CN103364547A - 一种多参数免疫层析检测试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多参数免疫层析检测试纸及其制备方法，它包括免疫层析检测试纸衬板，其特征是在免疫层析检测试纸衬板上固定设有相互分隔分离的若干固相膜和对应的结合垫膜，在免疫层析检测试纸衬板上还固定设有样品垫膜和吸水垫膜，在相互分隔分离的固相膜上涂有检测线试剂和质控线试剂；在结合垫膜上设有所需检测指标所对应的胶体颗粒试剂。本发明提供的多参数并行检测的免疫层析检测试纸，可应用于临床、食品、医药、化工、环境、畜牧、农业等方面所需的快速、集成检测分析，其优势在于本发明可以克服现有单参数及多参数免疫层析检测试纸制备工艺对生产效率的限制，在各方面性能上都不逊于单独检测指标检测时的表现，在体检、献血、输血等筛查时，可以避免多项检测指标分开检测，使用方便，并能够方便、快捷，缩短检测时间，提高效率，降低成本，节约人力物力，更容易工业化生产。

Description

一种多参数免疫层析检测试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种可用于生物医学等指标多参数并行化的快速检测技术，特别是一种多参数免疫层析检测试纸及其制备方法。

背景技术

固相膜免疫分析(solid phase membrane-based immunoassay)与固相酶免疫分析(ELISA)相类似，其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了两种不同类型的快速检测方法。在固相膜免疫分析中，有穿流(flow through)形式的，称为免疫渗滤分析(immunofiltration assay，IFA)；横流(lateral flow)形式的，称为免疫层析分析(immunochromatographic assay，ICA)。因常用胶体金作为标记物，国内文献中称穿流法为免疫金溶胶斑点法或滴金免疫测定法等，称横流法为胶体金免疫层析法等，统称“金标”。

本文为叙述方便，以胶体金免疫层析检测技术及胶体金免疫层析检测试纸泛指这种固相膜横流法免疫层析检测技术及制备的产品，而不特指其标记物为胶体金。

胶体金免疫层析检测技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在固相膜(如硝酸纤维素膜，nitrocellulose memberane，NC膜)上，胶体颗粒标记的抗原或抗体吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸一端的样品垫上后，通过静压力和毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体颗粒标记试剂后相互反应，在移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物和胶体颗粒标记试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体颗粒标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。

胶体金免疫层析检测试纸主要由样品垫(Sample pad)、结合垫(Conjugate pad)、硝酸纤维素膜和吸水垫(Absorbent pad)组成，固相膜上有两条线，一条为检测线(Test line，简称T线)，另一条为质控线(Control line，简称C线)，图13为现有技术中的胶体金免疫层析检测试纸的结构示意图。

多元化检测是固相膜免疫分析的一个重要发展方向，人们已经开发出许多多元检测系统，可同时检测多种项目，如献血员筛选的免疫层析检测试纸可同时检测HBsAg、抗-HIV、抗-HCV和梅毒抗体，HBsAg、抗-HBc、HBeAg三项指标检测乙肝等，肝脏肿瘤标记物AFP/CEA也可以同时检测。但相关内容多见于文献研究，市售产品应用不多。

相关的专利申请很多。“心脑血管疾病三通道检测卡”(200910043849.6)胶体金膜为含抗神经元特异性烯醇化酶抗体、抗髓鞘碱性蛋白抗体和抗S-100β蛋白抗体胶体金标记物的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有3条检测带，分别含抗神经元特异性烯醇化酶抗体、抗髓鞘碱性蛋白抗体和抗S-100β蛋白抗体，另有1条含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带。

“百草枯——草甘膦二联检测卡及其检测样品的处理方法”(200910042774.X)与上类似。“盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺三联检测卡及其检测样品的处理方法”(200910027007.1)，“一种肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的双通道检测卡”(201010197148.0)，“结核抗体阵列检测方法及阵列检测试剂盒和制备方法”(200910022141.2)，“急性心肌梗死早期诊断三合一检测试剂板”(200510018714.6)，“肺癌标志物检测免疫层析试纸及应用”(200910055141.2)，“CA15-3、CEA、CA19-9、CA12-5、SF乳腺癌胶体金五联检诊断试剂盒”(200810084835.4)，“胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条及其制备方法”(200410027292.4)，“一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用”(200810112738.1)，“一种麻疹、风疹病毒IGG抗体胶体金快速检测试纸条”(200810112724.X)，“一步多检的胶体金检测微生物的试剂盒”(02112230.X)，“一种流感A、B病毒抗原胶体金联合检测试纸条”(200510012268.8)，“一种麻疹、风疹病毒IgM抗体胶体金检测试纸条、其制备方法和应用”(200810112725.4)，“一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条及制备方法”(201010252425.3)等同样基于相同的技术路线，“多通道过敏原快速检测试剂盒及其制备方法”(申请号：200810121603.1)虽号称单通道可检测10-20个过敏原，其原理与方法与上述无异。

