CN114250267A

CN114250267A - 一种构建含修饰位点的rna的测序文库的方法

Info

Publication number: CN114250267A
Application number: CN202111517199.1A
Authority: CN
Inventors: 瞿志鹏; 江明扬; 曹林; 唐秋雨; 易文洋
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-03-29

Abstract

本发明提供一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法，属于生物技术领域，具体涉及含修饰位点的RNA的测序文库的制备方法。本发明的方法可实现起始量低至100个细胞或者总RNA低至5ng的样本进行文库构建并进行高通量测序，显著降低细胞投入量过大带来的背景噪音影响，同时解决微量样本不足导致无法建库的问题。

Description

一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法。

背景技术

表观转录组学越来越受到科学家们的重视，成为了近来兴起的热门领域之一，目前已知的天然RNA修饰类型超过150多种。研究表明转录后修饰影响RNA的结构和功能，RNA中大量动态、可逆的修饰具有多种生物学功能，能够参与真核生物基因表达的调控。因此,了解RNA修饰的动态分布、机制、调控和功能可以扩展人们对生命体调控机制的深入认识和理解。破译RNA修饰的生物学功能主要依赖于对这些修饰的精确检测、定量和定位分析。近10年来，用于RNA修饰的分析方法得到显著发展，促使RNA修饰领域发生了巨大变革。

常见的RNA修饰包括m6A、m5C、m1A、m7G和ac4C等。其中m6A是真核生物mRNA和非编码RNA中最常见的一种转录后修饰，占到RNA甲基化修饰的80％。m6A广泛参与各种生物学过程，如热休克反应、紫外诱导的DNA损伤、神经元功能、性别决定等，在癌症的发生发展等过程中起到重要的作用。

常见的研究RNA修饰的方法有：LC-MS/MS、MeRIP-seq和miCLIP等。

LC-MS/MS：液相色谱串联质谱法，能够很好的检测到极性高、稳定性差的化合物，是目前所有总体甲基化水平分析方法中能够对含量极低的修饰碱基进行准确定性定量的方法。所需RNA至少为2μg，对RNA质量要求高，且测试周期比较长。

MeRIP-seq：RNA甲基化免疫共沉淀(Methylated RNA Immunoprecipitation，MeRIP)基于m6A特异性抗体识别并结合mRNA上m6A的原理，以RNA免疫共沉淀方法富集甲基化修饰片段为基础，并联合高通量测序，研究发生m6A甲基化修饰的mRNA区域。能定位到m6A修饰位点附近200nt左右的区域，检测范围广，覆盖整个转录组范围的甲基化区域，通常需要10^8cells，5g组织或200μg总RNA。

miCLIP：m6A单碱基分辨率紫外交联沉淀，利用m6A抗体和紫外线交联，结合高通量测序技术，研究单碱基水平的m6A转录组图谱。对于活细胞样本需要大于10^7个细胞，对于总RNA样本需要100-150μg，数据分析基于已知共有序列的假设，对于除人/小鼠以外的物种需要进行评估。操作复杂，耗时＞2天。

现有RNA修饰检测方法所需的总RNA投入量通常在几微克至几百微克，无法满足稀有样本的高通量检测，难以在临床上展开广泛的应用，且实验步骤繁琐，实验时间长，重复性差。因此，构建一种快速、简便且能够兼容超低起始量的检测RNA修饰的方法，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、简便且能够兼容超低起始量的检测RNA修饰的方法，可以对起始量低至100个细胞或者总RNA低至5ng的样本进行高通量测序，可以显著降低细胞投入量过大带来的背景噪音影响，解决微量样本不足导致无法建库的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种RNA修饰位点的捕获方法，所述方法包含：

