CN105482988B - 一种纸基全自动核酸提取装置及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纸基全自动核酸提取装置及制备方法，包括3D打印技术打印的光固化树脂上盖和基座：上盖包括控制按钮、进样孔、取样孔和时间指示孔；基座包括储液模块和纸基通道模块：储液池用储液海绵和密封橡胶填充，每个储液池与纸通道相连处开有出液孔；纸基通道模块包括核酸提取模块和时间指示模块：核酸提取模块包括裂解液通道和清洗液通道，裂解液通道上有进样区、核酸吸附区和吸水；时间指示模块包括时间通道和时间指示区；最后，将上盖扣压在基座上就将装置组装完成。本发明所述的纸基全自动核酸提取装置无需外接设备和专业技术人员，具有成本低廉、操作简单、快速、易于携带等优点，适用于分子诊断领域，尤其是在资源匮乏的偏远地区。

Description

一种纸基全自动核酸提取装置及制备方法

【技术领域】

本发明涉及一种纸基全自动核酸提取装置及制备方法。

【背景技术】

核酸是生命的最基本物质之一，是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是医学分子诊断研究的主要对象。因此核酸提取是医学分子诊断中最重要、最基本的操作。

传统的核酸提取需在实验室使用试剂盒、冰箱、离心机，并且需要在专业技术人员的操作下才能完成，整个过程存在操作复杂、耗时、成本昂贵等缺陷。这些方法并不适用于资源匮乏地区，严重延误了贫困地区人们的疾病诊断与治疗。随着纸基微流体技术的发展，低成本、小型化、便捷化的纸基装置日渐受人们的重视。纸张资源丰富、可再生、生物相容性好，具有天然的微孔结构，可通过毛细力自动泵送液体，易于实现液体流动控制及检测时间控制，因此适合作为简单、廉价的核酸提取平台。目前市面上存在的纸基核酸提取方法，如：Whatman公司发明的纸上提取核酸的方法(如：FTA卡等)。它们仍然存在多步操作、耗时、无液体存储等缺陷，不能实现快速、简单、便携的核酸提取。仍然不适用于资源匮乏地区进行疾病诊断。

【发明内容】

本发明的目的在于解决现有纸基核酸提取装置所存在的缺陷，提供一种成本低廉、携带方便，操作简单、快速的纸基全自动核酸提取装置及制备方法，该装置提取时间短，效率高，适用范围广。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种纸基全自动核酸提取装置，包括上下扣合的上盖和基座，基座的一侧设置储液仓，储液仓内设置储液模块，另一侧为纸基通道模块；纸基通道模块包括清洗液通道、裂解液通道和纸基时间通道；储液模块包括分别与清洗液通道、裂解液通道和纸基时间通道相连通的裂解液储液池、清洗液储液池和纸基时间通道液体储液池；裂解液通道上设置有进样区和核酸吸附区，末端设置吸水垫；纸基时间通道的末端设置时间指示区；上盖一侧安装有控制按钮，用于将储液模块中的液体挤出至纸基通道模块；另一侧开设分别与进样区、核酸吸附区以及时间指示区相对应的进样孔、取样孔以及时间指示孔。

本发明进一步的改进在于：

所述裂解液储液池、清洗液储液池和纸基时间通道液体储液池均为圆柱形，储液仓的顶部分别开设与三个储液池相连通的储液池孔，控制按钮与三个储液池孔对准。

所述裂解液储液池、清洗液储液池和纸基时间通道液体储液池内均设置有储液海绵，储液海绵上分别设置有与各储液池壁紧密接触的密封橡胶；裂解液储液池、清洗液储液池和纸基时间通道液体储液池的底部侧壁上分别开设有与清洗液通道、裂解液通道和纸基时间通道相连通的出液孔。

所述清洗液通道为L型，且长边与裂解液通道平行，短边与裂解液通道相接触；清洗液通道的末端折叠3～5次，形成纸基控制阀，在清洗液通道没有液体时，将清洗液通道与裂解液通道断开；当清洗液通道中有液体流动时，纸基控制阀能够展开与裂解液通道相接触。