“多项同时检测胶体金免疫层析试纸卡”(200710142831.2)是有新意的一项发明。他是将两个试纸条中间用塑料衬底分隔，装在同一塑料卡盒中。塑料卡盒的正反面都有观察窗，两条试纸共用样品垫，但其它过程独立进行，完成两个以上参数的测定。

在“一种同时筛查多种重大传染病的免疫层析试剂盒”(200810142017.5)的申请中，申请者将胶体金颗粒直径从普通的20-40nm提高到80-90nm，为的是提高灵敏度。作者认为，在多参数试片联检的工作中，为了保证试剂盒的特异性，就不能把胶体金的用量调高；但是由于要同时检测几个项目，所以对应目标物的胶体金用量要减少，这样会导致每个项目的灵敏度比单独检测时要低，在实际应用时，会存在灵敏度偏低的问题。目前还没有可以同时筛查HBV、HCV、HIV、TP的免疫层析试剂盒问世，其主要原因可能与没有解决几个项目联合检测时，灵敏度不如单独检测的难题有关。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种既能实现多项检测指标在同一免疫层析检测试纸上并行检测，又能保证每个项目检测的灵敏度与单独检测时一致，从而能够方便、快捷，缩短检测时间，提高效率，降低成本，节约人力物力的多参数免疫层析检测试纸及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明所设计一种多参数免疫层析检测试纸，它包括免疫层析检测试纸衬板，其特征是在免疫层析检测试纸衬板上固定设有相互分隔分离的若干固相膜和对应的结合垫膜，在免疫层析检测试纸衬板上还固定设有样品垫膜和吸水垫膜，在相互分隔分离的固相膜上涂有检测线试剂和质控线试剂；在相互分隔分离的结合垫膜上设有所需检测指标所对应的胶体颗粒试剂。

所述的胶体颗粒试剂是包被有抗原或抗体的纳米尺度物质颗粒，包括彩色胶乳、胶体金、胶体硒、纳米铁、纳米镍、纳米钴、纳米氧化铁及上述物质的复合材料。具体所述的检测指标所对应的胶体颗粒试剂，根据检测指标对应的所需在胶体颗粒试剂中包被的抗原或抗体是本行业技术人员所公知的现有技术，在此不作进一步的限定描述。

一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是首先在免疫层析检测试纸衬板上固定相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，获得胶体金免疫层析检测试纸所需要的两种基本结构薄膜，在固相膜固定到免疫层析检测试纸衬板之前或之后根据检测指标的要求，在固相膜上分别喷涂检测线试剂和含第二抗体的质控线试剂；在结合垫膜固定到免疫层析检测试纸衬板之前根据检测指标的要求，喷涂不同的胶体颗粒试剂；再将商品化的样品垫膜成品和吸水垫膜成品分切后固定在免疫层析检测试纸衬板上。

所述的在免疫层析检测试纸衬板上固定相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，是首先选择一种基材，在基材表面按一定图形分别印刷制备相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，再顺次转印到免疫层析检测试纸衬板上，获得胶体金免疫层析检测试纸所需要的两种基本结构薄膜，在结合垫膜转印或固定到免疫层析检测试纸衬板之前根据检测指标的要求，喷涂不同的胶体颗粒试剂；采用印刷及转印方法制备的固相膜，在固相膜固定到免疫层析检测试纸衬板之后根据检测指标的要求，分别喷涂检测线试剂和含第二抗体的质控线试剂；将固相膜和结合垫膜转印到免疫层析检测试纸衬板上后，再将商品化的样品垫膜成品和吸水垫膜成品分切后固定在免疫层析检测试纸衬板上。

所述的基材可以是耐高温、耐溶剂的塑料薄膜或上述塑料薄膜表面修饰金属氧化物的复合材料或金属带；所述塑料薄膜可以是聚酯、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚丙烯，所述塑料薄膜表面修饰金属氧化物如氧化锡、氧化铝、二氧化硅，所述金属带可以是铜、铝或不锈钢薄带。另外，上述印刷制备的固相膜材料或结合垫膜材料可以沉积在基材表面，但可以无损伤与基材分离。

所述的在免疫层析检测试纸衬板上固定相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，是首先在大面积涂布的商品固相膜成品表面印刷油墨，包含喷墨打印方法，破坏相应位置的膜结构或膜材料，或/和采用模切技术将大面积涂布的商品固相膜成品分隔出纵向和横向流体互不连通的区域，实现连续固相膜的分隔分离；所述的相互分隔分离的结合垫膜是采用连续的纤维纺织品或无纺布通过印刷油墨或光刻胶曝光显影的方式，结合模切技术，分隔出纵向和横向流体互不连通的区域；在此，商品固相膜成品和结合垫膜成品是带有衬底的，所述的相互分隔分离的固相膜与结合垫膜，其所述的相互分隔分离是膜层的分隔分离，使流体互不连通，其衬底仍是连接在一体，通过连接在一体的衬底，再将相互分隔分离的固相膜和结合垫膜固定到免疫层析检测试纸衬板上，分别获得胶体金免疫层析检测试纸所需要的两种基本结构薄膜；采用商品固相膜成品再采用油墨印刷处理或/和模切加工制备的固相膜，是在固定到免疫层析检测试纸衬板之前或之后根据检测指标的要求，分别喷涂检测线试剂和质控线试剂。

