CN106290320A - 一种基于无标记适体传感器的ota化学发光检测方法 - Google Patents
一种基于无标记适体传感器的ota化学发光检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106290320A CN106290320A CN201610814401.XA CN201610814401A CN106290320A CN 106290320 A CN106290320 A CN 106290320A CN 201610814401 A CN201610814401 A CN 201610814401A CN 106290320 A CN106290320 A CN 106290320A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ota
- aptamer sensor
- fit
- solid phase
- detection method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 83
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 60
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 37
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 26
- 206010010254 Concussion Diseases 0.000 claims description 21
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 21
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 14
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 1H-imidazole Chemical compound C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 9
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011017 operating method Methods 0.000 abstract description 2
- OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N phenylglyoxal Chemical compound O=CC(=O)C1=CC=CC=C1 OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- RWQKHEORZBHNRI-BMIGLBTASA-N ochratoxin A Chemical compound C([C@H](NC(=O)C1=CC(Cl)=C2C[C@H](OC(=O)C2=C1O)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 RWQKHEORZBHNRI-BMIGLBTASA-N 0.000 description 129
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 101100449517 Arabidopsis thaliana GRH1 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 101100434479 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) AFB1 gene Proteins 0.000 description 4
- OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B1 Chemical compound C=1([C@@H]2C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N 0.000 description 4
- 229930020125 aflatoxin-B1 Natural products 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- POKOASTYJWUQJG-UHFFFAOYSA-M 1-butylpyridin-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCC[N+]1=CC=CC=C1 POKOASTYJWUQJG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXJVQQPLIMTRFK-UHFFFAOYSA-N C(CCC)[P](CCCC)(CCCC)CCCC Chemical compound C(CCC)[P](CCCC)(CCCC)CCCC WXJVQQPLIMTRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 2
- VYLQGYLYRQKMFU-UHFFFAOYSA-N Ochratoxin A Natural products CC1Cc2c(Cl)cc(CNC(Cc3ccccc3)C(=O)O)cc2C(=O)O1 VYLQGYLYRQKMFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 2
- DAEYIVCTQUFNTM-UHFFFAOYSA-N ochratoxin B Natural products OC1=C2C(=O)OC(C)CC2=CC=C1C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 DAEYIVCTQUFNTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000003620 semiochemical Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 1
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- -1 blank group) Chemical compound 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001868 liquid chromatography-fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011806 microball Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，该技术方案首先将适体捕获探针固定在磁性微球表面，然后利用捕获探针与OTA分别结合OTA适体的竞争关系，基于适体的特异性结合能力强于互补链的结合力，得到磁性微球表面检测探针的量与待测OTA浓度的量化关系；最后，对适体传感器进行化学发光检测。其化学发光检测机制基于OTA适体链上的鸟嘌呤碱基(G)与化学发光试剂苯甲酰甲醛(PG)间的瞬时衍生化反应产生化学发光的原理实现的，从而省去了其他化学放光标记物的标记环节，在保证灵敏度的基础上简化了操作步骤，缩短了检测时间，再加之所用化学发光分析法线性范围宽、设备简单、易操作，因此有望实现全自动化检测。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法。
