CN112067602A - 一种基于酶切辅助无标记适体传感器的atp化学发光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，首先将适体固定在磁性微球表面，再将适体与三磷酸腺苷特异性结合，然后利用核酸外切酶T能够特异地将单链DNA从3’端逐步降解为游离的碱基，基于外切酶可以显著降低背景信号，得到磁性微球表面检测适体的量与待测ATP浓度的量化关系；最后对适体传感器进行化学发光检测。本发明基于ATP适体链上的鸟嘌呤碱基(G)与化学发光试剂苯甲酰甲醛(PG)间的瞬时衍生化反应产生化学发光的原理，省去了其他化学放光标记物的标记环节，在保证灵敏度的基础上简化了操作步骤，缩短了检测时间，再加之所用化学发光分析法线性范围宽、设备简单、易操作，因此有望实现全自动化检测。

Description

一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测 方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，进一步涉及核酸适配体技术以及核酸外切酶可以显著降低背景信号，具体涉及一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法。

背景技术

三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)存在于生物细胞内，是活细胞的主要能量来源，能够控制生物合成反应、运动和细胞分裂等多种细胞代谢过程，从而能够实现能量转导。ATP的量在细胞内总是维持一种动态平衡，因此可以作为细胞的损伤、活力和增殖的指标。生物体内ATP的异常水平与各种发病机制密切相关，主要包括缺氧，缺血，低血糖，阿尔茨海默病和帕金森病。ATP还被专门用作食品质量控制的指标,故而对各方面的ATP含量的高效、简单的检测是非常必要的。

目前，常见的ATP检测方法有生物发光检测法、高效液相色谱检测法、高效液相色谱检测法、电泳检测法等，但这些方法通常所使用的相关设备价格昂贵，故存在检测周期长、成本高等一些缺点，导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。核酸酶是可以切割核酸中核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。它们可以将DNA或RNA水解成单核苷酸或寡核苷酸片段。核酸酶的裂解在从生物技术到药理学等各个领域都发挥着重要作用，特别是在涉及DNA修复，复制，重组，基因分型的生物过程中，并且还广泛用作PCR检测，基因定位，分子克隆和药物化学的必要工具。核酸酶对于维持基因组稳定性至关重要。由于细胞中突变率的稳定，人类细胞中核酸酶的过度表达可能与寿命的延长有关，而缺乏核酸酶的生物体则更易患严重疾病。因此，监测活细胞分泌的核酸酶和检测人血清中的核酸酶具有重要的意义。用于核酸酶测定的灵敏和选择性方法的发展已成为现代分子生物学和药物发现过程中的主要任务。

近年来，核酸适配体技术在分析化学尤其是微量物质的定量检测中展现出了突出的技术优势。核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标配体的寡聚核苷酸片段。以其特有的高亲和力和特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合各种生物目标分子，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而，要获得可行的检测方法，建立高效的适配体传感器是关键所在，首先适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量成规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适配体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足与难题，提供一种酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，以解决现有技术中ATP检测方法灵敏性差、结果不稳定、应用效果不佳的技术缺陷。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中基于适体技术的ATP化学发光检测方法，普遍需要附加标记物以提升发光灵敏性，从而导致检测步骤繁琐的技术。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术中基于适体技术的ATP化学发光检测方法耗时较长。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，包括以下步骤：

1)通过氨羧反应将氨基修饰的适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-适体复合物；

2)向磁性微球-捕获探针复合物中加入待测样品，使适体与ATP特异性结合，从而将ATP捕获间接联接在磁性微球表面，反应后取固相，即得到ATP适体传感器；

3)将步骤2)所述ATP适体传感器与50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液以及一定单位量的Exo T溶液混匀，而后检测发光信号CL值。

作为优选，步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的适体用量比为2:(2～3)(μL:pmoL)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于35～39℃震荡反应50～70min。

作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相利用WB缓冲溶液洗涤。在该优选技术方案中，利用WB缓冲溶液洗涤，旨在洗去多余的未固定到磁性微球表面的适体，洗涤次数可以优选为3次。

作为优选，步骤1)还包括以下操作：利用WB缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的BSA溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min。在此优选技术方案中，将固相(磁性微球)与BSA溶液混合，旨在以BSA溶液为封闭液，封闭磁性微球表面多余的结合位点，从而减少后续反应中的非特异性吸附。

