CN1415759A - 纳米微粒与亲和素标记探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种纳米微粒与亲和素标记探针及其制备方法和应用。该探针由纳米或胶体微粒与亲和素、链霉亲和素或抗生物素构成。本发明的基因探针的制备方法包括(1)胶体金或纳米粒子的制备和(2)复合物的制备。本发明的探针可用于DNA的突变及非突变检测，检测时加入银增强剂或金增强剂来增强检测信号。本发明的方法灵敏度高、特异性好，简便、快速、廉价，可进行高通量、低成本的筛选，用于单基因检测或多基因集成检测，如多种传染性微生物病原体的临床检测、癌症早期诊断、遗传病产前诊断与在体外常规体检，基因表达调控研究，特征基因表达谱检测，基因文库筛选等，尤其适用于低集成度基因芯片检测，有很好的临床使用价值。

Description

纳米微粒与亲和素标记探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基因检测技术，更具体地说，涉及纳米或胶体微粒与亲和素复合物标记探针及其制备方法，以及该探针联合银增强/金增强的检测DNA的方法。

背景技术

基因研究带动了20世纪整个生命科学的迅速发展；在21世纪，基因研究仍将推动生命科学研究向纵深发展，基因检测不仅对生物学研究至关重要，而且对临床医学、药学、农业技术、环境监控、法学鉴定等领域也具有极其重要的意义。

基因检测一般采用直接测序或杂交检测。杂交检测有放射法、酶标法、化学发光标记法等。放射法灵敏度高，但因其对环境有污染，正逐渐被非放射法所取代。酶标法由于反应过程复杂，酶催化底物反应过快，显色区域不集中，限制了它的使用，特别是不适合生物芯片领域的应用。荧光检测存在着过程复杂、检测仪器昂贵、操作人员需经培训，从而难于推广和应用等缺点。

化学发光标记法、普通银染法及一些其它的标记方法则由于灵敏度较低而使其应用受到很大限制。迄今，比较成熟的基因芯片检测方法是激光扫描共聚焦显微镜法，但其程序复杂，检测设备昂贵，难于推广和应用。

中国专利CN1339609A公开了一种纳米微粒标记的基因探针及其在基因检测中的应用，该技术由于制备获得的钠米颗粒不稳定，易聚集等原因，存在着制作成本高、稳定性差以及使用不便的缺陷。

目前，某些生物分子与其他分子间特定的结合能力已被医药、生物技术人员广泛应用于不同的诊断和筛选芯片。当一种生物分子具有与另一种生物分子的特异性结合力时，这两个分子就能形成有效的配体-受体连接，如发生于亲和素与小分子生物素间的非共价结合。这种生物素和亲和素之间的作用被广泛的用于DNA、RNA和蛋白的定量和纯化。这些技术被应用于细胞、组织中抗原的定位、免疫检测、DNA杂交技术。但是，由于纳米颗粒与DNA间的连接问题及其保存问题还没有根本解决，因此其推广使用还存在实际的困难。如CN1339609A专利所公开的技术。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是之一是提供一种纳米微粒与亲和素标记探针，避开了现有技术存在的纳米颗粒与DNA间的连接问题；

本发明需要解决的技术问题之二是公开上述探针的制备方法；

本发明需要解决的技术问题之三是公开上述探针在基因检测中的应用，以克服现有的检测技术存在的问题和不足。

本发明的技术构思是这样的：

链霉亲和素是一种四聚体蛋白，其每个单体通过亲水键和范德华力与一个生物素结合后两者间形成的链稳定且难断裂。因此，利用生物素和链霉亲和素间的亲和力，用一个生物素标记的探针与样品反应，再利用标记好的抗生物素蛋白或链霉亲和素的检测探针反应，

本发明将表面合成化学、生物化学及生物化学技术有机结合起来制备亲和素/链霉亲和素/抗生物素-纳米/胶体微粒复合物，利用生物素和亲和素间的形成的较稳定的键，以解决纳米颗粒与DNA间的连接问题。提供银粒子/金粒子着色进行微量DNA检测与信号放大的最新工艺，解决目视法检测的关键问题。根据T.Andrew Taton等在Scanmetric DNAArray Detection with nanoparticle Probes(science，289，2000)中提到采用纳米微粒-探针复合物时，DNA的特异性结合率与单碱基错配率的比值在一个较窄温度范围内发生巨大变化。因此，可利用DNA-生物素-亲和素/链霉亲和素/抗生物素-纳米/胶体微粒复合物特有的物理性质用于突变体的检测。

本发明的技术方案：

本发明的纳米微粒与亲和素标记探针为一种复合物，由纳米或胶体微粒与亲和素、链霉亲和素或抗生物素构成，亲和素、链霉亲和素或抗生物素通过CNHO基团与纳米或胶体微粒相接合。

所述及的纳米或胶体微粒的化学组分包括金、银、铁等，其粒径为5-160nm。

本发明的基因探针的制备方法包括如下步骤：

(1)胶体金或纳米粒子的制备：胶体金或纳米粒子的制备可采用常规的氯金酸溶液煮沸还原法，通过添加还原剂和搅拌速度来控制粒径，也可采取其他方法来制备。如可采用CNI1339609A专利所披露的方法，该技术为常规的技术，本发明不再赘述。

(2)复合物的制备：复合物的自组装与封闭只有严格控制反应条件，才能使亲和素/链霉亲和素/抗生物素牢牢地结合到纳米金或纳米粒子上，并使用牛血清白蛋白分闭多余的活性位点。

用K₂CO₃(碳酸钾)或Tris碱(三羟甲基氨基甲烷碱)调节胶体金或纳米粒子溶液的pH至选定值6-8，离心去除沉淀物，将亲和素、链霉亲和素或抗生物素加入到胶体金或纳米粒子溶液中，亲和素/链霉亲和素/抗生物素与胶体金或纳米粒子的重量比为：

亲和素/链霉亲和素/抗生物素∶胶体金或纳米粒子＝1∶1～1∶3；

室温放置10-40分钟后加入牛血清白蛋白分闭多余的活性位点，再室温放置2～6小时后，16000～25000/分钟转离心20～60分钟，取上清，加入含PBS(磷酸缓冲液)和稳定剂如甘油的溶液重悬，可重复数次，以除去不稳定的纳米金/胶体金、游离的蛋白质等杂质，将其加入浓度为0.1～0.2M的氯化钠，20～60mM磷酸缓冲液，0.1～0.5wt％的BSA(牛血清白蛋白)，0.05～0.15wt％的叠氮钠的溶液体系中，该体系的pH值为6～8，即获得本发明的纳米微粒与亲和素标记探针，4℃保存。

本发明的纳米微粒与亲和素标记探针可用于DNA突变及非突变的检测，检测方法包括如下步骤：

(1)含biotin(生物素)标记的寡核苷酸，与固定在固相载体上检测探针进行杂交。该步骤为常规步骤，本发明不再赘述。

(2)复合物与杂交物反应：

①对于检测T_m值相差较小的突变体，杂交后用PBS，0.1％Tween-20洗涤后加入用1×PBS(磷酸缓冲液)，0.1～0.5wt％BSA(牛血清白蛋白)溶液稀释的Avidin/streptavidin-Au的复合物，室温温浴0.5～1小时后用高严紧度的洗液(如SSC或SSPE溶液)在30～60的温度下洗脱。再用PBS洗涤后，加入银增强剂或金增强剂来增强检测信号，最后用蒸馏水多次洗涤，自然干燥。

②对于其他杂交检测，则可在杂交后直接洗脱，再与复合物温浴，PBS洗涤后，加入银增强剂或金增强剂来增强检测信号，

(3)结果判定：

凡是着色很深、呈斑点，与背景反差强者判为强阳性；着色较深，与背景反差强者判为阳性；着色较淡，与背景反差小者判为弱阳性；不着色者判为阴性。

本发明提供的检测方法有如下优点：

①灵敏度高、特异性好，简便、快速、廉价。

②可进行高通量、低成本的筛选，完全以手工完成而不用昂贵的液体操作机械手。可对突变体进行检测，只需目视判别结果，无需利用昂贵的检测设备。

③既可用于单基因检测，也可用于多基因集成检测，如多种传染性微生物病原体的临床检测、癌症早期诊断、遗传病产前诊断与在体外常规体检，基因表达调控研究，特征基因表达谱检测，基因文库筛选等，尤其适用于低集成度基因芯片检测，有很好的临床使用价值。

附图说明

图1是标记好的链霉亲和素纳米金复合物示意图。

具体实施方式

                       实施例1

纳米金(胶体金)的制备(100ml)：

将0.01％HAuClO₄(氯金酸)加热至沸。搅拌下加入4ml，1wt％的柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，继续加热煮沸15分钟，搅拌下冷却至室温，用蒸馏水恢复至原体积；