背景技术
赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是一种具有很强毒性的真菌毒素，其毒性在真菌毒素家族中位列第二位，仅次于黄曲霉毒素。OTA在自然界分布广泛，不仅污染谷物粮食，还严重污染动物性食品，对人类构成极大的威胁。鉴于食品安全问题关乎整个社会的安危，是受到国家及人民高度关注的大问题，建立OTA的高灵敏简便快速分析方法越发受到科研人员的重视。
目前，很多基层食品检测部门较多采用薄层层析法进行OTA的定量检测，这也是较早的一种OTA的检测方法，但其存在灵敏度较差、检测周期长、所需试剂较多、重现性差等缺点，已然不能满足现阶段对OTA的检测要求。另外，常见的OTA检测方法还有高效液相色谱-荧光检测法、毛细管电泳-二极管阵列检测法、液相-质谱联用法、固相萃取荧光检测法等，但这些方法通常对样品中毒素纯度做了较高要求，且所使用的相关设备价格昂贵，故存在检测周期长、成本高等一些缺点，导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。另外，OTA作为一种小分子物质，其分子量为403.82，是典型的半抗原，故有基于OTA免疫抗体分子作为识别元件的免疫检测方法，例如免疫传感、酶联免疫法等。这些方法虽然灵敏度高、特异性好，但也存在一定的局限性，比如抗体分子制备周期长、成本较高、稳定性差、易失活及易受pH、温度等环境因素影响而变性，故在不同程度上限制了免疫方法检测OTA的开展。
近年来，核酸适配体技术在分析化学尤其是微量物质的定量检测中展现出了突出的技术优势。核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标配体的寡聚核苷酸片段。以其特有的高亲和力和特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合各种生物目标分子，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而，要获得可行的检测方法，建立高效的适配体传感器是关键所在，首先适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量成规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适配体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，以解决现有技术中OTA检测方法灵敏性差、结果不稳定的技术缺陷。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中基于适体技术的OTA化学发光检测方法，普遍需要附加标记物以提升发光灵敏性，从而导致检测步骤繁琐的技术。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中基于适体技术的OTA化学发光检测方法耗时较长。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：
1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；
2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；
3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；
4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。
作为优选，步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的捕获探针用量比为3:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于35～39℃震荡反应50～70min。
作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。在该优选技术方案中，利用PBST缓冲溶液洗涤，旨在洗去多余的未固定到磁性微球表面的捕获探针，洗涤次数可以优选为3次。
作为优选，步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min。在此优选技术方案中，将固相(磁性微球)与PVP溶液混合，旨在以PVP溶液为封闭液，封闭磁性微球表面多余的结合位点，从而减少后续反应中的非特异性吸附。
作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃条件下震荡50～70min后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于BA缓冲溶液中，即得到磁性微球-捕获探针复合物；其中所述BA缓冲溶液是含有：20mM Tris，0.5M NaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。
作为优选，步骤2)包括以下操作：取OTA适体，于85～95℃水浴5～10min，而后于2～6℃水浴8～12min，而后将过量的OTA适体与待测样品在BB适配体反应液中混合，于35～39℃条件下震荡反应55～65min。在此优选技术方案中，对OTA适体先热水浴再冷水浴的前处理方法有助于提升步骤3)中OTA适体与捕获探针的杂交效率。
作为优选，步骤3)中反应条件为35～39℃震荡55～65min。该步骤用于使上一步反应后多余OTA适体与捕获探针互补杂交，从而固定到磁性微球表面。
作为优选，步骤3)取固相后利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，即得到OTA适体传感器。
作为优选，步骤4)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为(2～3):3(mmoL:μL)。
作为优选，以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。
作为优选，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的。
在以上技术方案中，所述PBST缓冲溶液可以是含有137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4·12H2O，2mM KH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。所述BB适配体反应液可以是含有10mM Tris，0.12M NaCl，0.005M KCl，0.02M CaCl2的水溶液，其pH是8.2～8.8。所述四丁基磷酸盐缓冲溶液可以是含有0.1M四丁基氢氧化铵的磷酸缓冲液。所述BA缓冲溶液可以是含有20mM Tris，0.5M NaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。
在以上技术方案中，所述氨基修饰的捕获探针是序列如下所示的核酸-氨基酸复合物：5’-CACCCACACCCIATCAAAAAAAAAA-NH2-3’；该物质可自试剂销售公司定制、购得。所述OTA适体是序列如下所示的DNA片段：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’，亦可自市面购得。所述过量的OTA适体，是指OTA适体与OTA的特异性结合反应中，OTA适体的量较多、使结合反应完成后仍有未结合OTA适体游离于体系中的情形；具体的OTA适体用量可根据对待测样品中OTA含量的估算来确定，当然亦可参照本发明实施例中OTA适体用量来实施本发明。所述充分反应是指OTA适体与OTA的特异性结合完全。所述过量的磁性微球-捕获探针复合物，是指固定于磁性微球表面的捕获探针与体系中游离的OTA适体之间的杂交反应中，捕获探针的量较多、使杂交反应完成后体系中游离的OTA适体被完全结合至磁性微球表面的情形；具体的磁性微球-捕获探针复合物用量可根据对体系中游离的(即未被OTA结合的)OTA适体含量的估算来确定，当然亦可参照本发明实施例中磁性微球-捕获探针复合物用量来实施本发明。