1)RNA样本与特异性结合RNA修饰位点的抗体进行孵育，使得抗体与RNA修饰位点结合；

2)以核酸酶打断与抗体结合的RNA样本获得RNA片段；

3)以能够结合上述抗体的纯化介质收集含有修饰位点结合抗体的RNA片段。

本发明的第二方面提供另一种RNA修饰位点的捕获方法，所述方法包含：

1)特异性结合RNA修饰位点的抗体与纯化介质共孵育获得纯化介质-抗体复合物，所述纯化介质含有所述抗体的结合物；

2)将纯化介质-抗体复合物与RNA样本孵育；

3)将步骤2)的产物与核酸酶进行孵育，获得RNA片段；

4)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段。

本发明的第三方面提供另一种RNA修饰位点的捕获方法，所述方法包含：

1)将RNA样本、特异性结合RNA修饰的抗体、纯化介质共孵育；

2)加入核酸酶处理获得RNA片段；

3)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段。

本发明的第四个方面，提供一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法，所述方法包含：

2)以核酸酶打断与抗体结合的RNA样本获得RNA片段；

3)以能够结合上述抗体的纯化介质收集含有修饰位点结合抗体的RNA片段；

4)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

5)以含polyA的RNA片段为模板，以含有polyT的逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cDNA一链，其中，所述逆转录引物含有polyT(例如至少3个T，例如4个T、5个T、6个T、7个T、8个T、9个T、10个T)或由其组成；

6)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

7)以含有oligoG或由其组成的转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cDNA一链得到全长cDNA，所述转换模板还含有位于所述oligoG的5'端的5'接头序列；

8)以全长cDNA为模板，以5'全长扩增引物和3'全长扩增引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA获得测序文库，其中，所述5'全长扩增引物包含全部或部分5'接头序列，或由其组成；所述3'全长扩增引物包含全部或部分3'接头序列，或由其组成；任选地，所述5'接头序列与所述3'接头序列相同或不同。

本发明的第五个方面，提供一种构建含修饰位点RNA的测序文库的方法，所述方法包含：

2)将纯化介质-抗体复合物与RNA样本孵育；

3)将步骤2)的产物与核酸酶进行孵育，获得RNA片段；

4)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段；

5)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

6)以含polyA的RNA片段为模板，以含有polyT的逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cDNA一链，其中，所述逆转录引物含有polyT(例如至少3个T，例如4个T、5个T、6个T、7个T、8个T、9个T、10个T)或由其组成；

7)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

8)以含有oligoG或由其组成的转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cDNA一链得到全长cDNA，所述转换模板还含有位于所述oligoG的5'端的5'接头序列；

9)以全长cDNA为模板，以5'全长扩增引物和3'全长扩增引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA获得测序文库，其中，所述5'全长扩增引物包含全部或部分5'接头序列，或由其组成；所述3'全长扩增引物包含全部或部分3'接头序列，或由其组成；任选地，所述5'接头序列与所述3'接头序列相同或不同。

本发明的第六方面提供一种构建含修饰位点RNA的测序文库的方法，所述方法包含：

1)RNA样本、特异性结合RNA修饰的抗体、纯化介质共孵育；

2)加入核酸酶处理获得RNA片段；

3)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段；

4)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

6)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

本发明的第七个方面，提供一种检测RNA位点修饰的方法，所述方法包含：

2)以核酸酶打断RNA样本获得RNA片段；

4)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

6)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

8)以全长cDNA为模板，以5'全长扩增引物和3'全长扩增引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA获得测序文库，其中，所述5'全长扩增引物包含全部或部分5'接头序列，或由其组成；所述3'全长扩增引物包含全部或部分3'接头序列，或由其组成；任选地，所述5'接头序列与所述3'接头序列相同或不同；

9)对所述测序文库进行测序。

本发明的第八个方面，提供一种检测RNA位点修饰的方法，所述方法包含：

2)将纯化介质-抗体复合物与RNA样本孵育；

3)将步骤2)的产物与核酸酶进行孵育，获得RNA片段；

4)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段；

5)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

7)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

9)以全长cDNA为模板，以5'全长扩增引物和3'全长扩增引物为引物，利用DNA聚合酶活性扩增全长cDNA获得测序文库，其中，所述5'全长扩增引物包含全部或部分5'接头序列，或由其组成；所述3'全长扩增引物包含全部或部分3'接头序列，或由其组成；任选地，所述5'接头序列与所述3'接头序列相同或不同；