所述的连续的纤维纺织品或无纺布所用的纤维为有机高分子聚合物或无机材料的纤维或有机高分子聚合物和无机材料的纤维的混合或混纺，所述的有机高分子聚合物纤维为纤维素纤维或蛋白质纤维或碳纤维或涤纶纤维或尼龙纤维或维伦纤维或它们中任何几种的混合纤维，所述的无机材料纤维为玻璃纤维或硅灰石纤维或莫来石纤维或硅酸铝纤维或它们中任何几种的混合纤维；所述的模切技术包括机械模切、激光切割技术或者超声剥离技术。所述的印刷方式可以是丝网印刷方式，或柔版印刷方式，或凸版印刷方式，或凹版印刷方式；采用自动或半自动印刷机。

所述的印刷油墨为UV油墨、挥发固化油墨、热固化油墨。所述多参数免疫层析检测试纸的制备方法，所采用的固相膜和结合垫膜上的试剂组合针对相同的检测指标，用于单参数免疫层析检测试纸的制备。

所述固相膜的材料是能负载抗原、抗体，提供免疫反应空间，并可以实现层析现象的薄膜材料，所述薄膜材料是有机高分子聚合物材料或无机材料或上述材料的混合物；所述的固相膜材料是包括硝酸纤维素或醋酸纤维素或尼龙或聚四氟乙烯或金属氧化物二氧化硅或氧化铝或二氧化钛或氧化锌或氧化钨或氧化铁颗粒或上述材料的混合物；所述结合垫膜材料是无机材料或有机高分子聚合物材料或上述材料的混合物，包括玻璃纤维或硅灰石或硅酸铝纤维或尼龙纤维或聚酯纤维。

本发明是综合利用印刷技术、膜制备技术、模切技术及固相膜免疫层析检测技术，制备多参数免疫层析检测试纸。

本发明提供的多参数免疫层析检测试纸，利用印刷技术和/或采用模切技术，在整幅的基材上制备相互分隔分离、流体互不流通的固相膜及结合垫膜，再转印或组装固定到整幅的免疫层析检测试纸衬板上，配合共用的样品垫膜及吸水垫膜的组装，通过分切，实现多参数免疫层析检测试纸的功能及大批量、高效率制备。结合垫膜上喷涂的针对不同检测指标的包被有抗原或抗体的胶体颗粒试剂在免疫层析检测试纸上相互独立分布，在空间上互相隔绝，与固相膜上对应的由特异性的抗原或抗体组成的检测线试剂进行组合，可针对同一份待测样品在试纸上相互独立的空间进行各个检测指标对应的免疫反应和层析过程，分别完成多个检测指标相应的测试。

按本发明方法制备出的多参数并行检测的免疫层析检测试纸，在各方面性能上都不逊于单独检测指标检测时的表现，在体检、献血、输血等筛查时，可以避免多项检测指标分开检测，并能够方便、快捷，缩短检测时间，提高效率，降低成本，节约人力物力。

利用本发明的基于印刷技术、膜制备技术、模切技术及固相膜免疫层析检测技术的免疫层析检测试纸，可应用于临床、食品、医药、化工、环境、畜牧、农业等方面所需的快速、集成检测分析。其优势在于，该发明可以克服现有单参数及多参数免疫层析检测试纸制备工艺对生产效率的限制，更容易工业化生产，并且成本低廉，使用方便。

附图说明

图1为本发明丝网印刷在基材101上的固相膜102的实施例结构立体图；

图2为本发明丝网印刷在基材201上的结合垫膜202的实施例结构立体图；

图3为本发明的在免疫层析检测试纸衬板301上固定的固相膜102的实施例结构立体图；

图4为本发明的在固相膜102表面分别划上检测线302和质控线303的实施例结构立体图；

图5为本发明通过转印过程将结合垫膜202由基材201转印到免疫层析检测试纸衬板301上的实施例机构立体图。结合垫膜202的一端与固相膜102的一端搭接，并且两个图形中心对称；

图6为本发明在免疫层析检测试纸衬板301上固定的固相膜102和结合垫膜202的两端粘贴吸水垫304长条和样品垫长条305的实施例结构立体图；

图7为本发明多参数免疫层析检测试纸的实施例结构立体图；

图8为本发明采用大面积涂布的商品固相膜成品及印刷方法制备固相膜实施例结构立体图；

图9为本发明采用玻璃纤维布及光刻胶曝光显影制备结合垫膜实施例结构立体图；

图10为本发明采用大面积涂布的商品固相膜成品及模切方法制备固相膜实施例结构立体图；

图11为本发明将胶体金标记的糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)和血栓前体蛋白(TpP)三种抗体分别喷涂在结合垫膜的制备方法实施例结构图。

