CN102707066A

CN102707066A - 一种基于抗体dna标记和高通量测序技术的蛋白质或其它分子的检测方法

Info

Publication number: CN102707066A
Application number: CN2012100924871A
Authority: CN
Inventors: 张玉祥; 王雅梅
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2012-04-01
Filing date: 2012-04-01
Publication date: 2012-10-03

Abstract

一种基于抗体DNA标记和高通量测序技术的蛋白质或其它分子的检测方法。把针对待测抗原的抗体用特定序列的DNA进行标记，免疫反应后用高通量手段测定DNA标签的个数，对实验结果进行数据分析，可以得出待测抗原的浓度。对样品进行梯度稀释，对不同稀释的样品用不同的DNA序列标签，然后放到一起测序，便可以得出抗原含量的浓度梯度。这样可以提高检测范围，还可以对每个抗原的含量得出一个梯度，提高了测定精度。对同一个样品的多个抗原进行测定时，可以对不同的抗体进行不同序列的DNA标记，在同一样品体系中进行反应和测定，因此，本方法可以对多个抗原同时进行测定，既节省样品，也可以对不同的抗原进行比较。该方法具有极低的检测限和较宽的检测范围，能够同时对多种抗原同时进行检测，具有重要的应用前景。

Description

一种基于抗体DNA标记和高通量测序技术的蛋白质或其它分子的检测方法

技术领域

一种基于用DNA标签标记抗体等测定用物质和高通量测序技术相结合的分子检测方法，属于分析生物化学技术领域。

背景技术

免疫酶联吸附实验、蛋白印记和放射免疫法等是目前广泛应用于基础和临床检测的免疫分析方法。但是，免疫酶联吸附实验方法测定抗原时的敏感度低，蛋白印记操作烦琐，不能精确定量，而放射免疫法需要使用同位素，不易操作。寻找一个检测范围广、灵敏度高、精密度高、能同时测定多个抗原或其它分子而又操作简单的方法非常必要。

免疫酶联吸附实验(ELISA)的工作原理基于抗原或抗体的固定以及抗原或抗体的酶标记。将抗原或抗体吸附于固相载体表面，结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性；抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，这种酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。由酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，使测定方法达到一定的灵敏度。但是，ELISA测定依赖于模拟信号测定，一般的检测限在pg/ml水平。因此，对ELISA进行改进，使用其它的标记方法，是可以考虑的一个改善抗原测定的途径。一个好的检测方法要满足下列要求：(1)敏感度高；(2)精确度高；(3)宽广的线性范围；(4)可同时测定多中分子。现有的ELISA等方法显然难以满足这些要求。

高通量基因测序(第二代)的方法最近进展迅速，现在的技术比如ABI的SOLID系统、Helicos的系统、Illumina的Solexa系统可以在一张芯片上进行几千万至上亿个DNA片段同时测序。每个片段可以测定35-250bp的长度。最近的第三代测序的研究进展迅速，有望提高测序的速度和通量。

本方法-DNA标签测序法(DNA Barcode Counting，DBC)把分子标签技术和高通量基因测序的方法结合起来，进行抗原等分子的测定。首先把DNA标签连到测定用抗体(或测定用其它分子)上，然后进行结合反应。对与待测分子结合的测定用抗体(或其它分子)上的DNA标签进行高通量测定，DNA标签的数量反映抗原等待测分子的浓度。另外，本方法可以用于同时测定多种未知分子，如对不同的抗体使用不同的标签，可以在同一个测定体系中测定多个抗原。

另外，本方法不限于免疫反应测定。在进行两个分子(蛋白质、小分子等)间相互作用测定时，可以把其中一个分子连接到固相上，把另一个分子用DNA标签进行标记，通过测定DNA 标签的个数来得出分子相互作用的程度。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于抗体等测定用分子的DNA标签标记技术和高通量测序技术的高敏感多重分子测定技术。这种方法具有较宽的线性范围、极低的检测限以及较高的精密度。

本发明的技术方案：一种基于抗体等分子的DNA标记技术和高通量测序技术的检测微量抗原或其它分子的方法，其特征步骤为：(1)在固相上利用捕捉抗体(或其它大分子)捕捉抗原等待测分子，或者直接将待测抗原等分子连接到固相上；(2)将测定用抗体等分子与DNA标签进行直接或间接连接；(3)将带有DNA标签的测定用抗体加入到待测分子里进行结合反应，洗脱未结合的；(4)将捕捉的测定用抗体所带DNA标签进行高通量测序，或进行适度扩增后测序，根据测序后特定DNA标签的数量，来计算该标签所对应的待测分子的量。

