CN116735729A - mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用 - Google Patents
mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116735729A CN116735729A CN202310020953.3A CN202310020953A CN116735729A CN 116735729 A CN116735729 A CN 116735729A CN 202310020953 A CN202310020953 A CN 202310020953A CN 116735729 A CN116735729 A CN 116735729A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mrna
- capping
- capping enzyme
- activity
- detecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 203
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 150
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 150
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 116
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 47
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 38
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 37
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 33
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 30
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 30
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 21
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 10
- 108010009595 Inorganic Pyrophosphatase Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 8
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000009617 Inorganic Pyrophosphatase Human genes 0.000 claims description 7
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 claims description 7
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 claims description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 abstract description 24
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 abstract description 24
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 10
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 abstract description 9
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 abstract description 9
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 abstract description 9
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 abstract description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 12
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108010027510 vaccinia virus capping enzyme Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 6
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 6
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 101150077194 CAP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100027050 Inorganic pyrophosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101100245221 Mus musculus Prss8 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 235000012511 Vaccinium Nutrition 0.000 description 2
- 241000736767 Vaccinium Species 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000180579 Arca Species 0.000 description 1
- 101100326791 Caenorhabditis elegans cap-2 gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940042040 innovative drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8827—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving nucleic acids
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用。该mRNA用于检测加帽酶活性，该mRNA的链长为20nt‑40nt，该mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％‑71％。本研究中，经过序列优化的mRNA由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用。
背景技术
近年来，mRNA药物由于研发周期短、扩产容易、成本低、可作用于细胞内外靶点、表达多种蛋白、不进入细胞核、无需体外表达等特征，受到国际学术界和产业界的广泛关注。而在mRNA药物生产研发过程中，mRNA样本制备是必不可少的一步。但是，由于mRNA的稳定性差，存在易被降解、免疫原性不可控等特性，在实际应用中，往往需要对其5'末端添加Cap结构，来提高合成mRNA的稳定性、翻译效率和降低mRNA的免疫原性。
目前，共转录加帽法和酶促反应加帽法是合成5'末端带有帽子结构的mRNA的两种方式。共转录加帽法是在T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应体系中加入mRNA帽结构类似物(如二核苷酸帽类似物ARCA(3′-O-Me-m7GpppG)、m7Gpppm7G或者三核苷酸帽类似物m7GpppA*pG等)，在转录起始时就引入帽类似物，而后转录本沿着帽类似物继续延长，转录完成后就可获得带有帽子结构的mRNA。该方法虽然操作简单，但是由于知识产权的限制，工业应用生产成本高；并且，如果帽结构类似物以错误的方向掺入mRNA则无法有效翻译，会导致目标蛋白产量低。酶促反应加帽法是在加帽酶的催化作用下，以GTP和SAM为底物，在mRNA末端形成5'GpppG帽结构，然后甲基化产生m7GpppG帽(称为Cap 0)，或继续在mRNA Cap-2'-氧甲基转移酶的作用下将Cap0的第一个核苷酸的2'-O位点添加甲基基团，形成带有Cap1结构的mRNA。与共转录加帽相比，酶促反应加帽法具有更高的加帽率(接近100％)，并且形成的是天然的Cap1结构，具有更低的免疫原性。因此，如果能够重复稳定地检测加帽酶的活性对于mRNA创新药研发及生产意义重大。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够重复稳定地检测加帽酶活性的mRNA。
此外，还有必要提供一种加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用。
一种mRNA，所述mRNA用于检测加帽酶活性，所述mRNA的链长为20nt-40nt，所述mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％-71％。
RNase A特异性识别和降解单链RNA上的胞嘧啶核糖核苷酸(C)或尿嘧啶核糖核苷酸(U)残基，常规的mRNA极易被环境中的RNase A污染。本研究中，经过序列优化的mRNA由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。经试验验证，以本研究的mRNA作为待测加帽酶的底物进行加帽反应，并采用HPLC(High PerformanceLiquid Chromatography，高效液相色谱法)检测加帽反应后的mRNA，能够获得待测加帽酶的活性，并将加帽反应后的mRNA稀释10倍和稀释20倍，并重复5个平行，对应RSD分别是0.79％和0.89％，说明重复性良好，检测结果稳定可靠。
在其中一个实施例中，所述mRNA的碱基序列如SEQ ID No.6-SEQ ID No.9所示。
一种加帽酶活性检测试剂盒，包括上述的mRNA。
在其中一个实施例中，还包括：加帽反应试剂，所述加帽反应试剂包括GTP、S-腺苷蛋氨酸、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂。
一种加帽酶活性检测试剂盒，包括用于合成mRNA的引物对，所述mRNA用于检测加帽酶活性，所述mRNA的链长为20nt-40nt，所述mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％-71％。
在其中一个实施例中，所述引物对带有T7启动子，所述引物对包括正向引物与反向引物，所述反向引物含有链长为20nt-40nt且由T碱基和C碱基构成的碱基序列。
在其中一个实施例中，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物选自如SEQ ID No.2-SEQ ID No.5所示的碱基序列中的至少一条。
在其中一个实施例中，还包括：引物退火反应试剂、体外转录反应试剂和加帽反应试剂。
一种加帽酶活性检测系统，包括检测装置和如上述加帽酶活性检测试剂盒。
在其中一个实施例中，所述检测装置为高效液相色谱检测装置。
一种加帽酶活性检测方法，包括如下步骤：
将待测加帽酶与mRNA进行加帽反应，得到反应物，所述mRNA的链长为20nt-40nt，所述mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成；
采用高效液相色谱法或LC-MS方法对所述反应物进行检测并计算获得所述mRNA的5'末端加帽率，得到所述待测加帽酶的活性。
在其中一个实施例中，所述将待测加帽酶与mRNA进行加帽反应的步骤之前，还包括合成所述mRNA的步骤：
将引物对进行退火反应形成含有转录模板，所述引物对带有T7启动子，所述引物对包括正向引物与反向引物，所述反向引物含有链长为20nt-40nt且由T碱基和C碱基构成的碱基序列；
将所述转录模板进行体外转录反应，得到所述mRNA。
在其中一个实施例中，采用高效液相色谱法对所述反应物进行检测并计算获得所述mRNA的5'末端加帽率的步骤包括：采用高效液相色谱法检测所述mRNA和所述反应物的出峰时间和峰面积，根据所述mRNA和所述反应物的出峰时间和峰面积计算得到所述mRNA的5'末端加帽率；
其中，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；洗脱程序包括：0-30min由所述流动相A和所述流动相B的体积占比分别由71％和29％梯度洗脱至65％和25％，30.1min-40min采用体积占比71％的所述流动相A和体积占比为29％的所述流动相B进行洗脱；所述流动相A为pH7.0、0.1M的醋酸三乙胺溶液，所述流动相B含有体积比为25:75的乙腈：pH7.0、0.1M醋酸三乙胺溶液。
