CN108841934B - 一种全转录组范围单碱基分辨率检测rna内部n7-甲基鸟苷修饰的方法及试剂盒 - Google Patents

一种全转录组范围单碱基分辨率检测rna内部n7-甲基鸟苷修饰的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的方法及试剂盒，属于基因测序技术领域，所述方法包括以下步骤：将所述样本细胞全转录组RNA断裂为片段化RNA；用硼氢化钠还原片段化RNA后；用苯胺盐酸盐断裂还原RNA，并在断裂后的RNA两端连接测序接头；反转录后，用测序引物进行PCR扩增构建测序文库；对所述测序文库进行测序获得测序数据；分析所述测序数据得到RNA断点次数和测序深度的比值，所述比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。本方法利用测序结果分析不仅可以分析m7G修饰在转录组中的分布还可以确定m7G修饰在转录组中的具体位点。

Description

一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部N7-甲基鸟苷修 饰的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，尤其涉及一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的方法及试剂盒。
背景技术
RNA作为中心法则中位于DNA和蛋白之间的一个纽带，不仅负责传递遗传信息，也具备多种转录后调控功能，但它们在以往的研究中常常被忽视。最近几年，随着研究手段的不断进步，包括测序技术、质谱等分析方法的革新，以及化学生物学研究思想的引入，人们对那些早已被发现但并未引起足够关注的RNA修饰产生了巨大的研究兴趣。
最初，人们分析RNA中的各种修饰，都只能通过质谱、高效液相等仪器分析方法进行定性和定量分析。由于新一代测序技术的广泛应用，现在已经可以精确的定位各种修饰核苷在转录组中的位置。早在2012年，就有科学家们利用修饰核苷的特异性抗体对RNA片段进行免疫沉淀，对RNA片段进行富集然后再进行二代测序。这种方法主要包括RIP-seq和CLIP-seq。RIP-seq是基于特殊的抗体对修饰核苷的特异结合，从而对修饰核苷富集进而测序；这种方法灵敏性很高，但是对修饰核苷特异性的抗体要求很高，而且还缺乏单碱基分辨率。CLIP-seq是基于特殊的抗体与修饰核苷结合后，用紫外光照射可以使修饰核苷附近某个特定位点发生突变，再进行富集然后测序；这种方法不仅灵敏度高还能做到单碱基分辨率，但是这种方法对抗体的要求比RIP-seq对抗体的要求更高了。由于这种基于抗体的方法对抗体的要求极高，而且现在市场上对各种修饰核苷的抗体也很缺乏，因而很多科学家们将自己的注意力又集中在了能与修饰核苷反应的各种化学试剂上。基于这种化学试剂的方法主要有三种：a.化合物与修饰核苷结合后可以使逆转录酶无法跨过从而提前终止，通过检测这种终止位点可以判断修饰核苷的位点；b.有些化合物可以与修饰核苷反应从而使与修饰核苷相连的磷酸二酯键断裂，通过检测这种断裂位点也可以检测修饰核苷的位点；c.有的化合物可以使修饰核苷发生改变，变成另外一种核苷，通过检测这种改变后的核苷就可以判断修饰核苷的位点。这种基于化学试剂检测修饰核苷的方法具有很高的单分辨率，但是这种方法也会受到很多因素的影响，例如：RNA二级结构、结合蛋白的存在及其他修饰核苷的存在等。RNA上存在的有些RNA修饰，在RNA逆转录的过程中会阻止逆转录酶通过从而导致逆转录的提前终止，但是在去修饰酶处理后，逆转录就可以顺利进行了。通过这种方法也可以检测修饰核苷的存在。
N7-甲基鸟苷(m7G)是鸟嘌呤核苷的第七个氮原子上发生了甲基化修饰，现在主要发现存在于真核生物的5-端帽子结构中。mRNA 5’-端帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。帽子结构可增加mRNA的稳定性，保护mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻击。还有文献报道帽子结构能够影响RNA的剪切、多聚A腺苷酸尾的形成以及mRNA的核输出。还有文献报道，m7G存在于一些物种的核糖体RNA中，例如大肠杆菌的16S rRNA、酵母17S rRNA、鸡的18S rRNA以及大鼠的18S rRNA；还存在于酵母的tRNA，叶绿体的tRNA和斑马鱼线粒体tRNA。虽然这些文献都有报道m7G的存在，但是都是些非常零散的报道或者是用某一种类型的RNA进行分析，到现在为止没有一种方法能够用于全转录组范围的分析。
