CN101747398A - 从精浆中提取胞外rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从精浆中提取胞外RNA的方法，包括将收集和分离精浆、对精浆进行两次变性液处理、用异丙醇和乙醇沉淀和洗涤RNA等步骤，该方法结合精液的生物化学特点和胞外RNA的特点，有针对性地选择和组合RNA提取试剂，针对精浆中含丰富的蛋白质，在变性液中加入了N-十二烷基肌氨酸钠，以促进硫氰酸胍对蛋白质的变性作用；针对胞外RNA一般与某种物质结合的特点，在变性液中加入了Triton X-100，有利于RNA与所结合物质的分离。该方法成本低廉、结果可靠、易于推广应用，所提取的胞外RNA含量高、质量好，为一种无创性的手段，可替代现行的穿刺方法而应用于男性生殖器官基因表达研究和器官功能检测、评定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及RNA的提取方法，尤其涉及从精浆中提取游离RNA的方法。
背景技术
胞外RNA是存在于细胞外的RNA，近年来被认为在基因表达研究、疾病诊断、法医鉴定等方面有很好的应用前景[参见：Vlassov VV，Laktionov PP，RykovaEY.Extracellular nucleic acids.Bioessays 2007，29：654-67]。精液是生殖系统多个器官共同分泌和排除液体的混合物，是进行生殖系统疾病诊断的重要标本[参见：熊承良，主编.《临床生殖医学》.人民卫生出版社.2007.p23-8]。
目前，研究和检测男性生殖系统器官(如睾丸、前列腺、精囊腺等)的某些基因的表达，及临床诊断某些男性生殖系统疾病，如肿瘤、睾丸精子发生情况，都依赖于穿刺，穿刺的有创性和不易接受性，在很大程度上限制了对生殖系统器官基因表达分析的研究和应用。
胞外RNA是指存在于细胞膜外的RNA，一般认为来源于细胞死亡后释放或活细胞分泌至胞外(图2)[参见：Fleischhacker M，Schmidt B.Circulatingnucleic acids(CNAs)and cancer-A survey.Biochim Biophys Acta 2007.1775：181-232]，并可能与其他物质结合[参见：Park NJ，Li Y，Yu TW，BrinkmanBM，Wong DT.Characterization of RNA in saliva.Clin Chem 2006.52：988-94]，增加其稳定性[参见：Zubakov D，Hanekamp E，Kokshoorn M，etal.Stable RNA markers for identification of blood and saliva stainsrevealed from whole genome expression analysis of time-wise degradedsamples.Int J Legal Med 2008，122：135-42]，逃脱RNA酶的降解作用。国外对胞外RNA的研究开始于1999年，两个小组在肿瘤患者外周血血浆中检测肿瘤来源的RNA[参见：Lo KW，Lo YMD，Leung SF，et al.Analysis of cell-freeEpstein-Barr virus associated RNA in the plasma of patients withnasopharyngeal carcinoma.Clin Chem 1999，45：1292-4；Kopreski MS，BenkoFA，Kwak LW，et al.Detection of tumor messenger RNA in the serum ofpatients with malignant melanoma.Clin Cancer Res 1999，5：1961-5]。目前，对于胞外RNA的研究成为一个新的热点，除外周血血浆外，已在唾液、支气管灌洗液、尿液中发现有胞外RNA的存在[参见：Li Y，Zhou X，John S，etal.RNA profiling of cell-free saliva using microarray technology.J DentRes 2004，83：199-203；Schmidt B，Carstensen T，Engel E，et al.Detectionof cell-free nucleic acids in bronchial lavage fluid supernatants frompatients with lung cancer.Eur J Cancer 2004，40：452-60]，其中以血浆和唾液中胞外RNA研究相对较多。由于胞外RNA对其来源器官基因表达的全面代表性，分子生物学技术的快速、敏感而准确，及其快速发展趋势和前景，胞外RNA被认为在疾病诊断、法医鉴定、产前诊断等方面有很好的应用价值[参见：Vlassov VV，Laktionov PP，Rykova EY.Extracellular nucleic acids.Bioessays 2007，29：654-67]。
虽然目前已有一些关于胞外RNA的研究，但却缺少一种廉价而可靠的提取这些胞外RNA的方法，目前所用的方法主要是用昂贵的试剂盒，如联合应用TRIzol LS和QIAGEN RNasy Kit来提取胞外RNA。目前也未见精浆胞外RNA的研究。
发明内容
本发明的任务是提供一种从精浆中提取游离RNA的方法，使其具有价廉、安全可靠、容易操作、易于推广应用、所提取的胞外RNA含量高、质量好、无创等特点，可替代现行的穿刺方法，从而克服现有技术的不足。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的这种从精浆中提取胞外RNA的方法包括以下步骤：
(1)配制变性液A：变性液A由pH值和浓度分别为7.0和50mmol/L的柠檬酸钠.2H2O、8mol/L的硫氰酸胍、1％的N-十二烷基肌氨酸钠、2％的TritonX-100组成，在临用前，按每毫升变性液A加入14.4mol/L的β-巯基乙醇14ul；
(2)取1ml高速离心后精浆，置5ml离心管中，加入等体积变性液A，用吸头吹打混匀；
(3)依次加入pH和浓度分别为4.0和2mol/L的醋酸钠0.2ml、苯酚2ml和按氯仿与异戊醇体积比为49∶1的比例混合的氯仿与异戊醇混合液0.4ml，每加一种后倒置混匀，全部加完后剧烈振荡30秒；
(4)冰浴15分钟；
(5)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(6)小心吸取上清入另一离心管中，向该上清离心管中加入与上清等体积的预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；
(7)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(8)配制变性液B：变性液B由pH和浓度分别为5.2和300mmol/L的乙酸钠浓度、浓度为4mol/L的硫氰酸胍组成；
(9)弃上清，收集沉淀，加入0.5ml变性液B溶解沉淀，沉淀溶解后移入1.5ml离心管中；
(10)加入0.5ml预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；
(11)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(12)弃上清，向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75％乙醇1ml，用吸头吹打使沉淀溶解；
(13)在离心力为12000g和4℃条件下离心5分钟；
(14)弃上清，干燥5分钟，向沉淀中加入50μl不含RNA酶的水溶解沉淀，即为所提取的精浆胞外RNA。
本发明在研究精子mRNA工作中，发现精浆中有胞外RNA，建立了从精浆中提取胞外RNA的方法，这种方法结合精液的生物化学特点和胞外RNA的特点，有针对性地选择和组合RNA提取试剂，主要有：①精浆中含丰富的蛋白质，在变性液A中加入N-十二烷基肌氨酸钠，促进硫氰酸胍对蛋白质的变性作用；且在获得RNA沉淀后，再用变性液B处理一次。②胞外RNA一般与某种物质结合[参见：Vlassov VV，Laktionov PP，Rykova EY.Extracellular nucleic acids.Bioessays 2007，29：654-67]，在变性液A中加入Triton X-100，有利于RNA与所结合物质的分离。③选用了廉价而可靠的试剂。
从RNA的量及质量来看，本方法所提取的RNA比较理想。在量方面，所提取的12例标本的胞外RNA量平均值达到1.73±0.57ug/ml，能满足很多研究和功能检测及评定的需要。在质量方面，经Agilent 2100电泳检测的结果表明，本方法所提取的RNA质量较好，2100RIN＞7.0并且28S/18S＞0.7。
由于精浆由前列腺、睾丸液、附睾液、精囊腺液等混合而成，而胞外RNA一般认为来源于细胞死亡后释放或活细胞分泌，所以，精浆胞外RNA应含有男性生殖系统精液组成器官表达的基因mRNAs。本研究证实了这一点，用RT-PCR检测到了精浆胞外RNA不仅含有看家基因，还含有睾丸、附睾、前列腺等特异性表达基因mRNAs。同时，也进一步证实了本方法所提取RNA的质量。
本方法所提取的精浆胞外RNA可望成为一种新的分子标志物，能反映精浆来源器官的基因表达事件，阐明精浆来源器官某些疾病的发生机制，在精浆来源器官某些疾病的诊断、性犯罪法医鉴定等方面有很好的应用前景。其优势在于：①人们对于生殖系统器官的认识偏见和过激的保护意识，使男性生殖系统器官标本不易获得，精浆胞外RNA获得的无创性有很好的优势；②可全面代表器官整体的基因表达信息，克服穿刺标本有可能代表性欠佳的缺点；③在某些疾病的诊断中，检测基因表达是更敏感而准确的方法，如通过检测肿瘤特异性标记物的mRNA诊断肿瘤。本发明发现精浆中存在细胞外RNA，为男性生殖系统器官来源的mRNAs，可作为一种无创性的新分子标志物，替代穿刺，用于分析男性生殖系统器官的基因表达情况。
本发明首次建立提取精液胞外RNA的方法，该方法成本低廉、结果可靠、易于推广应用，所提取的胞外RNA含量高、质量好，为一种无创性的手段，可替代现行的穿刺方法而应用于男性生殖器官基因表达研究和器官功能检测、评定。
附图说明
图1为所提取精浆胞外RNA经Agilent 2100电泳检测代表图。NRNA为提取的精浆胞外RNA样品；
图2为逆转录-PCR检测精浆cell-free RNA含多种基因的mRNAs。
具体实施方式
实施例1 本发明实验资料
1.本发明实验所用试剂
焦碳酸二乙酯 Sigma(St.Louis，USA)
DNA酶I Fermentas Life Science(Hanover，USA)
MMLV逆转录酶 Toyobo Company(Osaka，Japan)
RNA酶抑制剂 Toyobo Company(Osaka，Japan)
Olig(dT)18 Toyobo Company(Osaka，Japan)
TaqTM DNA聚合酶 TaKaRa Biotechnology(大连，中国)
变性液A 50mmol/L柠檬酸钠.2H2O(pH 7.0)
8mol/L硫氰酸胍
1％N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)
2％(v/v)Triton X-100
0.2mol/L β-巯基乙醇(临用前加，每ml加14.4mol/L β
-巯基乙醇14ul)
变性液B 300mmol/L乙酸钠(pH 5.2)
4mol/L硫氰酸胍
苯酚 分子生物学级，水饱和
氯仿-异戊醇 分子生物学级，49∶1
异丙醇 分子生物学级
无水乙醇 分子生物学级
2mol/L乙酸钠 去RNA酶水配，pH 5.2
1.本发明实验使用的主要仪器
电子天平(AE-240型) 上海梅特勒-托利多仪器有限公司
低速自动平衡离心机(LDZ5-2型) 北京医用离心机厂
高速冷冻离心机(BR4i型) Thermo
恒温水浴箱(DK-S22型) 上海精宏实验设备厂
超净工作台(FLC-3型) 哈尔滨市东联公司
微量核酸测定仪(Photometer) Biometra
普通PCR仪(Thermal Cycler 480) Perkin Elmer(Wellesley，USA)
琼脂糖凝胶电泳系统 BioRad
凝胶成像系统 Biometra
Agilent 2100电泳系统 Agilent
2.精浆标本收集与处理
人精液标本均取自华中科技大学同济医学院生殖医学中心，供精者知情同意，禁欲3～5天，手淫法采集精液[参见：World Health Organization.LaboratoryManual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction.1999，4th edn，Cambridge University Press，New York，USA]，用一次性无菌采精杯收集射出全部精液。精液37℃液化30min后，15,000g离心10min，取上清，普通光学显微镜高倍镜下确认无细胞和胞浆残余体等颗粒性物质。
3.精浆RNA提取
(1)配制变性液A：变性液A由pH值和浓度分别为7.0和50mmol/L的柠檬酸钠.2H2O、8mol/L的硫氰酸胍、1％的N-十二烷基肌氨酸钠、2％的TritonX-100组成，在临用前，按每毫升变性液A加入14.4mol/L的β-巯基乙醇14ul；
(2)取1ml高速离心后精浆，置5ml离心管中，加入等体积变性液A，用吸头吹打混匀；
(3)依次加入pH和浓度分别为4.0和2mol/L的醋酸钠0.2ml、苯酚2ml和按氯仿与异戊醇体积比为49∶1的比例混合的氯仿与异戊醇混合液0.4ml，每加一种后倒置混匀，全部加完后剧烈振荡30秒；
(4)冰浴15分钟；
(5)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(6)小心吸取上清入另一离心管中，向该上清离心管中加入与上清等体积的预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；
(7)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(8)配制变性液B：变性液B由pH和浓度分别为5.2和300mmol/L的乙酸钠浓度、浓度为4mol/L的硫氰酸胍组成；
(9)弃上清，收集沉淀，加入0.5ml变性液B溶解沉淀，沉淀溶解后移入1.5ml离心管中；
(10)加入0.5ml预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；
(11)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(12)弃上清，向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75％乙醇1ml，用吸头吹打使沉淀溶解；
(13)在离心力为12000g和4℃条件下离心5分钟；
(14)弃上清，干燥5分钟，向沉淀中加入50μl不含RNA酶的水溶解沉淀，即为所提取的精浆胞外RNA。
4.微量核酸测定仪测定RNA的浓度和纯度
按OD260值计算RNA的浓度，1 OD＝40μg RNA，纯度按OD260/OD280评价。
5.检测所提取RNA的质量
根据测定浓度，取2ug RNA上样，经Agilent 2100电泳检测所提取RNA的质量。
6.逆转录-PCR
逆转录-PCR用于检测所提取的RNA中是否存在男性生殖系统器官表达基因的mRNA。所提取RNA先经DNA酶I处理：在0.2ml RNase-free的PCR管中加入并混匀以下成份：1μg总RNA，1μl 10×Reaction Buffer(含Mg2+)，1μlDNA酶I(1IU/μl)，加DEPC处理双蒸水至终体积为10μl；置普通PCR仪上37℃孵育30min；加入1μl 25mmol/L EDTA，置65℃孵育10min灭活DNA酶I。
逆转录在PCR仪上进行，反应体系为25μl。取1μg用DNA酶I处理过的总RNA，加入1μg Olig(dT)18，75℃变性5min后置冰上，加入5μl 5×逆转录Buffer(含Mg2+)，2.5μl dNTPs(10mmol/L)，20IU RNA酶抑制剂和100IU MMLV逆转录酶，加DEPC处理双蒸水至25μl。42℃逆转录1h后，95℃5min灭活RNA酶。逆转录所得cDNA作为模板用于PCR。
PCR所有引物由北京奥科生物技术有限公司设计并合成，为了避免可能残存基因组DNA的污染，引物设计在不同的外显子，引物序列见表1和序列表。PCR体系体积为25μl，体系主要组分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，1.5IU TaqTM DNA聚合酶，0.4μmol/L引物，1μl cDNA。阴性对照以逆转录反应中未加逆转录酶的精浆RNA为模板。PCR反应条件为：94℃5min(预变性)后进入循环(35个)：94℃变性20sec；退火20sec(退火温度见表1)；72℃延伸80sec；循环结束后72℃延伸5min。
表1.RT-PCR所用引物
代表上游引物，代表下游引物.
7.PCR产物鉴定和测序
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性扩增结果进一步经测序鉴定。结果：
1.本发明方法所提取精浆胞外RNA的浓度
共收集和提取了12例病例标本，经微量核酸测定仪检测，精浆中胞外RNA浓度范围为1.21～2.02ug/ml，平均值为1.73±0.57ug/ml。
2.本发明方法所提取精浆胞外RNA的质量
共有3例标本的精浆胞外RNA经Agilent 2100电泳检测所提取RNA的质量，结果表明，本方法所提取的RNA质量较好，2100RIN＞7.0并且28S/18S＞0.7，见图1。
3.男性生殖系统器官表达基因mRNA的存在情况
在所有精浆标本胞外RNA都检测到看家基因β-ACTIN的mRNA，表明每份标本都成功提取了胞外RNA并逆转录。本实验进一步检测了男性生殖系统器官特异性表达基因的mRNA，结果表明，在所提取的精浆标本胞外RNA中，都检测到了睾丸特异性表达基因hVASA，附睾特异性表达基因hWFDC8，前列腺特异性表达基因hTGM4，见图2。
实施例2
方法：收集和分离12例精浆，经两次变性液处理后，分别用异丙醇和乙醇沉淀和洗涤RNA。用核酸测定仪测定OD260值，计算胞外RNA浓度。采用Agilent2100电泳观察所提取胞外RNA的质量。将所提取胞外RNA用于逆转录-PCR，扩增看家基因β-ACTIN、睾丸特异性表达基因hVASA、附睾特异性表达基因hWFDC8、前列腺特异性表达基因hTGM4的mRNA，结果经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定，进一步检验所提取胞外RNA的质量。
结果：12例标本均从精液中成功提取胞外RNA，每毫升精液胞外RNA含量为1.73±0.57ug。Agilent 2100电泳检测所提取RNA的质量的结果表明所提取的RNA质量较好，2100RIN＞7.0并且28S/18S＞O.7。在所有精浆标本胞外RNA都检测到看家基因β-ACTIN的mRNA，睾丸特异性表达基因hVASA，附睾特异性表达基因hWFDC8，前列腺特异性表达基因hTGM4。
以下为本发明专利申请中RT-PCR所用引物的序列表，表中各序列依次为：
序列1为β-ACTIN基因上游引物；
序列2为β-ACTIN基因下游引物；
序列3为hVASA基因上游引物；
序列4为hVASA基因下游引物；
序列5为hWFDC8基因上游引物；
序列6为hWFDC8基因下游引物；
序列7为hTGM4基因上游引物；
序列8为hTGM4基因下游引物。
序列表
<110>华中科技大学
<120>从精浆中提取胞外RNA的方法
<130>-
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>1
gagctacgag ctgcctgacg 20
<210>2
<211>20
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<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人类
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<210>4
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<400>7
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<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人类
<400>8
tcagaagatt gttctcatca cca 23
Claims (3)
1.一种从精浆中提取胞外RNA的方法，包括以下步骤：
(1)配制组份及终浓度如下的变性液A：
50mmol/L柠檬酸钠.2H2O(pH 7.0)
8mol/L硫氰酸胍
1％N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)
2％(v/v)Triton X-100
0.2mol/L β-巯基乙醇(临用前加，每ml加14.4mol/Lβ-巯基乙醇14ul)
在临用前，按每毫升变性液A加入14.4mol/L的β-巯基乙醇14ul；
(2)取1ml高速离心后精浆，置5ml离心管中，加入等体积变性液A，用吸头吹打混匀；
(3)依次加入pH和浓度分别为4.0和2mol/L的醋酸钠0.2ml、苯酚2ml和按氯仿与异戊醇体积比为49∶1的比例混合的氯仿与异戊醇混合液0.4ml，每加一种后倒置混匀，全部加完后剧烈振荡30秒；
(4)冰浴15分钟；
(5)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(6)小心吸取上清入另一离心管中，向该上清离心管中加入与上清等体积的预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；
(7)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(8)配制组份及终浓度如下的变性液B：
300mmol/L乙酸钠(pH 5.2)
4mol/L硫氰酸胍
(9)弃上清，收集沉淀，加入0.5ml变性液B溶解沉淀，沉淀溶解后移入1.5ml离心管中；
(10)加入0.5ml预先冷藏的异丙醇，用吸头吹打混匀，置-20℃沉淀1小时；
(11)在离心力为12000g和4℃条件下离心15分钟；
(12)弃上清，向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75％乙醇1ml，用吸头吹打使沉淀溶解；
(13)在离心力为12000g和4℃条件下离心5分钟；
(14)弃上清，干燥5分钟，向沉淀中加入50μl不含RNA酶的水溶解沉淀，即为所提取的精浆胞外RNA。
2.一种用于从精浆中提取胞外RNA的变性液，其组份和终浓度为：
50mmol/L柠檬酸钠.2H2O(pH 7.0)，
8mol/L硫氰酸胍，
1％N-十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)，
2％(v/v)Triton X-100，
0.2mol/L β-巯基乙醇(临用前加，每ml加14.4mol/L β-巯基乙醇14ul)。
3.一种用于从精浆中提取胞外RNA的变性液，其组份和终浓度为：
300mmol/L乙酸钠(pH 5.2)，
4mol/L硫氰酸胍。
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