CN109517881A

CN109517881A - 一种体液微量游离rna的高通量测序文库构建方法

Info

Publication number: CN109517881A
Application number: CN201810607652.XA
Authority: CN
Inventors: 鲁志; 谈畅
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-06-13
Also published as: CN109517881B

Abstract

本发明公开了一种体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法。该方法包括：用硅基质纯化体液样本exRNA，去磷酸化、加polyA尾，然后用模板转换和锁核酸技术对加尾产物进行反转录，获得5’末端具有接头的cDNA；然后进行低循环PCR，最终得到高通量测序文库。本发明通过应用模板转换和锁核酸技术，针对微量RNA在高通量测序文库的构建过程中遇到的问题做了深度优化，极大的降低了建库时间和成本。应用本发明的技术，可以在一天内对小于10ng的微量RNA完成建库，后通过高通量测序，可以得到质量良好的数据，经过分析可以找到已有的很多与疾病相关的RNA生物标志物。

Description

一种体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法。

背景技术

exRNA指胞外RNA，包括miRNA、Y-RNA、circRNA、lncRNA等。RNA标志物与现有的DNA和蛋白标志物相比，具有更好的敏感性、组织特异性和多样性，给更好的临床检验带来了新的期望。随着技术的持续进步，目前用血清或血浆中的微量RNA来诊断疾病，成为诊断医学十分关注的一个研究方向，这是因为：1)血清当中有大量的、种类丰富的RNA。并且这些RNA可以相对稳定地存在；2)同时我们已经知道RNA参与多种基因的表达调控；3)血液又是我们最容易获得的诊断样本之一；4)而且，目前血清或血浆中的RNA已经可以被检测到，所以许多学者都在研究血液中的RNA，以期望从中找到新的诊断Biomarker。

但在实际操作过程中遇到的瓶颈问题就是如何将从血清或血浆中得到的微量RNA构建为高通量测序文库(Library)，现有的方法需要较多样本量(至少>1mL血浆)，来获得足量(至少>10ng)的RNA，再通过连接适配子的方法来构建测序文库。以上方法存在的问题是：1)对exRNA大小没有筛选能力，小于15nt的序列没有信息价值；很多样本的获得是受限制的，包括体积(血液、唾液数量)和形态(FFPE、唾液、脑脊液等)，进而可得到的RNA量受到限制，所以很多情况下不能得到10ng以上的RNA；连接适配子的方法效率低，捕获的RNA数量有限；2)文库构建过程操作繁琐，耗时长，仅建库需要5到7天；并且适配子序列(adaptor)合成价格昂贵，整体建库成本高(>1200元/样)。以上问题都限制了体液RNA的研究进展和在临床上的应用。

发明内容

为了有效的解决上述技术问题，本发明提供了一种新的体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法。

第一方面，本发明要求保护一种体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法。

本发明所提供的体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法，可包括如下步骤：

(a)从待测体液样本中提取获得游离RNA粗提液；使用硅基质对所述游离RNA粗提液进行纯化，得到纯化后游离RNA；

(b)将所述纯化后游离RNA进行去磷酸化处理，然后添加polyA尾巴，得到加尾产物；

(c)采用反转录引物ODT和M-MLV逆转录酶将所述加尾产物进行反转录，所述反转录引物ODT自5’末端到3’末端结构如下：接头序列I、Oligo(dT)、随机序列；在反转录过程中加入接头引物TSP，所述接头引物TSP自5’末端到3’末端结构如下：接头序列II、GGG或其修饰物；最终获得5’末端具有所述接头序列II的cDNA；

(d)以步骤(c)获得的cDNA为模板，采用引物UFP和引物index#进行PCR反应，所述引物UFP自5’末端到3’末端结构如下：测序引物序列I、标签序列I、所述接头序列II；所述引物index#表示若干条序列不同的引物index，所述引物index自5’末端到3’末端结构如下：测序引物序列II、标签序列II、所述接头序列I；每条所述引物index中的所述标签序列II均不同(所述测序引物序列II和所述接头序列I均相同)；最终得到高通量测序文库。