10)对所述测序文库进行测序。

本发明的第九方面提供一种检测RNA位点修饰的方法，所述方法包含：

1)RNA样本、特异性结合RNA修饰的抗体、纯化介质共孵育；

2)加入核酸酶处理获得RNA片段；

3)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段；

4)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

6)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

9)对所述测序文库进行测序。

在一些实施方案，所述能够结合抗体的纯化介质为含有抗体结合物的磁珠。

在一些实施方案，所述抗体结合物选ProteinA、Protein G或ProteinAG中的一种或多种。

在一些实施方案，所述修饰位点RNA包含选自m6A、m5C、m1A、m7G和ac4C的一种修饰位点。

在一些实施方案中，RNA样本的量低至5ng。在一些实施方案中，RNA样本的量为5ng、6ng、7ng、8ng、9ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、250ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng或1000ng。在一些实施方案中，RNA样本的量选自5-1000ng、5-800ng、5-500ng、5-400ng、5-300ng、5-250ng、5-200ng、5-150ng、5-100ng、5-50ng、5-10ng、或5-8ng。

在一些实施方案中，RNA样本是核酸提取纯化后的总RNA，提取纯化后的总RNA其A260/A280、A260/A230的值在1.8-2.2间。

在一些实施方案中，起始RNA样本是裂解液裂解后的细胞裂解产物，在一些实施方式中，裂解的细胞低至100个细胞；在一些实施方式中，起始裂解的细胞数量是100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个细胞。

在一些实施方案中，特异性结合RNA修饰的抗体是能够特异性识别RNA的甲基化修饰。

在一些实施方案中，RNA的甲基化修饰是m6A、m5C、m1A或m7G中的一种。

在一些实施方案中，能够与每ng甲基化修饰RNA结合的特异性抗体使用量为0.01-1μg。

在一些实施方案中，所述核酸酶为微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)MNase，用于打断带有抗体结合的RNA修饰样本，每ng甲基化修饰RNA使用的MNase量为5pg-5ng。

在一些实施方案中，所述对目标RNA样本片段加polyA尾，是通过酶的作用将polyA尾添加到目标RNA样本片段的3'端，所述酶为加尾酶，优选地加尾酶为Poly(A)Polymerase。

在一些实施方案中，所述逆转录引物的3'端含有polyT或由其组成，优选地，逆转录引物的3'端含有poly T，5'端含有3'接头序列，所述3'接头序列与3'全长扩增引物序列全部或部分相同。

在一些实施方案中，所述利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端添加oligoC，优选地，所述oligoC的数量是3-6个。

在一些实施方案中，所述转换模板3'端含有oligoG或由其组成，优选地，转换模板3'端含有oligoG，5'端含有5'接头序列，所述5'接头序列与5'全长扩增引物序列全部或部分相同，进一步地，所述oligoG的数量为3-6个，其与cDNA一链3'端的oligoC反向互补。

其中，所述逆转录活性、所述末端转移活性和所述模板转换活性中的任一项、任两项或全部三项来自逆转录酶，优选地，所述逆转录酶是MMLV。

在一些实施方案中，所述逆转录引物3'端含有锚定碱基，所述锚定碱基是V或者VN，V代表A、C和G，N代表A、C、T和G。

在一些实施方案中，所述转换模板中的oligoG中G的数目与cDNA一链3'端的oligoC中C的数目相同或不同。

在一些实施方案中，所述DNA聚合酶活性来自高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶是Pfu、vent、KOD1中的至少一种。

