CN101241126A - 一种生物条形码探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物条形码探针的制备方法，包括：将纳米金溶液与等体积的吐温20缓冲液混合，离心，浓缩后加入到巯基化探针中，水浴过夜，加高浓度的NaCl溶液，水浴，离心，洗涤，稀释，得生物条形码探针，再将生物条形码探针、磁珠探针和靶序列DNA混合、杂交，磁分离器分离磁珠，去除未杂交的生物条形码探针，洗涤，加洗脱液，处理完成后，用磁分离器去除磁珠，留上清液进行荧光检测。该制备方法制备简单，所制备的生物条形码探针更加稳定，检测时间短，检测特异性大大提高。
Description
技术领域
本发明属生物检测领域，特别是涉及一种用于生物检测的探针的制备方法。
背景技术
最初，纳米金主要是用于蛋白质等高分子的标记。蛋白质与纳米金的连接是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。
纳米金与核酸的连接是最近十年发展的一种技术，不同于蛋白质的标记方法，核酸的标记主要依靠其与纳米金之间形成的共价键。纳米金标记核酸的方法主要有三种：巯基修饰的寡核苷酸与纳米金的连接，预活化的纳米颗粒与寡核苷酸的共价连接；物素修饰的寡核苷酸与包被了抗生物素蛋白的纳米金颗粒的连接。至今，巯基修饰的寡核苷酸与纳米金颗粒的连接方式是最普遍常用的标记方式。
巯基标记的共同特点是利用巯基能与纳米金表面发应生成共价连接的方式将寡核苷酸固定在金颗粒表面。现在的修饰方式大致有三种分别为：己基巯基修饰的寡核苷酸，类固醇二巯基修饰的寡核苷酸以及三巯基修饰寡核苷酸。己基巯基修饰法是最早也是常用的一种修饰方式，它用己基巯基修饰在寡核苷酸的5’端作为连接分子，再通过巯基与纳米金表明的共价键连接到纳米金颗粒的表面。但单巯基标记的寡核苷酸稳定性较差，如当Au颗粒大于30nm时，单巯基标记的寡核苷酸则会在40～90℃的温度下或高浓度的盐溶液中(0.3～1.0M NaCl)中缓慢降解。并且，不论所使用的纳米金颗粒的大小，其所在的溶液中含有二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇时，如果放置时间过长，巯基形成的共价键将被还原，纳米颗粒探针会失活。尤其当温度在40～95℃时，巯基乙醇和DTT能将寡核苷酸探针从纳米颗粒的表面置换下来。而且出现了DTT的置换过程后，纳米金颗粒会出现不可逆的聚集现象。
为了增加巯基修饰法连接的稳定性，2000年，Mirkin等开发了二巯基的修饰方式。连接分子使用的是类固醇二巯基，但在0.01mM DTT存在的情况下，溶液在40℃和95℃的两个温度的热循环中仍然不能维持长久的稳定。随后Mirkin选取了三巯基作为连接头，进行寡核苷酸的固定，进一步提高稳定性。实验数据显示，在40摄氏度时，10mM DTT，0.3mol/LNaCl的溶液中，单己基巯基修饰的寡核苷酸在2min内就出现了完全的聚集现象，而用具有二巯基尾的二噻烷表雄(甾)酮作为连接分子的寡核苷酸在2个小时内才出现聚集现象，6小时后完全聚集。使用三己基巯基修饰的寡核苷酸，则在10小时后才出现聚集现象，20小时后才完全聚集。
除了巯基固定的方法外，另一种常用的连接方式为生物素修饰寡核苷酸与链霉亲和素包被的纳米金的标记方法。生物素修饰的寡核苷酸一般由相应的序列合成公司，在合成过程中加入。纳米金颗粒的包被则有现有的试剂盒购买，可以快速的完成链霉亲和素的包被。其主要固定原理是生物素和亲合素的亲合作用。亲合素分子上有四个与生物素结合的位点，利用二者之间高特异性的亲合作用进行检测。由于亲合素(Avidin)是一种糖蛋白，分子量67kD。它包括四个亚基，每个为128氨基酸残基构成的多肽链，在该链中的10，20，43和110位点上共有四个色氨酸。每一亚单位上的糖基为一个低聚糖，含有甘露糖和氨基葡萄糖，最独特之处是亲合素(Avidin)分子表面有四个疏水口袋(每一亚单位有一个)，该处即为与四个生物素残基特异结合的位点。生物素与亲合素之间的结合是非共价键结合，但是非常稳定。只有在极低pH溶液或其他极端条件下，两者的连接才会被破坏。