对于RNA内部存在的m7G修饰的检测，最开始也是用色谱、质谱或色质联用的方法检测，但是基于色谱质谱的方法只能判断RNA内部是否存在m7G修饰，而不能得到哪个位点存在m7G修饰。后来科学家们发现碱溶液可以使m7G核苷的嘌呤环断开进而在酸性条件下可以使m7G核苷相连的磷酸二酯键发生断裂，从而就可以通过断裂位点来判断m7G核苷修饰的位点。但是碱溶液很容易使其他的核苷也发生反应，并且也很容易使RNA降解，因此特异性不高。硼氢化钠是一种常用的还原剂，能够特异的使RNA链中的m7G核苷发生还原反应，还原后的RNA可以在苯胺盐酸盐的作用下使与m7G核苷相连的磷酸二酯键断裂，通过检测断裂的片段也可以判断m7G核苷的位点。到目前为止，这两种基于化学试剂检测m7G核苷位点的方法都是利用放射性元素标记进行检测，使得方法的危害性增加，并且只能应用于丰度高的tRNA和rRNA检测，对于低丰度的mRNA和小RNA都不适用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种安全的、适用全转录组范围(mRNA、tRNA、rRNA和miRNA)的、具有单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的试剂盒及方法，所述方法不仅能够检测m7G修饰在转录组中的分布还可以检测m7G修饰在转录组中的具体位点。本发明所述方法的突破让发现生物体内转录组中m7G修饰存在及研究其在生物体内的功能成为可能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的方法，包括以下步骤：1)提取样本细胞总RNA获得样本细胞全转录组RNA；2)将所述样本细胞全转录组RNA断裂为100～300bp的片段化RNA；3)用硼氢化钠溶液还原所述片段化RNA获得还原RNA；4)所述还原后的30s内，用苯胺盐酸盐溶液断裂所述还原RNA，在所述断裂后的RNA两端连接测序接头；反转录连有测序接头的RNA片段后，用测序引物进行PCR扩增构建测序文库；5)对所述测序文库进行测序获得测序数据；6)分析所述测序数据得到RNA断点次数和测序深度的比值，所述比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。
优选的，步骤2)中所述的断裂采用二价镁离子实现。
优选的，步骤3)中所述硼氢化钠的浓度为4.5～5.5M。
优选的，所述片段化RNA的浓度为30～200ng/μl。
优选的，所述硼氢化钠与片段化RNA的体积比为1：(2～3)。
优选的，步骤4)中所述苯胺盐酸盐的浓度为1.8～2.2M，。
优选的，步骤4)中所述断裂的温度为58～62℃，所述断裂的时间为17～23min。
优选的，所述样本细胞为病理组织细胞或正常生理组织细胞。
本发明还提供了一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的试剂盒，包括使用说明书和试剂；所述试剂包括含二价镁离子的RNA片段化溶液，4.5～5.5M的硼氢化钠溶液，1.8～2.2M苯胺盐酸盐溶液，pH7.5的Tris-HCl，m7G核苷，RNase inhibitor，测序接头，Illumina测序引物。
本发明的有益效果：本发明所述的一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的方法，利用硼氢化钠特异的选择性还原带修饰的m7G，然后再将还原的RNA迅速与苯胺盐酸盐反应，从而使RNA序列形成两个不同的片段。前一个片段(片段A)在断裂位点只剩下m7G的一部分，而后一个片段(片段B)则会在断裂位点的后一个碱基的5’位置上留下一个磷酸基团。然后在片段B加上测序接头，进行反转录，再用测序引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序。利用测序结果分析不仅可以分析m7G修饰在转录组中的分布还可以确定m7G修饰在转录组中的具体位点。这种技术突破让发现生物体内转录组中m7G修饰存在及研究其在生物体内的功能成为可能。
附图说明
图1为实施例1中大肠杆菌16srRNA上的m7G修饰检测结果；
图2为实施例1大肠杆菌23srRNA上的m7G修饰检测结果；
图3为实施例2中人HEK293T细胞系18s rRNA上的m7G修饰检测结果。
具体实施方式
本发明的发明构思：硼氢化钠是一种常用的还原剂，能特异的选择性还原带修饰的m7G；还原后的m7G长时间暴露在空气中又会氧化成原来的m7G，但是如果迅速与苯胺盐酸盐溶液反应就会使m7G碱基与后面相连的碱基之间的磷酸二酯键断裂，从而使RNA序列形成两个不同的片段。前一个片段(片段A)在断裂位点只剩下m7G的一部分，而后一个片段(片段B)则会在断裂位点的后一个碱基的5’位置上留下一个磷酸基团。然后再利用片段B上留下的磷酸基团，在5’端加上一个5’RNAadaptor，在3’端加上一个3’DNAadaptor，然后利用3’端的反转录引物进行反转录PCR扩增，再用测序平台的测序引物进行扩增即可完成在全转录组检测m7G修饰的二代测序文库构建。这种建库方法可以利用测序结果分析不仅可以知道m7G修饰在转录组中的分布还可以知道m7G修饰在转录组中的具体位点。这种技术突破让发现生物体内转录组中m7G修饰存在及研究其在生物体内的功能成为可能。