所述裂解液通道、清洗液通道和纸基时间通道均为滤纸，吸水垫为吸水纸；裂解液通道的尺寸为25mm×5mm；清洗液通道的尺寸为10mm×5mm，纸基时间通道的尺寸为30mm×5mm，吸水纸的尺寸为25mm×20mm；时间指示区包括底层尺寸为10mm×10mm的遇水变红的纸和上层为开有直径为3mm～6mm圆孔的疏水纸，圆孔与上盖上的时间指示孔的位置相对应，且直径相同。

所述进样区采用直径为5mm～8mm的滤纸；核酸吸附区采用直径为4mm～8mm的玻璃纤维。

所述进样区位于裂解液通道前端10mm处，核酸吸附区位于进样区与吸水垫之间，且距离进样区0～10mm。

所述上盖和基座均为3D打印制成的一体式结构。

一种纸基全自动核酸提取装置的制备方法，包括以下步骤：

1)利用3D打印机分别打印上盖和基座；

2)用激光切割机制备相应尺寸的海绵和橡胶密封垫；

3)将储液海绵分别浸泡于相对应的液体中使海绵充满液体；

4)根据纸基模块的尺寸，用激光切割机制备相应尺寸的纸基通道，用打孔器制备进样区滤纸片和核酸吸附区玻璃纤维片；

5)将储液海绵与橡胶密封垫按先后顺序放入储液池；

6)将纸基通道模块中的每个部件分别粘贴于基座的相应位置；

7)将上盖和基座组装形成全自动核酸提取装置。

一种纸基全自动核酸提取方法，包括以下步骤：

1)将样品由进样孔处滴加至进样区；

2)按下上盖的控制按钮，并观察时间指示区，若圆孔完全变红，则提取完成；

3)用镊子夹出核酸吸附区的玻璃纤维，放入PCR管中，进行后序的PCR验证。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明纸基全自动核酸提取装置，具有无需额外仪器、成本低廉、携带方便、操作简单、快速等优点。利用计算机软件设计装置构型，并与海绵结合解决了储液问题，无需低温冰箱；装置中上盖的控制按钮与橡胶密封圈靠手指的压力对海绵进行挤压让液体流出，同时，与纸基通道模块结合，液体靠毛细作用力往前流动，无需外接泵，解决了便携问题；在清洗液通道上设计了纸基阀门，解决了多步操作问题；采用玻璃纤维吸附核酸，并用玻璃纤维直接进行后续试验，无需洗脱，简单方便。整个提取过程仅需2min，操作也仅需3步(加样－打开开关－取结果)，不需要使用大型的仪器和专业的技术人员就可以完成。因此，此装置实现了核酸的全自动提取。

【附图说明】

图1为本发明上盖的结构示意图；

图2为本发明基座的结构示意图；

图3为本发明储液模块和纸基通道模块的结构示意图；

图4为本发明的整体结构示意图；

图5为本发明PCR验证的结果图，其中(a)为全血的验证结果图，(b)为血浆的验证结果图，(c)为细胞的验证结果图，(d)为唾液的验证结果图，(e)为痰液的验证结果图，(f)为细菌的验证结果图。

其中，1-控制按钮；2-进样孔；3-取样孔；4-时间指示孔；5-清洗液储液池；6-裂解液储液池；7-纸基时间通道液体储液池；8-出液孔；9-密封橡胶；10-储液海绵；11-裂解液通道；12-清洗液通道；13-进样区；14-核酸吸附区；15-吸水垫；16-纸基时间通道；17-时间指示区。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1至图4，本发明纸基全自动核酸提取装置，包括3D打印的上盖、基座和基座上的集成模块。上盖包括控制按钮1、进样孔2、取样孔3和时间指示孔4，上盖是扣压在基座上，控制按钮1被固定在上盖上；基座上的集成模块包括储液模块和纸基通道模块；其中每个储液池与纸通道相连的位置开有出液孔8，每个储液池内均填充有储液海绵10和密封橡胶9；纸基通道模块包括核酸提取模块和时间指示模块：其中核酸提取模块包括裂解液通道11和清洗液通道12，其中裂解液通道11上有进样区13和核酸吸附区14和吸水垫15。时间指示模块包括纸基时间通道16和时间指示区17。