上述mRNA、或上述加帽酶活性检测试剂盒、或上述加帽酶活性检测系统、或上述加帽酶活性检测方法在筛选加帽酶中的应用。
附图说明
图1为实施例2中转录后的mRNA产物(即阴性对照)的检测结果图；
图2为实施例2中完全加帽的mRNA的检测结果图；
图3为实施例2中未加帽mRNA和完全加帽mRNA按体积比为1:1混合的检测结果图；
图4为实施例2中瀚海新酶牛痘病毒加帽酶对mRNA加帽的检测结果图；
图5为实施例3中瀚海新酶牛痘病毒加帽酶对mRNA加帽后的检测信号分析图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究一实施方式提供一种mRNA，mRNA用于检测加帽酶活性，mRNA的链长为20nt-40nt，mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％-71％。
RNase A特异性识别和降解单链RNA上的胞嘧啶核糖核苷酸(C)或尿嘧啶核糖核苷酸(U)残基，常规的mRNA极易被环境中的RNase A污染。本研究中，经过序列优化的mRNA由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。
在其中一些实施例中，mRNA的碱基序列中，A碱基的数量占比为29％-71％。此设置的mRNA避免了全是A碱基时容易被降解，具有更好的稳定性，能够重复稳定地用于加帽酶活性检测。
在其中一些实施例中，mRNA的碱基序列如SEQ ID No.6-SEQ ID No.9所示。
具体地，如SEQ ID No.6所示的序列为：5'-pppGGAAGGAGAGGAAGGAAAGGGAAGAAAGAAG-3'。如SEQ ID No.7所示的序列为：5'-pppGGAGAGGGAGGAGGAGGGAGGG-3'。如SEQ ID No.8所示的序列为：5'-pppGGAAAAAGAAGAAAAGAAAGAAAGAAGGAAGAAAGAAG-3'。如SEQ ID No.9所示的序列为：5'-pppGGAAGGAGAGAGGGAGAGGAAAGGAGAAGAAGGAG-3'。
本研究中，经过序列优化的mRNA由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。经试验验证，以本研究的mRNA作为待测加帽酶的底物进行加帽反应，并采用HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)检测加帽反应后的mRNA，能够获得待测加帽酶的活性，并将加帽反应后的mRNA稀释10倍和稀释20倍，并重复5个平行，对应RSD分别是0.79％和0.89％，说明重复性良好，检测结果稳定可靠。
本研究一实施方式提供一种加帽酶活性检测试剂盒，包括上述的用于检测加帽酶活性的mRNA。
用于检测加帽酶活性的mRNA的描述详见上文，此处不再赘述。
在其中一些实施例中，加帽酶活性检测试剂盒还包括加帽反应试剂。加帽反应试剂包括GTP、S-腺苷蛋氨酸、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂。
上述加帽酶活性检测试剂盒中，mRNA由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。
本研究一实施方式提供一种加帽酶活性检测试剂盒，包括用于合成mRNA的引物对，mRNA用于检测加帽酶活性，mRNA的链长为20nt-40nt，mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成。
用于检测加帽酶活性的mRNA的描述详见上文，此处不再赘述。
在其中一些实施例中，引物对带有T7启动子，引物对包括正向引物与反向引物，反向引物含有链长为20nt-40nt且由T碱基和C碱基构成的碱基序列。此设置合成的mRNA的链长为20nt-40nt，碱基序列由A碱基和G碱基构成，能够重复稳定地检测加帽酶活性。需要说明的是，反向引物除了含有链长为20nt-40nt且由T碱基和C碱基构成的碱基序列，还可以含有启动子序列，例如T7启动子序列。
进一步地，正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反向引物选自如SEQ IDNo.2-SEQ ID No.5所示的碱基序列中的至少一条。此设置的mRNA避免了全是A碱基时容易被降解，具有更好的稳定性，能够重复稳定地用于加帽酶活性检测。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5'-CGAAATTAATACGACTCACTATAGGA-3'。如SEQ ID No.2所示的序列为：5'-CTTCTTTCTTCCCTTTCCTTCCTCTCCTTCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC G-3'。如SEQ ID No.3所示的序列为：5'-CCCTCCCTCCTCCTCCCTCTCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCG-3'。如SEQ ID No.4所示的序列为：5'-CTTCTTTCTTCCTTCTTTCTTTCTTTTCTTCTTTTTCCTATAGTGAGTCGTATT AATTTCG-3'。如SEQ ID No.5所示的序列为：5'-CTCCTTCTTCTCCTTTCCTCTCCCTCTCTCCTTCCTATAGTGAGTCGTATTAA TTTCG-3'。
在其中一些实施例中，加帽酶活性检测试剂盒还包括：引物退火反应试剂、体外转录反应试剂和加帽反应试剂。
其中，引物退火反应试剂包括退火缓冲液和DNase/RNase-Free Distilled Water(无核酸酶水或DEPC水)。
体外转录反应试剂包括10×T7 Buffer、ATP、GTP、无机焦磷酸酶、RNaseInhibitor(RNase抑制物)、T7 RNA聚合酶、无核酸酶水或DEPC水。
加帽反应试剂包括GTP、S-腺苷蛋氨酸、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂。
上述加帽酶活性检测试剂盒中，引物对能够合成由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成的mRNA，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。
进一步地，上述加帽酶活性检测试剂盒减少了T7 RNA聚合酶进行体外转录过程中3′-extended的非均一产物的产生，经过优化的模板序列在T7 RNA聚合酶进行体外转录过程中只形成理论序列(例如SEQ ID No.6-SEQ ID No.9所示序列)和比理论序列多一分子AMP的序列产生。经过序列优化的模板DNA和其转录得到的mRNA是加帽酶稳定测活的基础。