图12为本发明所示例的的急性心肌梗死早期诊断免疫层析检测试纸成品结构实施例结构图。

图13是现有技术的胶体金免疫层析检测试纸结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例按固相膜和结合垫膜的不同制备方式分别作进一步的说明。

实施例1：

本实施例描述印刷方式制备固相膜和结合垫膜：

将固相膜材料用溶剂溶解，加入添加剂，包括表面活性剂、高分子聚合物、盐离子、成型剂，溶解在一个缓冲体系内，形成油墨。油墨浓度范围为10％-70％固含量，粘度为0.1～15Pa.s，在成膜过程中不会从基材上流走。

将结合垫膜材料用溶剂溶解，加入添加剂，包括微晶纤维素、微晶纤维素胶或羧甲基纤维素钠、氢化卵磷脂，形成油墨。油墨浓度范围为10％-70％固含量，粘度为0.1～15Pa.s，在成膜过程中不会从基材上流走。

采用自动或半自动印刷机，将上述油墨印刷在适宜的基材表面，获取厚度0.01mm-0.1mm的膜。

印刷结束后，马上开始成膜过程。固相膜成膜方法可以根据分析需要及制备效果采用均质膜常用的溶液浇铸法，及非对称膜制备常用的热凝胶法、蒸发凝胶法、水蒸汽吸入法和沉浸凝胶法。均质膜制备是将印刷好的薄膜，移至特定环境中让溶剂完全挥发，最后在基材上形成均匀的聚合物薄膜，将上述薄膜浸入去离子水中浸泡，交换出溶剂和添加剂后取出，自然晾干。非对称膜的制备可采用相转化法制膜。将一个均相的高分子铸膜液油墨通过各种途径使高分子从均相溶液中沉析出来，使之分为二相，一为高分子富相，形成膜的网络结构；另一为高分子贫相，形成膜孔。

制好的固相膜首先进行转印，将涂布或印刷粘结剂的免疫层析检测试纸衬板与印有固相膜的基材1面对面贴附，采用适宜的方式进行对位。在上面施加压力，固相膜即粘附在免疫层析检测试纸衬板表面，并形成相互分隔的图形区块。

转印过程完成后，参照常规的胶体金免疫层析检测试纸的制备方式，按检测指标的要求在固相膜表面分别喷涂检测线试剂和质控线试剂，干燥后用蛋白质溶液和/或其它高分子溶液浸泡封闭固相膜，再用溶液洗涤，干燥后密封保存。

结合垫膜材料成膜方式采用加热蒸发的方式除去溶剂。参照常规的胶体金免疫层析检测试纸的制备方式，将包被有抗原或抗体的胶体颗粒试剂按检测指标的要求喷涂在不同位置结合垫膜上，干燥后密封保存。

在上述已固定有固相膜的免疫层析检测试纸衬板上进行结合垫膜的转印过程。印有结合垫膜的基材2与其面对面贴附，采用适宜的方式进行对位，结合垫膜的一部分与免疫层析检测试纸衬板上的粘合剂接触，另一部分搭接在固相膜上。在结合垫膜与粘合剂的结合部分施加压力，使结合垫膜粘附在免疫层析检测试纸衬板上，之后将基材2移走。

实施例2：

本实施例描述分隔连续薄膜方式制备固相膜和结合垫膜

固相膜可以采用大面积涂布的商品固相膜成品，通过印刷方法在膜表面印上油墨，如UV油墨、挥发固化油墨、热固化油墨；和/或采用模切技术，包括机械模切、激光切割技术、超声剥离技术，破坏相应位置的膜结构或/和膜材料，使其失去亲水性和层析性能，将连续薄膜分隔成流体互不连通的材料。上述处理加工过程可选择在固相膜固定在涂有粘合剂的免疫层析检测试纸衬板之前或之后进行。

固相膜固定在涂有粘合剂的免疫层析检测试纸衬板之前或之后，参照常规的胶体金免疫层析检测试纸的制备方式，在固相膜表面分别喷涂检测线试剂和质控线试剂，干燥后用蛋白质溶液和/或其它高分子溶液浸泡封闭固相膜，再用溶液洗涤，干燥后密封保存。

结合垫膜可采用纤维纺织品或无纺布制备。在基材表面涂布或印刷一层油墨。这层油墨与纤维纺织品或无纺布材料附着牢固，但与基材则可以无损伤剥离。通过这层油墨，将纤维纺织品或无纺布固定在基材表面。也可以采用预涂光刻胶干膜，直接与纤维纺织品或无纺布材料压合而将其固定在基材表面。通过印刷的方法在纤维纺织品或无纺布表面分隔出与结合垫面积大小相近的区域，其它部分用油墨填充；也可以通过光刻胶膜的曝光显影，将与结合垫面积大小相近的区域的光刻胶去除，其它部分由光刻胶填充。再采用模切技术，包括机械模切、激光切割技术、超声剥离技术，将基材上的纤维纺织品或无纺布分割并去除一部分，使其在基材表面形成横向、纵向相互分离的区域。试剂仅分散在纤维纺织品或无纺布未被油墨或光刻胶填充的区域。