在利用本发明方法执行检测时，可以先利用该方法对一组具有浓度梯度且已知浓度的OTA标准溶液进行检测，以绘制出OTA浓度与发光信号CL值之间的线性关系，而后再对待测样品执行检测，将检测结果带入上述线性关系以获得实际检测值。其中标注曲线的绘制是利用本发明方法绘制的，而其中注入浓度梯度的选择、图表模式的选择、误差的校正等可以依照本领域的一般技术常识确定。
本发明提供了一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，该技术方案将核酸适配体技术与磁性微球的磁分离技术相结合，以磁性微球作为分离和固定载体，以OTA适体作为化学发光检测探针，在磁性微球表面构建了一种OTA的无标记化学发光适体传感器。本发明首先将适体捕获探针固定在磁性微球表面，然后利用捕获探针与OTA分别结合OTA适体的竞争关系，基于适体的特异性结合能力强于互补链的结合力，得到磁性微球表面检测探针的量与待测OTA浓度的量化关系。最后，对适体传感器进行化学发光检测，建立检测探针与化学发光强度的联系，从而实现了OTA的高灵敏度、高特异性、快速分析检测。该传感器的化学发光检测机制，是基于OTA适体链上的鸟嘌呤碱基(G)与化学发光试剂苯甲酰甲醛(PG)间的瞬时衍生化反应产生化学发光的原理实现的，从而省去了其他化学放光标记物的标记环节，在保证灵敏度的基础上简化了操作步骤，缩短了检测时间，可满足大批量样本快速检测的需求，再加之所用化学发光分析法线性范围宽、设备简单、易操作，因此有望实现全自动化检测。
附图说明
图1是本发明检测方法的原理示意图。
图2是本发明实施例1中的标准曲线图。
图3是本发明实施例1中对本发明检测方法的特异性考察实验结果。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
1实验原理
本实验以羧基磁性微球作为分离载体，在磁性微球表面构建OTA适体传感器，利用磁性微球表面OTA适体固定量与OTA浓度的负相关性及OTA适体序列中的G碱基与化学发光试剂PG的瞬时衍生化反应，实现OTA的无标记化学发光检测。首先通过氨羧结合反应将氨基捕获探针固定在羧基磁性微球表面；然后取不同浓度的OTA分别与等量且过量的OTA适体特异性结合，再将反应后多余的游离OTA适体通过与捕获探针互补杂交，固定磁性微球表面；最后用磁性分离器分离出磁性微球，通过采用化学发光法检测微球表面所固定的OTA适体的量，从而间接实现OTA的定量检测。当没有OTA存在时(即空白组)，OTA适体将全部固定在磁性微球表面，表现为CL信号值最高。当添加一系列不同浓度的OTA时，随着OTA浓度的增大，固定磁性微球表面的OTA适体量逐渐减少，CL信号值逐渐减小，对比未加OTA的空白组而言，引起的信号值变量(ΔCL)逐渐增大。因此，随着OTA浓度的增大，ΔCL与OTA浓度呈负相关。实验原理图如图1所示。
2试剂与仪器
表1本实施例所用试剂列表
表2本实施例所用仪器列表
3实验方法
取60μg羧基磁性微球于1.5mL离心管中，通过磁性分离移去上清液。磁性微球用100μL 0.1M咪唑缓冲溶液(pH6.0)洗涤，重复三次；加入含有EDC的咪唑缓冲溶液100μL，使磁性微球重新悬浮，于37℃下恒温震荡孵育20min；随后向磁性微球溶液中加入30pmol氨基修饰的捕获探针，于37℃下恒温震荡反应1h，通过氨羧反应使捕获探针固定在磁性微球表面；通过磁性分离移去上清液，用100μLPBST缓冲溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4·12H2O，2mM KH2PO4，0.05％Tween20，pH7.4)洗涤磁性微球，重复三次，以洗去多余的未固定到磁性微球表面的捕获探针；加入100μL 10％PVP溶液，于37℃下恒温震荡1h，封闭磁性微球表面多余的结合位点，从而减少后续反应中的非特异性吸附；通过磁性分离移去上清液，用100μL PBST缓冲溶液洗涤磁性微球，重复三次；最后，将制备好的磁性微球-捕获探针复合物重新悬浮于50μL BA缓冲溶液(20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.0)，备用。
为了提高OTA适体与捕获探针的杂交效率，将OTA适体置于90℃水浴5～10min后，立即4℃水浴10min；取50μL BB适配体反应液(10mM Tris，0.12M NaCl，0.005M KCl，0.02MCaCl2，pH8.5)配制的已知浓度的OTA标准品于1.5mL离心管中，加入30pmol OTA适体，于37℃下恒温震荡反应1h，使OTA与OTA适体特异性结合；然后加入上述步骤制备好的磁性微球-捕获探针复合物，于37℃下恒温震荡反应1h，使上一步反应后多余OTA适体与捕获探针互补杂交，从而固定到磁性微球表面，OTA适体传感器组装完成；通过磁性分离移去上清液，用100μL PBST缓冲溶液洗涤微球，重复三次；将制备好的OTA适体传感器悬浮于10μL四丁基磷酸盐缓冲溶液(四丁基氢氧化铵-0.1M磷酸，pH8.5)中，待测。
将上述OTA适体传感器悬浮液转移至圆柱形玻璃检测瓶中，迅速加入90μL PG溶液(30mM溶于DMF)，混匀并立即放入化学发光检测器中测定，化学发光信号由BPCL微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。
4适体传感器性能评价
我们通过对自酿葡萄酒样本进行加标回收试验，从而评价本方法的准确性及精密度。实验选用了C18固相萃取小柱对葡萄酒中的OTA进行提取净化，C18小柱使用前分别用2mL乙腈和2mL水活化。先取5mL葡萄酒样品加入5mL水，分别按照1、5、10ng/mL水平添加OTA标准品，混合作为上样液进行上样；再分别用10mL水淋洗，2mL甲醇-冰乙酸(99.5：0.5，v/v)进行洗脱，控制流速1mL/min；最后，洗脱液在50℃下用氮气吹干，再用1mL甲醇溶解，0.45μm有机滤膜过滤，滤液即为待测液。随后用本方法对待测液进行化学发光检测，计算加标样品回收率。
另外，我们还选取了两种食品中常见的真菌毒素AFB1和ZEN以及两种与OTA结构类似的物质WF、NAP对本方法的选择特异性进行考察。实验分别取10ng/mL OTA及与其等物质量浓度的AFB1、ZEN、WF、NAP采用本方法进行分析检测，并观察分别加入AFB1、ZEN、WF、NAP后化学发光信号值的变化。5实验结果
5.1标准曲线的建立
在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，30pmol捕获探针，30pmolOTA适体)，建立OTA化学发光检测标准曲线，结果如图2所示。当OTA浓度在0.1～50ng/mL范围内，ΔCL信号值(Y)与OTA浓度(X)的对数线性相关(Y＝1798X-3395,r2＝0.9952)，最低检出限为0.1ng/mL。近年来，基于核酸适配体技术检测OTA的方法有很多很多，由表3可见。本方法具有较高的灵敏度，检测范围更宽，更重要的是本方法无需标记即可检测OTA。
表3基于核酸适配体技术的不同种OTA分析检测方法的比较
5.2适体传感器的性能评价结果
在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，30pmol捕获探针，30pmolOTA适体)，用本方法分别对10μg/mL OTA及等物质量浓度的AFB1、ZEN、WF、NAP进行化学发光检测进行特异性考察。由实验结果(图3)可知，本方法对OTA的检测几乎不受其他共存物质的影响，具有较高的选择特异性。
