CN102286462A - 一种游离rna提取方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从生物样品中提取游离RNA的方法，其具体步骤包括：用化学试剂将生物样品中的核酸释放出来；酚氯仿抽提出游离RNA；抽提出的游离RNA在高盐条件下与硅胶柱结合；洗涤去除杂质；低盐条件下洗脱，得到高纯度的游离RNA。本发明还提供了一种游离RNA提取试剂盒。

Description

一种游离RNA提取方法及试剂盒

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从生物样本中提取游离RNA的方法和一种游离RNA提取试剂盒。

【背景技术】

游离RNA是指存在于血清、血浆、肺泡灌洗液、尿液、胸腹水等体液中的细胞外游离RNA，循环RNA是特指血清或血浆中游离RNA。

传统产前诊断需要依赖于有创性操作获取胎儿组织(如：羊膜腔穿刺和绒毛取样等)，均对胎儿有潜在的风险。1997年，Lo等首次发现，妊娠妇女血浆和血清中存在胎儿DNA。这位无创诊断提供了一种有效的途径。但血浆中母体来源的DNA占总DNA的比例非常高，一定程度上提高了检测胎儿DNA的难度。目前，游离DNA在临床上主要用于对父源性DNA检测，如SRY基因型鉴定胎儿性别、检测RhD血型及其它父源性遗传性疾病检测。产前诊断最常见的是21三体等非整倍体疾病检测，它要求对染色体拷贝数量进行精确定量，这对于游离DNA来说是个挑战。2000年，Poo等发现妊娠妇女血浆存在游离的胎儿RNA。同游离DNA相比，游离RNA的优势在于：前者主要依靠Y染色体相关基因检测判断，不适应于女性胎儿的检测，而游离RNA能扩大其检测范围；同时，游离DNA在母体血浆中含量低，而游离RNA能够排除母体背景干扰，检测更适用于产前诊断。

研究发现，一些肿瘤患者肿瘤组织中肿瘤相关基因表达与体液中游离肿瘤相关性基因RNA表达密切相关，游离RNA作为肿瘤标志物鉴别良恶性病变具有较好的特异性和敏感性。具有转移潜能的肿瘤细胞在术前或术时脱离原发灶，以非常少的数量转移到淋巴结、骨髓、血液或远处器官中，普通的检测手段不能发现，肿瘤的微转移是肿瘤复发和转移的重要起始步骤，及时诊断微转移有助于对临床治疗方案选择和预后的判断，游离RNA是肿瘤微转移、监测疗效、预后判断的有效标志物。

游离RNA作为一个新兴的研究领域，许多方法和技术尚处于探索阶段。它作为一种非侵入性的早期检测手段，能在许多领域广泛地应用，目前的研究中已显示出了良好的发展前景。

本发明拟提供一种从血清、血浆等无细胞体液中提取游离RNA的方法及提取试剂盒，可以应用于生物医学领域。

本发明的提取方法是按照以下步骤完成的：1)化学法释放核酸；2)酚氯仿抽提；3)RNA在特定条件下吸附于二氧化硅表面；4)洗涤去除杂质；5)洗脱得到RNA。

本发明提供的游离RNA提取方法，其特征在于：

1)释放核酸所用裂解液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种。

2)释放核酸所用裂解液中含有0.05-50％的表面活性剂，该表面活性剂可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、CTAB、NP-40中的一种或几种；

3)酚氯仿抽提中所用的酚氯仿抽提液中，苯酚与酚氯仿的比率为1∶0.5-1∶3，所述苯酚为pH小于7.0的饱和酚；

4)RNA吸附介质可以是玻璃粉、玻璃纤维及其它表面包覆有SiO₂的材料；

5)洗涤时所用洗涤液中含有5％-100％的乙醇；

6)洗涤时所用洗涤液中含有0-8M盐酸胍或者0-6M异硫氰酸胍，或者两者皆有。

7)洗脱时所用洗脱液可以是水，还可以是含有低浓度盐离子的水。

本发明提供的提取试剂盒，包括以下几种组份：裂解液、酚氯仿抽提液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、硅胶柱、使用说明书。

本发明提供的提取试剂盒，其特征在于：

1)裂解液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种。

2)裂解液中含有0.05-50％的表面活性剂，该表面活性剂可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、CTAB、NP-40中的一种或几种；

3)酚氯仿抽提液中，苯酚与酚氯仿的比率为1∶0.5-1∶3，所述苯酚为pH小于7.0的饱和酚；

4)洗涤液1中含有5％-100％的乙醇和异丙醇中的一种或两种；

5)洗涤液1中含有0-8M盐酸胍或者0-6M异硫氰酸胍，或者两者皆有。

6)洗涤液2中含有5％-100％的乙醇；

7)洗脱时所用洗脱液可以是水，还可以是含有低浓度盐离子的水。

本发明所提供的游离RNA提取方法及试剂盒具有简便、快速、得率高、产物纯度高、便宜等优势，适用于从血清、血浆等无细胞体液中快速分离RNA，所得RNA可以直接应用于聚合酶链式反应等分子生物学实验。

【具体实施方式】

尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。

实施例1试剂成分

裂解液：2.4M GuSCN，100mM Tris(pH 7.5)，0.5％Triton X-100

酚氯仿抽提液：苯酚氯仿等体积混匀。

洗涤液1：1.75M GuSCN，25mM Tris(pH 7.5)，15％乙醇

洗涤液2：25mM Tris(pH 7.5)，70％乙醇

洗脱液：DEPC处理水

实施例2游离RNA提取方法

1)取300μL新鲜分离的血浆或血清，加入等量裂解液，振荡混匀。

2)冰上放置5min。

3)加入等体积酚氯仿抽提液，盖上盖子，剧烈振荡30～60s。

4)12000g离心10min。

5)转移上层水相至新的离心管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，涡旋混匀。

6)将步骤5的混合液加到硅胶柱中，10000g离心30s。

7)弃去滤过液，将硅胶柱放回到原来的收集管中。

8)加入500μL洗涤液1，10000g离心30s，弃去滤过液，将硅胶柱放回到原来的收集管中。

9)加入600μL洗涤液2，10000g离心30s，弃去滤过液，将硅胶柱放回到原来的收集管中。

10)重复步骤9一次。

11)10000g离心1min，以除尽残留的醇类。

12)将硅胶柱放置在一个新的1.5mL离心管中，加50～100μL预热(95℃)的洗脱液到硅胶柱的滤膜中央。

13)10000g离心1min，，收集滤液(纯化的RNA)，-20℃或-80℃保存。

实施例3效果比较

1)分别用Ambion的mirVana PARIS Kit和本发明所述的游离RNA提取试剂盒提取同一份血浆样本，操作步骤分别参照Mirvana PARIS Kit说明书及实施例2中所述方法；

2)产物用100μL洗脱液洗脱，对所得产物进行OD值检测，比对其纯度和浓度；

3)每个样品取5μL进行实时PCR检测；

4)逆转录：采用TaqMan

MicroRNA Reverse Transcription Kit进行逆转录操作。

表1逆转录体系

10×RT buffer	1.5μL
		100mM dNTP	0.15μL
reverse transcriptase(5U/μL)	1μL
		Rnase inhibitor(40U/μL)	0.19μL
5×RT primer	3μL
		Micro RNA	5μL
H2O	4.16μL
		Total	15μL

表2反应条件

16℃	30min
		42℃	30min
85℃	5min
		10℃	hold

5)Real-time PCR：采用TaqMan

MicroRNA Assays，检测hsa miR16的表达水平，反应体系及反应条件见表3和表4。

表3反应体系

2×Master mix	10μL
		20×real-time primer	1μL
cDNA product	1μL
		H2O	8μL
Total	20μL

表4反应条件

6)FAM通道，60℃收集荧光。

7)实验数据参见表5，从数据可以看出，本发明所述游离RNA提取试剂盒的提取效果在纯度、得率等方面要好于mirVana PARIS Kit。

表5实验数据

Claims (4)

1.一种从无细胞体液中提取RNA的方法，该提取方法是按照以下步骤完成的：1)化学法释放核酸；2)酚氯仿抽提；3)RNA在特定条件下吸附于二氧化硅表面；4)洗涤去除杂质；5)洗脱得到RNA。

2.如权利1所述提取RNA的方法，其特征在于：

1)释放核酸所用裂解液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种。

2)释放核酸所用裂解液中含有0.05-50％的表面活性剂，该表面活性剂可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、CTAB、NP-40中的一种或几种；

3)酚氯仿抽提中所用的酚氯仿抽提液中，苯酚与酚氯仿的比率为1∶0.5-1∶3，所述苯酚为pH小于7.0的饱和酚；

4)RNA吸附介质可以是玻璃粉、玻璃纤维及其它表面包覆有SiO₂的材料；

5)洗涤时所用洗涤液中含有5％-100％的乙醇；

6)洗涤时所用洗涤液中含有0-8M盐酸胍或者0-6M异硫氰酸胍，或者两者皆有。

7)洗脱时所用洗脱液可以是水，还可以是含有低浓度盐离子的水。

3.一种从无细胞体液中提取RNA的试剂盒，该包括以下几种组份：裂解液、酚氯仿抽提液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、硅胶柱、使用说明书。

4.如权利3所述提取RNA的试剂盒，其特征在于：

1)裂解液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种。

2)裂解液中含有0.05-50％的表面活性剂，该表面活性剂可以是TritonX-100、Tween 20、SDS、CTAB、NP-40中的一种或几种；

3)酚氯仿抽提液中，苯酚与酚氯仿的比率为1∶0.5-1∶3，所述苯酚为pH小于7.0的饱和酚；

4)洗涤液1中含有5％-100％的乙醇和异丙醇中的一种或两种；

5)洗涤液1中含有0-8M盐酸胍或者0-6M异硫氰酸胍，或者两者皆有。

6)洗涤液2中含有5％-100％的乙醇；

7)洗脱时所用洗脱液可以是水，还可以是含有低浓度盐离子的水。