作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃条件下震荡50～70min后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于AA缓冲溶液中，即得到磁性微球-捕获探针复合物；其中所述AA缓冲溶液是含有：0.605g Tris，4.3875g NaCl，0.250g MgCl₂，取适量超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH至8.0，取超纯水定容至250mL。

作为优选，步骤2)包括以下操作：取上述磁性微球-适体复合物，加入一定量的待测样品于35～39℃条件下震荡反应55～65min后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相，即得到ATP适体传感器。

作为优选，步骤3)将上述ATP适体传感器重悬于50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液中并与一定单位量的Exo T溶液混合，反应条件为35～39℃震荡1～5h。

作为优选，步骤3)取固相后利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，然后加入PG溶液，混匀并立即放入化学发光检测器中测定。

作为优选，步骤3)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为(2～3):3(mmoL:μL)。

作为优选，以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。

作为优选，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的。

在以上技术方案中，所述WB缓冲溶液可以是含有1.21g Tris，4.975g NaCl，取适量的超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH8.0，再称取0.25g吐温后，取超纯水定容至500mL。所述AA缓冲溶液可以是含有0.605g Tris，4.3875g NaCl，0.250g MgCl₂，取适量超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH至8.0，取超纯水定容至250mL。所述四丁基磷酸盐缓冲溶液可以是含有0.1M四丁基氢氧化铵的磷酸缓冲液。所述BA缓冲溶液可以是含有20mMTris，0.5M NaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。

在以上技术方案中，所述氨基修饰的适体选用序列如下所示的核酸-氨基酸复合物：5’-NH-AGAGAACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’；该物质可自生工生物工程(上海)股份有限公司定制、购得。

在利用本发明方法执行检测时，可以先利用该方法对一组具有浓度梯度且已知浓度的ATP标准溶液进行检测，以绘制出ATP浓度与发光信号CL值之间的线性关系，而后再对待测样品执行检测，将检测结果带入上述线性关系以获得实际检测值。其中标注曲线的绘制是利用本发明方法绘制的，而其中注入浓度梯度的选择、图表模式的选择、误差的校正等可以依照本领域的一般技术常识确定。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，该技术方案将核酸适配体技术与磁性微球的磁分离技术相结合，以磁性微球作为分离和固定载体，以ATP适体作为化学发光检测探针，在磁性微球表面构建了一种ATP的酶切辅助无标记化学发光适体传感器。本发明首先将适体固定在磁性微球表面，然后利用适体与ATP特异性结合，利用核酸外切酶T能够特异地将单链DNA从3’端逐步降解为游离的碱基，基于外切酶可以显著降低背景信号，得到磁性微球表面检测适体的量与待测ATP浓度的量化关系。最后，对适体传感器进行化学发光检测，建立检测探针与化学发光强度的联系，从而实现了ATP的高灵敏度、高特异性、快速分析检测。该传感器的化学发光检测机制，是基于ATP适体链上的鸟嘌呤碱基(G)与化学发光试剂苯甲酰甲醛(PG)间的瞬时衍生化反应产生化学发光的原理实现的，从而省去了其他化学放光标记物的标记环节，在保证灵敏度的基础上简化了操作步骤，缩短了检测时间，可满足大批量样本快速检测的需求，再加之所用化学发光分析法线性范围宽、设备简单、易操作，因此有望实现全自动化检测。

附图说明

图1是本发明检测方法的原理示意图。

图2是本发明实施例1中的标准曲线图。

图3是本发明实施例1中对本发明检测方法的特异性考察实验结果。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

1实验原理

本实验以羧基磁性微球作为分离载体，在磁性微球表面构建ATP适体传感器，利用磁性微球表面ATP适体固定量与ATP浓度的正相关性及ATP适体序列中的G碱基与化学发光试剂PG的瞬时衍生化反应，实现ATP的酶切辅助无标记化学发光检测。首先通过氨羧结合反应将氨基适体固定在羧基磁性微球表面；然后；最后用磁性分离器分离出磁性微球，通过采用化学发光法检测微球表面所固定的ATP适体的量，从而间接实现ATP的定量检测。当没有ATP存在时(即空白组)，固定在磁性微球表面的ATP适体将全部被核酸外切酶降解，表现为CL信号值最低。当添加一系列不同浓度的ATP时，随着ATP浓度的增大，固定磁性微球表面的ATP适体量与ATP特异性结合逐渐增多，CL信号值逐渐增大，对比未加ATP的空白组而言，引起的信号值变量(ΔCL)逐渐增大。因此，随着ATP浓度的增大，ΔCL与ATP浓度呈正相关。实验原理图如图1所示。