链霉亲和素-胶体金的制备：

用0.2M的K₂CO₃(碳酸钾)或1M Tris碱调节胶体金溶液的pH至6.5；

取制备好的纳米或胶体金离心，10000转/分钟，离心5分钟，去除沉淀物，将60ug的链霉亲和素加入10ml的胶体金溶液中，室温放置4小时后，再20000转/分钟离心40分钟，去上清，加入含PBS和甘油稳定剂的溶液重悬，重复3次，以除去不稳定的纳米金/胶体金、游离的蛋白质等杂质。

最后加入终浓度为0.15M NaCl，20mM磷酸缓冲液，0.1％BSA，0.05％叠氮钠的溶液体系中，4℃保存。如图1所示。

                       实施例2结核分枝杆菌对利福平抗药性检测

将固定好的固相载体置于杂交管中，加入含碱变性后的PCR扩增产物的6×SSPE/0.5％SDS杂交液45～60℃杂交2小时。将杂交后的固相载体取出，用1×PBS、吐温-20室温洗涤10分钟后置于用1×PBS/0.1％BSA溶液200倍稀释的实施例1的溶液中，室温温浴1-2小时。再将固相载体置于杂交管中，用1×SSPE洗脱液50-65℃洗脱10-20分钟。

取出固相载体用1×PBS洗涤3次，每次5分钟，加入配置好的银增强剂(现配的硝酸银和还原剂构成的混合物)，反应10分钟，最后用蒸馏水多次洗涤后自然干燥。结果判定

凡是着色很深、呈斑点，与背景反差强者判为强阳性；着色较深，与背景反差强者判为阳性；着色较淡，与背景反差小者判为弱阳性；不着色者判为阴性。

Claims (9)

1.一种纳米微粒与亲和素标记探针，其特征在于由纳米或胶体微粒与亲和素、链霉亲和素或抗生物素构成，亲和素、链霉亲和素或抗生物素通过CNHO基团与纳米或胶体微粒相接合。

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述及的纳米或胶体微粒的化学组分包括金、银或铁。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于纳米或胶体微粒的粒径为5-160nm。

4.根据权利要求1、2或3所述的探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)胶体金或纳米粒子的制备；

(2)复合物的制备：用K₂CO₃或三羟甲基氨基甲烷碱调节胶体金或纳米粒子溶液的pH至选定值6-8，离心去除沉淀物，将亲和素、链霉亲和素或抗生物素加入到胶体金或纳米粒子溶液中，亲和素/链霉亲和素/抗生物素与胶体金或纳米粒子的重量比为：

亲和素/链霉亲和素/抗生物素∶胶体金或纳米粒子＝1∶1～1∶3；

加入牛血清白蛋白分闭多余的活性位点，再室温静置2～6小时后，16000～25000/分钟转离心分离20～60分钟，取上清，加入含磷酸缓冲液和稳定剂溶液重悬，除去杂质，将其加入浓度为0.1～0.2M的氯化钠，20～60mM磷酸缓冲液，0.1～0.5wt％的牛血清白蛋白，0.05～0.15wt％的叠氮钠的溶液体系中，该体系的pH值为6～8，即获得本发明的纳米微粒与亲和素标记探针。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，室温放置10-40分钟后加入牛血清白蛋白分闭多余的活性位点。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，加入牛血清白蛋白分闭多余的活性位点，再室温静置2～6小时后，16000～25000转/分钟离心分离20～60分钟。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，加入牛血清白蛋白分闭多余的活性位点，再室温静置2～6小时后，16000～25000转/分钟离心分离20～60分钟。

8.根据权利要求1、2或3所述的探针的应用，其特征在于用于DNA突变及非突变的检测。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于检测方法包括如下步骤：

(1)含biotin(生物素)标记的寡核苷酸，与固定在固相载体上检测探针进行杂交；

(2)复合物与杂交物反应：

①对于检测T_m值相差较小的突变体，杂交后用PBS，0.1％Tween-20洗涤后加入用1×PBS(磷酸缓冲液)，0.1～0.5wt％BSA(牛血清白蛋白)溶液将Avidin/streptavidin-Au的复合物稀释至工作浓度(以纳米金上结合的streptavidin量计为0.1ng/ml-20ng/ml)，室温温浴0.5～2小时后用高严紧度的洗液在室温～60的温度下洗脱，再用PBS洗涤后，加入银增强剂或金增强剂来增强检测信号，最后用蒸馏水多次洗涤，自然干燥；

②对于其他杂交检测，则可在杂交后直接洗脱，再与复合物温浴，PBS洗涤后，加入银增强剂或金增强剂来增强检测信号；

(3)结果判定：

凡是着色很深、呈斑点，与背景反差强者判为强阳性；着色较深，与背景反差强者判为阳性；着色较淡，与背景反差小者判为弱阳性；不着色者判为阴性。

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