另外，实验选取了3个不同浓度的OTA(1、5、10ng/mL)平行三次测定进行回收率实验，平均回收率在103.2％～112.5％之间，相对标准偏差在4.7％～7.2％之间。结果如表4所示，本方法准确性较高，具有良好的精密度，可行性强，可用于实际样品中的OTA检测。
表4葡萄酒样品中加标回收试验结果
6实验结论
本方法以羧基磁性微球为分离载体，利用自组装技术在羧基磁性微球表面构建OTA适配体传感器，同时利用OTA适体中的G碱基与化学发光试剂PG的瞬时衍生化反应，以OTA适体作为检测探针，建立了一种化学发光法无标记检测OTA的新方法。在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，30pmol捕获探针，30pmolOTA适体)定量检测OTA，OTA浓度在0.1～50ng/mL范围内与ΔCL信号值呈线性相关，最低检出限为0.1ng/mL。对葡萄酒样品进行加标回收实验，回收率在103.2％～112.5％之间，重复三次测定，相对标准偏差在4.7％～7.2％之间，这充分说明了本方法可用于实际样品中OTA的定量检测。另外，本方法灵敏度高、成本低，耗时短，全程仅需4h，并能满足大批量样本的快速筛查，为食品药品安全检测及分析领域提供了一种快速、简单且高灵敏度的分析手段。
实施例2
一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：
1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；
2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；
3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；
4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.1M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于37℃震荡孵育20min，而后以磁性微球与氨基修饰的捕获探针用量比为2:1(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于37℃震荡反应60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相加入10％的PVP溶液，于37℃条件下震荡60min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于BA缓冲溶液中，即得到磁性微球-捕获探针复合物。
步骤2)包括以下操作：取OTA适体，于90℃水浴8min，而后于4℃水浴10min，而后将过量的OTA适体与待测样品在BB适配体反应液中混合，于37℃条件下震荡反应60min。
步骤3)中反应条件为37℃震荡60min。
步骤3)取固相后利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，即得到OTA适体传感器。
步骤4)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为1:2(mmoL:μL)。
以上所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。
其中，所述PBST缓冲溶液是含有137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4·12H2O，2mM KH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。所述BB适配体反应液是含有10mMTris，0.12M NaCl，0.005M KCl，0.02M CaCl2的水溶液，其pH是8.2～8.8。所述四丁基磷酸盐缓冲溶液是含有0.1M四丁基氢氧化铵的磷酸缓冲液。所述BA缓冲溶液是含有20mM Tris，0.5M NaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。
实施例3
一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：
1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；
2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；
3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；
4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35℃震荡孵育15min，而后以磁性微球与氨基修饰的捕获探针用量比为3:1(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于35℃震荡反应50min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相加入8％的PVP溶液，于35℃条件下震荡50min。
步骤2)包括以下操作：取OTA适体，于85℃水浴5min，而后于2℃水浴8min，而后将过量的OTA适体与待测样品在BB适配体反应液中混合，于35℃条件下震荡反应55min。
步骤3)中反应条件为35℃震荡55min。
步骤4)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为2:3(mmoL:μL)。
其中，所述PBST缓冲溶液是含有137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4·12H2O，2mM KH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。所述BB适配体反应液是含有10mMTris，0.12M NaCl，0.005M KCl，0.02M CaCl2的水溶液，其pH是8.2～8.8。所述四丁基磷酸盐缓冲溶液是含有0.1M四丁基氢氧化铵的磷酸缓冲液。所述BA缓冲溶液是含有20mM Tris，0.5M NaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。
实施例4
一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：
1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；
2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；
3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；
4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于39℃震荡孵育25min，而后以磁性微球与氨基修饰的捕获探针用量比为3:2(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于39℃震荡反应70min，而后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。
步骤2)包括以下操作：取OTA适体，于95℃水浴10min，而后于6℃水浴12min，而后将过量的OTA适体与待测样品在BB适配体反应液中混合，于39℃条件下震荡反应65min。
步骤3)中反应条件为39℃震荡65min。