在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中的所述硅基质具体为zymo公司货号为R1059的产品中的硅基质，当然也可以为与该产品性能参数均相同的其他产品。

进一步地，所述反转录引物ODT中的所述接头序列I可为SEQ ID No.1的第1-23位，所述随机序列可为VN，V表示A或G或C，N表示A或G或C或T。所述接头引物TSP中的所述接头序列II可为SEQ ID No.2的第1-30位，所述GGG或其修饰物可为rGrG+G，rG表示鸟嘌呤核糖核苷酸，+G表示G为锁核酸形式。所述引物UFP中的所述测序引物序列I为SEQ ID No.3的第1-20位，所述标签序列I为SEQ ID No.3的第21-28位。所述引物index#可为引物index1、引物index2、引物index3、引物index4、引物index5、引物index6、引物index7和引物index8；所述引物index1的标签序列可为SEQ ID No.4的第25-30位，所述引物index2的标签序列可为SEQ ID No.5的第25-30位，所述引物index3的标签序列可为SEQ ID No.6的第25-30位，所述引物index4的标签序列可为SEQ ID No.7的第25-30位，所述引物index5的标签序列可为SEQ ID No.8的第25-30位，所述引物index6的标签序列可为SEQ ID No.9的第25-30位，所述引物index7的标签序列可为SEQ ID No.10的第25-30位，所述引物index8的标签序列可为SEQ ID No.11的第25-30位。

更进一步度，所述反转录引物ODT的序列具体可为SEQ ID No.1。所述接头引物TSP的序列具体可为SEQ ID No.2。所述引物UFP的序列具体可为SEQ ID No.3。所述引物index1的序列具体可为SEQ ID No.4，所述引物index2的序列具体可为SEQ ID No.5，所述引物index3的序列具体可为SEQ ID No.6，所述引物index4的序列具体可为SEQ ID No.7，所述引物index5的序列具体可为SEQ ID No.8，所述引物index6的序列具体可为SEQ ID No.9，所述引物index7的序列具体可为SEQ ID No.10，所述引物index8的序列具体可为SEQ IDNo.11。

进一步地，所述(c)可按照如下步骤进行：(c1)配制含有所述加尾产物、所述反转录引物ODT和所述接头引物TSP的混合体系I，然后将所述混合体系I置于72-75℃(如75℃)变性2分钟；(c2)加入First-Strand Buffer、DTT、dNTP、甜菜碱(Betaine)、MgCl₂、RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)和ddH₂O，得到混合体系II；向所述混合体系II中加入M-MLV逆转录酶，得到混合体系III；(c3)将所述混合体系III按照如下进行热循环：42℃90min；50℃2min，42℃2min，10个循环；70℃15min；4℃保存。反应结束即获得所述5’末端具有所述接头序列II的cDNA。

进一步地，步骤(c)中，所述M-MLV逆转录酶也替换为能够在反转录产物的3’端加上ccc(三个胞嘧啶)的其他逆转录酶。

进一步地，所述(d)中进行的PCR反应可为低循环PCR反应。

更进一步地，所述低循环PCR反应的循环数可为9-12个。

更加具体地，所述低循环PCR反应的反应程序可为98℃30s；98℃15s，65℃15s，72℃15s，9-12个循环；72℃2min；4℃保存。

进一步地，所述(d)中进行完PCR反应后还可包括对PCR产物进行纯化的步骤(如电泳后切胶纯化)。

进一步地，步骤(a)中，所述游离RNA粗提液可按照包括如下步骤的方法制备获得：将所述待测体液样本先用蛋白酶K进行消化处理；再依次用Tris盐酸缓冲液(促进核酸和硅基质的结合)和体积分数为95-100％的乙醇(促进核酸析出)处理，从而获得所述游离RNA粗提液。

