CN108441557A - Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108441557A
CN108441557A CN201810098145.8A CN201810098145A CN108441557A CN 108441557 A CN108441557 A CN 108441557A CN 201810098145 A CN201810098145 A CN 201810098145A CN 108441557 A CN108441557 A CN 108441557A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pca3
seq
psa
excretion body
psa gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810098145.8A
Other languages
English (en)
Inventor
阳卫超
麦家杰
邓秀磊
胡守旺
黄若磐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RAYBIOTECH Inc GUANGZHOU
Original Assignee
RAYBIOTECH Inc GUANGZHOU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RAYBIOTECH Inc GUANGZHOU filed Critical RAYBIOTECH Inc GUANGZHOU
Priority to CN201810098145.8A priority Critical patent/CN108441557A/zh
Publication of CN108441557A publication Critical patent/CN108441557A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种PCA3和PSA基因检测试剂盒及其使用方法，其括有针对PCA3/或PSA基因引物和探针，其中，针对PCA3基因的引物和探针序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、以及SEQ ID NO.3所示，针对A基因的引物和探针序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、以及SEQ ID NO.9所示。所示PCA3和PSA基因检测试剂盒，通过采集人体尿液进行外泌体RNA的提取，通过检测PCA3mRNA和PSA mRNA，测定PCA3mRNA/PSA mRNA比值，计算PCA3评分，从而实现早期诊断前列腺肿瘤，无创取样，避免前列腺穿刺，减轻病人痛苦，同时具有较高的灵敏度、高特异性和稳定性。

Description

PCA3和PSA基因检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PCA3和PSA基因检测试剂盒及其应用。
背景技术
在世界范围内，前列腺癌发病率位居男性恶性肿瘤第二位。近年来，我国前列腺癌发病率逐渐升高，多数地区新确诊患者中晚期比例高于欧美国家，这将对我国前列腺癌患者的治疗效果及长期生存产生直接影响。以前我国前列腺癌发病率较低，但近年来呈显著上升趋势。自2008年起，前列腺癌已成为泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤，国内前列腺癌发病率城乡差异较大，特别是大城市的发病率更高。近年来发现的前列腺癌新的标记物PCA3，在前列腺癌中高表达，可反应前列腺癌进展情况。PCA3位于9号染色体，含有4个外显子，为非编码的mRNA，通过选择性剪切和多聚腺苷酸化产生至少四种不同的转录产物。 RT-PCR分析显示PCA3仅在前列腺组织中表达，在其他组织中不表达。PCA3在95％的检测的全部前列腺癌中过度表达，可从前列腺癌变细胞中无害测定，且准确度接近100％。此外，在前列腺外组织(良性和恶性)中尚未检测到PCA3转录，证明PCA3是目前已知前列腺癌最具特异性的PCa标志物。PCA3不受年龄，前列腺体积或其他前列腺病的影响。 Northern blot检测分析50例患者中47例PCA3高度表达，而前列腺良性病变组织中不表达或低度表达。文献(cancerres.，2002，May1；62(9)2695-8)报道比较端粒酶RNA和 PCA3 RNA作为前列腺癌的标记物，PCA3指示作用更优。PCA3作为目前为止针对前列腺癌特异性最优的标志物，含有4个外显子，三个内含子，Gandini et al2003等文献报道，与其它外显子相比，PCA3外显子4用于前列腺癌检测特异性最优。PCA3基因特异性地高表达于人类前列腺癌细胞和转移坏死灶中，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中不表达或低表达。PSA主要有前列腺细胞合成，在其他组织细胞中不表达或低表达，PSA RNA表示样本中的前列腺特异性细胞的量。之前的检测，主要通过前列腺穿刺实现，通过尿液无创检测，可以减少部分患者不必要的前列腺穿刺，减轻病人痛苦。因此，建立通过以尿液为样本，且检测效果好的试剂盒就非常有必要，而且通过检测结果，判断是否还需要做进一步的前列腺穿刺。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种PCA3和PSA基因检测试剂盒，该检测试剂盒只需要以尿液作为检测样本，不需要进行前列腺穿刺就能得到很好的检测结果，而且，可以指导是否需要前列腺穿刺。