2实验方法

取80μg羧基磁性微球于1.5mL离心管中，通过磁性分离移去上清液。磁性微球用100μL 0.1M咪唑缓冲溶液(pH6.0)洗涤，重复三次；加入含有EDC的咪唑缓冲溶液100μL，使磁性微球重新悬浮，于37℃下恒温震荡孵育20min；随后向磁性微球溶液中加入6pmoL氨基修饰的适体，于37℃下恒温震荡反应1h，通过氨羧反应使适体固定在磁性微球表面；通过磁性分离移去上清液，用100μL WB缓冲溶液(1.21g Tris，4.975g NaCl，取适量的超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH8.0，再称取0.25g Tween20后，取超纯水定容至500mL)洗涤磁性微球，重复三次，以洗去多余的未固定到磁性微球表面的适体；加入100μL 10％BSA溶液，于37℃下恒温震荡1h，封闭磁性微球表面多余的结合位点，从而减少后续反应中的非特异性吸附；通过磁性分离移去上清液，用100μL WB缓冲溶液洗涤磁性微球，重复三次；最后，将制备好的磁性微球-适体复合物重新悬浮于50μL AA缓冲溶液(0.605g Tris，4.3875gNaCl，0.250g MgCl2，取适量超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH至8.0，取超纯水定容至250mL)，备用。

将上述处理过的磁性微球分别于不同浓度的ATP样品在100μL的AA缓冲溶液中混合，混合液在37℃的恒温震荡仪中反应50分钟，使得ATP与其适配体特异性结合，从而将ATP捕获间接联接在磁性微球表面。使用WB洗涤缓冲液清洗3次后在混合物中加入50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液以及一定单位量的Exo T，在37℃的水浴锅内孵育一段时间，以降解磁珠上未结合ATP的适配体。WB缓冲溶液清洗3次后，待化学发光检测。将制备好的磁珠-适配体-ATP复合物悬浮于10μL四丁基磷酸盐缓冲溶液(四丁基氢氧化铵-0.1M磷酸，pH8.5)中，待测。

将上述磁珠-适配体-ATP复合物悬浮液转移至圆柱形玻璃检测瓶中，迅速加入90μL PG溶液(30mM溶于DMF)，混匀并立即放入化学发光检测器中测定，化学发光信号由BPCL微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。

3适体传感器性能评价

我们首先通过对购买于当地超市的啤酒进行加标回收实验，以评价该方法的准确性及精密度。在处理后的啤酒样品中分别加入不同浓度的ATP(0.5μM、5μM、50μM)。在优化条件下，实验步骤同上所述，每组实验平行三次进行检测，计算加标样品回收率。

其次，为了检验该实验方法的特异选择性，我们选择了与ATP类似的几种物质(GTP、CTP、UTP)进行化学发光检测。其中ATP、GTP、CTP以及UTP的浓度都为10μM，其他条件保持不变，探究不同的物质对化学发光信号强度的影响。

4实验结果

4.1标准曲线的建立

在优化实验条件下(80μg羧基磁性微球，6pmoL ATP适体，3h酶降解时间以及30UExo T)，建立ATP化学发光检测标准曲线，结果如图2所示。当ATP浓度在0.1～100μM范围内，IΔCL与ATP浓度的对数值呈良好的线性关系。回归方程为IΔCL＝9246.5+310.44x(R²＝0.9905)，最低检出限为0.032μM。本方法具有较高的灵敏度，检测范围更宽，更重要的是本方法无需标记即可检测ATP。

4.2适体传感器的性能评价结果

在优化实验条件下(80μg羧基磁性微球，6pmoL ATP适体，3h酶降解时间以及30UExo T)，用本方法分别对50μM OTA及等物质量浓度的对ATP、GTP、CTP以及UTP的化学发光信号进行化学发光检测进行特异性考察。由实验结果(图3)可知，本方法对ATP的检测几乎不受其他共存物质的影响，具有较高的选择特异性。