本方法具有如下的优点和效果：

1.可以在一个管内同时测定多种分子；

2.可以测定非常大的线性范围；

3.因为标签数的测定是数字信号，测量结果精确。

附图说明

图1DNA标签标记和测序法流程图。

图2用于连接DNA标签和抗体的金纳米颗粒的紫外可见吸光光谱图。

图3标签序列。

图4抗原质量与标签数之间的线性关系标准曲线。

具体实施方式

下面以测定前列腺癌标记物PSA为例来说明过程。

1.在固相上连接捕获用抗体。下面以连有抗体的磁珠为例说明：

(1)将磁珠从冰箱里拿出来室温放置15分钟。重悬备用，避免起泡。

(2)吸取10μl的磁珠液置于磁力架上，吸取上清。用PBS洗涤，缓慢倾斜混悬2-3分钟，重复一次。重溶于500μl的PBS液中。

(3)磁吸取上清弃掉，将10μg抗PSA抗体溶于500μl的PBS液中，重悬混匀(107的磁珠对应3μg抗体)。

(4)根据抗体稳定性，在37℃下孵育4小时，并且保证充分混匀。

(5)将磁珠与上清分离，在PBS液中洗两次磁珠。

(6)将磁珠重溶于100μl的PBS液中，室温20分钟。

(7)用PBS液洗涤磁珠，转移到一个新管子中。

(8)将磁珠储存在500μl的PBS液中，4℃保存。

2.将DNA标签连到抗体上。本实验用间接法，将DNA标签通过纳米金连到抗体上：

(1)取巯基修饰的寡核苷酸100μM的10μl，加入到1ml的12nM 13nm胶体金溶液中，避光摇16h。

(2)向溶液中加入10.8μL 0.5M的磷酸缓冲液和一定量2M NaCl溶液使其Na+浓度递增，当Na+浓度升至0.1M，8小时后停止反应，向其中加入抗体，抗体浓度在6μg/ml。

(3)1小时后再加入0.3mL 10％BSA，摇1小时后离心，20000g，4℃，1小时。

(4)重溶于pH为7的溶液中保存。

3.液态实验检测：

(1)将磁珠重悬于100μl的PBS液。

(2)加入待测血清100μl。血清可作梯度稀释，不同浓度将用不同DNA标签。

(3)涡旋25℃孵育1.5小时。

(4)吸取弃去上清，用PBS液洗两次。

(5)添加100μl测定用抗体。抗体通过胶体金与DNA标签相连。

(6)25℃孵育1小时。

(7)用PBS液洗7次，每次200μl。每次3分钟。

(8)用含有DTT的释放液200μl来释放DNA。

(9)收集DNA标签，进行高通量测序(High-throuput sequencing)。

(10)标签数代表血清PSA的浓度。

Claims

1.一种基于DNA标签标记和高通量测序技术的检测蛋白质或其它分子的方法。

2.权利要求1中的DNA标签标记时，可将待测物质的测定用抗体(或者测定用蛋白质、核苷酸等)直接或经过纳米金等间接连上DNA标签。

3.用权利要求1的方法测定多个分子时，每种特定抗体等测定用分子连接一种(或多种)特定序列的DNA标签。

4.用权利要求1的方法测定样本的一种分子时，针对样本的不同稀释度可用不同的DNA序列标签，甚至每个浓度可用多种标签，以提高精确度。

5.DNA标签不只可以连到抗体和蛋白质上，也可以连接到核苷酸或其它用于测定的分子上。

6.权利要求1中的高通量测序技术是指将捕捉的测定用抗体(或其它大分子)所带DNA标签进行高通量测序，或进行适度扩增后测序，根据测序后特定DNA标签的数量，来计算该标签所对应的待测分子的量。

7.权利要求1中的高通量测序技术包括利用荧光、质子或纳米孔等(但不限于)技术平台的测序技术。

8.权利要求1不限于免疫反应测定。在进行两个分子(蛋白质、小分子等)间相互作用测定时，可以把其中一个分子连接到固相上，把另一个分子用DNA标签进行标记，通过测定DNA标签的个数来得出分子相互作用的程度。