一种增强试纸检测信号的方法
技术领域
本发明属于生物试纸检测技术领域,具体涉及一种增强试纸检测信号的方法。
背景技术
目前,基于试纸开发出来的生化分析装置主要有以下四种,即浸染型试纸(如pH试纸),侧向流试纸(如早孕试纸),纵向流试纸(1.OhYK,Joung H-A,Kim S,Kim M-G.Vertical flow immunoassay(VFA)biosensor for a rapid one-step immunoassay.Lab on a Chip2013;13(5):768-72)以及微流体试纸(2.Vella SJ,Beattie P,Cademartiri R,Laromaine A,Martinez AW,Phillips ST,Mirica KA,Whitesides GM.Measuring markers of liver function using a micropatterned paper devicedesigned for blood from a fingerstick.Analytical Chemistry2012;84(6):2883-91)。虽然这四种试纸利用的材料,组装的结构以及使用的方法不尽相同,但其基本工作原理一样,即将化学信号转变为光学或电学等易于检测的信号,通过检测这些信号,从而实现对目标物定性或定量检测。而与其他信号相比,光学信号基于检测的显色反应更简单、方便,也更为成熟,因而应用最为广泛。
目前将化学信号转变光学信号有两种方法,即直接法和间接法。所谓直接法,其原理在于检测分子可以和目标物相互作用并引起颜色变化,这种方法主要用于浸染型试纸和微流体试纸。而间接法在于检测分子可以和目标物相互作用但不引起颜色变化时,引入显色颗粒作为反应指示剂,此种方法主要用于侧向流试纸和纵向流试纸。对于间接法而言,其检测灵敏度除了受目标物本身性质影响,在很大程度上取决于显色颗粒的制备和应用。
目前主要有两种方法提高试纸间接法检测的灵敏度,一种方法利用两步反应,即在显色颗粒指示反应的基础上再进行酶催化或银染等二次反应,以进一步增强信号;另一种方法在于改进显色颗粒的指示能力,即利用颗粒聚合物代替传统单一颗粒作为反应指示剂。前者增加了试纸检测的复杂性,而后者虽然保留了试纸检测的简单性,但对颗粒聚合的制备要求较高,因此其应用受限。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种增强试纸检测信号的方法,简单而通用。
为达到上述目的,本发明采用了以下技术方案:
一种增强试纸检测信号的方法,包括以下步骤:
1)制备空白侧向流试纸条,先将结合垫、层析膜以及吸收垫按顺序粘贴于支持垫上,其中层析膜在中间,结合垫和吸收垫在两端,结合垫、吸收垫均与层析膜重合1~5mm,然后将其裁剪成2~8mm宽的试纸条,
所述结合垫用以承载显色颗粒,材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜;所述层析膜用以固定检测分子和对照分子,材料为尼龙膜、聚酯膜、PVDF膜、醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜;所述吸收垫用以吸收反应液,给试纸溶液流动提供驱动力,材料为纤维素、棉仔绒或棉纤维;所述支持垫用作支持物,给试纸提供力学强度,材料为聚氯乙烯或聚苯乙烯;