参照常规的胶体金免疫层析检测试纸的制备方式，将包被有抗原或抗体的胶体颗粒试剂按检测指标的要求喷涂在不同位置的纤维纺织品或无纺布制成的结合垫膜上，干燥后密封保存。

在上述已固定有固相膜的免疫层析检测试纸衬板上，固定有结合垫膜的基材与其面对面贴附，采用适宜的方式进行对位，结合垫膜的一部分与免疫层析检测试纸衬板上的粘合剂接触，另一部分搭接在固相膜上。在结合垫膜与粘合剂的结合部分施加压力，使结合垫膜粘附在免疫层析检测试纸衬板上，之后将基材移走。

实施例3：

本实施例是描述印刷方式制膜与分隔连续薄膜方式制膜的交叉组合使用：

印刷方式制备固相膜十分隔连续薄膜方式制备结合垫膜；

分隔连续薄膜方式制备固相膜+印刷方式制备结合垫膜。

吸水垫膜及样品垫膜可直接采用市售产品。样品垫膜多采用玻璃纤维或纤维素滤膜，也有采用全血分离材料作为样品垫膜。参照常规的胶体金免疫层析检测试纸的制备方式，将吸水垫膜和样品垫膜切成长条形式贴在固定有固相膜和结合垫膜的免疫层析检测试纸衬板上的适宜位置，一端附着在粘合剂上，另一端分别与固相膜及结合垫膜搭接。采用适宜的工装设备使之固定在衬板上。

制备多参数免疫层析检测试纸，是将结合垫膜上喷涂不同胶体颗粒试剂，与固相膜上喷涂的对应检测线试剂进行组合，每一组免疫层析检测试纸共用吸水垫和样品垫，并作为一个完整单位进行分切，得到单独的免疫层析检测试纸。测试使用时，胶体颗粒试剂从结合垫膜上的释放过程是独立进行的，在固相膜上的层析移动及与检测线试剂和质控线试剂的免疫反应也是相互独立、互不干扰进行的。

如果是制备单参数免疫层析检测试纸，则将结合垫膜上喷涂相同胶体颗粒试剂，并且固相膜上喷涂相同的检测线试剂。

实施例4：

本实施例是描述制备多参数免疫层析检测试纸，采用硝酸纤维素作为固相膜材料，成膜方法为水蒸气吸入法。将硝酸纤维素、丙酮、乙醇以2∶5∶3的比例加入密封容器内混合溶解，加入5％的去离子水，过滤后除去气泡，作为丝网印刷油墨备用。丝网印刷采用自动或半自动印刷机。基材101是聚酯塑料薄膜，或聚碳酸酯塑料薄膜，或聚酰亚胺塑料薄膜。印刷完成后，印有油墨的基材101通过具有特殊环境条件的空间，第一个空间充满热潮湿空气，油墨失去易挥发溶剂同时吸入水蒸气，整个高分子沉淀成膜过程约需10min完成，这时膜的结构是对称的。基材101可继续在对流的干燥热空气中处理，使膜内残存的溶剂全部挥发掉而变成干膜。这一过程速度可保持在0.2-1.6m/min。所获得的固相膜的性能满足免疫层析检测，根据不同项目需求调节制备条件，获得孔径3μm-10μm的固相膜102，呈一定的图形方式分布在基材101表面。印刷图形的长度约25mm-50mm，宽度约3mm，横向间距约0.3mm，纵向间距约50-100mm。结果如图1所示。

结合垫膜材料采用玻璃纤维，并用微晶纤维素胶作为粘结剂，采用氢化卵磷脂作为乳化和表面活性剂。三者按比例50∶2∶1混合，溶剂为水，加入合适比例的尿素和氨水，使最后混合成的油墨pH值不超过11。丝网印刷过程与固相膜的印刷过程类似，基材201是聚酯塑料薄膜，或聚碳酸酯塑料薄膜，或聚酰亚胺塑料薄膜。成膜方式采用加热蒸发方式除去溶剂，并实现玻璃纤维间适宜程度上的粘连，形成结合垫膜202，如图2所示。图形长约5-10mm，宽约3mm，横向间距约0.3mm，纵向间距约50-100mm。成膜结束后，根据分析目标物及对应采用的方法学的不同，将包被有抗原或抗体的胶体金溶液按检测参数的要求喷涂在不同位置结合垫膜202上，干燥后保存在相对湿度＜15％、温度为18℃一25℃的环境中备用。

胶体金免疫层析检测试纸的制备过程。制好的固相膜首先进行转印。将涂有粘合剂的衬板301与印有固相膜102的基材101面对面贴附，采用打孔或边缘对齐方式进行对位。采用覆膜机施加适宜的压力将衬板301和基材101复合，固相膜102即粘附在衬板表面。转印后将基材101和免疫层析检测试纸衬板301分开。这时固相膜102就转移到免疫层析检测试纸衬板301上，并形成相互区隔的图形区块，如图3所示。这一过程完成后，在固相膜102表面分别喷涂上检测线试剂302和质控线试剂303，37℃干燥2h，如图4所示。检测线试剂302位于距固相膜和样品垫连接处约2-10mm处，质控线试剂303与检测线试剂302之间间隔约2-5mm。之后固相膜102用10％牛血清白蛋白溶液浸泡封闭2小时，再用0.01mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，干燥后保存在相对湿度＜15％、温度为18℃一25℃的环境中备用。

通过同样的过程将结合垫膜202由基材201转印到免疫层析检测试纸衬板301上。采用打孔或边缘对齐方式定位，使结合垫膜202的一端与固相膜102的一端搭接，并且两个图形中心对称，如图5所示。之后分别在各个免疫层析检测试纸的两端粘贴吸水垫304和样品垫长条305，如图6所示。吸水垫304和样品垫305采用市售产品，如玻璃纤维素膜，以及滤纸膜。根据产品要求分切成适宜的宽度，如4mm-8mm，与固相膜或结合垫膜搭接长度为1-5mm。吸水垫和样品垫长度根据免疫层析检测试纸衬板301的宽幅来定。

制备多参数免疫层析检测试纸，是在相邻的结合垫膜202上分别喷涂针对不同检测指标的胶体颗粒试剂，与固相膜102上喷涂的对应检测线试剂302进行组合，每一组免疫层析检测试纸共用吸水垫304和样品垫305，并作为一个完整单位进行分切，得到单独的免疫层析检测试纸，如图7所示。

测试使用时，胶体颗粒试剂从结合垫膜上的释放过程是独立进行的，在固相膜上的层析移动及与检测线试剂和质控线试剂的免疫反应也是相互独立、互不干扰进行的。

在制备单参数免疫层析检测试纸时，检测线试剂302和质控线试剂303在各个单独的固相膜102上组分分别是相同的，结合垫膜202中的胶体金标记物也是同一种组分，固相膜、结合垫与吸水垫304和样品垫305组成一个单位，分别分切，构成相应的免疫层析检测试纸。

实施例5：

本实施例是采用硝酸纤维素作为固相膜材料，成膜方法为沉浸凝胶法。

沉浸凝胶法也称L-S法，是目前最重要的相转化制膜技术。将硝酸纤维素、丙酮、正丁醇以2∶6∶2的比例加入密封容器内混合溶解，加入5％的去离子水，过滤后除去气泡，作为丝网印刷油墨备用。丝网印刷过程与实施例1中所述相同。将印刷在基材101上的油墨薄膜浸入非溶剂浴(水)中。溶剂扩散进入凝胶浴，而非溶剂扩散到薄膜内。经过一段时间(20小时)，溶剂和非溶剂之间的质量交换达到一定程度，溶液变为热力学不稳定状态，发生分层，最终形成一定结构的固体聚合物膜。

胶体金免疫层析检测试纸制备的其它过程与实施例1中所述相同。

实施例6：

本实施例描述的是固相膜制备采用大面积涂布的商品固相膜成品，如MILLIPORE、WHATMAN and S&S、Puraband impuraband、SARTORIUS、伊能等品牌带有衬底的硝酸纤维素膜产品。将固相膜切成25mm-50mm宽度的长条形式401，粘贴在涂有粘合剂的免疫层析检测试纸衬板402上，相互间距50-100mm，如图8所示。401-1为商品固相膜成品的衬底，401-2为沉积在衬底上的硝酸纤维素膜。在固相膜401表面分别喷涂上检测线试剂403和质控线试剂404，37℃干燥2h，检测线试剂403位于固相膜401和样品垫连接处约2-10mm处，质控线试剂404与检测线试剂403之间间隔约2-5mm。之后固相膜401用10％牛血清白蛋白溶液浸泡封闭2小时，再用0.01mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，干燥后保存在相对湿度＜15％、温度为18℃一25℃的环境中备用。

通过印刷方法在固相膜401表面印上疏水性UV(紫外)油墨图案405，使相应位置的膜结构或膜材料失去亲水性和层析性能，将连续的固相膜的硝酸纤维素膜401-2分隔成流体互不连通的材料。图案405宽度为0.3mm，被油墨图形相互分隔的硝酸纤维素膜宽度为3mm。

结合垫膜制备，可先利用预涂在PET薄膜501表面的光刻胶膜材料502，将玻璃纤维布503贴合固定。所采用的光刻胶膜材料502与玻璃纤维布503附着力牢固，但与PET薄膜501的附着是可逆的，可以无损伤地从PET表面剥离。之后将光刻胶膜曝光显影，将一部分光刻胶膜去除，暴露出玻璃纤维布。通过模切方式(机械或激光、超声方式)将一部分玻璃纤维布排料去除，形成如图9所示结构。留下来的玻璃纤维布与光刻胶膜为长条形状，宽度5-10mm，相互间距50-100mm。长条上单个图形504宽约3mm，光刻胶膜的图形宽约0.3mm。在相邻的结合垫膜504上分别喷涂针对不同检测指标的胶体颗粒试剂，干燥后保存在相对湿度＜15％、温度为18℃一25℃的环境中备用。

胶体金免疫层析检测试纸制备的其它过程与实施例1中所述相同。

实施例7：

本实施例描述的是固相膜制备采用大面积涂布的商品固相膜成品，如MILLIPORE、WHATMAN and S&S、Puraband impuraband、SARTORIUS、伊能等品牌带有衬底的硝酸纤维素膜产品。将固相膜切成25mm-50mm宽度的长条形式601，粘贴在涂有粘合剂的免疫层析检测试纸衬板602上，相互间距50-100mm。601-1为商品固相膜成品的衬底，601-2为沉积在衬底上的硝酸纤维素膜。在固相膜601表面分别喷涂上检测线试剂603和质控线试剂604，37℃干燥2h，检测线试剂603位于距固相膜601和样品垫连接处约2-10mm处，质控线试剂604与检测线试剂603之间间隔约2-5mm。之后固相膜601用10％牛血清白蛋白溶液浸泡封闭2小时，再用0.01mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，干燥后保存在相对湿度＜15％、温度为18℃一25℃的环境中备用。

通过激光模切方法将连续的固相膜的硝酸纤维素膜601-2分隔成流体互不连通的材料。激光模切采用市售设备，借助激光束的烧蚀作用将宽度为0.3mm的硝酸纤维素膜605去除，而衬底601-1保持完整，完成固相膜的隔离。相互分隔的硝酸纤维素膜宽度为3mm，如图10所示。胶体金免疫层析检测试纸制备的其它过程与实施例3中所述相同，在此不再赘述。

不同方法制备的固相膜与结合垫膜可根据需要组合使用。

以急性心肌梗死早期诊断免疫层析检测试纸为例，说明如何利用本发明的方法制备多参数免疫层析检测试纸。利用该方法制备多参数免疫层析检测试纸，可在1平方米以上的免疫层析检测试纸衬板上构成各个独立的固相膜免疫层析检测单位。将胶体金标记的糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)和血栓前体蛋白(TpP)三种抗体在转印前按顺序分别喷涂在如实施例3中方法所制备的结合垫膜504-1，504-2，504-3，如图11所示。固相膜采用实施例4中所采用的方法。对应位置的检测线试剂603喷涂分别与胶体金标记抗体配对的糖原磷酸化酶BB型同工酶(GPBB)、心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)和血栓前体蛋白(TpP)单克隆抗体，质控线试剂604则是喷涂羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体。检测线试剂和质控线试剂在对应膜上施加完成后，再将结合垫膜转印到固相膜所在的免疫层析检测试纸衬板602上，并固定吸水垫膜606和样品垫膜607。之后将结合垫膜504-1、504-2、504-3与固相膜601、吸水垫膜606、样品垫膜607所组成的免疫层析检测试纸组合分切，形成如图12所示的结构。在样品垫607处加入待测样品后，各自独立的结合垫膜上的金标抗体从上面解离，转移到固相膜上向前移动，互不干扰地分别与对应的检测线试剂和质控线试剂接触。样品中有对应抗原物质，则检测线试剂和质控线试剂都会显色；否则只有质控线试剂显色；如果检测失败，则都不显色。

由于各个检测指标的对应试剂在免疫层析检测试纸上的分布是相互独立的，在空间上互相隔绝，检测过程与单独免疫层析检测试纸的过程和机制相同，在条件合适的情况下，其灵敏度和特异性与单个免疫层析检测试纸无异。但制备过程是集成化进行，使用过程加样和观察可在同一免疫层析检测试纸上同时进行，使得制备高效低耗，使用方便快捷。

本领域技术人员应当注意，以上的所述乃是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，作为基材101和201的材料可采用其它耐热、表面平整、特性均一的材料；应用丝网印刷方法制备固相膜及结合垫膜可单独使用，分别与其它方法搭配，而不是必须同时使用；固相膜制备材料配比与制备条件只是众多适宜条件之一，作为举例说明之用，而非限定性条件。采用大面积涂布的商品固相膜成品时，印刷油墨或模切与喷涂检测线试剂及质控线试剂的顺序可根据实际调整，不会对制造结果造成影响。若依本发明的构想所作的改变，其所产生的功能作用仍未超出说明书所涵盖的精神时，仍应属本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种多参数免疫层析检测试纸，它包括免疫层析检测试纸衬板，其特征是在免疫层析检测试纸衬板上固定设有相互分隔分离的若干固相膜和对应的结合垫膜，在免疫层析检测试纸衬板上还固定设有样品垫膜和吸水垫膜，在相互分隔分离的固相膜上涂有检测线试剂和质控线试剂；在结合垫膜上设有所需检测指标所对应的胶体颗粒试剂。

2.根据权利要求1所述的一种多参数免疫层析检测试纸，其特征是所述的胶体颗粒试剂是包被有抗原或抗体的纳米尺度物质颗粒，包括彩色胶乳、胶体金、胶体硒、纳米铁、纳米镍、纳米钴、纳米氧化铁及上述物质的复合材料。

3.一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是首先在免疫层析检测试纸衬板上固定相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，获得胶体金免疫层析检测试纸所需要的两种基本结构薄膜，在固相膜固定到免疫层析检测试纸衬板之前或之后根据检测指标的要求，在固相膜上分别喷涂检测线试剂和含第二抗体的质控线试剂；在结合垫膜固定到免疫层析检测试纸衬板之前根据检测指标的要求，喷涂不同的胶体颗粒试剂；再将商品化的样品垫膜成品和吸水垫膜成品分切后固定在免疫层析检测试纸衬板上。

4.根据权利要求3所述的一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，所述的在免疫层析检测试纸衬板上固定相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，是首先选择一种基材，在基材表面按一定图形分别印刷制备相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，再顺次转印到免疫层析检测试纸衬板上，获得胶体金免疫层析检测试纸所需要的两种基本结构薄膜，采用印刷及转印方法制备的固相膜，在固相膜固定到免疫层析检测试纸衬板之后根据检测指标的要求，分别喷涂检测线试剂和含第二抗体的质控线试剂；在结合垫膜转印或固定到免疫层析检测试纸衬板之前根据检测指标的要求，喷涂不同的胶体颗粒试剂；将固相膜和结合垫膜转印到免疫层析检测试纸衬板上后，再将商品化的样品垫膜成品和吸水垫膜成品分切后固定在免疫层析检测试纸衬板上。

5.根据权利要求4所述的一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是所述的基材是耐高温、耐溶剂的塑料薄膜或上述塑料薄膜表面修饰金属氧化物的复合材料或金属带。

6.根据权利要求3所述的一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是所述的在免疫层析检测试纸衬板上固定相互分隔分离的固相膜和结合垫膜，是首先在大面积涂布的商品固相膜成品表面印刷油墨破坏相应位置的膜结构或膜材料，或/和采用模切技术将大面积涂布的商品固相膜成品分隔出纵向和横向流体互不连通的区域，实现连续固相膜的分隔分离；所述的相互分隔分离的结合垫膜是采用连续的纤维纺织品或无纺布通过印刷油墨或光刻胶曝光显影的方式，结合模切技术，分隔出纵向和横向流体互不连通的区域；再将相互分隔分离的固相膜与结合垫膜分别固定到免疫层析检测试纸衬板上，获得胶体金免疫层析检测试纸所需要的两种基本结构薄膜；采用商品固相膜成品再采用油墨印刷处理或/和模切加工制备的固相膜，是在固定到免疫层析检测试纸衬板之前或之后根据检测指标的要求，分别喷涂检测线试剂和质控线试剂。

7.根据权利要求6所述的一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是所述的连续的纤维纺织品或无纺布所用的纤维为有机高分子聚合物或无机材料的纤维或有机高分子聚合物和无机材料的纤维的混合或混纺，所述的有机高分子聚合物纤维为纤维素纤维或蛋白质纤维或碳纤维或涤纶纤维或尼龙纤维或维伦纤维或它们中任何几种的混合纤维，所述的无机材料纤维为玻璃纤维或硅灰石纤维或莫来石纤维或硅酸铝纤维或它们中任何几种的混合纤维；所述的模切技术包括机械模切、激光切割技术或者超声剥离技术；所述的印刷方式可以是丝网印刷方式，或柔版印刷方式，或凸版印刷方式，或凹版印刷方式；采用自动或半自动印刷机。

8.根据权利要求6所述的一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是所述的印刷油墨为UV油墨、挥发固化油墨、热固化油墨。

9.根据权利要求3或4或5或6或7或8所述的一种多参数免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是所述固相膜的材料是能负载抗原、抗体，提供免疫反应空间，并可以实现层析现象的薄膜材料，所述薄膜材料是有机高分子聚合物材料或无机材料或上述材料的混合物；所述的固相膜材料是包括硝酸纤维素或醋酸纤维素或尼龙或聚四氟乙烯或金属氧化物二氧化硅或氧化铝或二氧化钛或氧化锌或氧化钨或氧化铁颗粒或上述材料的混合物；所述结合垫膜材料是无机材料或有机高分子聚合物材料或上述材料的混合物，包括玻璃纤维或硅灰石或硅酸铝纤维或尼龙纤维或聚酯纤维。

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