Pathlak在2001年利用预活化的纳米金颗粒实现了对核酸的共价标记。该方法是预先在纳米颗粒的表面通过DTT和1，1’-羰基二咪唑反应，形成氨基甲酸-咪唑簇。然后5’氨化修饰的寡核苷酸可以通过氨基甲酸连接到纳米颗粒的表面。
纳米金溶液并不稳定，其颗粒容易发生聚集，形成可见的沉淀。寡核苷酸修饰后有利于胶体金的稳定。但是对纳米金颗粒的吸收峰会产生微量的影响，并不影响检测。在寡核苷酸的标记过程中，需要考虑在纳米金表面的覆盖率、颗粒稳定性和杂交效率三者间达到一个平衡。覆盖率要足够高，可以提高纳米金颗粒的稳性，但是如果过高，又会降低后续的杂交效率。同时在制备的过程中有研究者提出使用吐温20等非离子表面活性剂预先处理纳米金后，再进行巯基的连接反应，能进一步的提高纳米金在反应过程中的稳定性。这和吐温20在纳米金表面形成的保护层相关。
纳米金标记的寡核苷酸与荧光标记的寡核苷酸相比，又更好的杂交特性。首先，它的熔解温度窄，一般为3～4℃，而荧光标记的一般为12℃左右。因此在合适的杂交温度下，它有很高的杂交特异性。对于单碱基的分辨率。发现，在相应的Tm值下，荧光标记的寡核苷酸完全配对的和存在一个碱基错配的序列杂交相比为62％/38％，而同样条件下，纳米金标记的寡核苷酸的比例为82％/18％。纳米金标记的杂交特异性比荧光标记的杂交特异性要高3～4倍。在电化学检测法中，特异性可以达到105∶1，远高于现今其他的检测手段。
纳米金标记的寡核苷酸的高灵敏度也是它的重要优点之一。文献记载的最低能检测的靶序列为50fm，达到了PCR的检测灵敏度。常用的显色手段为银染，在银染过程中，银颗粒会析出沉淀在纳米金颗粒表面，使其体积增大1万倍，成为肉眼可见的信号。
纳米金标记的寡核苷酸在杂交过程中，也存在一些不利因素。最主要的就是空间位阻问题。如果用于酶反应，如聚合酶链式反应。但实验数据表明，空间位阻虽然是影响杂交的一个重要因素，降低纳米金表面探针(或引物)的覆盖率、使用较长的连接分子都能大大提高杂交效率。使用C6H12N7作为连接分子的纳米金标记的引物，在PCR反应中的利用率将近100％。因此，纳米金颗粒的空间位阻效应并不会成为杂交的障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物条形码探针的制备方法，该方法可以大大提高生物条形码探针的稳定性、相应的特异性和缩短杂交时间。
本发明的一种生物条形码探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将纳米金溶液与等体积的吐温20缓冲液混合，离心，浓缩；
(2)将上述浓缩液加入到巯基化探针中，水浴过夜，所述浓缩液中纳米金的浓度为3.2mol/L，混合的巯基化探针的终浓度为100umol/L。；
(3)加入高浓度的NaCl溶液，水浴；
(4)离心，洗涤2-3次沉淀后，稀释，得生物条形码探针；
(5)将生物条形码探针(终浓度10umol/L)、磁珠探针(0.1mg/ml)和靶序列DNA(1nmol/L)混合、置于55℃水浴杂交20分钟；
(6)磁分离器分离磁珠，去除未杂交的生物条形码探针，并洗涤2-3次；
(7)加入洗脱液。混合后置于55℃水浴20分钟。，用磁分离器去除磁珠，留上清液进行荧光检测。
所述纳米金颗粒大小为30nm，浓度为3.2fmol/L。
所述步骤(1)中吐温20缓冲液是由吐温20和双蒸水混合配置而成，吐温20的终浓度为1.5μl/mL，pH值为8.0。
所述巯基化探针的巯基化DNA长度为25个碱基，巯基化DNA的5’端为巯基修饰，3’端为FAM荧光修饰，同时DNA的3’端的部分序列和待检的靶序列DNA互补。
所述高浓度的NaCl溶液的钠离子的终浓度为1mol/L。
所述步骤(3)、(4)中的水浴是37℃～55℃的水浴。
所述步骤(1)、(4)中的离心速度均为12000rpm/min，离心时间分别为5分钟和2分钟。
所述步骤(4)、(6)洗涤用的洗涤液成分为0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4。
所述生物条形码探针是由纳米金和巯基化DNA构成。
所述磁珠探针由亲和素磁珠与生物素修饰的寡核苷酸序列连接而成。磁珠直径为0.5-1um。
所述步骤(7)的洗脱液为浓度为10mol/L的二硫苏糖醇溶液。
本发明的有益效果：