储液模块包括1个直径为12mm、用于存储裂解液的裂解液储液池6，和2个直径为9mm、分别用于储存清洗液和5％PEG溶液的清洗液储液池5和纸基时间通道液体储液池7；每个储液池中，储液海绵填充于储液池底部，密封橡胶垫叠加在储液海绵上并与储液池紧密接触起到密封作用，同时，当上盖中的控制按钮1压下时，密封橡胶会一同压下，储液海绵中的液体从储液池底部开设的直径为5mm×2mm出液口8挤出，流到对应的纸基通道上。

纸基通道模块，其通道材质选用普通的滤纸；其中，裂解液通道11的尺寸位25mm×5mm，清洗液通道的尺寸为10mm×5mm，纸基时间通道的尺寸为30mm×5mm，吸水垫的尺寸为25mm×20mm。裂解液通道在距储液池端口10mm处设置进样区，相隔进样区5mm处设置核酸吸附区，紧接着是吸水区。进样区与上盖的进样孔相对应。使用直径为5mm～8mm的普通滤纸，滤纸直径根据样品体积而定。核酸吸附区，与上盖的取样孔相对应。使用直径为4mm～8mm的玻璃纤维纸。

纸基清洗液通道呈L型，与裂解液通道相连的一端设置有纸基控制阀，纸基控制阀采用将纸折叠3-5次的方式制备而成。当没有液体时，纸基控制阀将清洗液通道与裂解液通道断开，起到防止液体倒着从裂解液通道流到清洗液通道的作用；当有液体流动时，纸基控制阀会随着液体展开而使液体呈单向流动，起到清洗液从清洗液通道流到裂解液通道实现多步操作的作用。

时间指示区与上盖的时间指示区相对应。其底层使用直径为10mm×10mm的遇水变红的纸上层覆盖有直径为3mm～6mm的疏水纸，当直径为3mm～6mm孔内的纸全部变红后，即指示核酸提取完成。

本发明还提供了一种纸基全自动核酸提取装置的制备方法，包括以下步骤：

1)利用计算机软件设计上盖和基座结构，根据设计的上盖和基座结构，用3D打印机进行打印。

2)根据储液池所规定的直径，用激光切割机制备相应尺寸的海绵和橡胶密封垫。

3)将储液海绵分别浸泡于相对应的液体中使海绵充满液体。

4)根据纸基模块的尺寸，用激光切割机制备相应尺寸的纸基通道，用打孔器制备进样区滤纸片和核酸吸附区玻璃纤维片。

5)将储液海绵与橡胶密封垫按先后顺序放入储液池。

6)将纸基通道模块中的每个部件分别粘贴于基座的相应位置。

7)将上盖和基座组装形成全自动核酸提取装置。

采用本发明的装置对核酸进行提取，具体方法包括以下步骤：

1)将样品在进样孔处滴加进去。

2)按下上盖的控制按钮，观察时间指示区，如若圆孔完全变红，则提取完成。

3)用镊子夹出核酸吸附区的玻璃纤维，放入PCR管中，进行后序的PCR验证。

为了验证此装置的可行性，采用全血、血浆、细胞、唾液、痰液、细菌几类样品进行DNA的提取，用特异性引物进行PCR，跑3％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示每种样本(1，2，3)均有特异性条带扩增，其中PC为阳性对照，NC为阴性对照，其结果见图5(特异性条带用“---”标出)。

综上所述，本发明纸基全自动核酸提取装置，能够使整个提取过程快速(1～2min)、简单(全自动)。与现有提取方法相比，此装置解决了储液问题，减少了多步操作，整个提取过程从加样到提取完成仅需要2min，实现了全自动提取，不需要使用大型的仪器和专业的技术人员就可以完成。本发明在未来可与简单的纸基核酸扩增、核酸检测结合，将核酸提取、核酸扩增和核酸检测的功能集成在纸基上，使核酸检测系统一体化，以实现现场快速检测。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种纸基全自动核酸提取装置，其特征在于，包括上下扣合的上盖和基座，基座的一侧设置储液仓，储液仓内设置储液模块，另一侧为纸基通道模块；纸基通道模块包括清洗液通道(12)、裂解液通道(11)和纸基时间通道(16)；储液模块包括分别与清洗液通道(12)、裂解液通道(11)和纸基时间通道(16)相连通的裂解液储液池(6)、清洗液储液池(5)和纸基时间通道液体储液池(7)；裂解液通道(11)上设置有进样区(13)和核酸吸附区(14)，末端设置吸水垫(15)；纸基时间通道(16)的末端设置时间指示区(17)；上盖一侧安装有控制按钮(1)，用于将储液模块中的液体挤出至纸基通道模块；另一侧开设分别与进样区(13)、核酸吸附区(14)以及时间指示区(17)相对应的进样孔(2)、取样孔(3)以及时间指示孔(4)；

所述裂解液储液池(6)、清洗液储液池(5)和纸基时间通道液体储液池(7)内均设置有储液海绵(10)，储液海绵(10)上分别设置有与各储液池壁紧密接触的密封橡胶(9)；裂解液储液池(6)、清洗液储液池(5)和纸基时间通道液体储液池(7)的底部侧壁上分别开设有与清洗液通道(12)、裂解液通道(11)和纸基时间通道(16)相连通的出液孔(8)；

所述清洗液通道(12)为L型，且长边与裂解液通道(11)平行，短边与裂解液通道(11)相接触；清洗液通道(12)的末端折叠3～5次，形成纸基控制阀，在清洗液通道(12)没有液体时，将清洗液通道与裂解液通道(11)断开；当清洗液通道(12)中有液体流动时，纸基控制阀能够展开与裂解液通道(11)相接触；

所述裂解液通道(11)、清洗液通道(12)和纸基时间通道(16)均为滤纸，吸水垫(15)为吸水纸；裂解液通道(11)的尺寸为25mm×5mm；清洗液通道(12)的尺寸为10mm×5mm，纸基时间通道(16)的尺寸为30mm×5mm，吸水纸的尺寸为25mm×20mm；时间指示区(17)包括底层尺寸为10mm×10mm的遇水变红的纸和上层为开有直径为3mm～6mm圆孔的疏水纸，圆孔与上盖上的时间指示孔(4)的位置相对应，且直径相同。

2.根据权利要求1所述的纸基全自动核酸提取装置，其特征在于，所述裂解液储液池(6)、清洗液储液池(5)和纸基时间通道液体储液池(7)均为圆柱形，储液仓的顶部分别开设与三个储液池相连通的储液池孔，控制按钮与三个储液池孔对准。

3.根据权利要求1所述的纸基全自动核酸提取装置，其特征在于，所述进样区(13)采用直径为5mm～8mm的滤纸；核酸吸附区(14)采用直径为4mm～8mm的玻璃纤维。

4.根据权利要求3所述的纸基全自动核酸提取装置，其特征在于，所述进样区(13)位于裂解液通道(11)前端10mm处，核酸吸附区(14)位于进样区(13)与吸水垫(15)之间，且距离进样区(13)0～10mm。

5.根据权利要求1所述的纸基全自动核酸提取装置，其特征在于，所述上盖和基座均为3D打印制成的一体式结构。

6.一种权利要求1所述纸基全自动核酸提取装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用3D打印机分别打印上盖和基座；

2)用激光切割机制备相应尺寸的海绵和橡胶密封垫；

3)将储液海绵分别浸泡于相对应的液体中使海绵充满液体；

4)根据纸基模块的尺寸，用激光切割机制备相应尺寸的纸基通道，用打孔器制备进样区滤纸片和核酸吸附区玻璃纤维片；

5)将储液海绵与橡胶密封垫按先后顺序放入储液池；

6)将纸基通道模块中的每个部件分别粘贴于基座的相应位置；

7)将上盖和基座组装形成全自动核酸提取装置。

7.一种采用权利要求1所述装置的纸基全自动核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将样品由进样孔处滴加至进样区；

2)按下上盖的控制按钮，并观察时间指示区，若圆孔完全变红，则提取完成；

3)用镊子夹出核酸吸附区的玻璃纤维，放入PCR管中，进行后序的PCR验证。