另外，实验选取了3个不同浓度的ATP(0.5μM、5μM、50μM)平行三次测定进行回收率实验，每组实验平行进行三次测定。在啤酒样品中测量并计算得到平均回收率在97.2％～109.5％之间，相对标准偏差在5.2％～7.6％之间。结果如表1所示，本方法准确性较高，具有良好的精密度，可行性强，可用于实际样品中的ATP检测。

表1啤酒样品中加标回收试验结果

5实验结论

本方法以羧基磁性微球为分离载体，利用自组装技术在羧基磁性微球表面构建磁珠-适配体-ATP传感器，同时利用ATP适体中的G碱基与化学发光试剂PG的瞬时衍生化反应，以ATP适体作为检测探针，建立了一种化学发光法酶切辅助无标记检测ATP的新方法。在优化实验条件下(80μg羧基磁性微球，6pmoL ATP适体，3h酶降解时间以及30U Exo T)定量检测ATP，ATP浓度在0.1～100μM范围内与ΔCL信号值呈线性相关，最低检出限为0.032μM。对啤酒样品进行加标回收实验，回收率在97.2％～109.5％之间，重复三次测定，相对标准偏差在5.2％～7.6％之间，这充分说明了本方法可用于实际样品中ATP的定量检测。另外，本方法灵敏度高、成本低，耗时短，全程仅需4h，并能满足大批量样本的快速筛查，为食品药品安全检测及分析领域提供了一种快速、简单且高灵敏度的分析手段。

实施例2

一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，包括以下步骤：

1)通过氨羧反应将氨基修饰的适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-适体复合物；

2)向磁性微球-捕获探针复合物中加入待测样品，使适体与ATP特异性结合，从而将ATP捕获间接联接在磁性微球表面，反应后取固相，即得到ATP适体传感器；

3)将步骤2)所述ATP适体传感器与50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液以及一定单位量的Exo T溶液混匀，而后检测发光信号CL值。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.1M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于37℃震荡孵育20min，而后以磁性微球与氨基修饰的适体用量比为2:3(μL:pmoL)的比例加入氨基修饰的适体，于37℃震荡反应60min，而后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相加入10％的BSA溶液，于37℃条件下震荡60min，而后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于AA缓冲溶液中，即得到磁性微球-适体复合物。

步骤2)包括以下操作：取上述磁性微球-适体复合物，加入一定量的待测样品于37℃条件下震荡反应60min后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相，即得到ATP适体传感器。

步骤3)将上述ATP适体传感器重悬于加入50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液中并加入30U的Exo T，反应条件为37℃震荡3h。

步骤3)取固相后利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，然后加入PG溶液，混匀并立即放入化学发光检测器中测定

上述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为1:2(mmoL:μL)。

以上所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。

其中，所述WB缓冲溶液是含有1.21g Tris，4.975g NaCl，取适量的超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH8.0，再称取0.25g吐温后，取超纯水定容至500mL。所述AA缓冲溶液可以是含有0.605g Tris，4.3875g NaCl，0.250g MgCl2，取适量超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH至8.0，取超纯水定容至250mL。。所述四丁基磷酸盐缓冲溶液是含有0.1M四丁基氢氧化铵的磷酸缓冲液。

实施例3

一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，包括以下步骤：

1)通过氨羧反应将氨基修饰的适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-适体复合物；

2)向磁性微球-捕获探针复合物中加入待测样品，使适体与ATP特异性结合，从而将ATP捕获间接联接在磁性微球表面，反应后取固相，即得到ATP适体传感器；

3)将步骤2)所述ATP适体传感器与50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液以及一定单位量的Exo T溶液混匀，而后检测发光信号CL值。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.1M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35℃震荡孵育15min，而后以磁性微球与氨基修饰的适体用量比为1:1(μL:pmoL)的比例加入氨基修饰的适体，于35℃震荡反应50min，而后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相加入8％的BSA溶液，于35℃条件下震荡50min，而后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于AA缓冲溶液中，即得到磁性微球-适体复合物。

步骤2)包括以下操作：取上述磁性微球-适体复合物，加入一定量的待测样品于35℃条件下震荡反应50min后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相，而后取固相，即得到ATP适体传感器。