本发明的技术方案：一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的方法，包括以下步骤：1)提取样本细胞总RNA获得样本细胞全转录组RNA；2)将所述样本细胞全转录组RNA断裂为100～300bp的片段化RNA；3)用硼氢化钠还原片段化RNA获得还原RNA；4)30s内，用苯胺盐酸盐断裂还原RNA，并在断裂后的RNA两端连接测序接头；反转录连有测序接头的RNA片段后，用测序引物进行PCR扩增构建测序文库；5)对所述测序文库进行测序获得测序数据；6)分析所述测序数据得到RNA断点次数和测序深度的比值，所述比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。
在本发明中，提取样本细胞总RNA获得样本细胞全转录组RNA。本发明对所述样本细胞的种类没有特殊限定，可以为各种生物样本细胞；优选为病理组织细胞或正常生理组织细胞，在本发明具体实施过程中，所述样本细胞为血液样本细胞、皮肤样本细胞、微生物细胞。在本发明中，所述样本细胞的数量优选为(1～9)×106个。在本发明中，组织细胞的收集优选的为将细胞培养物用胰酶消化后，用PBS溶液漂洗两遍，离心收集细胞。在本发明中，所述微生物细胞的收集优选为将微生物培养液离心，收集细胞。在本发明中，所述提取样本细胞总RNA的方法采用本领域常规的RNA提取方法即可，无其他特殊要求。在本发明具体实施过程中采用总RNA提取试剂盒或氯仿分离异丙醇沉淀的方法。
本发明在获得样本细胞全转录组RNA后，将所述样本细胞全转录组RNA断裂为100～300bp的片段化RNA。在本发明中所述断裂优选的采用二价镁离子实现，更优选的采用RNA片段化缓冲液实现，具体的采用NEB RNA Fragmentation Buffer(New England Biolabs,USA)实现，NEB RNA Fragmentation Buffer(New England Biolabs,USA)中的二价镁离子可以使RNA中的磷酸二酯键断裂而不破坏相连碱基。在本发明具体实施过程中，优选的将样本细胞全转录组RNA与NEB RNA Fragmentation Buffer以(8～10)：1的体积比混合，更有选的在20μL体系中，加入18μL的样本细胞全转录组RNA和2μL的NEB RNAFragmentationBuffer；其中样本细胞全转录组RNA的浓度优选为0.1～1μg/μL。本发明在获得片段化RNA后，优选的还包括对断裂后的RNA进行纯化的步骤，本发明中所述纯化采用本领域常规的RNA纯化方法，具体的采用RNA clean&concentrator-5试剂盒进行纯化，步骤参考试剂盒说明书。
本发明在获得片段化RNA后，用硼氢化钠还原片段化RNA获得还原RNA。在本发明中，所述硼氢化钠的中所述硼氢化钠的浓度优选为4.5～5.5M，更优选为5M；所述片段化RNA的浓度为30～200ng/μL，更优选为50～100ng/μL。本发明中所述硼氢化钠与片段化RNA的体积比优选为1：(2～3)，更优选为5:13.在本发明中，还原的体系中优选的还包括Tris-HCl，m7G核苷和RNase inhibitor。所述Tris-HCl的浓度优选为0.8～1.2M，更优选为1M，pH优选为7.3～7.7，更优选为7.5；所述m7G核苷的浓度优选为95～105μM，更优选为100μM；所述RNase inhibitor的浓度为35～45U/μL，更优选为40U/μL。在本发明中，所述还原的体系优选为50μL，其中各组分的体积优选为：片段化RNA 13μL，硼氢化钠5μL，Tris-HCl 25μL，m7G核苷5μL和RNase inhibitor 2μL。本发明中所述还原的温度优选为-2～2℃，更优选为0℃；所述还原的时间优选为28～32min，更优选为30min；本发明中优选的将还原体系置于冰水中进行还原。