2)选择或制备指示颗粒和增强颗粒,指示颗粒的粒度为10N nm,用于指示试纸检测信号,能够天然显色或化学发光,具体包括金、硒、四氧化三铁或稀土纳米颗粒;增强颗粒的粒度为10M nm,用于增强试纸检测信号,具体为金、硒、四氧化三铁和稀土纳米颗粒中任一种,其中1≤N≤M≤10;
3)确定捕获分子、检测分子、对照分子、第一增强分子和第二增强分子,捕获分子不仅能和目标物特异性结合,而且能和指示颗粒结合;检测分子能和目标物特异性结合,对照分子能和捕获分子特异性反应结合,检测分子和对照分子都能和层析膜结合;第一、第二增强分子能相互特异性结合,此外第一增强分子能和指示颗粒结合,第二增强分子能和增强颗粒结合;
4)以含1%~10%(v/v)甲醇、乙醇或异丙醇的水、TAE缓冲液、TBE缓冲液或PBS缓冲液为溶剂,PBS缓冲液为10~100mM,pH=7.4,将检测分子和对照分子分别配置成检测溶液和对照溶液,浓度为1μM~1mM,各取两种溶液0.2~0.8μL加在试纸层析膜上,构成相应的检测区和对照区,两个区域距离间隔为1mm~1cm,将层析膜晾干;
5)将捕获分子和第一增强分子按摩尔比10N:(1~10)混合,将混合分子和10N nm的指示颗粒按摩尔比(30~60)N2:1混合形成第一颗粒缀合物,将第二增强分子与10M nm的增强颗粒按(30~60)M2:1混合形成第二颗粒缀合物,将第一颗粒缀合物和第二颗粒缀合物按摩尔比(1~10)M:N混合,制得颗粒聚合物;将制得的颗粒聚合物加在试纸结合垫上作为显色颗粒,将结合垫晾干;
6)取干燥后的试纸条,将其结合垫一端浸润于待测样品中,保持溶液不与颗粒聚合物接触,待吸收垫部分润湿后,取出试纸,观察检测区和对照线区,检测区和对照区均显色,表明结果为阳性;检测区未显色,对照区显色,表明结果为阴性;对照区未显色,结果不可靠,需重复检测。
本发明通过增加指示颗粒聚集度从而增强试纸检测信号。与传统试纸检测方法相比,其最大的改进之处在于通过引入第二颗粒缀合物,将多个第一颗粒缀合物连接在一起,因此增加了显色颗粒数。其具体方法是在传统检测试纸的基础上,引入一对特异性结合的增强分子,从而制得颗粒聚合物。该方法简单、方便,应用广泛,可用于核酸、蛋白质以及细胞检测。
附图说明
图1为本发明实施例1核酸检测结果对比:其中:图1(A)为增强核酸试纸检测结果;图1(B)为传统核酸检测试纸结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:核酸检测
一种增强试纸检测信号的方法,包括以下步骤:
1)制备空白侧向流试纸条,先将结合垫、层析膜以及吸收垫按顺序粘贴于支持垫上;其中层析膜在中间,结合垫和吸收垫在两端,结合垫、吸收垫均与层析膜重合2mm,然后将其裁剪成2.5mm宽的试纸条。所述结合垫用以承载显色颗粒,材料为玻璃纤维膜;所述层析膜用以固定检测分子和对照分子,材料为硝酸纤维素膜;所述吸收垫用以吸收反应液,给试纸溶液流动提供驱动力,材料为纤维素;所述支持垫用作支持物,给试纸提供一定的力学强度,材料为聚氯乙烯;
2)选择指示颗粒和增强颗粒均为10nm的纳米金颗粒,由柠檬酸钠还原法制得;指示颗粒用于指示试纸检测信号,增强颗粒用于增强试纸检测信号;
3)确定捕获分子、检测分子、对照分子、第一增强分子和第二增强分子,目标物、捕获分子、检测分子、对照分子、第一增强分子和第二增强分子如表1所示。捕获分子能和目标物5’端核酸杂交,其3’端连接的烷巯基SH-(CH2)6-能金纳米颗粒结合;检测分子能和目标物3’端能核酸杂交,对照分子能和捕获分子能核酸杂交,在紫外光照射下,检测分子和对照分子能和层析膜结合;第一、第二增强分子能相互杂交,而且第一、第二增强分子5’端连接的烷巯基SH-(CH2)3-能和金纳米颗粒结合;
表1核酸序列
4)以含10%(v/v)乙醇PBS缓冲液(10mM,pH=7.4)为溶剂,将检测分子和对照分子分别配置成检测溶液和对照溶液,浓度为100μM,各取两种溶液0.5μL加在试纸层析膜上,并在紫外光下照射3h,构成相应的检测区和对照区,两个区域距离间隔为2mm,将层析膜晾干;
5)将捕获分子和第一增强分子按摩尔比1:1混合,将混合分子和指示颗粒按摩尔比40:1混合形成第一颗粒缀合物,将第二增强分子与增强颗粒按摩尔比40:1混合形成第二颗粒缀合物,将第一颗粒缀合物和第二颗粒缀合物按摩尔比6:1混合,制得颗粒聚合物;将制得的颗粒聚合物加在试纸结合垫上作为显色颗粒,将结合垫晾干;
6)取干燥后的将试纸,将其结合垫一端浸润于80μL不同浓度的目标物溶液中,保持溶液不与颗粒聚合物接触,待吸收垫部分润湿后,取出试纸,观察检测区和对照线区,检测结果如图1A所示。以相同的金纳米颗粒和捕获分子制得的纳米金缀合物作为对照,传统试纸检测结果如图1B所示,检测限为0.25nM,增强试纸的检测限为0.1nM,较之提高了2.5倍,此外增强试纸的显色强度比传统试纸有了明显提高,上述结果表明试纸检测信号得到了增强。
实施例2:核酸检测
一种增强试纸检测信号的方法,包括以下步骤:
1)制备空白侧向流试纸条,先将结合垫、层析膜以及吸收垫按顺序粘贴于支持垫上;其中层析膜在中间,结合垫和吸收垫在两端,结合垫、吸收垫均与层析膜重合2mm,然后将其裁剪成2.5mm宽的试纸条。所述结合垫用以承载显色颗粒,材料为玻璃纤维膜;所述层析膜用以固定检测分子和对照分子,材料为硝酸纤维素膜;所述吸收垫用以吸收反应液,给试纸溶液流动提供驱动力,材料为纤维素;所述支持垫用作支持物,给试纸提供一定的力学强度,材料为聚氯乙烯;
2)选择指示颗粒为10nm的纳米金颗粒,增强颗粒为40nm的纳米金颗粒,纳米金颗粒均由柠檬酸钠还原法制得;指示颗粒用于指示试纸检测信号,增强颗粒用于增强试纸检测信号;
3)确定捕获分子、检测分子、对照分子、第一增强分子和第二增强分子,目标物、捕获分子、检测分子、对照分子、第一增强分子和第二增强分子如表2所示。捕获分子能和目标物5’端核酸杂交,其3’端连接的烷巯基SH-(CH2)6-能金纳米颗粒结合;检测分子能和目标物3’端能核酸杂交,对照分子能和捕获分子能核酸杂交,在紫外光照射下,检测分子和对照分子能和层析膜结合;第一、第二增强分子能相互杂交,而且第一、第二增强分子5’端连接的烷巯基SH-(CH2)3-能和金纳米颗粒结合;
表2核酸序列
4)以含10%(v/v)乙醇PBS缓冲液(10mM,pH=7.4)为溶剂,将检测分子和对照分子分别配置成检测溶液和对照溶液,浓度为100μM,各取两种溶液0.5μL加在试纸层析膜上,并在紫外光下照射3h,构成相应的检测区和对照区,两个区域距离间隔为2mm,将层析膜晾干;
5)将捕获分子和第一增强分子按摩尔比1:1混合,将混合分子和指示颗粒按摩尔比40:1混合形成第一颗粒缀合物,将第二增强分子与增强颗粒按摩尔比640:1混合形成第二颗粒缀合物,将第一颗粒缀合物和第二颗粒缀合物按摩尔比16:1混合,制得颗粒聚合物;将制得的颗粒聚合物加在试纸结合垫上作为显色颗粒,将结合垫晾干;
6)取干燥后的将试纸,将其结合垫一端浸润于80μL不同浓度的目标物溶液中,保持溶液不与颗粒聚合物接触,待吸收垫部分润湿后,取出试纸,观察检测区和对照线区。其检测结果和实施例1类似,与传统检测试纸相比,增强试纸的显色强度和检测限均有了明显提高。