术语

RNA样本：细胞或组织的RNA提取或裂解产物。

RNA片段：经核酸酶切割后，含有RNA修饰位点或不含RNA修饰位点的短RNA。

RNA修饰：在RNA的碱基上发生甲基化或乙酰化修饰。

修饰位点：RNA中被修饰的位点。

m6A：腺嘌呤第6位的氮原子上发生甲基化，N⁶-methyladenosine。

m5C：胞嘧啶的第5位上发生甲基化，5-methyladenosine。

m1A：腺嘌呤第1位氮原子上的甲基化，N¹-methyladenosine。

m7G：鸟嘌呤第7位氮原子上甲基化，N⁷-methylguanosine。

oligoC：多聚胞嘧啶寡核苷酸。

oligoG：多聚鸟嘌呤寡核苷酸。

孵育：在一定的稀释度、一定的温度环境下，抗体与抗原才能发生孵化反应，而且结合处于最佳状态。

有效文库：测序后经过序列比对，获得的文库结构与预期相符，且插入片段至少大于3个碱基。

附图说明

图1是三种RNA修饰片段捕获方法示意图；

图2是实施例2中Input％的结果数据；

图3是实施例3中构建含修饰位点RNA文库构建流程图；

图4是不同起始量RNA构建的文库分布情况，图4A-4D的RNA起始量分别为1μg、250ng、50ng、5ng。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。

在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。

以RNA甲基化m6A修饰为例，结合本发明的技术方案详细说明本发明的具体实施方式。

实验材料

1、RNA提取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司RNA isolater Total RNAExtraction Reagent试剂盒(货号R401)；

2、微球菌核酸酶为Thermo Scientific公司的微球菌核酸酶(300U/μL)(货号EN0181)；

3、特异性识别m6A修饰的抗体为Abcam公司Anti-N6-methyladenosine(m6A)抗体[17-3-4-1]试剂盒(货号为ab208577)；

4、Protein G Beads为带有Protein G蛋白修饰的磁珠，购自Invitrogen公司Dynabeads^TMProtein G for Immunoprecipitation试剂盒(货号10003D)；

5、PBST缓冲液为PBS缓冲液(WISENT公司的PBS，货号为311-010-CL)中加入终浓度为0.01％吐温20；

6、PK蛋白酶来自诺唯赞生物科技股份有限公司FastPure Blood/Cell/Tissue/Bacteria DNA Isolation Mini Kit(货号DC112)试剂盒中的Proteinase K；

7、RNA磁珠纯化试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司VAHTS RNA CleanBeads试剂盒(货号N412)；

8、qPCR定量产品试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司HiScript II OneStep qRT-PCR SYBR Green Kit试剂盒(货号Q221)；

9、加尾试剂盒为TAKARA公司Poly(A)Polymerase试剂盒(货号2181)；

10、单细胞全长RNA扩增试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司Single CellFull Length mRNA-Amplification Kit试剂盒(货号N712)；

11、Universal Primer为南京诺唯赞生物科技股份有限公司VAHTS Small RNAIndex Primer Kit for Illumina(货号N816)中的Universal Primer；

12、Index Primer为南京诺唯赞生物科技股份有限公司VAHTS Small RNA IndexPrimer Kit for Illumina(货号N816)中的Index Primer；

13、双链磁珠纯化试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司

DNAClean Beads(货号N411)；

14、Qubit试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司Equalbit 1×dsDNA HSAssay Kit(货号EQ121)；

15、拓扑异构酶超快速克隆试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司5min TA/Blunt-Zero Cloning Kit(货号C601)；

16、感受态细胞为南京诺唯赞生物科技股份有限公司Fast-T1化学感受态细胞(货号C505)。

表1实施例中涉及的序列

实施例1：微量RNA样本中m6A修饰的捕获

1、磁珠-抗体-RNA免疫共沉淀

a)使用RNA提取试剂盒对293T细胞进行总RNA提取，对提取后的总RNA进行浓度测定和纯度测定，选取A260/A280值、A260/A230值均在1.8-2.2间的RNA样本继续后续实验；

b)使用RNA-free无菌水配置的TE缓冲液对提取的总RNA进行稀释，得到浓度分别是1000ng/μl(样本1)、250ng/μl(样本2)、50ng/μl(样本3)、5ng/μl(样本4)的RNA样本；

c)将特异性识别m6A的抗体原液用Abcam公司抗体稀释剂(货号ab64211)分别稀释10倍和20倍，得到抗体稀释液；

d)按照表2配置免疫共沉淀反应体系：

表2免疫共沉淀反应体系

e)将上述4组反应体系室温旋转孵育60min；

f)将上述孵育后的反应体系放置于磁力架上静置1-2min，小心移去上清液，加入100μl PBST缓冲液进行重悬。

2、微球菌核酸酶(MNase，500pg/μl)打断RNA样本

a)配制4份打断缓冲液：每份为1μl MNase+5μl 20mM CaCl₂+94μl PBST；

b)将上步骤e)重悬后的产物室温放置于磁力架上静置1-2min，小心移去上清液；

c)4组体系分别加入100μl打断缓冲液进行重悬，室温消化5min。

3、收集捕获打断后的目标RNA片段

a)配制4份反应缓冲液：每份为1μl 20mg/ml PK蛋白酶+1μl 20mM EGTA+18μlPBST；

b)将上步骤c)重悬消化后的产物放置于磁力架上静置1-2min，小心移去上清液；

c)4组体系分别加入150μl PBST重悬漂洗两次，小心弃尽上清后，再分别加入20μl反应缓冲液，分别放置于PCR仪中55℃加热15min，注意不要盖热盖；

d)对4组体系放置于磁力架上静置1-2min，小心吸取上清液20μl至新的PCR管中，获得未纯化的捕获产物。

4、使用RNA磁珠纯化试剂盒纯化捕获产物，获得靶标RNA修饰片段捕获产物

a)RNA CleanBeads提前30min从2-8℃环境取出，静置使其平衡至室温；

b)颠倒或涡旋振荡使RNA Clean Beads充分混匀，吸取4份36μl Beads溶液分别加入到4组未纯化的捕获产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀；

c)将上述4组混合物室温孵育10min，使RNA结合到Beads上；

d)将上述4组产物置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；

e)将移除上清的4组PCR管放置于磁力架上，加入200μl 80％乙醇(现配现用)漂洗磁珠，注意不要吹散磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

f)重复步骤e)一次；

g)将移除上清的4组PCR管放置于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min；

h)将4组PCR管从磁力架上取出，各组分别加入10μl Nuclease-free ddH₂O，使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约2min)，小心吸取8μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中，获得捕获m6a修饰后的RNA样本片段，分别命名为样本9(对应于1μl的样本1捕获产物)、样本10(对应于1μl的样本2捕获产物)、样本11(对应于1μl的样本3捕获产物)、样本12(对应于1μl的样本4捕获产物)。

实施例2：利用qPCR技术对靶标m6A修饰的RNA片段进行质量验证

参考Merk公司的Magna MeRIPTMm6AKit Transcriptome-wide Profiling of N6-Methyladenosine(货号17-10499)产品说明书Materials Provided部分，引用其中HumanEEF1A1基因的阳性引物和阴性引物对投入样本和捕获产物分别进行扩增，阳性引物扩增的产物含有m6A甲基化修饰，阴性引物扩增的产物不含有m6A甲基化修饰，用以评估捕获产物的质量及捕获RNA片段占总体投入量的比例。在同一个样本中，当所检测到的阳性体系占捕获前总投入样本RNA的比例显著高于阴性体系的占比时，说明整个实验过程特异性的识别并捕获了m6A修饰的RNA片段，捕获产物的质量较高，背景RNA较少。

1、使用qPCR定量产品试剂盒配制反应体系

按照表3分别配制8组qPCR阳性反应体系，按照表4分别配制8组qPCR阴性反应体系。

表3单个阳性反应体系

加入组份	单个反应体系加入量
		2×One Step SYBR Green Mix	10μl
One Step SYBR Green Enzyme Mix	1μl
		50×ROX Reference Dye 1	0.4μl
阳性-GSPF(10μM)(SEQ ID NO:1)	0.4μl
		阳性-GSPR(10μM)(SEQ ID NO:2)	0.4μl
RNase-free ddH<sub>2</sub>O	6.8μl
		模板	1μl
总体积	20μl

表4单个阴性反应体系

加入组份	单个反应体系加入量
		2×One Step SYBR Green Mix	10μl
One Step SYBR Green Enzyme Mix	1μl
		50×ROX Reference Dye1	0.4μl
阴性-GSPF(10μM)(SEQ ID NO:3)	0.4μl
		阴性-GSPR(10μM)(SEQ ID NO:4)	0.4μl
RNase-free ddH<sub>2</sub>O	6.8μl
		模板	1μl
总体积	20μl

使用RNA-free ddH₂O将样本1稀释10倍，得到样本5，同样对样本2、样本3、样本4稀释10倍，分别得到样本6、样本7、样本8，取样本5-12各1μl，作为模板分别加入到阳性反应体系和阴性反应体系中，获得16份检测体系。

2、设置反应程序，进行qPCR反应

使用ABI StepOnePlus仪器对上述16份检测体系进行qPCR反应，反应程序设置见表5。

表5qPCR反应程序

3、数据处理

对qPCR仪的下机数据进行分析，评估捕获m6A修饰RNA片段质量，并通过公式ΔCt＝Ct_m6A-Ct_input和公式Input％＝2^^-ΔCt计算捕获后产物占捕获前投入量的百分比。

其中，Ct_m6A代表样本9-12的阳性反应体系和阴性反应体系检测结果，Ct_input代表样本5-8的阳性反应体系和阴性反应体系检测结果，Input％代表捕获产物中RNA片段占捕获前总投入量RNA的比例。

表6显示了不同投入量对应的ΔCt值和Input％，其中阳性体系ΔCt代表捕获产物阳性扩增Ct值与捕获前总投入样本阳性扩增Ct值之差，阴性体系ΔCt代表捕获产物阴性扩增Ct值与捕获前总投入样本阴性扩增Ct值之差，阳性体系Input％代表捕获产物中的m6A修饰RNA片段占捕获前总投入样本m6A修饰RNA的比例，阴性体系Input％代表捕获产物中的非m6A修饰RNA片段占捕获前总投入样本的比例，由此可知，阳性体系Input％越高代表捕获的目标m6A修饰RNA片段越多，阴性体系Input％越低代表捕获的非目标m6A修饰RNA片段越少。

表6数据处理结果

从表6的阳性体系Input％可知，通过本方法能够捕获到m6A修饰的RNA片段，且可以实现对投入量低至5ng的RNA样本进行特异性修饰位点RNA片段的捕获。

实施例3：对靶标m6A修饰RNA样本捕获产物进行文库构建

1、使用加尾试剂盒对捕获修饰的RNA产物(样本9-12)进行polyA加尾

a)按照表7配制加尾反应体系；

表7单个加尾反应体系的配制

加入组份	单个反应体系加入量
		10×Poly(A)Polymerase Buffer	1μl
Poly(A)Polymerase(0.2/μl)	1μl
		25mM MnCl<sub>2</sub>	1μl
10mM DTT	1μl
		0.1％BSA	2μl
100mM ATP	0.1μl
		样本9/10/11/12	5.9μl
总体积	12μl

b)将上述反应体系置于PCR仪中37℃反应15分钟，完成加尾反应；

c)使用RNA磁珠纯化试剂盒对上述步骤产物进行RNA纯化，8μl洗脱液进行洗脱，取7μl进行保存，并命名为样本13(样本9加polyA尾并纯化)、样本14(样本10加polyA尾并纯化)、样本15(样本11加polyA尾并纯化)、样本16(样本12加polyA尾并纯化)；

2、使用单细胞全长RNA扩增试剂盒对上述纯化产物进行文库扩增

a)按照表8配置第一链cDNA反应体系；

表8第一链cDNA反应体系

b)将上述4组反应体系使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上；

c)将混匀后的体系放置于在PCR仪中运行以下程序运行：72℃反应3min，之后立即置于冰上2min，分别命名为样本17(来自样本13)、样本18(来自样本14)、样本19(来自样本15)、样本20(来自样本16)；

d)按表9配制逆转录反应体系；

表9逆转录反应体系

e)使用移液器轻轻混匀上述反应体系，短暂离心收集后置于冰上，在PCR仪中按照表10程序运行；

表10逆转录反应程序

反应温度	反应时间
		42℃	90min
70℃	15min
		4℃	保持

反应结束后将产物放置于4℃进行保存，分别命名为样本21(来自样本17)、样本22(来自样本18)、样本23(来自样本19)、样本24(来自样本20)。

f)按照表11配制PCR扩增反应体系；

表11PCR扩增反应体系

加入组份	单个反应体系加入量
		样本21/22/23/24	20μl
Universal Primer	2.5μl
		Index Primer	2.5μl
2×Amplification Mix	25μl
		总体积	50μl

g)使用移液器轻轻混匀上述反应体系，短暂离心收集后置于冰上，在PCR仪中按照表12程序运行；

表12PCR扩增反应程序

其中，样本21进行PCR扩增反应循环数为12个循环，样本22进行PCR扩增反应循环数为15个循环，样本23进行PCR扩增反应循环数为18个循环，样本24进行PCR扩增反应循环数为20个循环。

反应结束后，得到产物样本25(来自样本21扩增后)、样本26(来自样本22扩增后)、样本27(来自样本23扩增后)、样本28(来自样本24扩增后)，将产物放置于4℃保存。

3、使用双链磁珠纯化试剂盒、Qubit试剂盒和Agilent 2100对扩增后的文库进行纯化与质量检测

a)将磁珠提前30min从2-8℃取出，静置使其平衡至室温；

b)颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，分别吸取90μl磁珠加入到样本25、26、27和28中，使用移液器轻轻吸打10次，充分混匀；

c)将上述混合物室温孵育10min，使得双链DNA充分结合到磁珠上；

d)将结合DNA后的磁珠样本复合物置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；

e)保持复合物处于磁力架上，加入200μl 80％乙醇(现配现用)漂洗磁珠，注意不要吹散磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清，再重复此步骤一次；

f)保持复合物处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min；

g)将复合物从磁力架上取出，加入22μl Nuclease-free ddH₂O，使用移液器轻轻吸打，充分混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约2min)，每份建库纯化DNA产物小心吸取20μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中，得到建库纯化后的终产物29(来自样本25纯化后)、终产物30(来自样本26纯化后)、终产物31(来自样本27纯化后)、终产物32(来自样本28纯化后)。

h)各取1μl上述4组终产物，使用Qubit检测试剂盒对终产物进行浓度测定；

i)各取1μl上述4组终产物，使用Agilent 2100Bioanalyzer仪器及配套检测试剂盒对终产物文库分布进行检测。

图4为文库片段分布结果，从图中可以看出4组终产物均成功构建文库，其主峰位置均在149bp左右，符合预期文库大小(预期分布范围140-200bp)，说明本发明能够实现微量RNA修饰样本的建库，且RNA样本投入量可以低至5ng。

实施例4：对靶标m6A修饰RNA样本捕获产物文库进行一代测序分析

1、使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司基于拓扑异构酶的超快速克隆试剂盒(货号C601)对上述获取的文库终产物29-32进行克隆；

2、使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司Fast-T1化学感受态细胞(货号C505)将上述克隆转化后涂氨苄抗性平板，过夜培养后，每个终产物随机挑选50个克隆进行一代测序；

3、统计一代测序结果如表13；

表13一代测序结果

表13数据显示，不同RNA投入量下捕获的m6A产物所构建的文库，在有效文库当中，已经证实为m6A修饰基因的占比约为17-27％，不同样本之间的占比无显著差异。

序列表

<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司

<120> 一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggtctcaga actgtttgtt tc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaccaaagt ggtccacaaa 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatggaaag tcacccgtaa g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtcagttg gacgagttgg 20

<210> 5

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(87)

<223> n=a或c或g或t

<400> 5

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttcagagttc tacagtccga cgatcttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttvn 87

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctrgrgg 39

Claims

1.一种RNA修饰的捕获方法，所述方法包含：

RNA样本与特异性结合RNA修饰位点的抗体进行孵育，使得抗体与RNA修饰位点结合；

以核酸酶打断与抗体结合的RNA样本获得RNA片段；

以能够结合所述抗体的纯化介质收集含有修饰位点结合抗体的RNA片段。

2.一种RNA修饰的捕获方法，所述方法包含：

特异性结合RNA修饰位点的抗体与纯化介质共孵育获得纯化介质-抗体复合物，所述纯化介质含有所述抗体的结合物；

将纯化介质-抗体复合物与RNA样本孵育，加入核酸酶进行孵育，获得RNA片段；

通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段。

3.一种RNA修饰的捕获方法，所述方法包含：

RNA样本、特异性结合RNA修饰的抗体、纯化介质共孵育；

加入核酸酶处理获得RNA片段；

通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段。

4.一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法，所述方法包含：

2)以核酸酶打断与抗体结合的RNA样本获得RNA片段；

3)以能够结合所述抗体的纯化介质收集含有修饰位点结合抗体的RNA片段；

4)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

5)以含polyA的RNA片段为模板，以含有polyT的逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cDNA一链，其中，所述逆转录引物含有polyT(例如至少3个T)或由其组成；

6)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

5.一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法，所述方法包含：

2)将纯化介质-抗体复合物与RNA样本孵育；

3)将步骤2)的产物与核酸酶进行孵育，获得RNA片段；

4)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段；

5)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

6)以含polyA的RNA片段为模板，以含有polyT的逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cDNA一链，其中，所述逆转录引物含有polyT(例如至少3个T)或由其组成；

7)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

6.一种构建含修饰位点的RNA的测序文库的方法，所述方法包含：

1)RNA样本、特异性结合RNA修饰的抗体、纯化介质共孵育；

2)加入核酸酶处理获得RNA片段；

3)通过纯化介质富集与特异性抗体结合的RNA片段；

4)在RNA片段末端加polyA获得含polyA的RNA片段；

6)利用末端转移活性，在cDNA一链的3'端增加oligoC；

7.一种检测RNA位点修饰的方法，所述方法包含：

使用权利要求4-6任一项所述方法构建含修饰位点的RNA的测序文库；

对所述测序文库进行测序。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述RNA样本为核酸提取后的总RNA。

9.根据权利要求8所述的方法，所述总RNA质量为5ng-1000ng；优选5ng-250ng；更优选5ng-50ng。

10.根据权利要求8所述的方法，所述总RNA的A260/A280和/或A260/A230的范围在1.8-2.2间。

11.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述RNA样本是裂解液裂解后的细胞裂解产物。

12.根据权利要求11所述的方法，所述细胞裂解产物裂解自≥100个细胞。

13.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述特异性结合RNA修饰的抗体是能够特异性识别RNA甲基化修饰的抗体。

14.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述特异性结合RNA修饰的抗体是能够特异性识别RNA乙酰化修饰的抗体。

15.根据权利要求13所述的方法，所述特异性结合RNA修饰的抗体是能够特异性识别RNAm6A、m5C、m1A、m7G或ac4C修饰中的一种。

16.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述核酸酶为微球菌核酸酶。

17.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述纯化介质是磁性微球。

18.根据权利要求17所述的方法，所述磁性微球为含有抗体结合物的磁珠。

19.根据权利要求18所述的方法，所述抗体结合物选自ProteinA、Protein G或ProteinAG中的一种或多种。

20.根据权利要求4-7任一项所述的方法，通过酶的作用在RNA片段末端加polyA。

21.根据权利要求20所述的方法，所述酶是加尾酶；优选地，所述加尾酶是Poly(A)Polymerase。

22.根据权利要求4-7任一项所述的方法，所述逆转录活性、所述末端转移活性和所述模板转换活性中的任一项、任两项或全部三项来自逆转录酶；优选地，所述逆转录酶是MMLV。

23.根据权利要求4-7任一项所述的方法，所述转换模板中的oligoG中G的数目与cDNA一链3'端的oligoC中C的数目相同或不同。

24.根据权利要求4-7任一项所述的方法，所述DNA聚合酶活性来自高保真DNA聚合酶；优选地，所述高保真DNA聚合酶是Pfu、vent、KOD1中的至少一种。