实现上述目的技术方案如下。
一种PCA3和PSA基因检测试剂盒，包括有针对PCA3和PSA基因引物和探针，其中，针对PCA3基因的引物和探针序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示，
针对PSA基因的引物和探针序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.9所示。
在其中一个实施例中，还包括有内参引物和内参探针，所述内参引物的序列如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述内参探针的序列如SEQ ID NO.6所示。
在其中一个实施例中，还包括有外泌体沉淀溶液、裂解液、RNA提取试剂和清洗液。
在其中一个实施例中，所述外泌体沉淀溶液的组成为：Poly(ethylene glycol)，NaCl和 ddH2O。
在其中一个实施例中，所述裂解液的组成为：Tris-HCl、EDTA、NaCl、0.1％SDS。
在其中一个实施例中，所述RNA提取试剂的组成为：含固量为50％的磁珠，乙醇。
在其中一个实施例中，所述清洗液的组成为：0.1M NaCl，异丙醇，乙醇，ddH2O。
在其中一个实施例中，提取外泌体RNA的操作步骤包括：
(1)将人体尿液样本离心以获得上清液；
(2)在上清液中加入外泌体沉淀溶液(人体尿液样本和外泌体沉淀溶液的体积比为1：1)，混匀，室温静置1小时/4℃过夜后，以13000rpm/分钟的速度离心10分钟，以形成外泌体沉淀物；
(3)在所述外泌体沉淀物中加入总RNA提取试剂以及抗体标记磁珠，静置10分钟，每两分钟上下颠倒5～6次，使磁珠在管內分布均匀；
(4)加入清洗液，重复清洗2遍后，加入80％乙醇；
(5)洗脱，从而获取外泌体RNA。
本发明提供一种PCA3和PSA基因检测试剂盒，通过采集人体尿液进行外泌体RNA的提取，通过检测PCA3 mRNA和PSA mRNA，测定PCA3 mRNA和PSA mRNA两种比值，计算PCA3评分，通过计算PCA3RNA和PSA RNA的比值即PCA3评分，PCA3评分＝(PCA3 mRNA)/(PSA mRNA)×1000，准确量化PCA3RNA的表达量。PCA3分数与前列腺癌的患病可能性呈正相关。PCA3评分＜30表示受试者患前列腺癌的可能性小，如果PCA3评分≥30表示受试者患前列腺癌的可能性较大，从而实现早期诊断前列腺肿瘤，无创取样，避免前列腺穿刺，减轻病人痛苦。
本发明所述的PCA3和PSA基因检测试剂盒，具有较高的灵敏度、高特异性和重复稳定性，不需要重复实验，利用本方法提供的PCA3 mRNA和PSA mRNA扩增核酸序列，构建测定尿液PCA3评分的诊断试剂盒，可达到无创诊断前列腺癌的目的，将大大减少前列腺穿刺活检给病人带来的损伤，有利于前列腺癌的早期治疗。
附图说明
图1实施例3中不同提取试剂的检测结果比较示意图。
图2是实施例4中针对PCA3精密度实验的结果示意图。
图3是实施例4中针对PSA精密度实验的结果示意图。
图4是实施例4中针对PCA3灵敏度实验的结果示意图。
图5是实施例4中针对PSA灵敏度实验的结果示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1.PCA3和PSA基因检测试剂盒
(1)用于扩增PCA3 mRNA的一对核苷酸扩增引物及探针(生工Sangon Biotech合成)：
正向引物：Y21 5’-GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’0.051nmol/ul SEQ ID NO:1；
反向引物：Y22 5’-AGGGCGAGGCTCATCGAT-3’0.058nmol/ul SEQ ID NO:2；
荧光探针：Y27 5’-CTGCTGACTTTACCATCTGAGGCCAC-3’0.053nmol/ul SEQ ID NO:3；
(2)用于扩增PSA mRNA的一对核苷酸扩增引物及探针(生工Sangon Biotech合成)：
正向引物：Y23 5’-GGGTCCCGGTTGTCTTCCT-3’0.047nmol/ul SEQ ID NO:7；
反向引物：Y24 5’-TGCCACGAGAGGCCACAA-3’0.052nmol/ul SEQ ID NO:8；
荧光探针：Y29 5’-GATTGTGGGAGGCTGGGAGTGC-3’0.049nmol/ul SEQ ID NO:9；
(3)用于检测前列腺细胞的一对内参引物和探针：(生工Sangon Biotech合成)
正向引物：Y25 5’-GAAGTGTGACGTGGACATCC-3’0.061nmol/ul SEQ ID NO:4；
反向引物：Y26 5’-GCAGTGATCTCCTTCTGCATC-3’0.057nmol/ul SEQ ID NO:5；
荧光探针：Y28 5’-CCAACACAGTGCTGTCTGGCGG-3’0.047nmol/ul SEQ ID NO:6；
(4)用于反转录定量扩增的RT-PCR试剂，包括RT-PCR试剂1：dNTPs、镁离子及缓冲液；RT-PCR 试剂2：BesTaqDNA热启动酶、RNA酶抑制剂、反转录酶。购买于上海酷乐生物科技有限公司。
(5)用于提取尿液外泌体的外泌体沉淀液：Poly(ethylene glycol)，NaCl和ddH2O。具体为： 0.2～8.5g的Poly(ethylene glycol)，0.2～2.5g的NaCl，溶解到5.5～15.5mL的ddH2O。
(6)用于消化蛋白的蛋白酶：向上海酷乐生物科技有限公司购买。
(7)用于裂解细胞的裂解液：Tris-HCl、EDTA、NaCl、0.1％SDS。
(8)用于提取外泌体RNA的RNA提取试剂：含固量为50％的磁珠(粒径200nm)，乙醇。
(9)清洗液：0.1M NaCl，异丙醇，乙醇，ddH2O。
(10)洗脱液：向凯杰企业管理(上海)有限公司购买。
实施例2.实施例1所述试剂盒的使用方法
(1)尿液采集：
收集人体新鲜尿液1mL；
(2)保存：
按体积比例为1:1的尿液和外泌体沉淀溶液，加入相同体积的外泌体沉淀溶液(1mL)，室温静置1小时/4℃下过夜；
(3)总RNA提取：
1.取过夜保存的尿液，13000rpm/min离心10分钟，转移上清至新的离心管；
2.分别加入310uL裂解液、外泌体RNA提取试剂，混匀10s，静置10分钟，每2分钟上下颠倒5～6次；
3.放置磁力架1分钟，确保所有磁珠贴壁；
4.小心吸掉混合液，注意不要吸到磁珠，加入600uL清洗液，混匀10s，放置磁力架1分钟，确保所有磁珠贴壁；
5.小心吸掉混合液，注意不要吸到磁珠，加入600uL清洗液，混匀10s，放置磁力架1分钟，确保所有磁珠贴壁；
6.小心吸掉清洗液，注意不要吸到磁珠，加入600uL 80％乙醇，混匀10s，放置磁力架1分钟，确保所有磁珠贴壁；
7.小心吸掉清洗液，注意不要吸到磁珠，室温静置2分钟，待磁珠干燥；
8.加入30-50uL洗脱液，混匀10s，放置磁力架1分钟，确保所有磁珠贴壁；
9.小心转移液体至另一离心管，注意不要吸到磁珠，转移的液体即提取的尿液外泌体RNA。
(4)荧光定量PCR反应：
检测PCA3表达的反应液
引物(SEQ ID NO.1) 0.5uL
引物(SEQ ID NO.2) 0.5uL
探针(SEQ ID NO.3) 0.5uL
RT-PCR试剂1 10uL
RT-PCR试剂2 2.5uL
Free water 0.3uL
内参引物(SEQ ID NO.4) 0.2uL
内参引物(SEQ ID NO.5) 0.2uL
内参探针(SEQ ID NO.6) 0.3uL
共 15uL
检测PSA表达的反应液
引物(SEQ ID NO.7) 0.3uL
引物(SEQ ID NO.8) 0.3uL
探针(SEQ ID NO.9) 0.3uL
RT-PCR试剂1 10uL
RT-PCR试剂2 2.5uL
Free water 0.9uL
内参引物(SEQ ID NO.4) 0.2uL
内参引物(SEQ ID NO.5) 0.2uL
内参探针(SEQ ID NO.6) 0.3uL
共 15uL
阴性质控品的制备
ACTB基因RNA片段:5’-TGATCTTGCATAGTACATTCA-3’(SEQ ID NO.10)
阳性质控品的制备
PCA3基因RNA片段：5’-GGTTGGTTGTTGCGGTCGCGG-3(SEQ ID NO.11)
PSA基因RNA片段：5’-GTAGGGTTTCGTAGCGTATTT-3(SEQ ID NO.12)
(5)加样量：待测样品及质控品的加样量均为10ul(总体系为25ul)，样本重复2孔，阴性质控品和阳性质控品各重复3孔。
(6)PCR仪器的选择及其适用性实验：使用7500荧光PCR仪/天隆科技TL988荧光PCR仪对样品进行扩增，每个样本选择FAM、JOE共2个荧光通道，参比荧光(Passive Reference)设置为none，反应条件设置如下：
(7)结果分析：反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在2～8、End值可设在10～20，荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为undet)，点击Analysis自动获得分析结果，对结果数值进行整理、分析，计算(PCA3 mRNA/PSA mRNA)*1000的数值，测定PCA3评分。
(8)质量控制：如果阴性质控品和阳性质控品全部满足如下表所列标准，并且病人样本随同阴性质控品和阳性质控品在同一次PCR反应中测定，该PCR反应被验证为是有效的。如果任何一个阴性质控品或阳性质控品样本或两个都无效，则无法分析病人样本的结果，那么就要重复测定本实验中全部病人的样本。
质控品验证PCR反应的有效性
样本结果的判定：在阴性质控品和阳性质控品数值均正常的前提下，对样本结果的判定如下表：
对单个PCR反应结果的判定
在两个PCR反应液都有效且PSA阳性的情况下，将PCA3和PSA的Ct值代入下列公式，计算 PCA3评分。
PCA3评分＝1000/2(PCA3 Ct值-PSA Ct值)
或PCA3评分＝PCA3 Ct值/PSA Ct值*1000
样本结果的解释：
如果待检样本内标通道Ct值＞38或PSA通道Ct值＞34，则需重新对样本进行提取或者重新采样提取后进行检测。
实施例3.分别用SBI提取试剂与本发明的提取试剂对相同的尿液样本进行外泌体RNA的提取，操作步骤如下：
SBI提取方法(按产品说明书操作)：
1.收集人体新鲜尿液1mL(样本来源：医院前列腺癌病人尿液样本)；
2.高速离心后取上清，按说明书要求的体积比例加入ExoQuick-TC，-20℃保存过夜；
3.高速离心后移除上清，加入350uL Lysis Buffer(静置5min)；
4.加入200uL乙醇，转移到该产品自带的柱状离心管，高速离心；
5.用产品自带的Wash Buffer清洗两遍后空转；
6.把柱状管转移到新的离心管，用产品自带的ELUTION BUFFER洗脱30uL。
本发明提取方法：本发明提取方法和检测方法参见实施例2
分别用以上两种方法提取尿液外泌体RNA后，使用本发明的PCA3和PSA的检测试剂盒与检测方法进行PCR,如实施例1和2所述。
按以下条件进行PCR反应
实验结果：
实验结论：使用本发明的试剂提取尿液外泌体RNA，RNA的Ct值在27.53～27.57(FAM)的范围，对应内参的Ct值在28.71～28.74(JOE)的范围，而使用SBI提取试剂的RNA Ct值在 29.78～29.93(FAM)的范围，对应内参的Ct值27.99～28.22(JOE)的范围。由此可见，本发明的提取试剂具有更高的RNA提取效率。参见图1。
实施例4.使用参考品对PCA3反应液和PSA反应液进行精密度和灵敏度的检测
PCA3和PSA基因检测试剂盒企业参考品的制备:企业参考品的来源均为经稀释的目的基因人工合成RNA片段的混合物。制备的企业参考品按照规定体积分装，于-18℃以下冻存，禁止反复冻融，从制备日起2年内有效。
阳性参考品参数表
阴性参考品参数表
阴性参考品 性质和来源 浓度copies/μl
N1 ACTB基因RNA 1×105
N2 ACTB基因RNA 1×104
N3 ACTB基因RNA 1×103
精密度参考品参数表
灵敏度参考品参数表
精密度参考品(R)的检测结果
精密度参考品的检测结果：使用上方配制的精密度参考品R分别与本发明的PCA3反应液及 PSA反应液进行PCR反应，两管反应液各重复10孔，结果如图2和图3所示，PCA3反应液检测通道(FAM)Ct值在31.10～31.46范围，内参通道(JOE)Ct值在28.20～28.68，PSA反应液检测通道(FAM)Ct值在31.12～31.63范围，内参通道(JOE)Ct值在28.04～28.54。从数值范围可知，精密度参考品符合精密度检测要求的指标。
灵敏度参考品(L5)的检测结果
本发明灵敏度的结果：使用上方配制的灵敏度参考品L5分别与本发明的PCA3反应液及PSA 反应液进行PCR反应，重复20孔，结果如图4和图5所示，PCA3反应液检测通道(FAM)Ct值在33.60～35.39范围，内参通道(JOE)Ct值在27.79～28.63范围，PSA反应液检测通道(FAM)Ct值在33.11～34.25范围，内参通道(JOE)Ct值在28.12～28.71范围，从以上数据可知，灵敏度参考品符合灵敏度测试要求的指标。
实施例5.PCR仪器的适用性研究实验：
使用ABI 7500荧光PCR仪和天隆科技TL988荧光PCR仪，对PCR反应体系灵敏度和特异性进行比较，实验步骤如下：
1.从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并瞬时低速离心备用；
2.取15μLPCR反应液加入到200μLPCR小管进行分装；
3.加样为参考品P3，PCR重复20次；
4.进行平行实验在两种仪器上检测目的基因，检测试剂盒的组成和检测方法参见实施例1和实施例2。
实验结果：ABI 7500荧光PCR仪检测到20次为PCA3及PSA均为阳性，且内参扩增正常，相同的实验方法在天隆科技TL988荧光PCR仪的结果与ABI 7500灵敏度一致。
实施例6.临床实验(小量样本测试)：
实验步骤：从零下80℃保存的冷库中取出前列腺癌患者的尿液样本(1～17，共17个)，健康人尿液样本,(18～20，共3个)，室温解冻，震荡数秒后，每个样本取样量1mL，高速离心后收集上清，加入外泌体沉淀溶液(外泌体沉淀溶液体积与样本体积比为1:1)，过夜保存。 13000rpm/min离心10分钟后取沉淀，使用磁珠法提取RNA，并用本发明的PCA3反应液进行PCR反应，选用仪器为ABI 7500荧光PCR仪。即检测试剂盒和检测方法，参见本发明实施例1和实施例2。
实验结果:
实验结论：从实验结果的数据可知，内标通道Ct值均>34，PSA通道Ct值均<38，所以数值结果均为有效。根据PCA3评分公式：PCA3 Ct值/PSA Ct值*1000，计算出评分结果，前列腺癌患者样本的Ct值均>30，健康人样本的Ct值均<30。样本检测结果符合实验要求。
实施例7.临床实验(大量样本测试)：
实验步骤：从零下80℃保存的冷库中取出前列腺癌患者的尿液样本(1～70，共70个)，健康人尿液样本,(71～100,共30个)，室温解冻，震荡数秒后，每个样本取样量1mL，高速离心后收集上清，加入外泌体沉淀溶液(外泌体沉淀溶液体积与样本体积比为1:1)，过夜保存。 13000rpm/min离心10分钟后取沉淀，使用磁珠法提取RNA，并用本发明的PCA3反应液进行 PCR反应，选用仪器为ABI 7500荧光PCR仪。即检测试剂盒和检测方法，参见本发明实施例1 和实施例2。
实验结果：
实验结论：从实验结果的数据可知，内标通道Ct值均>34，PSA通道Ct值均<38，所以数值结果均为有效。根据PCA3评分公式：PCA3 Ct值/PSA Ct值*1000，计算出评分结果，前列腺癌患者样本的Ct值均>30，健康人样本的Ct值均<30。样本检测结果符合实验要求。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州瑞博奥生物科技有限公司
<120> PCA3和PSA基因检测试剂盒及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgggaagg acctgatgat ac 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agggcgaggc tcatcgat 18
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgctgactt taccatctga ggccac 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagtgtgac gtggacatcc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcagtgatct ccttctgcat c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaacacagt gctgtctggc gg 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggtcccggt tgtcttcct 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgccacgaga ggccacaa 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gattgtggga ggctgggagt gc 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgatcttgca tagtacattc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggttggttgt tgcggtcgcg g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtagggtttc gtagcgtatt t 21

Claims (10)

1.一种PCA3和PSA基因检测试剂盒，其特征是，包括有针对PCA3和PSA基因引物和探针，其中，针对PCA3基因的引物和探针序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示，
针对PSA基因的引物和探针序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8以及SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的PCA3和PSA基因检测试剂盒，其特征是，还包括有内参引物和内参探针，所述内参引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述内参探针的序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的PCA3和PSA基因检测试剂盒，其特征是，还包括有外泌体沉淀溶液、RNA提取试剂、清洗液。
4.根据权利要求3所述的PCA3和PSA基因检测试剂盒，其特征是，所述外泌体沉淀溶液的组成为：Poly(ethylene glycol)，NaCl和ddH2O。
5.根据权利要求3所述的PCA3和PSA基因检测试剂盒，其特征是，所述RNA提取试剂的组成为：含固量为50％的磁珠，乙醇。
6.根据权利要求3所述的PCA3和PSA基因检测试剂盒，其特征是，所述清洗液的组成为：0.1M NaCl，异丙醇，乙醇，ddH2O。
7.权利要求1-6任一项所述的PCA3和PSA基因检测试剂盒的使用方法，其特征是，包括提取外泌体RNA；配置PCR反应液；进行荧光PCR反应。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征是，提取外泌体RNA的操作步骤包括：
(1)将人体尿液样本离心以获得上清液；
(2)在上清液中加入外泌体沉淀溶液，人体尿液样本和外泌体沉淀溶液的体积比为1：1，混匀，室温静置1小时/4℃过夜后，以13000rpm/分钟的速度离心10分钟，以形成外泌体沉淀物；
(3)在所述外泌体沉淀物中加入总RNA提取试剂以及抗体标记磁珠，静置10分钟，每两分钟上下颠倒5～6次，使磁珠在管內分布均匀；
(4)加入清洗液，重复清洗2遍后，加入80％乙醇；
(5)洗脱，从而获取外泌体RNA。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征是，针对PCA3基因的反应液如下：
针对PSA基因的反应液如下：
。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征是，荧光PCR反应的条件如下：
。
CN201810098145.8A 2018-01-31 2018-01-31 Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用 Pending CN108441557A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810098145.8A CN108441557A (zh) 2018-01-31 2018-01-31 Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810098145.8A CN108441557A (zh) 2018-01-31 2018-01-31 Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108441557A true CN108441557A (zh) 2018-08-24

Family

ID=63191564

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810098145.8A Pending CN108441557A (zh) 2018-01-31 2018-01-31 Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108441557A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109971850A (zh) * 2018-12-27 2019-07-05 李刚 一种辅助预测前列腺癌的液体活检方法及其应用
CN110951871A (zh) * 2019-11-21 2020-04-03 广州瑞博奥生物科技有限公司 Pca3和psa rna检测试剂盒和扩增体系
CN113249481A (zh) * 2021-06-03 2021-08-13 深圳市拾方杰科技有限公司 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置
CN115927633A (zh) * 2022-11-29 2023-04-07 神州医疗科技股份有限公司 一种检测pca3及psa的试剂盒及方法
CN116144769A (zh) * 2022-09-09 2023-05-23 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004070056A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-19 Diagnocure Inc. Method to detect prostate cancer in a sample
CN101942523A (zh) * 2010-10-15 2011-01-12 邵棠 一种检测pca3基因、psa基因的液相芯片法及其诊断试剂盒
WO2012007546A1 (en) * 2010-07-14 2012-01-19 Fundació Institut De Recerca Hospital Universitari Vall D'hebron, Fundació Privada Methods and kits for the diagnosis of prostate cancer
CN103849683A (zh) * 2014-01-26 2014-06-11 上海度微医学技术有限公司 前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用
CN104164474A (zh) * 2013-05-17 2014-11-26 刘代新 一种检测尿液中pca3基因和psa基因表达量的荧光定量pcr法及其诊断试剂盒
CN104531863A (zh) * 2014-12-19 2015-04-22 钱学庆 一种人类尿液中pca3基因检测方法和引物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004070056A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-19 Diagnocure Inc. Method to detect prostate cancer in a sample
WO2012007546A1 (en) * 2010-07-14 2012-01-19 Fundació Institut De Recerca Hospital Universitari Vall D'hebron, Fundació Privada Methods and kits for the diagnosis of prostate cancer
CN101942523A (zh) * 2010-10-15 2011-01-12 邵棠 一种检测pca3基因、psa基因的液相芯片法及其诊断试剂盒
CN104164474A (zh) * 2013-05-17 2014-11-26 刘代新 一种检测尿液中pca3基因和psa基因表达量的荧光定量pcr法及其诊断试剂盒
CN103849683A (zh) * 2014-01-26 2014-06-11 上海度微医学技术有限公司 前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用
CN104531863A (zh) * 2014-12-19 2015-04-22 钱学庆 一种人类尿液中pca3基因检测方法和引物

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. FONSECA COELHO等: "Expression of PCA3 and PSA genes as a biomarker for differential diagnosis of nodular hyperplasia and prostate cancer", 《GENETICS AND MOLECULAR RESEARCH》 *
中国医学创新杂志社: "《实用临床诊疗——检验学》", 31 October 2013, 科学技术文献出版社 *
刘妍等: "尿液前列腺癌基因-3在前列腺癌诊断中的临床价值", 《中国肿瘤》 *
吕春燕等: "聚乙二醇沉淀剂有效分离尿外泌体", 《中国生物化学与分子生物学报》 *
朱国栋等: "前列腺癌标志物PCA3的研究进展", 《现代泌尿外科杂志》 *
李伟 黄彬: "《分子诊断学（第3版）》", 30 September 2015, 中国医药科技出版社 *
李自刚 李鸣晓: "《生物检测技术（第二版）》", 31 August 2016, 中国轻工业出版社 *
杨帮东等: "尿液中PCA3评分对前列腺癌早期诊断的临床意义", 《天津医科大学学报》 *
杨诚等: "基于PEG6000富集精液来源外泌体的提取及鉴定", 《J SOUTH MED UNIV》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109971850A (zh) * 2018-12-27 2019-07-05 李刚 一种辅助预测前列腺癌的液体活检方法及其应用
CN110951871A (zh) * 2019-11-21 2020-04-03 广州瑞博奥生物科技有限公司 Pca3和psa rna检测试剂盒和扩增体系
CN110951871B (zh) * 2019-11-21 2024-01-05 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 Pca3和psa rna检测试剂盒和扩增体系
CN113249481A (zh) * 2021-06-03 2021-08-13 深圳市拾方杰科技有限公司 外泌体基因的应用、前列腺癌检测物及其检测试剂盒和检测装置
CN116144769A (zh) * 2022-09-09 2023-05-23 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用
CN116144769B (zh) * 2022-09-09 2023-09-01 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 一种基于PCA3、PSA双基因的sgRNA引物、检测试剂及其应用
CN115927633A (zh) * 2022-11-29 2023-04-07 神州医疗科技股份有限公司 一种检测pca3及psa的试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108441557A (zh) Pca3和psa基因检测试剂盒及其应用
CN108949990B (zh) 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法
CN105256014B (zh) 乳腺癌联合诊断标志物及检测试剂盒
CN108624688B (zh) hsa_circ_0012755作为前列腺癌分子靶标在制备药物和试剂盒中的应用
CN109897855A (zh) 一种血清miRNA标志物及其在胰腺炎介导的胰腺癌早期诊断中的应用
CN112662776A (zh) 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用
CN105463111B (zh) 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒
CN113337613B (zh) 一种与肝癌相关的血清外泌体tsRNA标志物、探针及其应用
CN114774540A (zh) 包括外泌体miR-106b-3p、miR-330-5p等在肺癌诊断中的应用
CN111455053B (zh) 用于结直肠腺瘤诊断的外泌体rna分子标记物组合及其应用
CN113528672A (zh) 用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用
CN111424085B (zh) tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用
CN111455052B (zh) 用于结直肠癌早期诊断的外泌体rna分子标记物组合及其应用
JP2011511635A (ja) 癌標識としての結腸癌関連転写因子１（ｃｃａｔ−１）
CN114875146A (zh) 检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用
CN117265112B (zh) 一种前列腺癌的数字微液滴rna扩增检测系统及pca3基因在该系统中的应用
CN111455051B (zh) 用于结直肠癌诊断及预测的外泌体rna及其应用
CN114214421B (zh) 外泌体miR-3615、ARPC5等在肺癌诊断中的应用
CN111826445B (zh) miR-1468-5p在评估宫颈癌患者PD-L1表达中应用
CN113957149B (zh) 一种检测甲胎蛋白基因和pgr13基因表达量的试剂盒及其应用
CN109929921A (zh) MicroRNA 21 (MIR21)核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
TWI690597B (zh) 泌尿上皮癌的檢測套組及檢測方法
CN101760525B (zh) 检测人前列腺癌中17β一羟基类固醇脱氢酶7表达量的试剂盒
CN114921546A (zh) circHIPK2作为乳腺癌生物标志物的应用
CN116751857A (zh) 定量检测外泌体miRNA分子标志物的产品在制备食管癌诊断工具中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180824

RJ01 Rejection of invention patent application after publication