步骤4)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为3:3(mmoL:μL)。
以上所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。
实施例5
一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：
1)通过氨酸反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；
2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；
3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；
4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；
2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；
3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；
4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。
2.根据权利要求1所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的捕获探针用量比为3:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于35～39℃震荡反应50～70min。
3.根据权利要求2所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。
4.根据权利要求3所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min。
5.根据权利要求4所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃条件下震荡50～70min后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于BA缓冲溶液中，即得到磁性微球-捕获探针复合物。
6.根据权利要求1所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤2)包括以下操作：取OTA适体，于85～95℃水浴5～10min，而后于2～6℃水浴8～12min，而后将过量的OTA适体与待测样品在BB适配体反应液中混合，于35～39℃条件下震荡反应55～65min。
7.根据权利要求1所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤3)中反应条件为35～39℃震荡55～65min。
8.根据权利要求1所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤3)取固相后利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，即得到OTA适体传感器。
9.根据权利要求1所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤4)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为(2～3):3(mmoL:μL)。
10.根据权利要求1～9任一项所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于其中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610814401.XA CN106290320B (zh) | 2016-09-09 | 2016-09-09 | 一种基于无标记适体传感器的ota化学发光检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610814401.XA CN106290320B (zh) | 2016-09-09 | 2016-09-09 | 一种基于无标记适体传感器的ota化学发光检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106290320A true CN106290320A (zh) | 2017-01-04 |
| CN106290320B CN106290320B (zh) | 2019-03-01 |
Family
ID=57710425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610814401.XA Expired - Fee Related CN106290320B (zh) | 2016-09-09 | 2016-09-09 | 一种基于无标记适体传感器的ota化学发光检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106290320B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858403A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-30 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法 |
| CN110988349A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-04-10 | 西北农林科技大学 | 一种捕获探针、大肠杆菌o157:h7的双通道检测方法及其应用 |
| CN112067602A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-12-11 | 南昌大学 | 一种基于酶切辅助无标记适体传感器的atp化学发光检测方法 |
| CN114437709A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-05-06 | 中国科学院海洋研究所 | 一种核酸功能化mof材料及其制备和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104458684A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-03-25 | 浙江农林大学 | 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法 |
-
2016
- 2016-09-09 CN CN201610814401.XA patent/CN106290320B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104458684A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-03-25 | 浙江农林大学 | 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 严喜鸾: "基于核酸适配体化学发光检测新技术的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858403A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-30 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于单分子荧光传感的痕量目标物检测方法 |
| CN110988349A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-04-10 | 西北农林科技大学 | 一种捕获探针、大肠杆菌o157:h7的双通道检测方法及其应用 |
| CN112067602A (zh) * | 2020-08-19 | 2020-12-11 | 南昌大学 | 一种基于酶切辅助无标记适体传感器的atp化学发光检测方法 |
| CN112067602B (zh) * | 2020-08-19 | 2021-12-14 | 南昌大学 | 一种基于酶切辅助无标记适体传感器的atp化学发光检测方法 |
| CN114437709A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-05-06 | 中国科学院海洋研究所 | 一种核酸功能化mof材料及其制备和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106290320B (zh) | 2019-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hendrickson et al. | Fluorescence polarization-based bioassays: new horizons | |
| US9778252B2 (en) | Analyte detection | |
| FI93781B (fi) | Biospesifinen multiparametrinen määritysmenetelmä | |
| Wang et al. | Simultaneous detection of small molecules, proteins and microRNAs using single molecule arrays | |
| Uludag et al. | Lab-on-a-chip based biosensor for the real-time detection of aflatoxin | |
| Lan et al. | Multi-residue detection of pesticides using a sensitive immunochip assay based on nanogold enhancement | |
| Rabbany et al. | Trace detection of explosives using a membrane-based displacement immunoassay | |
| US20090023144A1 (en) | Method and its kit for quantitatively detecting specific analyte with single capturing agent | |
| JPS5942454A (ja) | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための均一系免疫分析方法及び試薬 | |
| CN106290320A (zh) | 一种基于无标记适体传感器的ota化学发光检测方法 | |
| Hao et al. | Melamine detection in dairy products by using a reusable evanescent wave fiber-optic biosensor | |
| Zhao et al. | Introducing chemiluminescence resonance energy transfer into immunoassay in a microfluidic format for an improved assay sensitivity | |
| CN102288764B (zh) | 一种基于量子点的免疫荧光检测三聚氰胺的方法及专用试剂盒 | |
| CN106383110B (zh) | 基于纳米金标记适体传感器的ota化学发光检测方法 | |
| Chen et al. | Magnetic beads based immunoaffinity capillary electrophoresis of total serum IgE with laser-induced fluorescence detection | |
| Kim et al. | A review on lateral flow test strip for food safety | |
| Choi et al. | A droplet-based microfluidic immunosensor for high efficiency melamine analysis | |
| Varnum et al. | Enzyme-amplified protein microarray and a fluidic renewable surface fluorescence immunoassay for botulinum neurotoxin detection using high-affinity recombinant antibodies | |
| Xu et al. | Melamine-mediated base mismatch for label-free and amplified sensitive fluorescent detection of melamine in milk | |
| CN106442480B (zh) | 基于hrp标记适体传感器的ota化学发光检测方法 | |
| Qiu et al. | Aptamer-based detection of melamine in milk using an evanescent wave fiber sensor | |
| CN101782570A (zh) | 一种生物分子竞争分析方法及其应用 | |
| Joensson et al. | A homogeneous assay for protein analysis in droplets by fluorescence polarization | |
| Luo et al. | Chemiluminescent imaging detection of staphylococcal enterotoxin C1 in milk and water samples | |
| CN112813070A (zh) | 结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230220 Address after: 312400 room 1006, 10th floor, building 10, Shengzhou Beihang XingKong science and Technology Innovation Park, No. 1, Shuangta Road, Pukou street, Shengzhou City, Shaoxing City, Zhejiang Province Patentee after: Shaoxing Sanxun Technology Co.,Ltd. Address before: 999 No. 330031 Jiangxi province Nanchang Honggutan University Avenue Patentee before: Nanchang University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190301 |