养物按2倍倍比稀释待检；
2）将100μl上述培养物样品稀释后分别或一起加到样品吸收垫上，再加入0.01MpH7.4PBS促进其层析流动，于室温反应10-20min；
3）通过激发光源照射层析膜表层，在质控线和检测线上的荧光微球经激发光源激发后，可直接肉眼观察或采用侧向层析荧光检测系统检测质控线和检测线是否发出荧光条带，由此判读结果：
3-1）如图10所示，第一检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为沙门氏菌阳性；
3-2）如图11所示，第一、二检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为沙门氏菌和志贺氏菌阳性；
3-3）如图12所示，第一到第三检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为沙门氏菌，志贺氏菌和绿脓杆菌阳性；
3-4）如图13所示，第一到第四检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为沙门氏菌，志贺氏菌，绿脓杆菌和肠出血型大肠杆菌O157阳性；
3-5）如图14所示，所有检测线和质控线出现荧光条带现象，其结果判定为沙门氏菌，志贺氏菌，绿脓杆菌，肠出血型大肠杆菌O157和副溶血弧菌阳性；
3-6）如图15所示，所有检测线出现荧光条带现象，由于质控线无荧光现象，结果 判定无效，应更换新的检测条，重新从步骤2）开始执行；
3-7)所有检测线和质控线均无出荧光条带现象，结果判定无效，应更换新的检测条，重新从步骤2)开始执行；
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条，其特征在于：包括底板（1），在底板（1）上方从左端到右端依次设有样品吸收垫（2）、结合垫（3）、层析膜（4）和吸水纸（5），所述样品吸收垫（2）的右端压贴住结合垫（3）的左端，结合垫（3）的右端压贴住层析膜（4）的左端，所述吸水纸（5）的左端压贴住层析膜（4）的右端，构成侧向层析检测结构；所述层析膜（4）上从左到右制备有检测线（4-1）和质控线（4-2）；结合垫（3）由聚酯纤维膜和设置在该聚酯纤维膜上标记了不同配体的多种荧光微球构成，层析膜（4）由硝酸纤维膜及设置在该硝酸纤维膜上包含可特异结合靶标物质的不同配体的多条检测线构成。
2.根据权利要求1所述的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条，其特征在于：所述检测线（4-1）的数量大于二条；所述底板（1）采用不吸水性的PVC材料制成。
3.根据权利要求1或2所述的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条，其特征在于：所述荧光微球的粒径为20-400nm、激发波长为350-505nm、发射波长为440-515nm。
4.微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备结合垫；将不同微量靶标物质的特异配体通过物理吸附或化学偶联的方式标记在不同荧光微球上，制备标记了不同配体的多种荧光微球，并按比例将其喷涂在聚酯纤维膜上，制得结合垫；
2）制备层析膜，将可特异结合靶标物质的不同配体喷涂到硝酸纤维膜上制成多条检测线，同时，将抗配体的抗体包被成质控线，制成层析膜；
3）按规格准备好底板、样品吸收垫和吸水纸；
4）按规格在底板上依次搭接样品吸收垫、结合垫、层析膜及吸水纸，并按规格剪切宽度，制成微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条。
5.根据权利要求4所述的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的制备方法，其特征在于：所述检测条上的配体为同一配体或不同配体对的夹心模式，用于检测样品中的靶标物质。
6.根据权利要求4或5所述的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的制备方法，其特征在于：在层析过程中，若样品中含有待测靶标物质，靶标物质与荧光微球结合进行配体反应，形成“荧光微球-配体-靶标物质”三体复合物。
7.根据权利要求4或5所述的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的制备方法，其特征在于：层析进行到层析膜时，检测线包被的另一或同一特异性配体可捕获包含靶标物质的三体复合物，进一步形成“荧光微球-配体-靶标物质-包被配体”双配体夹心复合物。
8.微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的用途，其特征在于：用于对样品的微量靶标物质的荧光检测，检测方法包括以下步骤：
1)往检测条的样品吸收垫上加入待测样本，反应5-20min；
2)通过激发光源照射层析膜表层，在质控线和检测线上的荧光微球经激发光源激发后，可直接肉眼观察或采用侧向层析荧光检测系统检测质控线和检测线上是否发出荧光条带，由此判读结果：
2-1)若检测线和质控线出现荧光条带，判定为样品阳性反应；
2-2)若检测线出现荧光条带，质控线无显示，则判定为结果无效，需更换新检测条从步骤1)开始；
2-3)若检测线和质控线均无荧光条带显示，判定为结果无效，需更换新检测条从步骤1)开始。
9.根据权利要求8述的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的用途，其特征在于：所述激发光源可以为验钞笔，或紫外灯。
10.根据权利要求8所述的微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条的用途，其特征在于：所述侧向层析荧光检测系统为可以检测荧光微球发射波长的检测设备。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410079698.0A CN104076142A (zh) | 2014-03-05 | 2014-03-05 | 微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410079698.0A CN104076142A (zh) | 2014-03-05 | 2014-03-05 | 微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104076142A true CN104076142A (zh) | 2014-10-01 |
Family
ID=51597546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410079698.0A Pending CN104076142A (zh) | 2014-03-05 | 2014-03-05 | 微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104076142A (zh) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104407135A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒 |
| CN104407134A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒h1亚型检测方法及其试剂盒 |
| CN104407133A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒检测方法及其试剂盒 |
| CN105021595A (zh) * | 2015-07-23 | 2015-11-04 | 杭州金溪生物技术有限公司 | 快速诊断试纸条 |
| CN105203522A (zh) * | 2015-10-26 | 2015-12-30 | 杜文红 | 一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒 |
| CN105445466A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-03-30 | 苏州市博纳泰科生物技术有限公司 | 一种白介素6的检测方法及其试剂盒 |
| CN105699659A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-06-22 | 苏州联辰生物技术有限公司 | 一种多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒 |
| CN105784572A (zh) * | 2016-03-01 | 2016-07-20 | 广东医学院附属医院 | 一种基于流式细胞术定量检测外周血白细胞自噬的试剂盒 |
| CN106018792A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-10-12 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种胃功能检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN106018788A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-10-12 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种骨标志物检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN106018791A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-10-12 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种降钙素、叶酸、维生素d联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN107101991A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-08-29 | 东南大学 | 一种高灵敏度多靶标检测层析试纸条 |
| CN107271692A (zh) * | 2017-08-14 | 2017-10-20 | 浙江博华医药科技有限公司 | 一种标记特异性高亲和力重组抗体的荧光微球及其应用 |
| CN108348913A (zh) * | 2015-10-26 | 2018-07-31 | 幸福科技公司 | 侧向流测定装置和方法 |
| CN110133281A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | Crp和saa联合检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110824177A (zh) * | 2019-09-11 | 2020-02-21 | 润和生物医药科技(汕头)有限公司 | 一种快速检测试纸及其制备方法和应用 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN201053965Y (zh) * | 2007-06-06 | 2008-04-30 | 万积成 | 一种流感病毒快速检测试纸 |
| CN101726596A (zh) * | 2009-11-04 | 2010-06-09 | 无锡中德伯尔生物技术有限公司 | 检测乙肝五项的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法 |
| CN101980021A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-02-23 | 南通市伊士生物技术有限责任公司 | 一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法 |
| CN102830230A (zh) * | 2012-08-28 | 2012-12-19 | 暨南大学 | 莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条及制备与应用 |
| CN102928593A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-02-13 | 北京宝瑞源科技孵化有限公司 | 丁丙诺啡检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102928594A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-02-13 | 北京宝瑞源科技孵化有限公司 | 苯环利定检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102937647A (zh) * | 2012-02-16 | 2013-02-20 | 北京宝瑞源科技孵化有限公司 | 麦角乙二胺检测试剂盒及其制备方法 |
| CN103105492A (zh) * | 2013-01-17 | 2013-05-15 | 重庆市科学技术研究院 | 一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸 |
| CN103267854A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-08-28 | 西安交通大学 | 一种增强试纸检测信号的方法 |
| CN103364547A (zh) * | 2012-04-01 | 2013-10-23 | 嘉善德智医疗器械科技有限公司 | 一种多参数免疫层析检测试纸及其制备方法 |
| CN103499699A (zh) * | 2013-09-27 | 2014-01-08 | 南昌大学 | 一种结合物联网数据传输系统的荧光微球免疫层析定量检测仪 |
-
2014
- 2014-03-05 CN CN201410079698.0A patent/CN104076142A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN201053965Y (zh) * | 2007-06-06 | 2008-04-30 | 万积成 | 一种流感病毒快速检测试纸 |
| CN101726596A (zh) * | 2009-11-04 | 2010-06-09 | 无锡中德伯尔生物技术有限公司 | 检测乙肝五项的荧光微球免疫层析检测卡及其制备方法 |
| CN101980021A (zh) * | 2010-10-22 | 2011-02-23 | 南通市伊士生物技术有限责任公司 | 一种快速检测西布曲明及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法 |
| CN102928593A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-02-13 | 北京宝瑞源科技孵化有限公司 | 丁丙诺啡检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102928594A (zh) * | 2011-12-27 | 2013-02-13 | 北京宝瑞源科技孵化有限公司 | 苯环利定检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102937647A (zh) * | 2012-02-16 | 2013-02-20 | 北京宝瑞源科技孵化有限公司 | 麦角乙二胺检测试剂盒及其制备方法 |
| CN103364547A (zh) * | 2012-04-01 | 2013-10-23 | 嘉善德智医疗器械科技有限公司 | 一种多参数免疫层析检测试纸及其制备方法 |
| CN102830230A (zh) * | 2012-08-28 | 2012-12-19 | 暨南大学 | 莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条及制备与应用 |
| CN103105492A (zh) * | 2013-01-17 | 2013-05-15 | 重庆市科学技术研究院 | 一种荧光免疫层析流感病毒检测试纸 |
| CN103267854A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-08-28 | 西安交通大学 | 一种增强试纸检测信号的方法 |
| CN103499699A (zh) * | 2013-09-27 | 2014-01-08 | 南昌大学 | 一种结合物联网数据传输系统的荧光微球免疫层析定量检测仪 |
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104407135A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒h5和h9亚型检测方法及其试剂盒 |
| CN104407134A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒h1亚型检测方法及其试剂盒 |
| CN104407133A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | A型流感病毒检测方法及其试剂盒 |
| CN105021595A (zh) * | 2015-07-23 | 2015-11-04 | 杭州金溪生物技术有限公司 | 快速诊断试纸条 |
| CN105021595B (zh) * | 2015-07-23 | 2017-07-14 | 杭州金溪生物技术有限公司 | 快速诊断试纸条 |
| CN105203522A (zh) * | 2015-10-26 | 2015-12-30 | 杜文红 | 一种量子点结核分枝杆菌定量检测试剂盒 |
| CN108348913A (zh) * | 2015-10-26 | 2018-07-31 | 幸福科技公司 | 侧向流测定装置和方法 |
| CN105445466A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-03-30 | 苏州市博纳泰科生物技术有限公司 | 一种白介素6的检测方法及其试剂盒 |
| CN105699659A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-06-22 | 苏州联辰生物技术有限公司 | 一种多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒 |
| CN105784572A (zh) * | 2016-03-01 | 2016-07-20 | 广东医学院附属医院 | 一种基于流式细胞术定量检测外周血白细胞自噬的试剂盒 |
| CN106018791A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-10-12 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种降钙素、叶酸、维生素d联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN106018788A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-10-12 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种骨标志物检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN106018792B (zh) * | 2016-05-17 | 2018-02-13 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种胃功能检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN106018788B (zh) * | 2016-05-17 | 2018-02-16 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种骨标志物检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN106018791B (zh) * | 2016-05-17 | 2018-02-16 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种降钙素、叶酸、维生素d联合检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN106018792A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-10-12 | 北京美康基因科学股份有限公司 | 一种胃功能检测用免疫层析试剂盒及其制备方法 |
| CN107101991A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-08-29 | 东南大学 | 一种高灵敏度多靶标检测层析试纸条 |
| CN107271692A (zh) * | 2017-08-14 | 2017-10-20 | 浙江博华医药科技有限公司 | 一种标记特异性高亲和力重组抗体的荧光微球及其应用 |
| CN110133281A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-16 | 中生北控生物科技股份有限公司 | Crp和saa联合检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110824177A (zh) * | 2019-09-11 | 2020-02-21 | 润和生物医药科技(汕头)有限公司 | 一种快速检测试纸及其制备方法和应用 |
| CN110824177B (zh) * | 2019-09-11 | 2021-06-11 | 润和生物医药科技(汕头)有限公司 | 一种快速检测试纸及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104076142A (zh) | 微量靶标物质多重联检的荧光微球侧向层析检测条及其制备方法和用途 | |
| Bamrungsap et al. | Rapid and sensitive lateral flow immunoassay for influenza antigen using fluorescently-doped silica nanoparticles | |
| US11371987B2 (en) | Method of amplifying detection light using light-reflecting material, in immunochromatography | |
| CN111999507B (zh) | 一种检测新型冠状病毒抗体的荧光免疫层析试纸 | |
| US20190361029A1 (en) | Preparation of visible colored insoluble carrier particles labeled with a fluorescent dye and an immunoassay method using the same | |
| CN101701958A (zh) | 同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条及应用 | |
| CN104076140A (zh) | 一种化学发光-胶体金免疫层析试纸条的构建及应用 | |
| CN101528942A (zh) | 用于检测污染物的方法及系统 | |
| CN105486854A (zh) | 一种信号放大方法及相关装置 | |
| Feuerstein et al. | The use of near-infrared light-emitting fluorescent nanodiamond particles to detect Ebola virus glycoprotein: Technology development and proof of principle | |
| EP3802591A1 (en) | Antibody pairs for use in a rapid influenza b diagnostic test | |
| JP2014098715A (ja) | 着色ラテックス粒子を用いるメンブレンアッセイ法およびキット | |
| CN104407131A (zh) | 一种免疫磁珠底物显色试纸及其制备方法 | |
| KR20160005962A (ko) | 멀티 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하여 인플루엔자를 검출하는 방법 | |
| WO2019241184A1 (en) | Antibody pairs for use in a rapid influenza a diagnostic test | |
| JP2009192222A (ja) | 免疫学的測定方法 | |
| CN104330556B (zh) | 森林脑炎抗体的检测试纸、试纸制备方法及其检测试剂盒 | |
| JP2012215419A (ja) | 測定装置及び測定プログラム | |
| CN104330557B (zh) | 贝氏柯克斯体抗体的检测试纸、试纸制备方法及试剂盒 | |
| CN201892678U (zh) | 一种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘 | |
| CN103353523B (zh) | 磷光二氧化硅纳米颗粒标记的免疫层析方法及其检测试纸 | |
| US20220034879A1 (en) | Means and method for point-of-care analysis of liquid samples | |
| CN107677813A (zh) | 腺病毒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| JP2015232467A (ja) | ラテラルフロー用テストストリップ、分析システム、及びラテラルフロー用テストストリップの製造方法 | |
| de Andrade Fontes | Exploring carbohydrate binding modules in cellulose-based lateral flow assays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141001 |