步骤3)将上述ATP适体传感器重悬于加入50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液中并加入20U的Exo T，反应条件为35℃震荡1h。

步骤3)取固相后利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，然后加入PG溶液，混匀并立即放入化学发光检测器中测定。

上述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为2:3(mmoL:μL)。

其中，所述WB缓冲溶液是含有1.21g Tris，4.975g NaCl，取适量的超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH8.0，再称取0.25g吐温后，取超纯水定容至500mL。所述AA缓冲溶液可以是含有0.605g Tris，4.3875g NaCl，0.250g MgCl2，取适量超纯水溶解，用0.10M HCl溶液调节pH至8.0，取超纯水定容至250mL。。所述四丁基磷酸盐缓冲溶液是含有0.1M四丁基氢氧化铵的磷酸缓冲液。

实施例4

一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，包括以下步骤：

1)通过氨羧反应将氨基修饰的适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-适体复合物；

2)向磁性微球-捕获探针复合物中加入待测样品，使适体与ATP特异性结合，从而将ATP捕获间接联接在磁性微球表面，反应后取固相，即得到ATP适体传感器；

3)将步骤2)所述ATP适体传感器与50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液以及一定单位量的Exo T溶液混匀，而后检测发光信号CL值。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于39℃震荡孵育25min，而后以磁性微球与氨基修饰的适体用量比为1:2(μL:pmoL)的比例加入氨基修饰的适体，于39℃震荡反应70min，而后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相加入12％的BSA溶液，于39℃条件下震荡70min，而后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于AA缓冲溶液中，即得到磁性微球-适体复合物。

步骤2)包括以下操作：取上述磁性微球-适体复合物，加入一定量的待测样品于39℃条件下震荡反应70min后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相，即得到ATP适体传感器。

步骤3)将上述ATP适体传感器重悬于加入50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液中并加入40U的Exo T，反应条件为39℃震荡5h。

步骤3)取固相后利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，然后加入PG溶液，混匀并立即放入化学发光检测器中测定。

上述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为3:3(mmoL:μL)。

以上所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。

实施例5

一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，包括以下步骤：

1)通过氨羧反应将氨基修饰的适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-适体复合物；

2)向磁性微球-捕获探针复合物中加入待测样品，使适体与ATP特异性结合，从而将ATP捕获间接联接在磁性微球表面，反应后取固相，即得到ATP适体传感器；

3)将步骤2)所述ATP适体传感器与50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液以及一定单位量的Exo T溶液混匀，而后检测发光信号CL值。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南昌大学

<120> 一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagaacctg ggggagtatt gcggaggaag gt 32

Claims (10)

1.一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)通过氨羧反应将氨基修饰的适体固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-适体复合物；

2)向磁性微球-适体复合物中加入待测样品，使适体与ATP特异性结合，从而将ATP适体间接联接在磁性微球表面，反应后取固相，即得到ATP适体传感器；

3)将步骤2)所述ATP适体传感器与50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液以及一定单位量的Exo T溶液混匀，而后检测发光信号CL值。

2.根据权利要求1所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的适体用量比为2:2～4(μL:pmoL)的比例加入氨基修饰的适体，于35～39℃震荡反应50～70min。

3.根据权利要求2所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相后用WB缓冲溶液洗涤。

4.根据权利要求3所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：利用WB缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的BSA溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min。

5.根据权利要求4所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃条件下震荡50～70min后，取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于AA缓冲溶液中，即得到磁性微球-适体复合物。

6.根据权利要求1所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤2)包括以下操作：取上述磁性微球-适体复合物，加入一定量的待测样品于35～39℃条件下震荡反应55～65min后取固相利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相，即得到ATP适体传感器。

7.根据权利要求1所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤3)将所述ATP适体传感器重悬于50μL的1倍浓度的Exo T缓冲液中并与一定单位量的Exo T溶液混合，反应条件为35～39℃震荡1～5h，而后取固相。

8.根据权利要求1所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤3)取固相后利用WB缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，然后加入PG溶液，混匀并立即放入化学发光检测器中测定。

9.根据权利要求8所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于步骤3)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG溶液的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为2～3:3(mmoL:μL)。

10.根据权利要求1～9任一项所述的一种基于酶切辅助无标记适体传感器的ATP化学发光检测方法，其特征在于所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。

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