(1)使用吐温20(1.5μl/mL)处理纳米金溶液，能使所制备的述的生物条形码探针稳定性显著提高，稳定存在于钠离子浓度为1.0mol/L的溶液中，同时稳定存在于温度为55℃的条件下；
(2)使用高盐溶液(NaCl 1mol/L)处理纳米金-探针溶液，能使所制备的述的生物条形码探针特异性显著提高，特异性为140∶1；
(3)所制备的述的生物条形码探针杂交速度快，检测时间可以缩短75％。
附图说明
图1是不同NaCl浓度下的生物条形码探针的荧光值；
图2是不同NaCl浓度下的生物条形码探针的信噪比；
图3是不同温度下的生物条形码探针的荧光值；
图4是不同温度下的生物条形码探针的信噪比；
图5是不同杂交时间的生物条形码探针的信噪比。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例中的每个步骤过程参数请具体(参见发明内容中所要求的具体数值、种类等)
实施例1生物条形码探针的制备
(1)取纳米金溶液600μl，加入等体积吐温20溶液，吐温20的终浓度为1.5μl/ml，室温放置30分钟；
(2)离心(12000rpm/min)5分钟去除上清，使纳米金溶液浓缩；
(3)将上述浓缩液加入到巯基化探针(1OD，终浓度100umol/L)中，并溶解，37℃反应4小时；
(4)加入NaCl，终浓度为0.1mol/L，37℃水浴8小时；
(5)继续加入NaCl，终浓度为1mol/L，37℃水浴8小时；
(6)离心(12000rpm/min)2分钟，洗涤(0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4)2-3次沉淀；
(7)用缓冲液(0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4)悬浮沉淀，制得生物条形码探针，待用。
实施例2新型生物条形码探针在高盐溶液中的稳定性
(1)将制备好生物条形码探针10μl，磁珠探针(由亲和素磁珠和生物素DNA连接而成)10μl和待测DNA(1nM)1μl混合，在37℃下杂交，溶液的钠离子浓度分别为0.01mol/L，0.15mol/L，0.5mol/L，1.0mol/L，1.5mol/L，2.0mol/L，2.5mol/L，3.0mol/L；
(2)将完成杂交的反应体系，用磁分离器迅速处理，并用洗涤液(0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4)洗涤4～5次；
(3)加入洗脱液(0.1mol/L二硫苏糖醇)5μl，在60℃下反应5～10分钟；
(4)用磁分离器处理，去除磁珠，上清液用于检测；
(5)检测结果显示，在整个反应过程中，当钠离子浓度大于1.0mol/L时，生物条形码探针才会出现大量降解现象(图1)，信噪比下降(图2)。
实施例3新型生物条形码探针在高温下的稳定性
(1)将制备好生物条形码探针10μl，磁珠探针(由亲和素磁珠和生物素DNA连接而成)10μl和待测DNA(1nM)1μl混合，分别在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，54℃，55℃，56℃，60℃，65℃和70℃下杂交，溶液的钠离子浓度分别为1.0mol/L；
(2)将完成杂交的反应体系，用磁分离器迅速处理，并用洗涤液(0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4)洗涤4～5次；
(3)加入洗脱液(0.1mol/L二硫苏糖醇)5μl，在60℃下反应5～10分钟；
(4)用磁分离器处理，去除磁珠，上清液用于检测；
(5)检测结果显示，在整个反应过程中，当钠离子浓度大于温度大于55℃时，生物条形码探针才会出现大量降解现象(图3)。
实施例4新型生物条形码探针的特异性
(1)将制备好生物条形码探针10μl，磁珠探针(由亲和素磁珠和生物素DNA连接而成)10μl和待测DNA(1nM)1μl混合，在55℃下杂交，溶液的钠离子浓度为1.0mol/L；
(2)将完成杂交的反应体系，用磁分离器迅速处理，并用洗涤液(0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4)洗涤4～5次；
(3)加入洗脱液(0.1mol/L二硫苏糖醇)5μl，在60℃下反应5～10分钟；
(4)用磁分离器处理，去除磁珠，上清液用于检测；
(5)检测结果显示，其检测特异性达到140∶1(图4)。
实施例5新型生物条形码探针的检测时间
(1)将制备好生物条形码探针10μl，磁珠探针(由亲和素磁珠和生物素DNA连接而成)10μl和待测DNA(1nM)1μl混合，混合液的钠离子浓度分别为0.5M、1.0M、1.5M；
(2)上述混合液均分别杂交5分钟，10分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟和40分钟，杂交温度为55℃；
(3)将完成杂交的反应体系，用磁分离器迅速处理，并用洗涤液(0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4)洗涤4～5次；
(4)加入洗脱液(0.1mol/L二硫苏糖醇)5μl，在60℃下反应5～10分钟；
(5)用磁分离器处理，去除磁珠，上清液用于检测；
(6)检测结果显示，20分钟，新型的生物条形码探针能完成杂交反应(图5)。
Claims (10)
1.一种生物条形码探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将纳米金溶液与等体积的吐温20缓冲液混合，离心，浓缩；
(2)将上述浓缩液加入到巯基化探针中，水浴过夜；
(3)加入高浓度的NaCl溶液，水浴；
(4)离心，洗涤2-3次沉淀后，稀释，得生物条形码探针；
(5)将终浓度10umol/L生物条形码探针、终浓度0.1mg/ml磁珠探针和靶序列终浓度1nmol/L DNA混合、置于55℃水浴杂交20分钟；
(6)磁分离器分离磁珠，去除未杂交的生物条形码探针，并洗涤2-3次；
(7)加入洗脱液。混合后置于55℃水浴20分钟。处理完成后，用磁分离器去除磁珠，留上清液进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述纳米金颗粒大小为30nm，浓度为3.2fmol/L。
3.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中吐温20缓冲液是由吐温20和双蒸水混合配置而成，吐温20的终浓度为1.5μl/mL，pH值为8.0。
4.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述巯基化探针的巯基化DNA长度为25个碱基，巯基化DNA的5’端为巯基修饰，3’端为FAM荧光修饰，同时DNA的3’端的部分序列和待检的靶序列DNA互补。
5.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述浓缩液中纳米金的浓度为3.2mol/L，混合的巯基化探针的终浓度为100umol/L。
6.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述高浓度的NaCl溶液的钠离子的终浓度为1mol/L。
7.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)、(4)中的水浴是37℃～55℃的水浴。
8.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(4)中的离心速度均为12000rpm/min，离心时间分别为5分钟和2分钟。所述步骤(4)、(6)洗涤用的洗涤液成分为0.01M磷酸氢钠缓冲液，0.15M NaCl，0.1％SDS，pH 7.4。
9.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述磁珠探针由亲和素磁珠与生物素修饰的寡核苷酸序列连接而成。
10.根据权利要求1所述的生物条形码探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)的洗脱液为浓度为10mol/L的二硫苏糖醇溶液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20080813 |