本发明在获得还原RNA后，30s内，用苯胺盐酸盐断裂还原RNA。在本发明中，还原后的RNA迅速与苯胺盐酸盐反应，可以避免还原后的RNA重新被氧化。在本发明中，还原反应完毕后优选的加入还原体系1/10倍体积的6M醋酸，所述醋酸的作用为使没有反应完的硼氢化钠消耗掉；本发明在消耗掉硼氢化钠以后，将体系与苯胺盐酸盐溶液混合，进行还原RNA的断裂。在本发明中，所述苯胺盐酸盐的浓度优选为1.8～2.2M，更优选为2.0M，所述苯胺盐酸盐的体积优选为加入醋酸后的体系体积的0.9～1.1倍，更优选为1倍。本发明在所述还原RNA的断裂的温度优选为58～62℃，更优选为60℃；所述还原RNA的断裂时间优选为17～23min，更优选为20min。本发明中所述断裂温度优选的通过水浴实现。本发明在断裂还原RNA后，优选的还包括对断裂后的RNA进行纯化的步骤，本发明中所述纯化采用本领域常规的RNA纯化方法，具体的采用RNA clean&concentrator-5试剂盒进行纯化，步骤参考试剂盒说明书。
本发明在断裂还原RNA后，在断裂后的RNA两端连接测序接头；反转录连有测序接头的RNA片段后，用测序引物进行PCR扩增构建测序文库。在本发明中，所述在断裂后的RNA两端连接测序接头；反转录连有测序接头的RNA片段后，用测序引物进行PCR扩增构建测序文库优选的采用测序文库构建试剂盒实现，在本发明中，所述测序文库构建试剂盒优选为NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina(Set 1)(NewEnglandBiolabs,USA)；具体构建方法参照是结合说明书进行。
本发明在完成测序文库构建后，对所述测序文库进行测序获得测序数据。本发明中，所述测序优选为二代测序，更优选为Illumina双端测序，所述测序的读长优选为150bp。
本发明在获得测序数据后，分析所述测序数据得到RNA断点次数和测序深度的比值，所述比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。在本发明中，所述分析包括将所述测序数据去除接头序列、去除低质量碱基，然后将处理后的测序数据比对到原核生物转录组序列及真核生物核糖体RNA序列，统计read1第一个碱基的比对位置信息，即硼氢化钠-苯胺处理后的RNA断点次数；统计每个位点的测序深度，并得到RNA断点次数和测序深度的比值，比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。在本发明具体实施过程中，所述分析包括以下步骤：通过cutadapt软件去除read1的接头序列，并去除5’端第一个碱基(cutadapt–a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC–u 1–q 20–ocleandata.fastq rawdata.fastq)。将去掉接头和低质量碱基的fastq文件用bowtie2软件比对到原核生物转录组序列及真核生物核糖体RNA序列，比对参考数为bowtie2-p 8-xreference cleandata.fastq-S align.sam；用tophat软件比对真核生物基因组序列及转录组序列，比对参数为“tophat2-r 50-p 8-o align.sam--solexa-quals genomecleandata.fastq”。将比对BAM文件用bedtools软件转换成Bed文件。从Bed文件中统计read1第一个碱基的比对位置信息，即硼氢化钠-苯胺处理后的RNA断点次数。基于BAM文件统计每个位点的测序深度，并得到RNA断点次数和测序深度的比值，比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。
本发明还提供了一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的试剂盒；所述试剂盒包括上述方法涉及到的必要试剂和操作说明书。其中，所述试剂包括含二价镁离子的RNA片段化溶液，硼氢化钠溶液，苯胺盐酸盐溶液，Tris-HCl，m7G核苷，RNaseinhibitor，测序接头，Illumina测序引物。
下面结合实施例对本发明提供的一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的方法及试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1大肠杆菌中RNA7mG修饰的检测
1、RNA获取
(1)将过夜培养的100mL大肠杆菌菌液离心，4000rpm，4℃离心5分钟，去掉上清，保留菌体沉淀；
(2)将准备好的研钵和研杵放在一个装有水的托盘上，倒上少许的酒精并点燃，待酒精燃烧完并冷却后取出研钵和研杵；
(3)向研钵中导入液氮，用注射器吸取菌体沉淀并将沉淀一滴一滴地滴进液氮中，待液氮气化后立马用研杵进行研磨，研磨成粉，再加入液氮，待液氮消失后立马用研杵进行研磨后，如此重复三次，最后立即加入Trizol Reagent(可以多加点)，此时Trizol Reagent后凝结成块；
(4)待Trizol Reagent变成变成液体后用移液器吹打混匀，再按每管1mL分装到1.5mLEP管中，然后用振荡器震荡混匀，在冰上放置5分钟，使细胞充分裂解；
(5)按TRI Reagent体积加入1/5的氯仿，振荡器剧烈混匀15秒后，冰上放置10分钟；
(6)12,000rpm 4℃离心15分钟，将上层水相转移新的EP管中,注意不要吸到中间有机溶剂层。加入等体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃放置1-2小时；
(7)4℃，12000rpm离心15分钟。小心弃去上清(离心后RNA沉淀贴在管底)，加入1mL75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀；
(8)4℃，12000rpm离心5分钟后，用乙醇再次洗涤沉淀；
(9)离心后弃去上清，再瞬时离心吸出残留的液体，室温干燥数分钟，待沉淀成透明状，用无核酸酶的灭菌DEPC-ddH2O溶解RNA。
(10)取1μL上述步骤所得产物，Qubit2.0荧光计(Invitrogen)测定总RNA的量为830ng/μL。
2、用NEB RNAFragmentationBuffer(New EnglandBiolabs,USA)进行RNA打断，打断体系见表1。
表1 RNA片段化体系
Figure BDA0001755432730000091
将溶液混匀，置于PCR仪上，运行程序：94℃保持8分钟。反应完毕后向每个样本中加入2μL 10×RNA Fragmentation Stop Solution(New EnglandBiolabs,USA)中止反应。
3、用RNA clean&concentrator-5(ZYMO Research,USA)试剂盒纯化，纯化具体步骤如下：
(1).向每个样品中加入2倍体积RNABinding Buffer(即50μL样品加入100μLBuffer，样品最小体积为50μL)；
(2).混匀后加入等体积的无水乙醇(即再加入150μL无水乙醇)；
(3).混匀后将所有样品混匀液转移到放在套有收集管的Zymo-SpinTM IC Column中，13200rpm离心30秒；
(4).将下流液重新加入到套有收集管的Zymo-SpinTM IC Column中，再用13200rpm离心30秒；
(5).重复步骤(4)两次；最后一次弃掉下流液；
(6).向Zymo-SpinTM IC Column中加入400μL RNA Prep Buffer，13200rpm离心30秒，弃掉下流液；
(7).向Zymo-SpinTM IC Column中加入700μL RNAWash Buffer，用离心机13200rpm离心30秒，弃掉下流液；
(8).再向Zymo-SpinTM IC Column中加入400μL RNAWash Buffer，13200rpm离心30秒，弃掉下流液；
(9).再将套有收集管的Zymo-SpinTM IC Column放回离心机中空离4分钟，出去管壁多余的液体；
(10).空离完毕后将Zymo-SpinTM IC Column放到一个新的干净的1.5mLEP管中，开盖放置3分钟，使酒精挥发干净；
(11).根据需要向柱中加入适量体积的RNase-Free H2O，室温放置3分钟后13200rpm离心2分钟；
(12).再重复步骤(11)；下流液体即为纯化的RNA片段，浓度40ng/μL。
4、硼氢化钠(Sigma-Aldrich,USA)处理纯化后样本，还原体系见表2。
表2硼氢化钠还原体系
Figure BDA0001755432730000101
混匀后，放在冰水中反应30分钟。
5、苯胺盐酸盐(Sigma-Aldrich,USA)溶液处理还原后的样本RNA
反应完毕后加入1/10倍体积的6M醋酸，使没有反应完的硼氢化钠消耗掉；消耗掉硼氢化钠以后加入55μL现配的苯胺盐酸盐溶液；混匀后，放在60℃水浴锅中孵育20分钟。
6、用RNA clean&concentrator-5试剂盒纯化，纯化具体步骤如上步骤3所述，纯化后的浓度20ng/μL。
7、将硼氢化钠和苯胺盐酸盐处理的RNA片段用NEBNext Multiplex SmallRNALibrary Prep Set for Illumina(Set 1)(New England Biolabs,USA)试剂盒构建文库：
(1)将下列成份与硼氢化钠处理的RNA片段样品混合：连接测序接头的体系见表3。
表3 RNA片段和3’接头退火的体系
Figure BDA0001755432730000111
(2)混匀后70℃反应2分钟，反应完毕后立即转到冰上放置；
(3)向上述反应样品中加入表4所示成份；
表4连接3’接头的体系
Figure BDA0001755432730000112
(4)混匀后，20℃反应1小时；
(5)反应完毕后加入1μL的SR RTPrimer forIllumina；
(6)混匀后PCR仪中反应：75℃反应5分钟，37℃反应15分钟，25℃反应15分钟；
(7)按样品个数取1.1倍样品个数的5′SR adaptor到一个新的nuclease-free的PCR管中，70℃反应2分钟，反应完毕后立即放到冰上；
(8)向上述样品反应体系中加入表5所示成份；
表5连接5’接头的体系
Figure BDA0001755432730000113
Figure BDA0001755432730000121
(9)混匀后PCR仪中25℃反应1小时；
(10)反应完毕后加入表6所示成份；
表6逆转录反应体系
Figure BDA0001755432730000122
(11)混匀后PCR仪中50℃反应1小时；
(12)反应完毕后取20μL上述反应液进行扩增；
扩增体系见表7；
表7 PCR扩增体系
Figure BDA0001755432730000123
PCR反应程序如表8所示；
表8 PCR反应程序
Figure BDA0001755432730000124
(13)反应完毕后用1.5倍体积的DNAXP磁珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)纯化；
(14)取1μL上述步骤纯化所得产物，Qubit2.0荧光计(Invitrogen)测定文库总量，测定结果显示核酸量均大于2ng/μL，可用于二代测序。
8、测序结果展示
通过上机测序，结果显示以该方法构建的全转录组文库可以检测7mG修饰位点，具体结果见图1和图2。
检测m7G修饰位点的文库测序数据的序列读长为150bp，采用Illumina双端测序。获得测序数据后我们首先通过cutadapt软件去除read1的接头序列，并去除5’端第一个碱基(cutadapt–a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC –u 1 –q 20 –ocleandata.fastq rawdata.fastq).
将去掉接头和低质量碱基的fastq文件用bowtie2软件比对到原核生物转录组序列及真核生物核糖体RNA序列，比对参考数为bowtie2 -p 8 -x referencecleandata.fastq-S align.sam；用tophat软件比对真核生物基因组序列及转录组序列，比对参数为“tophat2 -r 50 -p 8 -o align.sam--solexa-quals genomecleandata.fastq”。将比对BAM文件用bedtools软件转换成Bed文件。从Bed文件中统计read1第一个碱基的比对位置信息，即硼氢化钠-苯胺处理后的RNA断点次数。基于BAM文件统计每个位点的测序深度，并得到RNA断点次数和测序深度的比值，比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。
结果如图1和图2所示，通过分析大肠杆菌RNA上的m7G修饰，确定16s rRNA527位的鸟嘌呤带有7甲基修饰，23s rRNA2069位的鸟嘌呤带有7甲基修饰。
实施例2 HEK293T细胞系中RNA7mG修饰的检测
1、RNA获取
(1)将培养在10cm直径的细胞培养皿中的细胞用胰酶消化下来，搜集到15mL离心管中，1000rpm，离心5分钟，去掉上清，保留细胞沉淀；
(2)用10mLPBS缓冲液重悬细胞，离心5分钟，去掉上清，保留细胞沉淀；
(3)向细胞沉淀中加入2mLTrizol Reagent，用移液器吹打混匀，再按每管1mL分装到1.5mLEP管中，然后用振荡器震荡混匀，在冰上放置5分钟，使细胞充分裂解；
(4)按TRI Reagent体积加入1/5的氯仿，振荡器剧烈混匀15秒后，冰上放置10分钟；
(5)12,000rpm 4℃离心15分钟，将上层水相转移新的EP管中,注意不要吸到中间有机溶剂层。加入等体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃放置1-2小时；
(6)4℃，12000rpm离心15分钟。小心弃去上清(离心后RNA沉淀贴在管底)，加入1mL75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀；
(7)4℃，12000rpm离心5分钟后，用乙醇再次洗涤沉淀；
(8)离心后弃去上清，再瞬时离心吸出残留的液体，室温干燥数分钟，待沉淀成透明状，用无核酸酶的灭菌DEPC-ddH2O溶解RNA。
(9)取1μL上述步骤所得产物，Qubit2.0荧光计(Invitrogen)测定总RNA的量为732ng/μL。
2、用NEB RNAFragmentationBuffer(New EnglandBiolabs,USA)进行RNA打断，打断体系见表9。
表9 RNA片段化体系
Figure BDA0001755432730000141
将溶液混匀，置于PCR仪上，运行程序：94℃保持8分钟。反应完毕后向每个样本中加入2μL 10×RNA Fragmentation Stop Solution(New EnglandBiolabs,USA)中止反应。
3、用RNA clean&concentrator-5(ZYMO Research,USA)试剂盒纯化，纯化具体步骤如下：
(1).向每个样品中加入2倍体积RNABinding Buffer(即50μL样品加入100μLBuffer，样品最小体积为50μL)；
(2).混匀后加入等体积的无水乙醇(即再加入150μL无水乙醇)；
(3).混匀后将所有样品混匀液转移到放在套有收集管的Zymo-SpinTM IC Column中，13200rpm离心30秒；
(4).将下流液重新加入到套有收集管的Zymo-SpinTM IC Column中，再用13200rpm离心30秒；
(5).重复步骤(4)两次；最后一次弃掉下流液；
(6).向Zymo-SpinTM IC Column中加入400μL RNA Prep Buffer，13200rpm离心30秒，弃掉下流液；
(7).向Zymo-SpinTM IC Column中加入700μL RNAWash Buffer，用离心机13200rpm离心30秒，弃掉下流液；
(8).再向Zymo-SpinTM IC Column中加入400μL RNAWash Buffer，13200rpm离心30秒，弃掉下流液；
(9).再将套有收集管的Zymo-SpinTM IC Column放回离心机中空离4分钟，出去管壁多余的液体；
(10).空离完毕后将Zymo-SpinTM IC Column放到一个新的干净的1.5mLEP管中，开盖放置3分钟，使酒精挥发干净；
(11).根据需要向柱中加入适量体积的RNase-Free H2O，室温放置3分钟后13200rpm离心2分钟；
(12).再重复步骤(11)；下流液体即为纯化的RNA片段，浓度45ng/μL。4、硼氢化钠(Sigma-Aldrich,USA)处理纯化后样本，还原体系见表10。
表10硼氢化钠还原体系
Figure BDA0001755432730000151
混匀后，放在冰水中反应30分钟。
5、苯胺盐酸盐(Sigma-Aldrich,USA)溶液处理还原后的样本RNA
反应完毕后加入1/10倍体积的6M醋酸，使没有反应完的硼氢化钠消耗掉；消耗掉硼氢化钠以后加入55μL现配的苯胺盐酸盐溶液；混匀后，放在60℃水浴锅中孵育20分钟。
6、用RNAclean&concentrator-5试剂盒纯化，纯化具体步骤如上步骤3所述，纯化后的浓度23ng/μL。
7、将硼氢化钠和苯胺盐酸盐处理的RNA片段用NEBNext Multiplex SmallRNALibraryPrep Set for Illumina(Set 1)(New England Biolabs,USA)试剂盒构建文库：
(1)将下列成份与硼氢化钠处理的RNA片段样品混合：连接测序接头的体系见表11。
表11 RNA片段和3’接头退火的体系
Figure BDA0001755432730000161
(2)混匀后70℃反应2分钟，反应完毕后立即转到冰上放置；
(3)向上述反应样品中加入表12所示成份；
表12连接3’接头的体系
Figure BDA0001755432730000162
(4)混匀后，20℃反应1小时；
(5)反应完毕后加入1μL的SR RT Primer for Illumina；
(6)混匀后PCR仪中反应：75℃反应5分钟，37℃反应15分钟，25℃反应15分钟；
(7)按样品个数取1.1倍样品个数的5′SR adaptor到一个新的nuclease-free的PCR管中，70℃反应2分钟，反应完毕后立即放到冰上；
(8)向上述样品反应体系中加入表13所示成份；
表13连接5’接头的体系
Figure BDA0001755432730000171
(9)混匀后PCR仪中25℃反应1小时；
(10)反应完毕后加入表14所示成份；
表14逆转录反应体系
Figure BDA0001755432730000172
(11)混匀后PCR仪中50℃反应1小时；
(12)反应完毕后取20μL上述反应液进行扩增；
扩增体系见表15；
表15 PCR扩增体系
Figure BDA0001755432730000173
PCR反应程序如表16所示；
表16 PCR反应程序
Figure BDA0001755432730000174
Figure BDA0001755432730000181
(13)反应完毕后用1.5倍体积的DNAXP磁珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)纯化；
(14)取1μL上述步骤纯化所得产物，Qubit2.0荧光计(Invitrogen)测定文库总量，测定结果显示核酸量均大于2ng/μL，可用于二代测序。
8、测序结果展示
通过上机测序，结果显示以该方法构建的全转录组文库可以检测7mG修饰位点，具体结果见图3。
检测m7G修饰位点的文库测序数据的序列读长为150bp，采用Illumina双端测序。获得测序数据后我们首先通过cutadapt软件去除read1的接头序列，并去除5’端第一个碱基(cutadapt–a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC –u 1 –q 20 –ocleandata.fastq rawdata.fastq).
将去掉接头和低质量碱基的fastq文件用bowtie2软件比对到原核生物转录组序列及真核生物核糖体RNA序列，比对参考数为bowtie2 -p 8 -x referencecleandata.fastq-S align.sam；用tophat软件比对真核生物基因组序列及转录组序列，比对参数为“tophat2 -r 50 -p 8 -o align.sam--solexa-quals genomecleandata.fastq”。将比对BAM文件用bedtools软件转换成Bed文件。从Bed文件中统计read1第一个碱基的比对位置信息，即硼氢化钠-苯胺处理后的RNA断点次数。基于BAM文件统计每个位点的测序深度，并得到RNA断点次数和测序深度的比值，比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点。
结果如图3所示，通过分析人HEK293T细胞系RNA上的m7G修饰，确定18s rRNA 1639位的鸟嘌呤带有7甲基修饰，28s rRNA上未发现7甲基鸟嘌呤修饰。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的方法，包括以下步骤：
1)提取样本细胞总RNA获得样本细胞全转录组RNA；
2)将所述样本细胞全转录组RNA断裂为100～300bp的片段化RNA；
3)用硼氢化钠溶液还原所述片段化RNA获得还原RNA；
4)所述还原后的30s内，用苯胺盐酸盐溶液断裂所述还原RNA，在所述断裂后的RNA两端连接测序接头；反转录连有测序接头的RNA片段后，用测序引物进行PCR扩增构建测序文库；
5)对所述测序文库进行测序获得测序数据；
6)分析所述测序数据得到RNA断点次数和测序深度的比值，所述比值大于0.5，且断点位置是G碱基位点的被确定是m7G位点；
所述分析包括将所述测序数据去除接头序列、去除低质量碱基，然后将处理后的测序数据比对到原核生物转录组序列及真核生物核糖体RNA序列，统计read1第一个碱基的比对位置信息，即硼氢化钠-苯胺处理后的RNA断点次数；统计每个位点的测序深度，并得到RNA断点次数和测序深度的比值；
步骤3)中所述硼氢化钠溶液的浓度为4.5～5.5M；
步骤2)所述片段化RNA的浓度为30～200ng/μl；
所述硼氢化钠与片段化RNA的体积比为1：(2～3)；
所述RNA包括mRNA、tRNA、rRNA和miRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的断裂采用二价镁离子实现。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述苯胺盐酸盐溶液的浓度为1.8～2.2M。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述断裂的温度为58～62℃，所述断裂的时间为17～23min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本细胞为病理或正常组织细胞。
6.一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA内部m7G修饰的试剂盒，包括使用说明书和试剂；其特征在于，所述试剂包括含二价镁离子的RNA片段化溶液，硼氢化钠溶液，苯胺盐酸盐溶液，Tris-HCl，m7G核苷，RNaseinhibitor，测序接头，Illumina测序引物。
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