第二方面，本发明要求保护一种从待测体液样本中提取并纯化游离RNA的方法。

本发明所提供的从待测体液样本中提取并纯化游离RNA的方法，可包括前文第一方面所示方法中的步骤(a)。

第三方面，本发明要求保护如下(A1)或(A2)所示的引物组：

(A1)由前文第一方面所示方法中的所述反转录引物ODT、所述接头引物TSP和所述引物UFP组成的引物组。

(A2)由前文第一方面所示方法中所述的反转录引物ODT、所述接头引物TSP和所述引物UFP和所述引物index#组成的引物组。

第四方面，本发明要求保护前文第二方面所示的方法或前文第三方面所示引物组在构建体液微量游离RNA的高通量测序文库中的应用。

在上述第一方面、第二方面和第四方面中，所述待测体液样本均可为血浆、唾液、母乳、尿液或精液等。所述游离RNA均可为exRNA。在本发明的具体实施方式中，所述待测体液样本具体为血浆。

本发明通过应用模板转换和锁核酸技术，针对微量RNA在高通量测序文库的构建过程中遇到的问题做了深度优化，极大的降低了建库时间和成本(表12)。应用本发明的技术，可以在一天内对小于10ng的微量RNA完成建库，后通过高通量测序，可以得到质量良好的数据，经过分析可以找到已有的很多与疾病相关的RNA生物标志物。

具体而言，本发明的创新点及有益效果在于：

第一，本发明使用硅基质的纯化方法，对exRNA的进行筛选，剔除小于15nt的序列，显著提高数据信噪比。

第二，超敏感的RNA捕获能力，可对1ng以下的exRNA进行建库测序，适用于体液exRNA的检测需求。

第三，建库成本显著降低，仅是已有方案的10％左右；仅需1天即可完成提取、建库，显著增加实验的时效性，同时降低降低人力成本；

附图说明

图1为文库构建的流程示意图。

图2为非变性聚丙烯酰胺凝胶分离文库和文库的切胶。其中，A为非变性聚丙烯酰胺凝胶分离文库；B为文库的切胶。

图3为文库的琼脂糖凝胶检测结果。

图4为文库的核酸分析仪检测结果。

图5为文库的qPCR检测结果。

图6为最终文库结构示意图。

图7为FastQC结果。

图8为reads长度分布和映射(mapping)到人类基因组结果。HG38代表人类基因组，NonHuman代表非人类基因组。

图9为已知生物标志物的分析。

图2至图9中的Library1和Library2均表示两个不同的样本，分别对应实施例1中的2例肝癌病人的血浆，Library1代表第一位，Library2代表第二位。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的高通量文库构建流程中所使用的核酸序列及其修饰以及测序引物(P5和P7)具体见表1。

表1高通量文库构建流程中所使用的核酸序列及其修饰

注：V表示A或G或C，N表示A或G或C或T。r表示RNA；+G表示LNA(锁核酸)。

实施例1、从血浆样本中提取exRNA并构建高通量测序文库

本实施例中的待测液体样本为2例肝癌病人的血浆，文库1(Library1)代表第一位，文库2(Library2)代表第二位。本实施例将详细描述从血浆样本中提取exRNA并构建高通量测序文库的具体方法，并通过鉴定所得文库质量来评价本方法。

一、提取并纯化exRNA

1.将1mL血浆样本吸取至15mL管中，加入1mL Digestion Buffer(成分是Tris盐酸缓冲液，为酶促反应提供反应环境，zymo货号R1059)混匀。

2.加入配好的蛋白酶K 25μL(50unit)，混匀后室温孵育2小时。

3.加入2mL Binding buffer(成分是Tris盐酸缓冲液，为核酸结合提供反应环境，zymo货号R1059)，混匀。

4.加入8mL 95-100％(体积分数)乙醇(促进核酸析出)，混匀，得到血浆exRNA粗提液。

5.将Filter Reservoir放入过滤柱Filter上，组装过滤装置(zymo货号S7000)。

6.将前述步骤3获得的混合液(血浆exRNA粗提液)转移至Reservoir管中，打开真空泵抽滤使混合液完全流过过滤柱，关闭真空泵，弃去Reservoir管。

7.加入600μL RNA prep buffer(甲醇，促进核酸析出，zymo货号R1059)至过滤柱基质(硅基质，zymo公司产品，货号为R1059)中，打开真空泵，使液体流过(大于400mmHg压力即可)，关闭真空泵。

8.将过滤柱转移至一收集管中，12000g离心2mins除去残留液体。将过滤柱转移至另一收集管中。

9.加入200μL RNA Recovery Buffer(甲醇乙醇混合物，促进核酸析出，zymo货号R1059)，室温孵育3-5mins，12000g离心30s，保留滤液。

10.向滤液中加入300μL 95-100％(体积分数)乙醇，混合后转移至装有IC Column过滤柱(zymo货号C1004-50)中，放置在一干净收集中，12000g离心30s。弃去滤液。

11.加入400μL RNA Prep Buffer，12000g离心30s，弃去滤液。

12.加入700μL RNA Wash Buffer(体积分数为75％的乙醇，去除盐离子)，12000g离心30s，弃去滤液。

13.加入400μL RNA Wash Buffer，12000g离心2mins，将过滤柱转移至一无RNA酶的离心管中。

14.加入20μL超纯水至过滤柱基质(硅基质，zomy公司产品，货号为R1059)中，室温孵育2mins，12000g离心30s洗脱RNA，至此得到纯化后的血浆exRNA。这两例血浆(Library1和Library1)分别提取到3.2ng和6.6ng exRNA。

二、文库构建

文库构建的流程示意图如图1所示。具体步骤如下：

1.去磷酸化：

1.1将步骤一提取纯化得到的20μL exNRA与表2中的试剂混合：

表2该步骤加入的试剂

注：表中的T4polynucleotide kinase buffer(无ATP)、SUPERase·In抑制剂和T4polynucleotide kinase为NEB产品，货号为M0201。

1.2将整个反应体系放入37℃金属浴中60分钟；

1.3将整个反应体系放入70℃金属浴中10分钟；

1.4向体系中加入表3中的成分：

表3该步骤加入的试剂

1.5混匀后将反应体系放入-10℃冰箱中30分钟；

1.6之后4℃下16,000×g离心30分钟；

1.7弃去上清，加入500μL 75％(体积分数)乙醇，4℃下16,000×g离心10分钟；

1.8去乙醇，空气中静置晾干，加入11.25μL超纯水溶解RNA沉淀。

2.多聚A尾的添加

2.1准备2×tailing reaction mix试剂(表4)以及Poly(A)polymerase mix试剂(表5)，后均置于冰上待用；

表4 2×tailing reaction mix试剂

注：表中的10×Poly(A)Polymerase buffer和RNase Inhibitor抑制剂为NEB产品，货号为M0276。

表5 Poly(A)polymerase mix

注：表中的Poly(A)polymerase(5U/μL stock)为NEB产品，货号为M0276。

2.2将上述获得的去磷酸化的产物75℃变性2分钟后，立即放置冰上2分钟；

2.3在冰上向体系中加入11.25μL的2×tailing reaction mix和2.5μL的Poly(A)polymerase mix；

2.4将反应体系置于37℃金属浴10分钟；

2.5向反应体系中加入1.3μL的250mM EDTA终止加尾反应；

2.6沉淀加尾产物，依照1.3-1.8步骤进行。

3.反转录(运用模板转换及锁核酸技术)

3.1加入9μL的RNase-free H₂O重悬上述获得的加尾产物；

3.2依次加入反转录引物ODT(具体序列见表1)(50μM)和接头引物TSP(具体序列见表1)(50μM)各1μL；

3.3将上述混合物75℃变性2分钟后，立即放置冰上2分钟；

3.4加入表6中的成分：

表6该步骤加入的成分

注：表中试剂一栏给出的浓度是试剂本身的浓度。

轻慢的混匀后加入1μL的M-MLV RTase逆转录酶(200U/μl，Takara货号2641A)混匀。

3.5将上述体系放入PCR仪器中，进行表7中的热循环步骤：

表7该步骤的热循环

经该步骤后，获得5’末端具有接头的cDNA。

4.文库扩增和纯化

4.1配制如下表8中的PCR反应体系：

表8该步骤的PCR反应体系

注：其中引物UFP和引物Index#(可表示8个不同的引物Index)的具体序列参见表1。表中试剂一栏给出的浓度是试剂本身的浓度。

然后，进行如下表9所示的PCR反应。

表9该步骤PCR反应的扩增程序

4.2配制8％浓度1.5mm厚度非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，成分如表10所示：

表10 8％非变性聚丙烯酰胺凝胶配方

将胶液灌制1.5mm制胶板中，待凝固后待用。

4.3将完成步骤4.2后PCR的反应体系加入终浓度1×Loading Buffer，组装凝胶电泳设备后将样品加入样品槽中，在180V电压和1×TBE缓冲液中电泳30分钟后使用1×SYBRGold染料在1×TBE缓冲液中染色5分钟。

4.4在凝胶成像仪中对凝胶进行取像和切胶(结果见图2)。

4.5在1.5mL离心管中将切下的胶块粉碎，加入600μL的DNA提取缓冲液，成分如表11所示：

表11 DNA提取缓冲液的成分

在室温下缓慢旋转混匀4个小时，12,000×g离心1分钟后转移上清液到0.22μm孔径SPINX离心过滤器后12,000×g离心1分钟，将流穿液按照1.4步骤进行文库的回收。

5.文库的质量控制

5.1使用琼脂糖凝胶电泳对文库进行质量控制(结果见图3)。图3表明回收后的文库大小正确，未见杂带，纯度达标。

5.2使用安捷伦2100核酸分析仪进行文库的质量控制(结果见图4)。图4表明文库的精确分子量符合预期，纯度达标。

5.3使用qPCR仪对文库进行质量控制(使用P5和P7引物对文库的浓度进行测定，作为上机测序数据量的依据，P5和P7的具体序列参见表1)(结果见图5)。图5表明每个文库溶解曲线单一，说明文库纯度达标，根据荧光强度表明浓度达标。

5.4理论最终文库示意图(图6)。

6序列测定

本发明使用illumina Hiseq2500对文库进行单端50测序，每个文库约输出10兆reads。

7.数据分析

7.1进行fastQC(结果见图7)。图7表明测序数据质量良好，符合实验预期。

7.2去除低质量reads，参数如下：

cutadapt-u-60

7.3去除接头序列，参数如下：

cutadapt-g GGGGGG

cutadapt-a AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATCG

7.4去除小于15nt的reads，参数如下：

cutadapt-m 15

7.5长度统计和映射(mapping)到人类基因组(结果见图8)。图8表明测序数据符合预期。

7.6已知生物标志物的分析(结果见图9)。图9表明在选取的个别基因上有正确的数据覆盖，表明此文库构建方式是有效的。

表12文库构建成本

试剂	供应商	单价	单样本使用量	单样本成本
					T4 polynucleotide kinase	NEB	456元/500U	2U	约2元
Poly(A)polymerase	NEB	584元/100U	2U	约12元
					M-MLV	Clontech	533元/1000U	2U	约1元
RNase Inhibitor	Clontech	423元/5000U	10U	约1元
					TSP	Genescript	450元/5OD	1μL	<1元
Phusion高保真聚合酶	NEB	743元/100U	2U	约15元
					Index#	Genewiz	150元/5OD	1μL	<1元
其他基本试剂和耗材				约80元
					总计				约120元

<110> 清华大学

<120> 一种体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法

<130> CGGNQALN186062

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> v为a或g或c

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> n为a或g或c或t

<400> 1

ttcagacgtg tgctcttccg atcttttttt tttttttttt ttttvn 46

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(32)

<223> 各核苷酸均为核糖核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> 锁核酸

<400> 2

ctctttccct acacgacgct cttccgatct ggg 33

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatagtcgt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

caagcagaag acggcatacg agatactgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agatatgctg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

caagcagaag acggcatacg agatacgtcg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

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<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

caagcagaag acggcatacg agatatcgta gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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caagcagaag acggcatacg agatcgtcag gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

caagcagaag acggcatacg agatcgtagc gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

Claims

1.一种体液微量游离RNA的高通量测序文库构建方法，包括如下步骤：

(d)以步骤(c)获得的cDNA为模板，采用引物UFP和引物index#进行PCR反应，所述引物UFP自5’末端到3’末端结构如下：测序引物序列I、标签序列I、所述接头序列II；所述引物index#表示若干条序列不同的引物index，所述引物index自5’末端到3’末端结构如下：测序引物序列II、标签序列II、所述接头序列I；每条所述引物index中的所述标签序列II均不同；最终得到高通量测序文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反转录引物ODT中的所述接头序列I为SEQ ID No.1的第1-23位，所述随机序列为VN，V表示A或G或C，N表示A或G或C或T；和/或

所述接头引物TSP中的所述接头序列II为SEQ ID No.2的第1-30位，所述GGG或其修饰物为rGrG+G，rG表示鸟嘌呤核糖核苷酸，+G表示G为锁核酸形；和/或

所述引物UFP中的所述测序引物序列I为SEQ ID No.3的第1-20位，所述标签序列I为SEQ ID No.3的第21-28位；和/或

所述引物index#为引物index1、引物index2、引物index3、引物index4、引物index5、引物index6、引物index7和引物index8；所述引物index1的标签序列为SEQ ID No.4的第25-30位，所述引物index2的标签序列为SEQ ID No.5的第25-30位，所述引物index3的标签序列为SEQ ID No.6的第25-30位，所述引物index4的标签序列为SEQ ID No.7的第25-30位，所述引物index5的标签序列为SEQ ID No.8的第25-30位，所述引物index6的标签序列为SEQ ID No.9的第25-30位，所述引物index7的标签序列为SEQ ID No.10的第25-30位，所述引物index8的标签序列为SEQ ID No.11的第25-30位。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反转录引物ODT的序列为SEQ IDNo.1；和/或

所述接头引物TSP的序列为SEQ ID No.2；和/或

所述引物UFP的序列为SEQ ID No.3；和/或

所述引物index1的序列为SEQ ID No.4，所述引物index2的序列为SEQ ID No.5，所述引物index3的序列为SEQ ID No.6，所述引物index4的序列为SEQ ID No.7，所述引物index5的序列为SEQ ID No.8，所述引物index6的序列为SEQ ID No.9，所述引物index7的序列为SEQ ID No.10，所述引物index8的序列为SEQ ID No.11。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述(c)是按照如下步骤进行的：(c1)配制含有所述加尾产物、所述反转录引物ODT和所述接头引物TSP的混合体系I，然后将所述混合体系I置于72-75℃变性2分钟；(c2)加入First-Strand Buffer、DTT、dNTP、甜菜碱、MgCl₂、RNA酶抑制剂和ddH₂O，得到混合体系II；向所述混合体系II中加入M-MLV逆转录酶，得到混合体系III；(c3)将所述混合体系III按照如下进行热循环：42℃90min；50℃2min，42℃2min，10个循环；70℃15min。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述(d)中进行的PCR反应为低循环PCR反应；

进一步地，所述低循环PCR反应的循环数为9-12个；

更进一步地，所述低循环PCR反应的反应程序为98℃30s；98℃15s，65℃15s，72℃15s，9-12个循环；72℃2min。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述游离RNA粗提液是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将所述待测体液样本先用蛋白酶K进行消化处理，再依次用Tris盐酸缓冲液和体积分数为95-100％的乙醇处理，从而获得所述游离RNA粗提液。

7.一种从待测体液样本中提取并纯化游离RNA的方法，包括权利要求1-6任一中的步骤(a)。

8.引物组，为如下(A1)或(A2)：

(A1)由权利要求1-3任一中所述的反转录引物ODT、所述接头引物TSP和所述引物UFP组成；

(A2)由权利要求1-3任一中所述的反转录引物ODT、所述接头引物TSP和所述引物UFP和所述引物index#组成。

9.权利要求7所述的方法或权利要求8所述引物组在构建体液微量游离RNA的高通量测序文库中的应用。

10.根据权利要求1-7中任一所述方法或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述待测体液样本为血浆、唾液、母乳、尿液或精液；和/或

所述游离RNA为exRNA。