本研究一实施方式提供一种加帽酶活性检测系统，包括上述加帽酶活性检测试剂盒、检测装置。
上述加帽酶活性检测试剂盒的具体描述详见上文，此处不再赘述。
在其中一个实施例中，检测装置为高效液相色谱检测装置。高效液相色谱检测装置包括高效液相色谱仪和色谱柱。具体地，色谱柱为DNA Core 1000C18柱。
上述加帽酶活性检测系统包括加帽酶活性检测试剂盒，该试剂盒含有或者能够合成用于检测加帽酶活性的mRNA，该mRNA由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。
进一步地，与磁珠捕获-荧光定量PCR方法相比，本加帽酶活性检测系统采用HPLC方法进行酶活检测，检测信号直接来自于加帽或不加帽的RNA，没有扩增过程，检测信号更加可信；与LC-MS检测方法相比，加帽酶活性检测系统采用HPLC方法进行酶活检测，数据处理过程更加清晰明了，并且重复性更好，检测结果更加可靠。
最好，本加帽酶活性检测系统采用HPLC方法进行酶活检测，测定的加帽与不加帽RNA的信号峰差异显著，而加帽RNA是加帽酶的直接产物，通用性好，能适用于所有的加帽酶活性检测。
本研究一实施方式提供一种加帽酶活性检测方法，包括如下步骤S110-S120：
S110、将待测加帽酶与mRNA进行加帽反应，得到反应物，mRNA的链长为20nt-40nt，mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％-71％。
需要说明的是，mRNA为上述用于检测加帽酶活性的mRNA，具体描述详见上文，此处不再赘述。
在一个具体示例中，将待测加帽酶与mRNA进行加帽反应，得到反应物的步骤包括：将mRNA加入到1.5mL离心管，使用无核酸酶的水稀释至39μL；65℃加热5min；取出离心管置于冰上5min，即得到变性后的mRNA；依次向1.5mL离心管中添加如表4反应体系成分，轻轻混合，37℃孵育1h，然后立即放回冰上；然后进行氯化锂沉淀回收加帽后的mRNA，溶于100μL无核酸酶水中，过滤后置于液相瓶中待检测，即得到反应物。
需要说明的是，表4的加帽反应体系各组分的浓度和体积不限于表中指出的量，可以等比例放大。
表4加帽反应体系(反应体系可以等比放大)
| 成分 | 反应体积/μL |
| 变性后的mRNA | 39 |
| 10×Capping Buffer | 6 |
| GTP(10mM) | 3 |
| SAM(2mM) | 3 |
| 无机焦磷酸酶 | 1.5 |
| RNase抑制剂 | 1.5 |
| 加帽酶 | 3 |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Up to 60 |
在其中一些实施例中，将待测加帽酶与mRNA进行加帽反应的步骤之前，还包括合成mRNA的步骤：S101-S102：
S101、将引物对进行退火反应形成转录模板，引物对带有T7启动子，引物对包括正向引物与反向引物，反向引物含有链长为20nt-40nt且由T碱基和C碱基构成的碱基序列。
此设置合成的mRNA的链长为20nt-40nt，碱基序列由A碱基和G碱基构成，能够重复稳定地检测加帽酶活性。
进一步地，正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反向引物选自如SEQ IDNo.2-SEQ ID No.5所示的碱基序列中的至少一条。此设置合成的mRNA能够重复稳定地检测加帽酶活性。
具体地，如SEQ ID No.1-SEQ ID No.5所示的序列详见上文，此处不再赘述。
在一个具体示例中，引物退火反应体系如表1所示。引物退火程序如表2所示。需要说明的是，表1的引物退火反应体系各组分的浓度和体积不限于表中指出的量，可以等比例放大。
表1引物退火反应体系(反应体系可以等比放大)
| 组分 | 体积/μL |
| 10×Annealing Buffer(退火缓冲液) | 5 |
| T7-F(100μM) | 20 |
| T7-R(100μM) | 20 |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | 5 |
表2引物退火程序
| 温度 | 时间及循环数 |
| 95℃ | 4min |
| 95℃ | 20s，-0.5℃/cycle，150cycle |
| 20℃ | 60min |
| 4℃ | forever |
S102、将转录模板进行体外转录反应，得到mRNA。
具体地，按照表3的体外转录反应体系配制反应液，37℃孵育4h；反应结束后加入2U DNase I 37℃消化30min，然后进行氯化锂沉淀回收mRNA，测定mRNA浓度备用；得到体外合成序列优化的mRNA。需要说明的是，表3的体外转录反应体系各组分的浓度和体积不限于表中指出的量，可以等比例放大。
表3体外转录反应体系(反应体系可以等比放大)
| 组分 | 加入体积/μL |
| 10× T7 Buffer | 2 |
| ATP/GTP(100mM each) | 4each |
| 上述Annealing Mix | 2 |
| 无机焦磷酸酶 | 1 |
| RNase Inhibitor(40U/μL) | 1 |
| T7 RNA聚合酶(50U/μL) | 2 |
| 无核酸酶水或DEPC水 | Up to 20 |
S120、采用高效液相色谱法或LC-MS方法检测对反应物进行检测并计算获得mRNA的5'末端加帽率，得到待测加帽酶的活性。
可以理解，mRNA即未加帽的mRNA，反应物可能含有加帽后的mRNA；例如：若待测加帽酶具有加帽酶活性，则反应物含有加帽后的mRNA。
在其中一些实施例中，采用高效液相色谱法对反应物进行检测并计算获得mRNA的5'末端加帽率的步骤包括：采用高效液相色谱法检测mRNA和反应物的出峰时间和峰面积，根据mRNA和反应物的出峰时间和峰面积计算得到mRNA的5'末端加帽率。
在其中一些实施例中，采用高效液相色谱法检测mRNA和反应物的出峰时间和峰面积的步骤中，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱。洗脱程序包括：0-30min由流动相A和流动相B的体积占比分别由71％和29％梯度洗脱至65％和25％，30.1min-40min采用体积占比71％的流动相A和体积占比为29％的流动相B进行洗脱。流动相A为pH7.0、0.1M的醋酸三乙胺溶液。流动相B含有体积比为25:75的乙腈：pH7.0、0.1M醋酸三乙胺溶液。
进一步地，色谱柱为DNA Core 1000C18柱，4.6×150mm，填料粒径为5μm。流速为1mL/min。柱温为60℃。检测波长为280nm。进样体积为20μL。
在其中一些实施例中，通过比较mRNA和反应物的出峰时间和峰面积，计算待测加帽酶的活性，mRNA的出峰时间为T3和T4，mRNA的峰面积为M3和M4，反应物在出峰时间T3和T4处未出峰，或在早于T3且T3与T4之间的时间有出峰，则说明待测加帽酶具有加帽酶活性。
进一步地，S120的步骤包括：待测加帽酶采用高效液相色谱法检测mRNA、完全加帽的mRNA和反应物的出峰时间和峰面积，完全加帽的mRNA的出峰时间分别为T1和T2，完全加帽的mRNA的峰面积分别为M1和M2，mRNA出峰时间分别为T3和T4，mRNA的峰面积分别为M3和M4反应物在出峰时间T3和T4处未出峰，或在早于T3且T3与T4之间的时间有出峰，即反应物在T1和T2处出峰或在T1-T4都出峰，则说明待测加帽酶具有加帽酶活性。(出峰时间T1，T2，T3和T4均未检测到峰，说明该次检测异常，需重检测)。其中，完全加帽的mRNA通过过量加帽酶加帽反应后，纯化回收的方式得到。
具体地，根据检测mRNA、完全加帽的mRNA和反应物的出峰时间和峰面积计算待测加帽酶的加帽率，得到待测加帽酶加帽酶的活性。mRNA的出峰时间为T3和T4，mRNA的峰面积M3和M4，加帽率为100％-M3-M4＝0。完全加帽mRNA的出峰时间为T1和T2，完全加帽mRNA的峰面积M1和M2，加帽率为M1+M2＝100％。反应物的出峰时间为T1，T2或T3，T4，反应物的峰面积为M1，M2或M3，M4，加帽率为M1+M2或100％-M3-M4。
常见的加帽酶活性检测方法目前主要针对牛痘病毒加帽酶，包括放射性同位素检测法，细胞转染法和液相质谱法等。放射性检测法是将含有放射性32P-GTP底物加到GTP中，在牛痘病毒加帽酶的作用下形成放射性的加帽mRNA，通过检测产物的放射性强度来测定加帽酶的活性。该方法安全性低，操作繁琐，对实验环境要求高且无法定量检测；细胞转染法通过比较荧光蛋白表达基因mRNA在加帽和不加帽情况下转染细胞，观察细胞内荧光蛋白的表达量来测定牛痘病毒加帽酶的活性。该方法操作简便，但灵敏度低，干扰因素多检测结果只能定性观察，难以定量计算，酶活测定误差大。一研究公开了一种利用液相质谱比较加帽前后产物的分子量差异来测定牛痘病毒加帽酶活性的方法。该方法体外转录序列未经过优化，在T7 RNA聚合酶催化的体外转录反应中容易形成多种3′-extended的非均一产物，导致质谱检测目的片段的分子量不准确；即使偶尔能正确检测出目的片段的分子量，也需要高灵敏度质谱进行分析加帽mRNA所占比例，而且同一个样品在不同时间进行质谱分析时会有不同程度的加钠分子出现，对结果的分析形成干扰，导致分析数据获得准确结果的耗时过长。另一研究也公开了一种检测牛痘病毒加帽酶活性的方法，该方法首先通过3'-biotin-GTP和牛痘病毒加帽酶对mRNA进行加帽反应，然后用链霉亲和素标记的磁珠捕获加帽mRNA，再以磁珠捕获的加帽mRNA为模板进行RT-qPCR扩增，通过加帽前后CT值差异来判定牛痘病毒加帽酶的活性。该方法操作步骤繁琐，耗时长，而且要结合PCR才能实现检测，检测信号来自于扩增产物，而不是加帽后的mRNA，是一种间接的检测方法，同时该方法重现性有待证明。
因此，针对现有技术存在的缺陷，本研究的加帽酶活性检测方法是一种稳定性好、通用性高、安全有效、快速直接、低成本，并且能够高通量筛选加帽酶及突变体活性的检测方法。本研究的加帽酶活性检测方法至少具有如下优点：
与放射性标记相比，本方法避免了放射性标记造成的污染，安全性更高；与体外翻译法相比，本方法的检测结果可以数值化定量输出，避开了定性观察时主观因素造成的影响，并且可以实现高通量、自动化检测。
与磁珠捕获-荧光定量PCR方法相比，本方法检测信号直接来自于加帽或不加帽的RNA，没有扩增过程，检测信号更加可信。
再者，本方法测定的加帽与不加帽RNA的信号峰差异显著，而加帽RNA是加帽酶的直接产物，因此，本方法的通用性好，能适用于所有的加帽酶活性检测。
最后，本研究的加帽酶活性检测方法，利用T7 RNA聚合酶以序列优化的DNA模板进行体外转录合成mRNA，回收后的mRNA作为底物在加帽酶的催化下进行酶促加帽反应，加帽反应产物回收后用HPLC或LC-MS方法对所述反应物进行检测并计算获得mRNA的5'末端加帽率，得到待测加帽酶的活性，样品检测灵敏度高，重复性好，操作简单，并且能够实现高通量，具有很好的工业应用价值。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
如无特别说明，以下实施例中所需的试剂及耗材：10×Annealing Buffer(退火缓冲液)：100mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM EDTA，1mM NaCl(所有试剂均为分子级)；无水乙醇，乙腈，乙酸，三乙胺，DNase I(RNase-free)，DNase/RNase-Free Distilled Water，氯化锂；各个量程的艾本德移液枪对应吸头、过滤器、注射器、0.22μM滤膜、内嵌管、液相小瓶、色谱柱DNA Core 1000C184.6×150mm 5μm等。
如无特别说明，以下实施例中所需的仪器：离心机、漩涡震荡器、恒温水浴锅、超净工作台、PCR仪、真空泵、液相仪等。
实施例1体外合成序列优化的mRNA
1、引物T7-F和T7-R的设计
带有T7启动子的引物对T7-F与T7-R一定条件下退火，形成转录模板，具体序列如下：
T7-F1引物如下：
5'-CGAAATTAATACGACTCACTATAGGA-3'(如SEQ ID No.1所示)；
T7-R1引物如下：
5'-CTTCTTTCTTCCCTTTCCTTCCTCTCCTTCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCG-3'(如SEQ IDNo.2所示)。
T7-R2引物如下：
5'-CCCTCCCTCCTCCTCCCTCTCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCG-3'(如SEQ ID No.3所示)。
T7-R3引物如下：
5'-CTTCTTTCTTCCTTCTTTCTTTCTTTTCTTCTTTTTCCTATAGTGAGTC GTATTAATTTCG-3'(如SEQ ID No.4所示)。
T7-R4引物如下：
5'-CTCCTTCTTCTCCTTTCCTCTCCCTCTCTCCTTCCTATAGTGAGTCGT ATTAATTTCG-3'(如SEQ ID No.5所示)。
体外合成目的mRNA的序列如下：
31nt mRNA的核苷酸序列如下：
5'-pppGGAAGGAGAGGAAGGAAAGGGAAGAAAGAAG-3'(如SEQ IDNo.6所示)。
22nt mRNA的核苷酸序列如下：
5'-pppGGAGAGGGAGGAGGAGGGAGGG-3'(如SEQ ID No.7所示)。
38nt mRNA的核苷酸序列如下：
5'-pppGGAAAAAGAAGAAAAGAAAGAAAGAAGGAAGAAAGAAG-3'(如SEQ ID No.8所示)。
35nt mRNA的核苷酸序列如下：
5'-pppGGAAGGAGAGAGGGAGAGGAAAGGAGAAGAAGGAG-3'(如SEQ ID No.9所示)。
由于环境中最容易污染RNase A，RNase A特异性识别和降解单链RNA上的胞嘧啶核糖核苷酸(C)或尿嘧啶核糖核苷酸(U)残基。但是经过序列优化的mRNA只由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解。同时减少了T7 RNA聚合酶进行体外转录过程中3′-extended的非均一产物的产生，经过优化的模板序列在T7 RNA聚合酶进行体外转录过程中只有理论序列(如SEQ ID No.6-SEQ ID No.9所示)和比理论序列多一分子AMP的序列产生(见图1B和图2B中两个峰簇)。经过序列优化的模板DNA和其转录得到的mRNA是加帽酶稳定测活的基础。
2、引物退火反应
1)引物退火反应体系如表1所示。
表1引物退火反应体系(反应体系可以等比放大)
| 组分 | 体积/μL |
| 10×Annealing Buffer(退火缓冲液) | 5 |
| T7-F(100μM) | 20 |
| T7-R(100μM) | 20 |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | 5 |
2)引物退火程序如表2所示。
表2引物退火程序
| 温度 | 时间及循环数 |
| 95℃ | 4min |
| 95℃ | 20s，-0.5℃/cycle，150cycle |
| 20℃ | 60min |
| 4℃ | forever |
PCR程序结束后，获得Annealing Mix(退火混合物)，置于-20℃备用。
3、体外转录
具体地，体外转录反应体系如表3所示。
表3体外转录反应体系(反应体系可以等比放大)
| 组分 | 加入体积/μL |
| 10× T7 Buffer | 2 |
| ATP/GTP(100mM each) | 4each |
| 上述Annealing Mix | 2 |
| 无机焦磷酸酶 | 1 |
| RNase Inhibitor(40U/μL) | 1 |
| T7 RNA聚合酶(50U/μL) | 2 |
| 无核酸酶水或DEPC水 | Up to 20 |
37℃孵育4h；反应结束后加入2U DNase I 37℃消化30min，然后进行氯化锂沉淀回收mRNA，测定mRNA浓度备用；得到体外合成序列优化的mRNA。
实施例2加帽酶对mRNA进行加帽反应(以31nt mRNA为例，即如SEQ IDNo.6所示序列)
取15μg体外转录后经过氯化锂纯化的mRNA(31nt即如SEQ ID No.6所示序列)到1.5mL离心管，使用无核酸酶的水稀释至39μL；65℃加热5min；取出离心管置于冰上5min，依次向1.5mL离心管中添加如表4反应体系成分。
表4加帽反应体系(反应体系可以等比放大)
| 成分 | 反应体积/μL |
| 变性后的mRNA | 39 |
| 10×Capping Buffer | 6 |
| GTP(10mM) | 3 |
| SAM(2mM) | 3 |
| 无机焦磷酸酶 | 1.5 |
| RNase抑制剂 | 1.5 |
| 加帽酶 | 3 |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Up to 60 |
注：阴性对照组(未加帽)反应体系中的加帽酶3μL替换成等体积的无核酸酶水。
轻轻混合，37℃孵育1h，然后立即放回冰上；然后进行氯化锂沉淀回收加帽后的mRNA，溶于100μL无核酸酶水中，过滤后置于液相瓶中待检测。
实施例3HPLC法分析加帽酶的活性(以31nt mRNA为例，即如SEQ ID No.6所示序列)
1、HPLC检测条件准备
使用色谱柱DNA Core 1000C18 4.6×150mm 5μm，配制流动相：A：0.1M醋酸三乙胺溶液，pH7.0，B：乙腈：0.1M醋酸三乙胺溶液(pH7.0)＝25:75，设置仪器检测参数流速：1mL/min，柱温：60℃；检测波长：280nm；进样体积：20μL；按照表格5设置样品检测的流动相梯度条件。
表5样品检测的色谱条件
| 时间 | A(％) | B(％) |
| 0 | 71 | 29 |
| 30 | 65 | 35 |
| 30.1 | 71 | 29 |
| 40 | 71 | 29 |
2、HPLC检测加帽酶活性
步骤一：合成退火引物T7-F和T7-R1，混合引物后退火，得到转录模板，其中，所述T7-F和T7-R1引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
步骤二：加入ATP和GTP，通过T7 RNA聚合酶进行体外转录，纯化回收RNA；
步骤三：在加帽酶的作用下在转录产物mRNA的5'端加帽；
步骤四：利用HPLC检测加帽反应的产物，比较加帽前后mRNA的出峰时间和峰面积，计算加帽酶的活性。
使用上述检测方法检测待测样品，阴性对照组(图1)，阳性对照组1(图2)，阳性对照组2(图3)，实验组(图4)，其中图1为未加帽的mRNA；图2为完全加帽的mRNA；图3为未加帽mRNA和完全加帽mRNA按体积比1：1混合；图4为瀚海新酶公司的牛痘病毒加帽酶对mRNA加帽的结果。
本实施检测步骤所需时间为40min，图1结果显示未加帽mRNA的出峰时间17.689min和19.713min，峰面积百分比为60.10％和39.9％；图2结果显示完全加帽mRNA的出峰时间17.663min和19.755min，峰面积百分比为59.43％和40.57％；图3结果显示未加帽mRNA和完全加帽mRNA按体积比1：1混合，加帽mRNA出峰时间是18.562min和20.697min，对应峰面积百分比为30.91％和22.11％，未加帽mRNA出峰时间是19.454min和21.601min，对应峰面积百分比为27.45％和19.53％，说明该方法可以分离加帽前后的mRNA；而图4结果与图3一致，说明mRNA加帽成功，该酶具有加帽活性。HPLC出峰时间和峰面积百分比如表6所示。
表6出峰时间和峰面积百分比
/>
3、一种检测加帽酶活性方法的重复性验证(以31nt mRNA为例)
对实施例三中的实验组分别稀释10倍和20倍，每组重复5次制备检测样品，采用实施例三中的方法进行酶活的测定，结果如下(表7)：
表7酶活测定方法的重复性验证
结果显示稀释10倍和稀释20倍对应的平行组实验结果重复性良好,对应RSD分别是0.79％和0.89％，说明检测结果可靠；并且相同条件下，将加帽酶稀释10倍加帽率高于稀释20倍，说明本方法能够准确区分不同活性的加帽酶。同时，采用LC-MS法对相同的样本进行酶活性检测的重复性验证，其检测结果与HPLC的重复性检测结果一致，重复性良好。当使用优化后的序列时，不论是HPLC法，还是LC-MS法都可以获得稳定的加帽酶活性检测结果。但是相对HPLC法而言，LC-MS是通过分析物质理论和实际分子量大小，根据仪器检测的信号强度百分比来计算加帽率，数据获得准确结果耗时过长。
实施例4比较HPLC和LC-MS方法检测牛痘病毒加帽酶活性(以31nt mRNA为例)
步骤1：合成退火引物T7-F和T7-R1，混合引物后退火，得到转录模板，其中，T7-F和T7-R1引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；
步骤2：加入ATP和GTP，通过T7 RNA聚合酶进行体外转录，纯化回mRNA；
步骤3：在加帽酶的作用下对转录产物mRNA的5'端加帽；
步骤4：首先，利用LC-MS检测mRNA 5'末端加帽率，从而判定牛痘病毒加帽酶的活性。检测结果和图5A和表8所示，根据质谱分析显示检测到Uncapped RNA及Capped RNA的质荷比和信号强度，然后通过计算，结果表明待测加帽酶加帽率为92.96％。
表8LC-MS测定法的结果分析
同时，使用HPLC方法检测该批次加帽酶的活性，检测结果如图5B和表9所示，根据出峰时间和峰面积可以得到待检牛痘病毒加帽酶加帽率为88.38％，检测结果与上述LC-MS基本一致。但是，在数据处理上，HPLC法一目了然的展示加帽RNA和未加帽RNA的比例，计算加帽率简便迅速；而LC-MS要根据mRNA的理论分子量，在质谱峰找到加帽RNA和未加帽RNA的峰，因不同的Na+修饰产物影响特定峰的定位而影响加帽率的判断，导致结果分析耗时相对较长。
表9HPLC测定法的结果分析
综上，本研究的mRNA、加帽酶活性检测试剂盒中，经过序列优化的mRNA由腺嘌呤核糖核苷酸(A)和鸟嘌呤核糖核苷酸(G)组成，最大程度减少了其被环境中RNase的降解，能够重复稳定地检测加帽酶活性，以便稳定、高效地筛选加帽酶及其突变株。本研究的加帽酶活性检测系统和检测方法，采用特定mRNA并结合高效液相色谱法，能够稳定性好、通用性高、安全有效、快速直接、低成本地检测加帽酶活性，能够高通量筛选加帽酶及突变体活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
具体详见电子序列表。
Claims (14)
1.一种mRNA，其特征在于，所述mRNA用于检测加帽酶活性，所述mRNA的链长为20nt-40nt，所述mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％-71％。
2.根据权利要求1所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA的碱基序列如SEQ ID No.6-SEQID No.9任一碱基序列所示。
3.一种加帽酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的mRNA。
4.根据权利要求3所述的加帽酶活性检测试剂盒，其特征在于，还包括：加帽反应试剂，所述加帽反应试剂包括GTP、S-腺苷蛋氨酸、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂。
5.一种加帽酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括用于合成mRNA的引物对，所述mRNA用于检测加帽酶活性，所述mRNA的链长为20nt-40nt，所述mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％-71％。
6.根据权利要求5所述的加帽酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述引物对带有T7启动子，所述引物对包括正向引物与反向引物，所述反向引物含有链长为20nt-40nt且由T碱基和C碱基构成的碱基序列。
7.根据权利要求6所述的加帽酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物选自如SEQ ID No.2-SEQ ID No.5所示的碱基序列中的至少一条。
8.根据权利要求5-7任一项所述的加帽酶活性检测试剂盒，其特征在于，还包括：引物退火反应试剂、体外转录反应试剂和加帽反应试剂。
9.一种加帽酶活性检测系统，其特征在于，包括检测装置和如权利要求3-8任一项所述的加帽酶活性检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的加帽酶活性检测系统，其特征在于，所述检测装置为高效液相色谱检测装置或LC-MS装置。
11.一种加帽酶活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待测加帽酶与mRNA进行加帽反应，得到反应物，所述mRNA的链长为20nt-40nt，所述mRNA的碱基序列由A碱基和G碱基构成，A碱基的数量占比为29％-71％；
采用高效液相色谱法或LC-MS方法对所述反应物进行检测并计算获得所述mRNA的5'末端加帽率，得到所述待测加帽酶的活性。
12.根据权利要求11所述的加帽酶活性检测方法，其特征在于，所述将待测加帽酶与mRNA进行加帽反应的步骤之前，还包括合成所述mRNA的步骤：
将引物对进行退火反应形成含有转录模板，所述引物对带有T7启动子，所述引物对包括正向引物与反向引物，所述反向引物含有链长为20nt-40nt且由T碱基和C碱基构成的碱基序列；
将所述转录模板进行体外转录反应，得到所述mRNA。
13.根据权利要求11-12任一项所述的加帽酶活性检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法对所述反应物进行检测并计算获得所述mRNA的5'末端加帽率的步骤包括：采用高效液相色谱法检测所述mRNA和所述反应物的出峰时间和峰面积，根据所述mRNA和所述反应物的出峰时间和峰面积计算得到所述mRNA的5'末端加帽率；
其中，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；洗脱程序包括：0-30min由所述流动相A和所述流动相B的体积占比分别由71％和29％梯度洗脱至65％和25％，30.1min-40min采用体积占比71％的所述流动相A和体积占比为29％的所述流动相B进行洗脱；所述流动相A为pH7.0、0.1M的醋酸三乙胺溶液，所述流动相B含有体积比为25:75的乙腈：pH7.0、0.1M醋酸三乙胺溶液。
14.权利要求1-2任一项所述的mRNA、或权利要求3-8任一项所述的加帽酶活性检测试剂盒、或权利要求9-10任一项所述的加帽酶活性检测系统、或权利要求11-13任一项所述的加帽酶活性检测方法在筛选加帽酶中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310020953.3A CN116735729A (zh) | 2023-01-07 | 2023-01-07 | mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310020953.3A CN116735729A (zh) | 2023-01-07 | 2023-01-07 | mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116735729A true CN116735729A (zh) | 2023-09-12 |
Family
ID=87899980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310020953.3A Pending CN116735729A (zh) | 2023-01-07 | 2023-01-07 | mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116735729A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116949137A (zh) * | 2023-09-20 | 2023-10-27 | 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 | RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途 |
-
2023
- 2023-01-07 CN CN202310020953.3A patent/CN116735729A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116949137A (zh) * | 2023-09-20 | 2023-10-27 | 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 | RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途 |
| CN116949137B (zh) * | 2023-09-20 | 2023-12-22 | 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 | RNA沉淀液在检测mRNA加帽效率中的用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210230578A1 (en) | Removal of dna fragments in mrna production process | |
| Baronti et al. | A guide to large-scale RNA sample preparation | |
| Liu et al. | Synthesis and applications of RNAs with position-selective labelling and mosaic composition | |
| Kellner et al. | Detection of RNA modifications | |
| EP2246428A1 (en) | Modified trna containing non-natural nucleotide and use thereof | |
| CN111500775B (zh) | 一种SARS-CoV-2病毒的RNA标准物质的制备方法 | |
| CN108841934B (zh) | 一种全转录组范围单碱基分辨率检测rna内部n7-甲基鸟苷修饰的方法及试剂盒 | |
| US20200325532A1 (en) | Polya tail length analysis of rna by mass spectrometry | |
| CN116735729A (zh) | mRNA、加帽酶活性检测试剂盒及检测系统和检测方法、应用 | |
| WO2024082909A1 (zh) | 一种实时监测体外转录合成rna的检测方法 | |
| CN114480570B (zh) | 一种检测mRNA 2′-O-甲基转移酶活性的方法 | |
| CN114250268A (zh) | 检测mRNA样品的加帽效率的产品及用途 | |
| Muthmann et al. | Quantification of mRNA cap-modifications by means of LC-QqQ-MS | |
| CN116515927A (zh) | 一种测定mRNA 3’Poly(A)尾长度及其分布的方法 | |
| CN116626142A (zh) | 一种检测mRNA Poly(A)尾长度的方法 | |
| CN116426610B (zh) | 一种LC-MS法准确定量mRNA加帽效率的方法 | |
| WO2023077720A1 (zh) | 一种核酸代谢酶活性检测方法 | |
| CN116640833A (zh) | 一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mRNA加帽率的方法 | |
| CN116497019A (zh) | 一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液及转录反应体系 | |
| CN114395613B (zh) | 一种检测牛痘病毒加帽酶活性的方法 | |
| CN117677710A (zh) | 用于定量评估mRNA加帽效率的测定 | |
| CN113025686A (zh) | 一种病毒rna释放剂、试剂盒及其应用 | |
| WO2023115495A1 (zh) | 质谱法检测mRNA加帽效率的方法 | |
| Wang et al. | EmPC-seq: Accurate RNA-sequencing and bioinformatics platform to map RNA polymerases and remove background error | |
| CN111378730A (zh) | 一种多重逆转录聚合酶链式反应检测试剂缓冲液及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |