CN113249481B - 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置 - Google Patents

外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置 Download PDF

Info

Publication number
CN113249481B
CN113249481B CN202110620360.1A CN202110620360A CN113249481B CN 113249481 B CN113249481 B CN 113249481B CN 202110620360 A CN202110620360 A CN 202110620360A CN 113249481 B CN113249481 B CN 113249481B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
prostate cancer
value
exosome
tmprss2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110620360.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113249481A (zh
Inventor
刘好
罗敏虹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Shifangjie Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Shifangjie Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Shifangjie Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Shifangjie Technology Co ltd
Priority to CN202110620360.1A priority Critical patent/CN113249481B/zh
Publication of CN113249481A publication Critical patent/CN113249481A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113249481B publication Critical patent/CN113249481B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置。外泌体基因作为生物标志物在制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置中的应用，其特征在于，所述外泌体基因含有PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因中的至少一种。采用该生物标志物制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置，对前列腺癌的阳性检出率较高。

Description

外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测 装置
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置。
背景技术
前列腺癌(PCa)是世界范围内泌尿系最常见的恶性肿瘤，是导致男性癌症死亡的第五大原因，也是中国近年来发病率、病死率升高速度最快的恶性肿瘤。癌症早期诊断是一种专门针对癌症早期患者的诊疗方法，其目的在于早发现早治疗，从而减轻患者痛苦和精神、经济负担，争取通过癌症早期诊断治疗让癌症患者早日康复。临床诊断前列腺癌主要依靠直肠指诊、血清PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查，确诊前列腺癌需要通过前列腺穿刺活检进行病理检查。2016年美国Exosome Diagnostics公司推出基于尿液外泌体的前列腺癌筛查试剂盒ExoDx
Figure BDA0003099633190000011
Prostate(IntelliScore)(EPI)。2017年Exosome Diagnostics公司推出基于肿瘤外泌体中RNA检测的血检ExoDxTMLung(ALK)成功获得美国FDA的批准，标志着基于外泌体进行肿瘤诊断的技术在临床应用又近了一步。
血清PSA作为目前临床上前列腺癌的检测标志物，其特异性不高，约有30％的PCa患者血清PSA可能不升高，只是在正常范围内波动(正常范围＜4.0ng/ml)，约有40％的正常健康个体检测出PSA升高，误差较大，阳性检出率较低，“基于PSA的PCa筛查策略”导致的过度穿刺、过度诊断问题令PSA受到质疑。而主要依靠影像与病理活检的前列腺癌早期诊断方法，检出率虽高，但由于前列腺癌具备症状隐匿的特点，大多数患者确诊时已属中晚期，但早期前列腺癌治愈率可达80％，而中晚期前列腺癌的治愈率只有10％～20％，且细胞和组织病理学检测需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材，不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。因此研究前列腺癌诊断技术是具有重要意义及实用价值。
发明内容
基于此，有必提供一种外泌体基因作为生物标志物在制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置中的应用，采用该生物标志物制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置，对前列腺癌的阳性检出率较高。
此外，还有必要提供一种前列腺癌检测物及其试剂盒和检测装置。
外泌体基因作为生物标志物在制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置中的应用，其特征在于，所述外泌体基因含有PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因中的至少一种。
本研究在前列腺癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因在前列腺癌病人和健康人的体内的表达差异较大，PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的表达量与前列腺癌具有较高相关性，且PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因在体外很稳定，因此，能够作为生物标志物应用于制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置中。经试验验证，通过基于上述生物标志物研发的前列腺癌检测试剂盒对尿液外泌体的PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的联合检测，得到的结果对前列腺癌的检测具有较高的敏感度和特异性，对前列腺癌的阳性检出率为81.71％，准确性高，能够应用于前列腺癌的筛查和早期诊断。此外，采用尿液外泌体进行前列腺癌检测是一种非侵入性前列腺液体活检方法，不会出现过度穿刺等问题，对人体健康无害。
其中一个实施例中，所述外泌体为尿液外泌体。
一种前列腺癌检测物，能够与外泌体基因特异性结合，所述外泌体基因含有PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因中的至少一种。
其中一个实施例中，所述前列腺癌检测物包括PCA3基因扩增引物对、SPDEF基因扩增引物对及TMPRSS2:ERG融合基因扩增引物对中的至少一种。
其中一个实施例中，所述PCA3基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示；所述SPDEF基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述TMPRSS2:ERG融合基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
一种前列腺癌检测试剂盒，包括上述前列腺癌检测物。
其中一个实施例中，还包括能够检测内参基因的试剂，所述内参基因选自U6、GAPDH及β-actin中的至少一种。
其中一个实施例中，所述能够检测内参基因的试剂包括内参基因扩增引物对，所述内参基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
其中一个实施例中，还包括外泌体提取试剂、外泌体RNA提取试剂和外泌体RNA逆转录试剂。
一种前列腺癌检测装置，包括获取模块、计算模块、分析报告模块，其中，
获取模块，用于获取外泌体基因扩增的Ct值，并将结果提供给所述计算模块，所述外泌体基因含有PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因；；
计算模块，用于将所述外泌体基因扩增的Ct值带入计算模型中计算P值，并将结果提供给所述分析报告模块，所述计算模型为：P＝26.307-0.28CtPCA3-0.179CtSPDEF-0.201CtTMPRSS2:ERG，其中，CtPCA3为PCA3基因扩增的Ct值，CtSPDEF为SPDEF基因扩增的Ct值，CtTMPRSS2:ERG为TMPRSS2:ERG融合基因扩增的Ct值；
分析报告模块，用于将所述P值与预设值进行比较，所述预设值包括第一预设值和第二预设值，且所述第一预设值大于所述第二预设值；若P值大于或者等于所述第一预设值则输出患有前列腺癌的结果，若P值小于所述第一预设值且大于或者等于所述第二预设值则输出可能患有前列腺癌的结果，若P值小于所述第二预设值则输出未患有前列腺癌的结果。
其中一个实施例中，所述第一预设值为6，所述第二预设值为5。
附图说明
图1为外泌体的透射电子显微镜检测图；
图2为外泌体的纳米流式细胞仪检测结果图；
图3为外泌体特异性标志蛋白TSG101和CD9的WB检测图；
图4为SPDEF基因扩增引物对的特异性验证结果；
图5为PCA3基因扩增引物对的特异性验证结果；
图6为TMPRSS2:ERG基因扩增引物对的特异性验证结果；
图7为SPDEF基因的扩增曲线；
图8为PCA3基因的扩增曲线；
图9为TMPRSS2:ERG基因的扩增曲线；
图10为外泌体PCA3基因mRNA ROC分析结果；
图11为外泌体SPDERF基因mRNA ROC分析结果；
图12为外泌体TEPRSS2:ERG基因mRNA ROC分析结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究一实施方式提供外泌体基因作为生物标志物在制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置中的应用，其中，外泌体基因含有PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因中的至少一种。
其中，生物标志物是指可以标记系统、器官、组织及细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。
其中，外泌体为尿液外泌体。采用尿液外泌体进行前列腺癌检测是一种非侵入性前列腺液体活检方法，不会出现过度穿刺等问题，对人体健康无害。
其中，外泌体基因为外泌体中的基因。
其中，PCA3是非编码信使核糖核酸(mRNA)片段，定位于第9号染色体上(9q21-22)。PCA3即新型前列腺癌抗原3，在前列腺癌症中高特异性表达。
其中，TMPRSS2:ERG融合基因是TMPRSS2基因与ERG基因融合，是一种染色体重排，是前列腺癌病人中的一种基因重排。
本研究在前列腺癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因在前列腺癌病人和健康人的体内的表达差异较大，PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的表达量与前列腺癌具有较高相关性，且PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因在体外很稳定，因此，能够作为生物标志物应用于制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置中。经试验验证，通过基于上述生物标志物研发的前列腺癌检测试剂盒对尿液外泌体的PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的联合检测，得到的结果对前列腺癌的检测具有较高的敏感度和特异性，对前列腺癌的阳性检出率为81.71％，准确性高，能够应用于前列腺癌的筛查和早期诊断。此外，采用尿液外泌体进行前列腺癌检测是一种非侵入性前列腺液体活检方法，不会出现过度穿刺等问题，对人体健康无害。
进一步地，Exosome Diagnostics公司推出基于尿液外泌体的前列腺癌筛查试剂盒ExoDx
Figure BDA0003099633190000061
Prostate(IntelliScore)(EPI)，由于人种的差异，其标志物组合并不普适于黄种人群。本研究通过基于上述生物标志物研发的前列腺癌检测试剂盒符合我国人群基因特点，能够用于我国人群的前列腺癌筛查。
本研究一实施方式还提供一种前列腺癌检测物，能够与外泌体基因特异性结合，外泌体基因含有PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因中的至少一种。该前列腺癌检测物对前列腺癌的阳性检出率较高。
其中，外泌体为尿液外泌体。采用尿液外泌体进行前列腺癌检测是一种非侵入性前列腺液体活检方法，不会出现过度穿刺等问题，对人体健康无害。
其中，外泌体基因为外泌体中的基因。
其中，前列腺癌检测物包括PCA3基因扩增引物对、SPDEF基因扩增引物对及TMPRSS2:ERG融合基因扩增引物对中的至少一种。
其中，PCA3基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为GCACACTTCCAGCGCCTTTA；如SEQ ID No.2所示GGCAATTGTCCCACGGATCT。
其中，SPDEF基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。具体地，如SEQ ID No.3所示的序列为CCACGTGGACATCTCGAAG；如SEQ ID No.4所示的序列为AATCGCGCCAGGTGTAGT。
其中，TMPRSS2:ERG融合基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。具体地，如SEQ ID No.5所示的序列为CAAGTGCTCGTACTCTCGGAT；如SEQ ID No.6所示的序列为AACATACAGATACTCGTGCTC。
经试验验证，通过含有上述前列腺检测物的前列腺癌检测试剂盒对尿液外泌体的PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的联合检测，得到的结果对前列腺癌的检测具有较高的敏感度和特异性，对前列腺癌的阳性检出率为81.71％，准确性高，能够应用于前列腺癌的筛查和早期诊断。
本研究一实施方式还提供一种前列腺癌检测试剂盒包括上述前列腺癌检测物。该前列腺癌检测物对前列腺癌的阳性检出率较高。
其中，前列腺癌检测试剂盒还包括能够检测内参基因的试剂，内参基因选自U6、GAPDH及β-actin中的至少一种。
其中，能够检测内参基因的试剂包括内参基因扩增引物对，内参基因扩增引物对的序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。具体地，如SEQ ID No.7所示的序列为AACGACGCCTACATTGACC；如SEQ ID No.8所示的序列为TCCACCACATTCTCAGCACC。具体地，内参基因为GAPDH。
其中，前列腺癌检测试剂盒还包括外泌体提取试剂、外泌体RNA提取试剂和外泌体RNA逆转录试剂。外泌体提取试剂用于提取样本的外泌体。外泌体RNA提取试剂用于提取外泌体中的RNA，外泌体RNA逆转录试剂用于对外泌体中的RNA逆转录为cDNA。
进一步地，该前列腺癌检测试剂盒还包括基因扩增常用的DNA聚合酶和试剂，能够和与前列腺癌检测物相互配合，以实现对外泌体基因的检测。
其中，DNA聚合酶例如可以为T4DNA聚合酶、Klenow酶和DNA聚合酶I中的至少一种。
试剂包括缓冲液、dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP)、荧光染料(例如SYBR Green染料)。
经试验验证，采用本研究的前列腺癌检测试剂盒对尿液外泌体的PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的联合检测，得到的结果对前列腺癌的检测具有较高的敏感度和特异性，对前列腺癌的阳性检出率为81.71％，准确性高，能够应用于前列腺癌的筛查和早期诊断。
本研究一实施方式还提供一种前列腺癌检测装置，能够应用于前列腺癌的筛查和早期诊断。该前列腺癌检测装置包括获取模块、计算模块、分析报告模块。
其中，获取模块用于获取外泌体基因扩增的Ct值，并将结果提供给计算模块。外泌体基因含有PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因。
具体地，采用本研究的前列腺癌检测试剂盒对外泌体基因进行PCR扩增，以获得外泌体基因的Ct值(Ct值即循环阈值)。
计算模块用于将外泌体基因扩增的Ct值带入计算模型中计算P值，并将结果提供给分析报告模块。
其中，计算模型为：P＝26.307-0.28CtPCA3-0.179CtSPDEF-0.201CtTMPRSS2:ERG，其中，CtPCA3为PCA3基因扩增的Ct值，CtSPDEF为SPDEF基因扩增的Ct值，CtTMPRSS2:ERG为TMPRSS2:ERG融合基因扩增的Ct值。该计算模型能够可以明显区前列腺癌患者和健康人群，区分效率为78.14％。
分析报告模块用于将P值与预设值进行比较，预设值包括第一预设值和第二预设值，且第一预设值大于所述第二预设值；若P值大于或者等于第一预设值则输出患有前列腺癌的结果，若P值小于第一预设值且大于或者等于第二预设值则输出可能患有前列腺癌的结果，若P值小于第二预设值则输出未患有前列腺癌的结果。
其中，第一预设值为6，所述第二预设值为5。具体地，P≥6可判断为患有前列腺癌，5≤P<6表明可能患有前列腺癌，P<5表示未患有前列腺癌。
需要说明的是，前列腺癌检测装置还可以包括用于癌症检测的常见装置，此处不再赘述。
在其中一个实施例中，前列腺癌检测装置为荧光定量PCR仪。
采用本研究的前列腺癌检测装置对尿液外泌体的PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的联合检测，得到的结果对前列腺癌的检测具有较高的敏感度和特异性，对前列腺癌的阳性检出率为81.71％，准确性高，能够应用于前列腺癌的筛查和早期诊断。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
尿液外泌体提取及鉴定
对前列腺按摩后收集晨尿20mL，保存于4℃，2000g离心10min，以除去残留细胞收集上清液，接着再10000g离心10min，以除去细胞碎片。
取10mL上清液至新的离心管中，加入体积比为2：1的外泌体提取试剂1(深圳市拾方杰科技有限公司)；颠倒混匀后于4℃静置5min后10000g离心2min；取上清液转移置新的离心管中，加入体积比为1：1的外泌体提取试剂2(深圳市拾方杰科技有限公司)；颠倒混匀后于4℃静置1h后12000g离心30min后弃去上清液；收集沉淀，加入0.5mL PBS缓冲液重悬沉淀物，用移液器吹打混匀，制成外泌体重悬液。
采用透射电子显微镜检测外泌体形态，纳米流式细胞仪(NanoFCM)进行外泌体粒径和浓度的测定，WB(蛋白印迹)检验外泌体标志性蛋白TSG101和CD9，检测结果详见图1～图3。图1为外泌体的透射电子显微镜检测图；图2为外泌体的纳米流式细胞仪检测结果图；图3为外泌体特异性标志蛋白TSG101和CD9的WB检测图。从图1～图3可以说明外泌体重悬液中含有外泌体。
实施例2
外泌体基因检测
2.1尿液外泌体RNA提取：
①取0.5mL外泌体重悬液放入1.5ml的RNA-free的离心管中，加入1mL Trizol裂解液，震荡混匀，室温静置5mins；
②加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2mins；
③4℃，12000×g离心15min后，分为三层，将上层水相转移到新的1.5mL RNA-free的EP管中，注意不要触及中间层的白膜；
④向管中加入预冷的0.6mL的异丙醇，混匀，室温静置10mins；
⑤4℃，12000×g离心10mins，弃上清，RNA沉于管底；
⑥加入1mL预冷的用灭菌的DEPC水稀释而成的75％乙醇，悬浮沉淀，温和震荡，洗涤RNA；
⑦4℃，7500×g离心5mins，弃上清，室温静置2mins，待酒精挥发，加入30μLRnase-free水，用枪头反复吹打几次，溶解RNA(也可短暂至于60℃水浴中促溶)；
⑧超微量分光光度计测定RNA浓度，校正调零后，将1μL含有RNA的溶液滴加到微量酶标板，通过分光光度计检测总RNA的含量，并计算提取的RNA的A260/A280的比值是否在1.8-2.1范围之间，进一步检测RNA纯度。
2.2反转录cDNA
反转录合成cDNA使用如下体系进行反转录过程：
①取RNA溶液1μL、oligo(dT)18μL、primer 1μL、DEPC-treated water 10μL分别加入Rnase-free PCR管中，共12μL，混匀后放入PCR仪中，65℃，5mins；
②取出PCR管，再加入5×Reaction Buffer 4μL，RNase Inhibitor(20μ/μL)1μL，10mM dNTP Mix 2μL，Reverse Transcriptase(200μ/μL)1μL，共20μL，混匀后放入PCR仪进行扩增，42℃，60mins；70℃，5mins后，取出样品，-80℃保存，备用。
2.3RT-PCR检测检测外泌体SPDEF基因，PCA3基因和TMPRSS2:ERG基因的mRNA的表达，GAPDH作为内参基因。各基因的扩增引物对如下表1：
表1各基因的扩增引物对
Figure BDA0003099633190000111
Figure BDA0003099633190000121
采用ABI公司荧光定量PCR仪，SYBR Green染料法完成。扩增体系如下：
cDNA模板1μL；上游引物(10μM)0.5μL；下游引物(10μM)0.5μL；2×qPCR Supermix10μL；Rnase Free dH2O 8μL；总体积20μL，将所有样品准备完成后，用八连管专用离心机，1000rpm，离心30s，将样品放入荧光定量PCR仪。采用三步法反应过程:94℃、30s，94℃、5s，58℃、15s，72℃、10s循环40次，4℃保存。实验完成后，导出实验数据，获得各检测基因的CT值。各目的基因扩增引物对的特异性验证结果详见图4～图6。各目的基因的扩增曲线详见图7～图9。图4为SPDEF基因扩增引物对的特异性验证结果，图5为PCA3基因扩增引物对的特异性验证结果，图6为TMPRSS2:ERG基因扩增引物对的特异性验证结果。图7为SPDEF基因的扩增曲线，图8为PCA3基因的扩增曲线，图9为TMPRSS2:ERG基因的扩增曲线。从图4～图9可以，各基因的扩增引物的特异性好，扩增效率高。
2.4前列腺癌检测
构建基于PCA3，SPDEF和TMPRSS2:ERG mRNA预测模型：用受试者工作特征(ROC)曲线分析PCA3，SPDEF和TMPRSS2:ERG mRNA作为诊断PCa标志物的潜在价值，曲线下面积(AUC)作为评估PCA3，SPDEF和TMPRSS2:ERGmRNA的特异性和灵敏性，PCA3、SPDEF和TMPRSS2:ERG的AUC分别为0.879(95％CI,0.857-0.812)、0.83(95％CI,1.00-0.56)、0.871(95％CI,0.929-0.75)。各目的基因的ROC分析结果详见图10～12。图10为外泌体PCA3基因mRNA ROC分析结果，图11为外泌体SPDERF基因mRNA ROC分析结果，图12为外泌体TEPRSS2:ERG基因mRNA ROC分析结果。从图10～图12可以看出，尿液外泌体PCA3、SPDEF和TMPRSS2:ERG的mRNA具有作为筛查PCa生物标志物的潜力。其中，受试者包括前列腺癌患者(即临床确诊为前列腺癌患者)和健康人群。
基于现有样品的检测结果，采用逻辑回归分析方法构建预测模型，预测模型的公式如下：P＝26.307-0.28CtPCA3-0.179CtSPDEF-0.201CtTMPRSS2:ERG。将QPCR检测受试者的PCA3，SPDEF，TMPRSS2:ERG的CT值代入公式计算P值，结合临床病理诊断结果(Gleason评分)和血液PSA检测结果进行对比分析，说明上述预测模型可以明显区前列腺癌患者和健康人群，临床符合率为78.14％，特异性为92％，对前列腺癌的阳性检出率为81.71％，计算得到的P≥6可判断为患病，5≤P<6表明可能患病，P<5表示不患病。此标志物的诊断效果(即临床符合率为78.14％)高于目前血液PSA检测的准确率。
本研究在前列腺癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因在前列腺癌病人和健康人的体内的表达差异较大，PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的表达量与前列腺癌具有较高相关性，且PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因在体外很稳定，因此，能够作为生物标志物应用于制备前列腺癌检测试剂、前列腺癌检测试剂盒或前列腺癌检测装置中。经试验验证，通过基于上述生物标志物研发的前列腺癌检测试剂盒对尿液外泌体的PCA3基因、SPDEF基因及TMPRSS2:ERG融合基因的联合检测，得到的结果对前列腺癌的检测具有较高的敏感度和特异性，对前列腺癌的阳性检出率为81.71％，采用本研究的预测模型能够更为准确的检测和筛选前列腺癌，准确性高，能够应用于前列腺癌的筛查和早期诊断。再者，采用尿液外泌体进行前列腺癌检测是一种非侵入性前列腺液体活检方法，不会出现过度穿刺等问题，对人体健康无害。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0003099633190000151
Figure BDA0003099633190000161
Figure BDA0003099633190000171
Figure BDA0003099633190000181
序列表
<110> 深圳市拾方杰科技有限公司
<120> 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcacacttcc agcgccttta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcaattgtc ccacggatct 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacgtggac atctcgaag 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatcgcgcca ggtgtagt 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagtgctcg tactctcgga t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacatacaga tactcgtgct c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacgacgcct acattgacc 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccaccacat tctcagcacc 20

Claims (2)

1.一种前列腺癌检测装置，其特征在于，包括前列腺癌检测试剂盒、获取模块、计算模块、分析报告模块，其中，
所述前列腺癌检测试剂盒用于对外泌体基因进行PCR扩增，所述前列腺癌检测试剂盒包括：能够检测所述外泌体基因表达水平的前列腺癌检测物和能够检测内参基因表达水平的试剂，所述外泌体基因由 PCA3 基因、SPDEF基因及 TMPRSS2:FRG融合基因构成，所述前列腺癌检测物包括 PCA3 基因扩增引物对、SPDEF 基因扩增引物对及 TMPRSS2:ERG融合基因扩增引物对，所述 PCA3 基因扩增引物对的序列如 SEQ ID No.1和 SEQ ID No.2 所示；所述 SPDEF 基因扩增引物对的序列如 SEQ ID No.3 和 SEQ ID No.4 所示；所述TMPRSS2:ERG融合基因扩增引物对的序列如 SEQ ID No.5和SEQ ID No.6 所示，所述内参基因为 GAPDH，所述能够检测内参基因表达水平的试剂包括内参基因扩增引物对，所述内参基因扩增引物对的序列如 SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；
所述获取模块，用于获取所述外泌体基因扩增的Ct值，并将结果提供给所述计算模块；
所述计算模块，用于将所述外泌体基因扩增的Ct值带入计算模型中计算P值，并将结果提供给所述分析报告模块，所述计算模型为：P=26.307-0.28CtPCA3-0.179CtSPDEF-0.201CtTMPRSS2:ERG，其中，CtPCA3为PCA3基因扩增的Ct值，CtSPDEF为SPDEF基因扩增的Ct值，CtTMPRSS2:ERG为TMPRSS2:ERG融合基因扩增的Ct值；
所述分析报告模块，用于将所述P值与预设值进行比较，所述预设值包括第一预设值和第二预设值，且所述第一预设值大于所述第二预设值；若P值大于或者等于所述第一预设值则输出患有前列腺癌的结果，若P值小于所述第一预设值且大于或者等于所述第二预设值则输出可能患有前列腺癌的结果，若P值小于所述第二预设值则输出未患有前列腺癌的结果；
所述第一预设值为6，所述第二预设值为5；
所述外泌体为尿液外泌体。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌检测装置，其特征在于，所述前列腺癌检测试剂盒还包括外泌体提取试剂、外泌体RNA提取试剂和外泌体RNA逆转录试剂。
CN202110620360.1A 2021-06-03 2021-06-03 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置 Active CN113249481B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110620360.1A CN113249481B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110620360.1A CN113249481B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113249481A CN113249481A (zh) 2021-08-13
CN113249481B true CN113249481B (zh) 2022-10-21

Family

ID=77186169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110620360.1A Active CN113249481B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113249481B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410787A (zh) * 2022-01-24 2022-04-29 上海康黎医学检验所有限公司 一种用于前列腺癌早期诊断、转移预警以及预后评估的引物探针组合、试剂盒及其应用
CN115927633A (zh) * 2022-11-29 2023-04-07 神州医疗科技股份有限公司 一种检测pca3及psa的试剂盒及方法
CN116334224A (zh) * 2023-03-09 2023-06-27 南方医科大学南方医院 用于神经内分泌前列腺癌诊断的分子标志物和试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2668164C2 (ru) * 2013-08-06 2018-09-26 Эксосам Дайэгностикс, Инк. Когорты биомаркеров мочи, профиль экспрессии генов и способы их применения
CN108441557A (zh) * 2018-01-31 2018-08-24 广州瑞博奥生物科技有限公司 Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用
CN111778331B (zh) * 2020-06-29 2022-09-16 诺迦(杭州)生物工程有限公司 用于辅助前列腺癌早期筛查的尿液核酸标志物和检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN113249481A (zh) 2021-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113249481B (zh) 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置
CN111172287B (zh) 外泌体lncRNA RN7SL5P作为内参基因在胃癌lncRNA检测中的应用
CN111560435A (zh) 一种用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒及使用方法、应用
CN110964823A (zh) 用于结直肠癌检测的dna甲基化试剂盒和检测方法
CN113337613B (zh) 一种与肝癌相关的血清外泌体tsRNA标志物、探针及其应用
CN108866187B (zh) 一种与肺癌辅助诊断相关的长链非编码rna标志物及其应用
CN109593852B (zh) 一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用
CN109536502B (zh) 一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体miRNA的PCR内参
CN111235274A (zh) 喉鳞癌血清外泌体标志物筛选方法和外泌体来源miR-941应用
CN110184270A (zh) 非编码rna作为男性骨质疏松症的诊断标志物
CN110184269A (zh) Loc105377068诊断新用途
CN115161402A (zh) 血液microRNA作为前列腺癌筛查或诊断标志物的用途、检测引物和试剂盒
CN111733242B (zh) lncRNA AK024561作为卵巢癌诊断标志物的应用
CN109988834B (zh) 血浆外泌体分子标志物hsa-miR-219a-5p的应用
CN113416784A (zh) 一种与乳腺癌诊断相关的血清外泌体tsRNA标志物及其应用
CN112266955A (zh) 一种强直性脊柱炎诊断标志物及应用
CN106520924A (zh) 一种用于检测卵巢癌的引物组及检测方法
WO2020025029A1 (zh) 宫颈癌的诊治标志物、诊断与治疗方法
CN110904233A (zh) 检测样本中abcg2基因相对表达量的寡核苷酸和方法
CN110257514A (zh) 一种新的食管癌血液miRNA标志物及其应用
CN112921090B (zh) 细胞外囊泡circRNAs作为胃癌诊断标志物的应用
CN116162705B (zh) 一种胃癌诊断产品和诊断模型
CN117106919B (zh) 外泌体miRNA组合在早期肺癌检测中的应用
CN111455057B (zh) 用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法
CN115820857B (zh) 一种鉴别胃癌前病变和胃癌及诊断胃癌的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant