KR20140064732A - 신생물을 진단하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 1 이상의 핵산 마커의 발현 레벨의 조절을 스크리닝하는 것에 의하여, 결장직장 신생물의 발병, 발병에의 소인 및/또는 진행에 대하여 대상체를 스크리닝하는 것과 관련된다. 특히, 본 발명은 막 미세소낭 내 1 이상의 유전자 마커의 발현 레벨에서의 조절을 스크리닝하는 것에 의하여, 결장직장 신생물의 발병, 발병에의 소인 및/또는 진행에 대하여 대상체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 발현 프로파일은, 결장직장 선종 및 선암과 같은 결장직장 신생물을 진단 및/또는 모니터링하는 것과 관련되는 것을 포함하는 응용 범위에 유용하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

Description

신생물을 진단하는 방법{A METHOD OF DIAGNOSING NEOPLASMS}

본 발명은 일반적으로, 1 이상의 핵산 마커 발현 레벨의 조절을 스크리닝하는 것에 의하여, 결장직장 신생물의 발병, 발병에의 소인 및/또는 진행에 대하여 대상체를 스크리닝하는 방법에 관련된다. 보다 구체적으로 본 발명은, 막 미세소낭 내 1 이상의 유전자 마커의 발현 레벨에 있어서의 조절을 스크리닝하는 것에 의하여, 결장직장 신생물의 발병, 발병에의 소인 및/또는 진행에 대하여 대상체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 발현 프로파일은 결장직장 선종 및 선암과 같은 결장직장 신생물을 진단 및/또는 모니터링하는 것과 관련된 것을 포함하는 응용 범위에 유용하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서 중 저자에 의하여 언급된 공보의 서지 사항은 상세한 설명의 마지막에 알파벳 순으로 모아놓았다.

본 명세서 중의 그 어떠한 선행 공보(또는 그로부터 유래한 정보) 또는 그 어떠한 알려진 사항에 관한 언급은 선행 공보(또는 그로부터 유래한 정보) 또는 알려진 사항이 본 명세서가 관련된 노력 분야에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성하는 것을 승인 또는 인정 또는 그 어떠한 형태로든 제안하는 것이 아니며 그로서 받아들여져서는 아니된다.

선종(adenoma)는 선상 조직(glandular tissue)으로부터 유래한 상피 근원의 양성 종양 또는 신생물이며, 명확하게 정의된 선상 구조를 나타낸다. 몇몇 선종은 섬유 조직(섬유종) 및 상피 구조와 같은 알아볼 수 있는 조직 성분을 나타내는 반면에, 기관지 선종과 같은 다른 것들은 임상 증후군을 일으킬 수 있는 활성 물질을 생산한다.

선종은 침습적인 신생 물질로 진행할 수 있으며, 이 경우 선암(adenocarcinoma)으로 지칭된다. 이에 따라, 선암은 신체 많은 기관의 구성 부분인 선상 구조로부터 유래한 악성 상피 종양으로 정의된다. 용어 선암은 선상 성장 패턴을 보이는 종양에도 또한 적용된다. 이들 종양은 예컨대 점액 분비 선암 및 장액 선암과 같이 그들이 생산하는 물질에 따라, 또는 유두상 및 여포성 선암종과 같이 세포의 현미경 상의 배열 배턴에 따라 하부 분류될 수 있다. 이러한 암종은 고형 또는 포낭성(낭포선암) 일 수 있다. 각각의 기관은 다양한 조직학적 형태를 나타내는 종양을 발생시킬 수 있는데, 예를 들어 난소는 점액암 및 낭종암 둘 모두를 발생시킬 수 있다.

다양한 기관에서 선종은 다르게 행동한다. 일반적으로 아데노마 내 존재하는 종합적인 선종의 확률(즉, 양성 병변 내에서 발전한 암의 초점)은 대략 5%이다. 그러나, 이는 선종의 크기와 관련된다. 예를 들어, 대장(특히 결장 및 직장)에서, 선종 내 암의 발생은 1 센티미터 미만의 선종에서는 희귀하다. 그와 같은 발전은 4 센티미터 초과의 선종에서 40 내지 50%로 추정되며, 융모 변형 또는 고등급의 형성 장애와 같은 특정 조직학적 변화를 나타낸다. 고등급의 형성 장애를 갖는 선종은 선암의 발생이 높다. 임의의 주어진 결장직장 선종에서, 조직 내 암의 현재 또는 과거 암 존재의 예측 변수는 관 형태에서 융모 형태로 변화하는 크기(특히 9mm 초과)의 정도, 고등급 형성 장애의 존재 및 "톱니상 선종"과 같이 기술된 형태학적 변화를 포함한다. 임의의 주어진 개인에 있어서, 연령 증가, 결장직장 선종 또는 암의 가족 발생, 남성 또는 선종의 다중성은, 기관 내에 미래에 증가하는 암의 위험-소위 위험 인자를 예측한다. 선종의 존재 및 그 크기를 제외하고는, 논의 대상 특징의 정확한 정의와 관련하여 이들 중 그 어느 것도 객관적으로 정의되지 않으며, 숫자 및 크기를 제외하고는 이 모든 것들은 관찰자의 실수 및 혼란의 대상이 된다. 그와 같은 요소들을 산정하고 정의하는 것이 어려울 수 있기 때문에, 현재 또는 미래의 암 위험 예측 변수로서 그들의 값은 부정확하다.

산발적인 선종이 일단 발생하면, 새로운 선종이 발생할 확률은 26개월 이내에 대략 30%이다.

결장직장 선종은 특히 부유한 나라에 있어서 발병 증가를 나타내는 선종의 한 그룹을 대표한다. 선종의 원인 및 선암으로 진행되는 원인은 아직 집중적인 연구 대상이다. 지금까지 유전적인 소인에 더하여 (식이와 같은) 환경적 인자가 이러한 조건 발생에 역할을 하는 것으로 고찰되어 왔다. 대부분의 연구는 관련된 환경 인자가 고 지방 식이, 낮은 섬유소, 낮은 야채 섭취, 흡연, 비만, 물리적 비활동성 및 정제된 탄수화물과 관련됨을 나타낸다.

결장 선종은 단지 하나 또는 수개의 선와를 초기에 수반하는 형성이상 상피의 국소화된 영역이며, 표면으로부터 돌출되지 않을 수도 있으나, 일반적으로 증식 및/또는 아폽토시스 내 불균형으로 인하여 그 크기가 증가함에 따라, 돌출될 수도 있다. 선종은 여러 방식으로 분류될 수 있다. 하나는 그들의 총체적 외관에 의한 것이고, 주요 서술자로서 돌출 정도를 포함한다: 평평한 고착(즉, 뚜렷한 자루 없이 돌출) 또는 자루형(즉, 자루를 가진 것). 다른 총체적 서술자로는 최대 직경에 있어 실제 크기 및 결장/직장 내 실제 개수가 있다. 작은(5 또는 10 밀리미터 미만) 선종이 부드러운 황갈색 표면을 나타내는 반면에, 자루가 있고 특히 큰 선종은 자갈 또는 소엽상의 적갈색 표면을 갖는 경향이 있다. 큰 고착형 선종은 보다 섬세한 융모형 표면을 나타낼 수도 있다. 서술자의 다른 세트로는 병리조직적 분류가 포함된다; 임상적 가치의 주된 서술자로서 형성 장애의 정도(낮거나 높음), 침습적 암의 초점이 존재하는지 여부, 관형 샘 형성에서 융모형 샘 형성으로 변화한 정도(그리하여, 분류는 관형, 융모형 또는 관융모형), 혼합된 형성 장애 변화 및 소위 "톱니 모양" 선종의 존재 및 그의 하부 그룹이 포함된다. 선종은 그들이 직장 및 말단 결장 내 보다 흔한 성향이 있음에도 불구하고, 결장 및/또는 직장 내 그 어느 부위에도 위치할 수 있다. 이 모든 서술자들은, 개수 및 크기를 제외하고는, 상대적으로 주관적이며 관찰자 간 불일치의 대상이 된다.

선종의 다양한 서술자적 특성은, 단지 탐지된 때에 주어진 임의 선종의 암적인 상태를 확인하기 위한 것일 뿐만 아니라, 또한 결장직장 선종 또는 암이 발전할 장래의 개인적인 위험을 예측하기 위해서도 가치 있는 것이다. 개인에 있어 암 또는 새로운 선종 재발의 장래 증가된 위험을 나타내는 이러한 선종의 특성 또는 선종의 개수는 다음을 포함한다; 최대(특히 10 mm 이상) 선종의 크기, 융모성 변화의 정도(특히 적어도 25%의 그와 같은 변화 및 특히 100% 그와 같은 변화), 높은 정도의 형성 장애, 개수(임의의 크기 또는 형태학적 상태가 3개 이상) 또는 톱니 모양 선종 특성. 크기 및 수를 제외하고는 그 어느 것도 객관적이지 않으며, 모두가 상대적으로 주관적이고 관찰자 간 불일치의 대상이 된다. 장래 신조직 형성에 대한 위험(그리하여 "위험")의 이러한 지시자는 실제적으로 필수적인데, 이는 장래 결장경 감시의 비율 및 필요성 및 빈도를 결정하는데 사용되기 때문이다. 따라서, 보다 정확한 위험 분류는 결장경 검사의 작업 부하를 감소시킬 것이며, 더 비용 효율적이게 하고, 불필요한 절차로부터 발생하는 합병증의 위험을 감소시킬 것이다.

선종은 일반적으로 증상이 없고, 그리하여 그들이 침습적인 특성을 발전시키고 암이 되기 전 단계에서 그들을 진단하고 치료하는 것을 어렵게 한다. 비록 더 큰 선종이 더 작은 선종보다 악성 영역을 나타내기가 쉬움에도 불구하고, 선종의 총체적 외관에 근거하여 암의 존재 또는 부존재를 예측하는 것은 기술적으로 불가능하다. 고착성 선종은 동일한 크기의 자루가 있는 선종보다 더 높은 악성 빈도를 나타낸다. 몇몇 선종은 대변 중에서 관찰되거나 탐지될 수 있는 혈액 손실을 야기한다: 그것은 가끔은 눈에 의하여 관찰 가능하지만, 그것은 종종 발생하는 경우 현미경적 또는 "잠혈성"이다. 큰 선종은 작은 선종보다 출혈이 쉬운 경향이 있다. 그러나, 스툴 중 혈액이 명시적이든 또는 잠혈적이든 간에 이는 또한 비-선종성 질환도 나타낼 수도 있는 것이어서, 제거(즉, 용종 절제술) 또는 생검 및 추후 조직학적 분석에 의한 조직 획득과 결합된 결장경과 같은, 고도로 침습적인 절차의 적용 없이는 선종의 정확한 진단을 어렵게 한다.

이에 따라, 선종의 원인을 밝히고, 보다 정보력 있는 진단 프로토콜 또는 선종을 가지고 있을 것 같은 사람들에게 결장경의 지시를 가능하게 하는 진단에의 도움에 대한 지속적인 필요성이 있다. 이러한 선종은 고도로 위험하거나, 진행되었거나 또는 이들 모두도 아닐 수 있다. 게다가, 특히 다수의 선종을 가진 사람의 경우, 결장경 이후에도 모든 선종이 제거되었음을 명확히 하는 것은 어렵다. 정확한 스크리닝 시험이, 신생물이 대장으로부터 제거되었음을 명확히 하기 위하여 초기 2차 결장경을 받을 필요를 최소화할 수 있을 것이다. 이에 따라, 유용한 스크리닝 시험의 발전을 포함하여 선종 진단을 개선하면서, 선종의 형태학적 단계를 설명하면서, 선종의 분자적 상태에 기반하여 환자의 장래 결장직장 신생물의 위험을 특성화하면서, 그리고 선종의 치료를 촉진하면서, 선종에 대한 분자적 마커의 동정은 선종 및 암의 원인 이해를 위한 수단을 제공할 것이다.

지금까지, 연구는 결장직장 신생물을 결정하는 유전적 변이를 동정하는데 촛점을 맞추는 경향이 있었다. 그러나, 더 최근의 발견은 사실 건강한 개인 중에서 발현되는 변이되지 않은 유전자의 발현 레벨에의 변화 또한 신생물 발전의 지시자임을 나타내고 있다. 이러한 유전자 발현의 변화는 일반적으로 직장결장 조직 시료 중에서 일상적으로 탐지된다. 그러나, 환자 입장에서, 결장직장 조직 시료의 수집은 침습적이고, 감염과 같은 시술 이후 합병증의 관점에서 위험이 없지 않다. 말단 혈액 채취는, 분석을 위하여 생물학적 시료를 채취하는 점에서 일반적으로 현저하게 선호되는 방법이지만, 문제되는 유전자 발현 레벨의 변화가 진단학적으로 유용한 레벨로 혈액 중에서 탐지가능한지 여부에 전적으로 의존한다.

본 발명을 이끈 작업에서, 결장직장 신생물 유전자 마커, 신생물 중 증가하는 발현 레벨의 관점에서, 진단 민감도 문제로 인하여 이러한 발현의 증가가 혈장 중에서 필수적으로 용이하게 탐지가능한 것은 아닌 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 유전자 마커의 적은 서브세트가 순환하는 엑소좀(exosome) 내에 그들의 발현 레벨에 있어 현저한 증가를 나타내는 것이 예상치못하게 발견되었다. 암 조직 내 발현에 있어 증가하는 모든 결장직장 유전자 마커가 또한 엑소좀 내에서도 필수적으로 증가하는 것은 아니기 때문에, 이러한 발견은 예상치 못한 것이다. 이러한 발견은 엑소좀이 말단을 순환하며, 따라서 혈액 시료를 통하는 것과 같이 용이하게 채취할 수 있기 때문에 특히 중요하다. 또한 더욱이, 전혈 또는 혈장 내 유전자 발현 레벨의 분석이 민감성 결여의 문제를 겪을 수 있는 반면에, 종전에 밝혀진 결장직장 신생물 마커의 작은 하부 그룹이 엑소좀의 한정된 환경 내에서 실질적으로 탐지 가능하다는 발견은, 유전자 물질을 오염시키는 관련없는 것의 레벨 감소로 인하여, 현저하게 훨씬 민감한 탐지 수단을 이제 제공한다. 또한 이것은, 그것이 혈액 시료의 채취와 같이 최소한도로 침습적인 채취 기술의 사용과 관련된다는 관점에서 매우 바람직하다.

본 발명의 일 관점은 개체 중의 대장 신생물(neoplasm) 발병 또는 발병 소인에 대한 스크리닝 방법으로서, 상기 개체로부터 유래한 막 미세소낭(membranous microvesicle) 시료 중에서, 다음의 발현 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다:

(i) 다음으로부터 선택되는 1 이상의 유전자:

(ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

여기서, 대조군 레벨과 비교하여 상기 유전자 발현 레벨의 증가는 신생물의 발병 또는 발병 소인을 나타낸다.

다른 관점에서, 상기 신생물은 선종 또는 선암이고, 보다 더욱 바람직하게는 결장직장 선종 또는 선암이다.

또 다른 관점에서, 상기 방법은 상기 유전자의 단백질 발현 산물 또는 그의 단편을 스크리닝하는 것에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 개체 중의 대장 신생물의 발병 또는 발병의 소인을 스크리닝하는 방법에 제공되는데, 상기 방법은 상기 개체로부터 유래한 막 미세소낭(membranous microvesicle) 시료 중에서, 하기로부터 선택되는 유전자로부터 전사되는 RNA 전사체의 레벨을 측정하는 단계를 포함한다:

(i) 하기로부터 선택되는 1 이상의 유전자:

(ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

여기서, 대조군 레벨과 비교하여 상기 RNA 전사체의 발현 레벨의 증가는 신생물의 발병 또는 발병에 대한 소인을 나타낸다.

또 다른 관점에서, 상기 RNA는 mRNA이다.

또 다른 관점에서, 상기 막 미세소낭은 엑소좀이다.

추가의 관점에서, 상기 유전자는 다음의 1 이상이다:

(i)

(ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

다른 추가의 관점에서, 상기 영역은 다음의 1 이상이다:

(i)

(ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

문맥에서 다르게 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 하기의 청구항 전체에 걸쳐, 용어 "포함"과 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변수는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단게의 그룹의 포함을 함축하는 것으로 이해될 것이지만, 그 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배척하는 것은 아니다.

본 명세서에 사용되는 용어 "유래한"은 특정 정수 또는 정수의 그룹이 특정된 종으로부터 유래 되었음을 나타내는 것으로 받아들여질 것이지만, 특정된 근원으로부터 필연적으로 직접 얻어지는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 단일 형태 "하나(a)", "및(and)" 그리고 "그(the)"는 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않은 한 복수의 언급을 포함한다.

다르게 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진자에게 보통으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본 발명은, 직장결장 신생물 환자 중에서 증가된 발현을 겪는 것으로 알려져 있는 유전자 패널 내에, 사실상, 엑소솜과 같은 환자의 막 미세소낭 중에서 증가된 레벨의 탐지가능한 유전자의 작은 서브그룹이 있다는 결정에 부분적으로 입각한 것이다. 이러한 결정은 놀라운 것이다. 조직 중에서 증가된 레벨로 발현되는 대부분의 유전자가 혈장에서도, 특히 단백질 레벨에서 탐지가능할 것이 기대됨에도 불구하고, 사실 탐지의 민감성이 언제나 적절한 것은 아니다. 엑소좀의 내인적 성질과 그들이 이제 신뢰성 있게 농축될 수 있다는 사실로 인하여, 단백질 또는 RNA에 대하여 전혈 또는 혈장을 단지 스크리닝하는 것이 아닌, RNA 레벨에서 이러한 유전자의 발현 레벨 중의 변화를 시험하는 현저하게 더 민감하고 정확한 수단이 제공된다. 엑소좀이 전혈 시료로부터 편리하게 수확될 수 있다는 사실과 함께 고려할 때, 최소로 침습적인 프로토콜에 기반한 결장직장 신생물을 스크리닝하는 특히 민감한 수단이 제공된다. 이는 결장직장 신생물의 초기 진단을 가능하게 하는 맥락에서 매우 관련된다.

따라서, 본 발명의 하나의 관점은 개체의 대장 신생물(neoplasm) 발병 또는 발병 소인에 대한 스크리닝 방법으로서, 상기 개체로부터 유래한 막 미세소낭(membranous microvesicle) 시료 중에서, 다음의 발현 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다;

(i) 하기에서 선택되는 1 이상의 유전자:

(ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

여기서, 대조군 레벨과 비교하여 상기 유전자 발현 레벨의 증가는 신생물의 발병 또는 발병 소인을 나타낸다.

문제의 염색체는 명칭 및 염색체 코디네이트 둘 모두에 대한 언급에 의하여 본 명세서에 기술되는 것으로 이해되어야 한다. 염색체 코디네이트는 2009년 2월 중에 공개된 인간 게놈 데이터베이스 버전 Hg19와 일치한다(본 명세서에서 "Hg19 코디네이트"로 언급됨).

용어 "대장"은 회장의 말단 영역 이후에 시작하는 영역으로서, 대장의 6개 해부학상 영역의 어느 하나로부터 유래된 세포를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 이들은 다음과 같다:

(i) 맹장;

(ii) 상행 결장;

(iii) 횡행 결장;

(iv) 하행 결장;

(v) S상 결장; 및

(vi) 직장.

용어 "신생물"은 신생물 세포를 포함하는 병변, 종양 또는 다른 캡슐화된 또는 비캡슐화된 덩어리 또는 다른 성장 형태에 대한 언급으로 이해되어야 한다. "신생물 세포"는 비정상적 성장을 나타내는 세포에 대한 언급으로 이해되어야 할 것이다. 용어 "성장"은 그의 가장 넓은 의미로 이해되어야 할 것이며, 증식에 대한 언급을 포함한다. 이와 관련하여, 비정상적 세포 성장의 예로는 세포의 통제되지 않은 증식이 있다. 따른 예로는 세포 중의 실패된 아폽토시스로 인하여, 일반적인 수명이 연장되는 것이 있다. 신생물 세포는 양성 세포 또는 악성 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대상 신생물은 선종 또는 선암이다. 본 발명을 어느 하나의 이론 또는 작용 모드로 제한하지 않고, 선종은 일반적으로 상피 조직으로부터 유래하거나 또는 명확하게 정의된 상피 구조를 나타내는 상피 기원의 양성 종양이다. 이러한 구조는 선 모양을 취할 수 있다. 이것은 양성의 선종이 악성의 선암으로 진행하면서 발생하는 것과 같이, 선종 이내에 악성의 세포 군집을 포함할 수 있다.

본 발명은 대장 내에 위치하는 신생물 세포 또는 세포 군집을 스크리닝하기 위하여 디자인되었다. 따라서, 용어 "세포 또는 세포 군집"은 개별 세포 또는 세포의 그룹에 대한 언급으로서 이해되어야 할 것이다. 상기 세포 그룹은 세포의 확산된 군집, 세포 현탁, 세포의 캡슐화된 군집 또는 조직의 형상을 가지는 세포의 군집일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 신생물은 선종 또는 선암이고, 보다 더 바람직하게는 결장직장 선종 또는 선암이다.

상기 설명된 유전자 및 그들의 전사되고 번역된 발현 산물에 대한 언급(본 명세서에서 집합적으로 "유전자 마커"로서 언급됨)은 이러한 유전자 및 단백질의 모든 형태 및 이들의 단편을 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 당업계에서 기술을 가진자에게 이해되는 바와 같이, 유전자는 개체 간에 대립(allelic) 또는 다형성 변형을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 이들 유전자들에 대한 언급은, 본 진단적 적용의 관점에서, 개체간 최소의 유전적 변형이 실제 핵산 서열 사이에 존재할 수 있다는 사실에도 불구하고 동일한 결과를 얻을 수 있는, 그와 같은 변형에까지 이르는 것으로 이해되어야 한다. 유전자 마커의 스플라이스 변이체 또한 흔히 존재할 수 있는데, 이는 복수의 엑손 조합 또는 번갈아 나타나는 5'- 또는 3'- 말단의 관점과 같은, 엑손 발현 및 배열에 있어 변화를 나타내는 이러한 유전자의 대체적인 전사적 형태를 의미한다. 그러므로, 본 발명은 모든 형태의 RNA(예컨대, mRNA, 일차 RNA 전사체, miRNA 등), cDNA, 및 대체 스플라이싱 또는 다른 변이, 대립(allelic) 또는 다형성 변형으로부터 발생하는 이소 형태까지 확장되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 전구체 형태와 같은 임의의 서브유닛 폴리펩타이드에 대한 언급도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 방법의 관점에서, 이러한 유전자 마커들의 "발현 레벨"의 스크리닝은 이러한 유전자로부터 전사된 RNA의 임의의 형태 또는 그로부터 발생시킨 cDNA를 스크리닝을 포함하는 다양한 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 용어 "RNA 전사체 레벨 스크리닝"은 RNA를 직접적으로 스크리닝하거나 또는 그로부터 전사된 cDNA를 스크리닝하는 것에 대한 언급으로서 이해되어야 한다. 이러한 산물 중 임의의 것의 레벨에의 변화는 대상 유전자의 발현 변화를 나타내는 것이다. 또한 게다가, 동정되고 측정된 핵산 분자는 전체 분자 또는 그의 단편일 수 있다. 예를 들어, 그것이 어떻게 가공되었는지에 따라, 엑소좀 시료로부터 RNA 단편만을 동정해 낼 수도 있다. 상기 단편이 특정 유전자와 함께 그것의 기원을 나타내기에 충분한 서열을 포함한다면, 단편화된 유전자 분자는 본 발명 방법의 문맥에서 유용하다.

발현의 레벨은, 막 미세소낭 이내에, 그의 단편을 포함하여 대상체 유전자의 단백질 산물의 발현 레벨을 스크리닝하는 것에 의하여 산정될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에 기술된 유전자들에 대한 단백질 서열은 잘 알려져 있으며, 통상의 기술자에 의하여 공개적으로 접근가능한 데이터베이스로부터 통상적으로 얻어질 수 있는 것이다. 그럼에도 불구하고 본 명세서에 다음을 위한 단백질 서열이 제공된다: KIA1199 (SEQ ID NO: 1), OLFM4 (SEQ ID NO: 2), DPEP1 (SEQ ID Nos: 3 및 4), S100A11 (SEQ ID NO: 5), ITGA6 (SEQ ID NOs: 6 및 7), TESC (SEQ ID NOs: 8 및 9), REG4 (SEQ ID NOs: 10, 11 및 12) 및 SLC12A2 (SEQ ID NO: 13).

일 구현예에서, 상기 방법은 상기 유전자의 단백질 발현 산물 또는 그의 단편을 스크리닝하는 것에 관한 것이다.

용어 "핵산 분자"는 디옥시리보 핵산 분자 및 리보 핵산 분자 둘 모두와 그들의 단편을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 그러므로, 본 발명은 엑소좀 시료 내 RNA 레벨을 직접 스크리닝하는 것 또는 관심대상 RNA 군집으로부터 역 전사된 상보적인 cDNA를 스크리닝하는 것 둘 모두에까지 확장된다. DNA 또는 RNA를 스크리닝하는 방법론을 디자인하는 것은 당업계에서 기술을 가진자의 기술 이내에 잘 속한다.

용어 "단편"은 대상체 유전자 또는 핵산 분자의 부분을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이 전에 기술한 바와 같이, 이는 효소적으로 처리되었을 수 있는 엑소좀 시료 내에서 조절된 RNA 레벨을 스크리닝하는 것과 특히 관련되는데, 이는 대상체 RNA가 분해되거나 또는 아니면 단편화되었을 수 있기 때문이다. 그러므로, 대상체 RNA 분자의 단편을 실제 탐지할 수도 있는데, 이러한 단편은 적절하게 특이적인 프로브를 사용하는 것에 의하여 동정된다.

다른 구현예에서, 개체 내 대장 신생물의 발병 또는 발병에의 소인을 스크리닝하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 개체로부터 유래한 막 미세 소낭 내에서, 다음으로부터 선택되는 유전자로부터 전사된 RNA 전사체의 레벨을 측정하는 것을 포함한다:

(i) 다음으로부터 선택되는 1 이상의 유전자:

(ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

여기서, 대조군 레벨과 비교하여 상기 RNA 전사체 발현 레벨의 증가는 신생물의 발병 또는 발병 소인을 나타낸다.

일 구현예에서, 상기 RNA 전사체는 mRNA이다.

용어 "막 미세소낭"은 세포의 원형질 막 성분으로서 포함되는 임의의 입자를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 막 미세소낭은 원형질 막에 의하여 둘러싸인 루멘의 형태를 취하는 구조를 채택할 수도 있다. 막 미세소낭의 예로는 마이크로파티클, 엑소좀, 아폽토시스성 수포, 아폽토시스 자멸사체, 세포적 수포 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 상기 막 미세소낭은 엑소좀이다.

따라서, 본 발명의 다른 관점은 개체 내 대장 신생물의 발병 또는 발병에의 소인을 스크리닝하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 상기 개체로부터 유래한 엑소좀 시료로부터 다음의 발현 레벨을 측정하는 것을 포함한다:

(i) 하기에서 선택되는 1 이상의 유전자:

(ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

여기서, 대조군 레벨과 비교하여 상기 유전자 발현 레벨의 증가는 신생물의 발병 또는 발병 소인을 나타낸다.

일 구현예에서, 상기 대장 신생물은 결장직장 선종 또는 선암이다.

다른 구현예에서, 상기 유전자 발현 레벨은 mRNA와 같은 RNA 전사물이다.

또 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 유전자의 단백질 발현 산물 또는 그의 단편을 스크리닝하는 것에 관한 것이다.

용어 "엑소좀"은 매우 다양한 세포 타입에 의하여 분비되는 소낭(vesicles)을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 임의의 작용 이론 또는 모드로 제한함이 없이, 늦은 엔도좀 또는 다포성소체는 제한된 엔도좀 막으로부터 소낭이 내부로 버딩 및 절단되는 것에 의하여 이러한 봉합된 나노 소낭으로 형성되는 루멘 내부의 소낭들을 함유한다. 이러한 루멘 내부 소낭들은 그 다음, 원형질 막의 융합에 의한 엑소사이토시스 동안에, 다포성소체 루멘으로부터 세포 외부 환경으로 분비된다. 엑소좀은 막의 분할이 함입하고 엔도사이토시스되는 때에, 세포내부적으로 생성된다. 작은 소낭으로 분열되고 궁극적으로 세포로부터 추방되는 내부화된 분할은 mRNA 및 miRNA와 같은 단백질 및 RNA 분자를 함유한다. 혈장-유래된 엑소좀은 리보좀 RNA를 크게 결여하기 때문에, 그들은 RNA의 원천으로서 유용하며, 결장직장 신생물에서 관찰되는 증가된 유전자의 발현 중 일부가 순환하는 엑소좀 군집 중에 반영된다는 것이 밝혀졌기 때문에 특히 그러하다.

본 발명의 엑소좀은 생물학적 시료로부터 농축된 것이다. "생물학적 시료"란 개체로부터 유래한 임의의 생물학적 물질을 의미한다. 그러한 시료로는 다음의 것들이 제한 없이 포함된다: 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 림프, 뇌척수액, 복수, 타액, 점액, 대변, 생검 표본, 젖, 위액, 늑막액, 정액, 땀, 눈물, 헤어, 질분비물 및 예컨대 폐 세척 이후에 폐로부터 추출한 염수액 또는 관장 세척 후에 되돌아온 용액과 같이 개체의 몸속으로 도입되었다가 그 후 제거된 액체. 본 발명의 방법에 따라 시험되는 생물학적 시료는 시험에 앞서 전처리의 몇몇 형태를 요구할 수도 있고, 직접 시험될 수도 있다. 예를 들어, 시료는 시료를 유동화하기 위하여 완충액과 같은 시약의 첨가를 필요로 할 수도 있다. 시험의 대상이 되는 시료는 신선하게 분리되거나, 또는 시간 내 초기 시점에 분리되고 그 후 보관되거나 아니면 시험에 앞서 처리될 수도 있다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 예를 들어 시료는 시간 내 초기 시점에 수집되고 동결되거나, 아니면 시험 부위로의 운반을 촉진하기 위하여 보존될 수도 있다. 또 다른 예에서, 시료는 가능성 있는 임의의 병원균의 감염을 중화하기 위하여 처리되어, 기술자에로의 감염 전달의 위험을 줄일 수도 있다.

일 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변, 타액, 눈물 또는 복수액 시료이다.

대상 생물학적 시료가 개체로부터 얻어지는 한도까지, 용어 "개체"는 인간 영장류, 가축(예컨대, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀), 실험실 시험 동물(예컨대, 마우스, 래트, 래빗 ,기니아피그), 반려 동물(예컨대, 개, 고양이), 포획된 야생 동물(예컨대, 여우, 캥거루, 사슴), 조류(예컨대, 닭, 거위, 오리, 에뮤, 타조), 파충류 또는 어류를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 좋기로는 대상체 개체는 인간이다.

다른 구현예에서, 상기 유전자는 다음의 1 이상이다:

(i)

(ii) 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

다른 구현예에서, 상기 영역은 다음의 1 이상이다:

(i)

(ii) 코디네이트에 의하여 정의되는 1 이상의 영역:

본 발명의 방법은 상기 유전자 마커의 엑소좀 시료 중에서의 발현을 이러한 유전자들의 대조군 발현과 비교하는 것에 입각한 것이다. "대조군 레벨"이란 "정상 레벨"로서, 정상의 개체로부터 유래한 상응하는 엑소좀 군집에 의하여 발현되는 유전자의 레벨이다.

정상 (또는 "비신생물"의) 레벨은, 이슈가 되는 환자가 아닌 다른 개체로부터 얻어진 개별적 또는 집합적인 결과를 반영하는 표준 결과에 관련된 시험 결과 분석과 같은, 적절한 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 분석 형태는 실제로 선호되는 분석 방법인데, 이는 미리 결정된 표준과 비교하여, 관심 대상 시험 시료인 단일 엑소좀 시료의 수집과 분석을 필요로 하는 키트의 디자인을 가능하게 하기 때문이다. 정상 레벨을 제공하는 표준 결과는 당업계에서 숙련된 자에게 잘 알려진 임의의 적당한 수단에 의하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 엑소좀으로부터 유래한 정상 혈장의 군집은 논의 대상 유전자 마커의 레벨의 관점에서 산정되어, 그에 의하여 표준 값 또는 장래의 모든 시험 시료가 분석되는 값의 범위를 제공할 수 있다. 또한, 정상 레벨은 특정 코호트의 대상체로부터 측정되고 그 코호트로부터 유래한 시험 시료와 관련하여 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 할 것이다. 이에 따라, 연령, 성별, 인종 또는 건강 상태와 같은 특성들이 다른 코호트와 상응하는 수많은 표준값 또는 범위가 측정될 수 있다. 상기 "정상 레벨"은 분리된 레벨 또는 레벨의 범위일 수 있다. 정상 레벨과 비교하여 대상체 유전자 마커의 발현 레벨에서의 증가는 조직이 신생물이라는 것을 나타낸다.

좋기로는, 상기 대조군 레벨은 비신생물의 레벨이다.

본 발명의 이러한 관점들에 따라, 상기 대장 조직은 좋기로는 결장직장 조직이다.

보다 더 좋기로는, 상기 신생물은 결장직장 선종 또는 선암이다.

유전자 마커 전사 생산물이 엑소좀 시료 내에 존재하는 한도에서, 생물학적 시료는 직접적으로 시험될 수도 있고, 또는 엑소좀 시료 내에 존재하는 핵산 물질의 전부 또는 일부를 시험에 앞서 분리할 수도 있다. 이를 위하여, 그리고 앞서 기술된 바와 같이, 상기 유전자 마커의 발현 레벨의 변화를 스크리닝할 때에, RNA 전사체 그 자체 또는 그로부터 전사된 cDNA가 스크리닝 될 수도 있음을 인식할 것이다. 그로부터 유래한 엑소좀 군집 또는 분자를 시험에 앞서 전처리하는 것, 예컨대 살아있는 바이러스의 불활성화 또는 겔에 거는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 엑소좀 시료는 신선하게 수확하거나 또는 시험에 앞서 보관되거나(예컨대 동결하는 것에 의하여) 또는 시험에 앞서 다르게 처리할 수도 있다는 것을 또한 이해하여야 할 것이다.

어떠한 타입의 시료가 본 발명에 기술된 방법에 따른 시험에 가장 적합한지 선택은 상황의 본질에 의존할 것이다.

선종 또는 선암과 같은 신생물의 "발병"에 대한 언급은 형성 이상을 나타내는 개체의 1 이상의 세포를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이와 관련하여, 선종 또는 선암이 잘 발전하여, 형성 이상 세포의 덩어리가 발전할 수도 된다. 또는, 선종 또는 선암이 매우 초기 단계에 있어서 오직 상대적으로 적은 수의 비정상적 세포 분열이 진단 시점에 발생할 수도 있다. 또한 본 발명은 선종 또는 선암과 같은 신생물 발전에 대한 개체의 소인을 산정하는 것까지 확장한다. 본 발명을 그 어떠한 방법으로도 제한함이 없이, 변화된 유전자 마커의 레벨은 하나의 선종 또는 선암 또는 다른 선종 또는 선암의 장래 발전과 같은 신생물의 발전에 대한 개체의 소인을 나타내는 것일 수 있다.

비록 바람직한 방법이 신생물 발전 또는 그에 대한 소인을 진단하는 것이라 할지라도, 예컨대 선종 또는 선암 발전과 같은 신생물 질환을 조절하는 것과 관련된 치료적 또는 예방적 처치의 효과를 모니터하기 위하여, 상기 마커 레벨의 역의 변화의 탐지는 특정 환경 하에서 바람직한 것일 수 있다. 예를 들어, 유전자 마커의 상승된 레벨이 개체가 선종 또는 선암 발전을 특징으로 하는 질환을 발전시켰음을 지시하는 곳에서, 치료적 계획의 착수 후에 이러한 마커 레벨의 감소를 스크리닝하는 것은 대상 개체 질환의 전환 또는 다른 형태의 개선을 나타내기에 유용할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 방법은 신생물 발전의 위험이 있다고 생각되는 이러한 개체의 1회 시험 또는 진행중인 모니터로서, 또는 신생물 발전을 억제하거나 아니면 이를 늦추는 치료적 또는 예방적 처치 계획의 효과에 대한 모니터로서 유용하다. 이러한 환경에서, 엑소좀 중의 유전자 마커 발현 레벨의 조절을 맵핑하는 것은 개체의 상태 또는 현재 사용중인 치료적 또는 예방적 계획의 효과의 가치있는 지시자이다. 이에 따라, 본 발명의 방법은 개체 중의 유전자 마커 발현의 변화를 그들의 정상 레벨(앞서 정의된 바와 같은)과 비교하여 모니터링하는 것, 또는 상기 개체의 생물학적 시료로부터 결정된 1 이상의 초기 마커 발현 레벨과 비교하여 모니터링하는 것까지 확장되는 것으로 이해되어야 한다.

엑소좀 시료는 임의의 적절한 생물학적 시료로부터 유래되거나 또는 그 시료로부터 분리된 것 또는 농축된 것일 수 있다. 분리 또는 농축을 시행하는 방법은 잘 알려져 있으며, 특정 환경에 적절한 방법을 선택하고 적용하는 것은 당업자의 기술 이내에 있다. 예를 들어, 엑소좀은 그들이 일부인 생물학적 시료를 기계적으로 파열시키어, 그 결과 세포 물질이 파열되고 엑소좀 이외에는 효소적으로 제거되도록 하는 것에 의하여 농축될 수 있다. 엑소좀과 비교한 세포의 물리적 특성의 차이로 인하여, 기계적 세포 파열 방법은 그들이 세포를 파열하지만 엑소좀은 파열하지 않는 충분한 힘을 나타내도록 디자인될 수 있다. 이는 엑소좀과 비교하여, 상대적으로 더 큰 세포의 질량과 같은 물리적 특성의 현저한 차이로 인한 것이다. 생물학적 시료를 시험하여, 온전한 세포 또는 엑소좀을 동정하는 방법이 극히 간단하고 평범하기 때문에, 엑소좀이 또한 파열되지 않음을 보장하기 위하여, 기계적 세포 파열을 위한 널리 알려진 표준 기술의 임의의 것을 최적화하는 수단은 통상적인 절차의 문제이다. 유사하게, 새롭게 개발된 임의의 기술을 최적화하는 것 또한 간단한 것이다.

기계적 세포 파열을 얻기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 다음을 제한없이 포함한다;

(i) 원심분리,

(ii) 초음파 분해 (계면활성제의 포함 또는 포함없이),

(iii) 계면활성제 사용을 첨가하거나 첨가하지 않은 비드 밀링, 예컨대 소유리, 세라믹, 지르코늄 또는 스틸 비드,

(iv) 균질화,

(v) 질소 파열 방법(nitrogen burst method),

(vi) 작은 프로브 초음파(small probe ultrasound),

(vii) 저장액 쇼크,

(viii) 고전단성 기계적 방법,

(ix) 회전자-정류자 파열,

(x) 밸브-타입 프로세서,

(xi) 고정된 지오메트리 프로세서,

(xii) 일정한 압력 프로세서,

(xiii) 전기영동 기반 삼투, 및

(xiv) 전기적 투과화.

대상 생물학적 시료가 혈액 또는 혈장 시료이거나, 자연적으로 또는 다르게 진단 대상 분자를 분해하는 효소를 함유하는 다른 생물학적 시료인 한도에서 예컨대, 세포 군집과 관련해서뿐만 아니라, 그 시료 중의 비엑소좀 단백질성 및 비단백질성 물질과 관련하여, 이러한 농축 기술은 엑소좀 군집의 농축을 편리하게 달성할 것이다.

본 발명의 진단 방법이, 관심 대상 유전자 마커의 존재를 탐지하기 위하여 엑소좀 핵산의 증폭 또는 시퀀싱을 필요로 하기 때문에, 앞서 기술한 농축 방법의 사용은 대상 생물학적 시료를 추가로 정제할 필요가 없을 것이라는 것을 의미할 것인데, 이는 핵산 물질을 분석하는 기술이 이에 관하여 선택적이고, 비-엑소좀 핵산 물질이 분해된다면, 정확한 결과가 얻어질 것이기 때문이다. 이러한 농축 방법은, 엑소좀 유래된 핵산의 분석에 앞서, 엑소좀 구조의 손상 없이 원하지 않는 세포 물질의 제거와, 더 나아가 혈장 내에 자연적으로 존재하는 뉴클레아제로 인한 오염시키는 핵산 분자의 분해 모두를 달성한다.

표준 적용에 있어서 이러한 농축 방법이 밀도에 기반하여 시료 내에 요소를 분리하기 위하여 원심력의 응용을 사용할 수 있다 하더라도, 이는 단지 이를 펠렛으로 밀치고 그 다음 엑소좀을 함유하는 상등액을 기울여 수확하는 것이라기보다는, 주로 세포를 선택적으로 파열시키기 위하여 디자인된 것이다. 만일 세포를 파괴하는 적절한 원심력이 사용되지 않는다면, 펠렛으로부터 상등액이 분리된다고 하더라도, 이는 여전히 그들의 핵산 함량을 보유하고 있는 오염시키는 세포를 함유할 수 있다. 그렇다면, 엑소좀 군집을 수확하는 목적이 그것의 RNA를 분석하기 위한 것이기 때문에, 이는 필수적으로 비정상적인 결과를 이끌어낼 것인데, 이는 엑소좀 RNA를 보존하고 수확하도록 디자인된 모든 단계가 용액 중 남아있는 온전한 세포의 RNA를 동등하게 보존하고 수확할 것이기 때문이다. 그러나, 세포를 선택적으로 파괴하는 힘을 적용하는 것에 의하여, 모든 세포는 용해되고 그리하여 엑소좀 군집이 진하게 농축된다. 그러므로, 그러한 어떤 펠렛도 전체 세포를 포함하지 않을 것이기 때문에, 형성될 수 있는 임의의 펠렛으로부터 유래한 상등액을 분리하는 것이 필수적이지 않다. 그러므로, 그와 같은 추가 분리 단계는 불필요한 것이다.

심지어 엑소좀 RNA를 분석하는 것이 추구되는 한도까지, 엑소좀이 용액 중에 분해된 세포 물질과 함께 남아있다는 사실은 그다지 중요하지 않은데, 이는 새롭게 노출된 세포 핵산이, 생물학적 시료 중에 자연적으로 존재하거나 또는 첨가된 효소에 의하여 분해될 것이기 때문이다. 따라서, 추가의 농축 또는 정제는 수행될 필요가 없다. 그러나, 이는 임의의 추가 단계의 수행을 배척하지 않는다는 것이 이해되어야 할 것이다. 예를 들어, 1 이상의 스핀을 수행하여 펠렛을 제거하고, 시료 중에 존재하는 가장 밀집한 입자 물질의 부분을 제거하고, 그 다음에 그로부터 얻어진 상등액에 대하여 진단적 방법을 수행하기를 원할 수도 있다. 그러나, 이러한 특정한 농축 기술의 독특한 장점은 이것이 사실 필수적이 아니라는 것이다. 그럼에도 불구하고, 어떤 타입의 시료를 사용할 것이고 본 진단 방법의 적용에 앞서 그 준비 모드의 성질을 결정하는 것, 더 나아가 농축된 엑소좀 군집을 어떻게 그 다음 농축으로 처리할 것인지를 결정하는 것은 당업계에서 숙련된 자의 기술 이내에 잘 속한다.

앞서 기술한 바와 같이, 기계적 세포 파열 다음에, 용액 중에 몇몇 오염물(즉, 비-엑소좀 분자)이 여전히 남아있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이러한 오염물이 DNA 및 RNA와 같은 핵산 분자인 범위에서, 이들은 용이하게 제거될 수 있다. 이와 유사하게, 단백질 또한 제거될 수 있다. 이는 뉴클레아제 및 프로테아제와 같은 효소의 사용을 통하여 달성될 수 있다. 엑소좀 자체가 그들의 핵산 또는 단백질 함량을 산정하는 목적을 위하여 용해되지 않은 경우에, 이는 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 시료를 추가로 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 이를 위하여, 적어도 혈장 시료 중에서는, 오염시키는 세포의 파괴 및 그 다음 기계적 파열 단계로 인하여 방출된 시토졸 유래 RNA와 같은 자유 RNA를 분해하기 위한 충분한 리보뉴클레아제가 존재한다는 것이 관찰되었다. 이러한 방법이, 비록 세포는 아니더라도 엑소좀의 완전성이 유지된다는 것을 담보하기 때문에, 엑소좀 내에 함유된 RNA가 최종 관심대상인 한도까지, 이는 오염시키는 자유 RNA를 제거하여 그 결과 엑소좀에서 유래된 RNA 분석에서 얻어지는 결과를 정확하게 하는 편리한 수단을 제공한다. 기능적 뉴클레아제(DNAses 또는 리보뉴클레아제), 또는 심지어 단백질 분해 효소가 시료 내에 자연적으로 존재하는 양이 불충분한 경우, 기계적 세포 파열 과정을 시작하기 전에 또는 과정 도중과 같은 적절한 임의의 시점에, 이러한 분자를 시료 속으로 도입할 수 있다.

엑소좀을 정제하는 다른 방법은 밀도 기반 분리 기법, 여과 또는 막 항원-특이적 친화적 분리법과 같은 잘 알려진 선행 기술들을 포함한다.

엑소좀 내의 mRNA를 분리하고 분석하는 것을 추구하는 한도에서, 예를 들어 유전자 마커 발현 레벨의 변화를 산정하기 위하여, 엑소좀을 용출시키어 그 핵산 함량을 노출시키고, 그 다음 핵산 분자의 mRNA 서브 군집을 분석하는 것이 요구된다. 이를 위하여, 엑소좀 RNA의 분석은 총 RNA를 분리하고 그 다음 관심 대상 특정 전사체의 PCR 증폭하는 것에 기초한다. 총 RNA를 분리하고 분석하는 방법은 잘 알려져 있다.

엑소좀으로부터 총 RNA를 분리하는 데 사용될 수 있고 사용되어 온 광범위한 다양한 방법이 존재한다. 그와 같은 엑소좀으로부터 총 RNA를 분리하는 첫 번째 단계는 변성 조건 하에서 엑소좀을 깨뜨려 여는 것이다. 활용되는 방법은 세포로부터 RNA를 분리하는데 사용되는 방법을 반영한다. 시르그윈 등(Chirgwin et al . Biochemistry, 18(24):5294-9, 1979)은 0.1 M 2-메르캅토에탄올을 포함하는 단백질 변성 구아니디늄 티오시아네이트의 4 M 용액 중에 균질화시키어 단백질 이황화 결합을 파괴하는 것에 의하여, 총 RNA를 분리하는 효과적인 방법을 개발하였다. 그 다음, 시르기윈은 에탄올 추출 또는 염화세슘을 통한 초원심분리에 의하여 RNA를 분리하였다. 콤크진스키 및 사키(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162(1):156-9, 1987)는 이 방법을 변형하여, 구아니디늄 티오시아네이트 및 페놀-클로로포름의 혼합물을 사용하는 신속한 단일 단계 추출을 개발하였는데, 이 방법은 다수의 시료를 가공하거나 또는 소량의 세포 또는 조직으로부터 RNA를 분리하는데 특히 유용하다.

현재 이용가능한 많은 키트는, 최적화된 결과를 위하여 구아니디늄 티오시아네이트 및 페놀-클로로포름의 전매 특허 혼합물을 사용하는 이러한 두 가지 기법에 기반한 것이다. 계면활성 용해 및 친화성 매트릭스에의 흡착에 의하여 대체되는 유기 추출과 같은 대안적인 용해 방법이 또한 사용될 수 있다.

분리된 핵산에의 접근은 세포 용해 및 세포 뉴클레아제의 불활성화를 필요로하는데, 이 방법은 세포를 깨뜨려 열기에 충분하게 가혹하면서도 온전한 핵산을 야기할 만큼 충분히 온화하여야만 한다. 이는 기계적으로 균질화에 의하여 또는 화학적으로 계면활성 용해 또는 카오트로픽(chaotropic) 제제에 의하여 달성될 수 있다. 대부분의 절차에서, 용해 및 불활성화는 단일 용액에 의하여 달성된다. 예를 들어, 분자 연구 센터(Molecular Research Center Inc.)에 의하여 제조되고, 생명 공학 메세지마커 mRNA 분리시스템(Life Technologies의 MessageMaker^® mRNA Isolation System)에 의하여 사용되는 TRIzol 시약은 산성 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트의 혼합물이다. 조직 시료는 TRIzol 중에서 용해되고, 총 RNA는 클로로포름 추출 및 이소프로판올 침전에 의하여 얻어진다. 유사하게, 바이오텍스 실험실(BIOTECX Laboratories Inc.)의 ULTRASPEC^® RNA 분리 키트에 사용되는 카오솔브(Chaosolv)는 구아니딘 염과 유레아의 14 M 용액인데, 이는 변성 제제로서 작용하며, 페놀 및 다른 계면활성제와 함께 사용된다.

통상의 방법으로는 RNA를 분리하기가 어려운 세포 및 조직을 위하여, Bio101은 패스트프렙(FastPrep) 시스템을 제공한다. 이 시스템은 수초의 시간 이내에 조직 균일화, 세포 용해 및 RNA 안정화를 동시에 수행하기 위하여, 신속한 왕복 펌프와 매트릭스 및 카오트로픽(chaotropic) 제제의 조합을 사용하는 벤치탑(benchtop) 기구에 기반한 것이다. 용해 매트릭스의 신속한 교반은 넓은 범위의 물질의 효과적인 용해를 야기한다. 특정 세포 및 조직 형태로부터 RNA를 분리하도록 디자인된 각각의 FastRNA^® 키트는 다음과 같은 다른 용해 매트릭스를 함유한다: 실리카 입자(박테리아), 세라믹 입자(이스트, 균류 및 조류) 및 지르코늄 입자(식물 및 동물 조직).

실리카- 또는 유리-계 매트릭스 또는 필터는 RNA의 선택적인 흡수를 위한 인기있는 선택이다. 총 RNA는 일반적으로 용해물로부터의 추출을 위하여 유기 용매의 사용을 피할 수 있게 하는 카오트로픽 염의 존재하에서 매트릭스 또는 필터에 결합한다.

앰비온의 RNAqueous 시스템은 RNA의 유리-섬유 필터에의 결합에 의존한다. 소규모 적용을 위하여 디자인된 표준 RNAqueous 키트에서, 필터는 마이크로퓨즈 튜브 내의 필터 카트리지 내에 위치한다. 용액은 원심분리 또는 진공 하에 의하여 필터를 통과한다. 더 큰 적용을 위하여, 필터는 RNAqueous-MIDI 키트 내의 루어록 시린지 필터 내에 위치한다. 용액은 10- 또는 20-ml 시린지를 사용하여 밀려서 유리-섬유 필터를 통과한다. 몇 가지 시료를 한번에 가공하기 위하여, 시린지 필터 유닛은 진공 매니폴드 상에 장착될 수 있다.

Bio101의 RNaid 플러스 키트는 전매 특허의 실리카 겔 계 RNAMATRIX^®를 함유한다. RNA가 RNAMATRIX에 결합하기에 앞서, 이 프로토콜은 용해액의 산 페놀 추출을 필요로 한다. RNA 결합은 배치 형태이고, 스핀 모듈을 사용하여 매트릭스로부터 용출된 RNA를 분리한다.

역 결합 전략을 사용하여, Bioline Ltd의 RNAce 키트는 오염시키는 DNA의 미네릴 캐리어로의 결합에 의하여, 세포 용해액으로부터 RNA를 추출하는데 사용된다. 얻어진 상등액은 오염시키는 DNA로부터 유출된 분해되지 않은 RNA를 함유한다.

CLONTECH는 NucleoSpin^®RNA II 및 NucleoTrap mRNA 키트를 제공하는데, 이 둘은 모두 실리카 지지체를 통한 RNA의 전제에 기반하고 있다. NucleoSpin 컬럼은 카오트로픽 염의 존재 하에서 DNA 및 RNA와 결합하는 독특한 실리카 막을 함유한다. DNA는 DNase I를 직접적으로 컬럼에 첨가하는 것에 의하여 조제물로부터 제거된다. NucleoTrap은 RNA에 결합하는 현탁액 중에 활성화된 구형의 실리카 매트릭스이다.

S.N.A.P.는 인비트로겐(Invitrogen Corp)에서 구입가능한 실리카계 레진이다. S.N.A.P. 총 RNA 분리키트에서, 레진은 막/컬럼 형태로 오는데, 이는 효과적인 복합 시료 절차를 가능하게 한다.

생명공학사(Life Technologies)의 GLASSMAX RNA 분리 스핀 카트리지는 RNA에 결합하는 음전하를 띤 실리카 매트릭스를 함유한다. 세포는 구아니딘 이소티오시아네이트 중에서 용해되고, 시료는 산 나트륨 용액 중에 현탁된다. 이는 스핀 카트리지에 적용되는데, 그 다음 이로부터 결합된 RNA가 용출된다.

QIAGEN의 RNeasy 키트는 구아니디늄 티오시아네이트 용해의 장점을 실리카 겔 막을 통한 신속한 정제와 결합시킨 것이다. 복합 적용을 수용하기 위하여, 막은 다양한 크기의 스핀 컬럼 및 96-웰 플레이트 내에 위치한다. RNeasy 96 절차는 진공 매니폴드, 원심분리를 사용하여 매뉴얼적으로 수행될 수 있고, BioRobot 9604 상에 자동화될 수 있다. 식물 조직으로부터 RNA 수율을 증가시키기 위하여, RNeasy 식물 미니 키트 내에 QIAshredder 컬럼을 포함시킨다. 이들 컬럼은 RNeasy 스핀 컬럼의 사용에 앞서, 식물 및 균류의 점성의 용해액의 균질화 및 여과를 위하여 사용된다.

로쉐 분자 바이오케미칼사의 하이 퓨어 RNA 분리 키트는 스핀-필터 튜브 내에 유리-섬유 플리스(fleece)를 채택하여 총 핵산에 결합하게 한다. 공동 정제된 DNA는 궁국적으로 DNase I-소화 단계에 의하여 소화된다. 키트는 배양된 세포, 조직 및 바이러스로부터 RNA를 분리하기 위하여 이용가능하다.

StrataPrep 총 RNA 미니프렙 키트는 넓은 범위의 시료 양으로부터 다양한 조직 및 세포로부터 총 RNA를 분리한다. 소량의 RNA를 필요로 하는 실험을 위하여 디자인되면서, RT-PCR을 위하여 총 RNA를 제조하는데 이상적이도록 하는 특이적 DNA 제거 단계가 프로토콜에 포함된다. 마이크로스핀-컵 형태는 다수의 시료를 동시에 처리하는 것을 가능하게 한다.

자성 분리는 RNA를 분리하는 신속한 수단을 제공한다. 초상자성 입자는 폴리스티렌 또는 산화철 및 다당류와 같은 다수의 물질로부터 유래될 수 있는데, 이는 자기장 내에 위치시킨 경우는 자성을 갖지만, 자기장으로부터 제거된 경우에는 잔여 자성을 보유하지 않는다. 이러한 잔여 자성의 결여는 자기적으로 유도된 응집 없이, 입자가 반복적으로 분리되고 재현탁될 수 있게 보장한다.

어드밴스 바이오테크놀로지(Advanced Biotechnologies)의 RiboMag 총 RNA 분리 키트는 총 RNA의 분리를 위하여 자기 분리와 실리카 흡착을 결합한 것이다. 비페놀 용해 단계 및 펠렛 세포 벽으로의 큇 스핀 다음에, 상등액을 자기 실리카와 혼합한다. 10mg을 넘는 양에 대하여, 자기 분리는 알코올 침전으로 대체될 수도 있다. 자기 분리기는 10 또는 20개 1.5-ml 튜브 및 96-웰 플레이트에 대하여 이용가능하다. 어드밴스 바이오테크놀로지는 또한, 조직, 세포, 박테리아, 식물, 이스트 및 생물학적 유체로부터 총 RNA를 단일 단계로 분리하기 위한, 페놀 구아니딘계 총 RNA 분리 시약(TRIR)을 제공한다.

그러나, 총 RNA가 단지 mRNA 이상의 것을 포함한다는 것을 염두에 두면, 그것이 단지 총 RNA의 작은 성분을 형성하는 경우에-특히 관심 대상 특정 mRNA가 매우 낮은 복제 수로 존재하는 경우에, mRNA의 특이적 분석이 이상적이지 않을 수 있다.

이를 위하여, 엑소좀-유래된 mRNA가 전체 길이를 가지고 폴리아데닐화될 수 있다는 것이 최근에 밝혀지었기 때문에, 이는 폴리 (A) 꼬리를 표적화하는 것에 근거하여 엑소좀 mRNA을 특이적으로 분리하는 방법을 개발하는 것이 가능해졌다. 폴리아데닐화된 RNA를 표적화하고 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 용이하고도 통상적으로 적용된다.

본 진단 방법의 RNA 증폭 및 프로브 단계는 프라이머의 사용에 의존한다. 용어 "프라이머" 또는 "올리고뉴클레오타이드 프라이머"는 그 기능이 관심 대상 핵산 분자의 영역에 혼성화 하는 것을 포함하는 것인, 뉴클레오타이드의 서열 또는 그의 기능적 유도체 또는 유사체를 포함하는 임의의 분자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 프라이머는 비-핵산 성분을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 프라이머는 형광 또는 효소 태그 또는 프로브로서 분자의 사용을 촉진하거나 아니면 그의 탐지 또는 고정화를 촉진하는 몇 가지 다른 비-핵산 성분과 같은 비-핵산 태그를 또한 포함할 수도 있다. 프라이머는 또한, 이하에서 더 상세하게 논의되는 올리고뉴클레오타이드 태그와 같은 추가의 핵산 성분을 포함할 수도 있다. 다른 예에서, 프라이머는 핵산 측쇄를 나타내는 펩타이드 백본을 포함하는 단백질 핵산일 수도 있다.

본 발명에의 사용에 적합한 프라이머의 디자인 및 합성은 당업계에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 일 구현예에서, 대상 프라이머는 그 길이가 4 내지 60 뉴클레오타이드이고, 다른 구현예에서는 그 길이가 10 내지 50, 또 다른 구현예에서는 그 길이가 15 내지 45, 또 다른 구현예에서는 그 길이가 20 내지 40, 또 다른 구현예에서는 그 길이가 25 내지 35 뉴클레오타이드이다. 또 다른 구현예에서, 프라이머는 약 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34 뉴클레오타이드 길이이다.

관련된 유전자 발현 레벨을 측정하기 위하여, 다양한 기술이 증폭 산물 분석을 위해 사용될 수 있다. 사용의 용이성 또는 민감도와 같은 그들의 작동적 특성은 다양하여, 다양한 기술들이 다양한 목적을 위하여 유용할 수 있다. 그들은 다음을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다:

시퀀싱

파이로시퀀싱

효소적 소화

마이크로어레이 분석

변성 구배 겔 전기영동

아가로스 겔 기반 분리

실시간 PCR 사이클러 상의 멜트 커브 분석

정량적 실시간 PCR

변성 고성능 액체 크로마토그래피

질량분석

프라이머 확장

올리고뉴클레오타이드-리게이션

변이 특이적 중합효소 연쇄 반응

변성 구배 전기영동(DGGE)

온도 구배 변성 전기영동

일정한 변성 전기영동(Constant denaturing electrophoresis)

단일 가닥 컨포메이션 전기영동

변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC)

단백질 발현 산물을 탐지하는 관점에서, 생물학적 시료 내 단백질성 발현 산물에 대한 시험은 당업계에서 숙련된 자에게 잘 알려진 적절한 다수의 방법 중 어느 하나에 의하여 수행될 수 있다. 적절한 방법의 예로는 웨스턴 블롯, ELISA, 면역조직화학 또는 유세포 분석 절차의 맥락과 같은 항체 기반 스크리닝을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 물론 이들은 전통적인 경쟁적 결합 분석에서뿐만 아니라, 비경쟁적 타입의 일측 및 2측 또는 샌드위치 분석을 포함한다. 이들 분석은 또한 표적에 표지된 항체가 직접적으로 결합하는 것을 포함한다.

이하에서 기술되는 유전자 마커 발현 레벨의 스크리닝을 위한 적절한 방법을 선별하고 적용하는 것은 당업계에서 통상의 기술을 가진자의 기술 범위 이내에 잘 속한다.

도 1은 인간 혈장 중 GAPDH 레벨의 도해적 표현이다(n = 398).
도 2는 직장결장 신생물 환자로부터 유래한 혈장으로부터 KIAA1199가 보다 빈번하게 탐지되었음을 보여주는 도해적 표현이다(45명 환자 패널이 표시됨).

본 발명은 하기의 비 제한적인 실시예를 언급하는 것에 의하여 더 기술된다.

실시예 1

혈장 표본 내 유전자 마커의 탐지가능성을 시험하기 위하여, 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)으로부터 상업적으로 이용가능한 TaqMan 분석을 구입하였다. 42개 매치된 정상 표본 및 톱니 모양 선종의 인간 ST 엑손 1.0 마이크로어레이 연구에 의하여 지시받아, 즉 정상 및 선종 결장 표본 간 가장 큰 배수 변화를 나타내는 엑손을 향하여, PCR 앰플리콘의 로케이션(즉, 엑손-엑손 교차점)을 위치시켰다.

혈장 2 mL로부터 추출한 RNA(RNA:cDNA 1:1)로부터 유래한 cDNA 2.5 uL에 대하여, 46개 유전자(부록 1 및 2에 적색/녹색 표시된 유전자)를 표적화하는 총 68 TaqMan 분석을 사용하였다. 9 mL K3-EDTA 진공 채혈기 튜브 내에 수집한 전혈의 2회 연속 원심분리 단계(1,500g, 10분, 4degC)에 의하여 혈장을 준비하였다. 15명의 정상 환자, 15명의 대장결장 선종 환자 및 15명의 대장결장암 환자(결장경 검사에 의하여 취득한 표현형)로부터 유래한 45개 혈장 표본의 적어도 하나의 패널에 대하여 TaqMan 분석을 시험하였다. 표 1(그리고 표 2 및 3)은 46개 독특한 유전자로부터 유래한 RNA 신호를 요약한 것이다.

혈장 내 조직 mRNA의 탐지가능성은 대장결장암 조직 표본 중에서 관찰되는 발현 레벨과 상관관계가 없다는 것이 표 2로부터 명백하다. 예를 들어, 비-신생적 대조군과 비교하여 신생적 결장 조직 표본 내 다르게 발현되는 상위 5개 유전사 중에서, 3개의 전사물, 즉 DPEP1, MMP7 및 CDH3이 심지어 매우 민감한 방법론을 사용하여서도 대장결장암 환자로부터 얻어진 인간 혈장 중에서 탐지되지 않았다. 역으로, 정상 및 신생적 표본 간에 오직 상대적으로 적은 발현 차이를 나타내는 이들 결장직장 조직 바이오마커의 몇몇은, 예컨대 CRNDE 및 OLFM4는 혈장 표본 중에서 쉽게 탐지되었다.

앰플리콘 위치(즉, PCR 분석에 의하여 어떠한 엑손-엑손 교차점이 증폭되는지), 앰플리콘 크기(더 큰 앰플리콘이 PCR 증폭하기가 더 어렵다), PCR 분석법에 의하여 증폭된 스플라이스 변이체의 수, 염색체 가닥 및 염색체 위치, mRNA의 크기 및 mRNA의 세포 내 위치와 같은 인자를 연구하였다. 혈장 내 mRNA의 탐지 가능성과 비교하여 이들 인자 간 그 어떠한 상관관계도 발견되지 않았다.

그러나, 발견된 예상치 못하고도 놀라운 상관관계는, 추정되는 엑소좀 함량을 가진 몇몇 mRNA 표적의 혈장 탐지가능성 사이의 상관관계였다. 이는 (놀랍게도) 다른 것들은 그러지 않는 반면에, 결장직장 신생물 중 발현이 증가되는 몇몇 유전자 마커가 엑소좀 중 현저하게 증가된 레벨로 실제로 탐지가능하다는 결정을 이끌어 낸다.

실시예 2

실험재료 및 방법

임상적 표본

플린더 의학 센터(Flinders Medical Center; Adelaide, 호주) 또는 임상적 표본 벤더(Proteogenex, 미국)와의 공동 작업을 통하여, 건강한 기증자(136), 선종 환자(124, 임의 등급) 및 암 환자(138, 임의 등급)로부터 유래한 혈액 표본을 확보하였다. 모든 표본에 대하여 결장경 검사 및 병리학적 검사에 의하여, 결장직장 신생적 상태를 확인하였다. 2 x 1,500g 스핀 프로토콜을 사용하여 혈액 채취 4시간 이내에, 전혈 정맥절개술 표본(K3EDTA 진공 채혈기)으로부터 혈장을 발생시켰다.

플라스마 RNA 채취, cDNA 라이브러리의 발생 및 채취 품질 대조군

QIAamp 순환 핵산 채취 키트(Qiagen, 호주)를 사용하여 2 mL 혈장 분량으로부터 RNA를 채취하고, 최종 부피 100 pL 중으로 용출시켰다. 표본 간 핵산 추출 효율 차이를 평준화하기 위하여, RNA 분리에 앞서 각 혈장 표본 중으로 arRNA 엔테로바이러스(Asuragen, US)를 접종하였고, 추출 절차의 다운스트림에 회복을 측정하였다. RNA 10 μL를 cDNA 반응물 20 μL(SuperScript^®, 인비트로겐, 미국)로 변환시키는 것에 의하여 10개의 뚜렷한 cDNA 패널(각각은 15개 건강한 기증, 15개 선종 및 15개 암을 포함)이 발생되었다.

qRT - PCR 에 의한 혈장 mRNA 발현 분석

48개의 독특한 유전자를 표적화하는 Taqman 유전자 발현 분석(어플라이드 바이이오시스템, 미국)을 사용하여 조직 대 혈장 발현 휴대성을 시험하였다. 분석은 환자 당 cDNA 2.5 μL에 대하여 3회 수행하였다. '정상' 표본에 대한 배지 Ct 값에 대하여 비교한 환자 평균 Ct 값(수집된 arRNA)으로서, 환자 배수 변화를 계산하였다.

혈장- 탐지성 vs . 비탐지성 mRNA 전사체 분석

서술자 공변자(예컨대, 앰플리콘 길이, 염색체 위치, GC-함량 등)의 범위에 걸쳐, 혈장 내 탐지가능한 mRNA 서브세트를 혈장에서 탐지 불가능한 mRNA 전사체에 대하여 비교하였다. 특히, 인간 및 뮤린 조직 세포의 범위로부터 유래된 엑소좀 중에서 특정 mRNA 또는 단백질이 탐지가능한 것으로 관찰된다는 증거에 대한 mRNA 발현의 대응을 분석하였다.

실험결과

(1) 총 RNA 는 혈장 표본으로부터 용이하게 추출된다.

상업적으로 이용가능한 TaqMAN 유전자 발현 GAPDH 분석 Hs99999905_m1(Applied Biosystems, USA)를 사용하여, 분석된 398개 혈장 표본(Ct 평균 30.21; 95% CI: 27.5 내지 32.9) 모두에서 GAPDH가 탐지되었다.

(2) 혈장 중 탐지가능성과 결장 조직 중 바이오마커 발현 사이의 상관관계

시험된 46개의 다른 유전자 중, 21개가 그 어떠한 혈장 표본 중에서도 탐지가능한 RNA 신호를 보이지 않은 반면에, 22개는 탐지가능하였지만 암과 비신생적 대조군 혈장 간 다르게 발현되지 않았다. 조직 중 확인된 오직 3개의 mRNA 바이오마커만이 비신생적 대조군과 비교하여 신생적 혈장 중에서 더 높은 농도에서 마찬가지로 발현되었다.

(3) 신생적 표본에서 상승된 혈장 중 KIAA1199 mRNA 레벨

세 배수의 3개 중 2개가 양성적인 qRT-PCR 신호를 나타낸 경우 지시된 시료의 표준에 양성을 적용할 때, 평균 민감도 74% (CI: 58-90%) 및 특이성 66% (CI: 45-87%)를 가지는, 총 96명 건강한 기증자 및 95명 결장 직장 선종 및 99명 암 환자를 포함하는 6개의 cDNA 혈장 라이브러리 중에서 KIAA1199를 탐지하기 위하여, 상업적으로 이용가능한 TaqMAN 유전자 발현 KIAA1199 분석인 Hs01552116_m1을 사용하였다.

(4) 조직 바이오마커의 탐지가능성은 미소낭포( microvesicles ) 내의 외관과 관련이 있다.

인자의 범위를 연구하였지만, 조직 대 혈액 존재 상관관계의 결여, 예컨대 앰플리콘 크기/위치, %GC, 증폭된 스플라이스 변이체의 수, 전사체 크기 등을 설명하지 못하였다. 그러나, 혈장 내 RNA 탐지와 엑소좀 발현의 증거 사이의 증거가 밝혀지었다. 이것이 비록 엑소좀 단백질 및 RNA의 데이터베이스인 엑소카르타(ExoCarta) 데이터베이스 중에 제공되는 정보와 완전하게 상응하는 것은 아니었지만 그러하였다. 특히, 혈장 내 PCR-증폭가능한 신호가 없는 유전자의 약 30%가 그럼에도 불구하고, 엑소카르타 데이터베이스 중에 열거된 반면에, 혈장 내 탐지 가능하였던 유전자의 약 30%가 이 데이터베이스 중에 나타나지 않았다. 이는 이 데이터베이스가 비인간 세포주 데이터로부터 유래하였다는 것에 의하여 설명될 수 있으며, 이러한 결과의 비 예측적인 성질과 이러한 데이터베이스의 활용은 주의를 가지고 다루어야 한다는 사실을 나타낸다.

당업계에서 숙련된 자들은 본 명세서에 기술된 발명이, 특히 기술된 것 이외의 변형 및 수정을 받아들일 수 있다는 사실을 인식할 것이다. 본 발명은 그와 같은 변형 및 수정 모두를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 또한 본 발명은 본 명세서에 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 지시된, 단계, 특징, 조성 및 화합물 모두를 포함하며, 상기 단계 또는 특징의 임의의 2 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.

표 1:

상업적으로 이용가능한 TaqMan 분석 사용에 근거하여 혈장에서 얻어진 신호들

표 2:

상향조절된 유전자 마커(유효 및 >2배 상향조절)

표 3: 혈장에서 스크리닝 된 다른 마커들

표 4:

표 5:

서지사항

시르그윈 등(Chirgwin et al . Biochemistry, 18(24):5294-9, 1979)

콤크진스키 등(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162(1):156-9, 1987).

SEQUENCE LISTING <110> Clinical Genomics Pty. Ltd. LAPOINTE, Lawrence C (US only) PEDERSEN, Susanne K (US only) <120> A METHOD OF DIAGNOSING NEOPLASMS <130> 35108339/TDO <150> US 61/483028 <151> 2011-05-05 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1361 <212> PRT <213> homo sapien <400> 1 Met Gly Ala Ala Gly Arg Gln Asp Phe Leu Phe Lys Ala Met Leu Thr 1 5 10 15 Ile Ser Trp Leu Thr Leu Thr Cys Phe Pro Gly Ala Thr Ser Thr Val 20 25 30 Ala Ala Gly Cys Pro Asp Gln Ser Pro Glu Leu Gln Pro Trp Asn Pro 35 40 45 Gly His Asp Gln Asp His His Val His Ile Gly Gln Gly Lys Thr Leu 50 55 60 Leu Leu Thr Ser Ser Ala Thr Val Tyr Ser Ile His Ile Ser Glu Gly 65 70 75 80 Gly Lys Leu Val Ile Lys Asp His Asp Glu Pro Ile Val Leu Arg Thr 85 90 95 Arg His Ile Leu Ile Asp Asn Gly Gly Glu Leu His Ala Gly Ser Ala 100 105 110 Leu Cys Pro Phe Gln Gly Asn Phe Thr Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Ala 115 120 125 Asp Glu Gly Ile Gln Pro Asp Pro Tyr Tyr Gly Leu Lys Tyr Ile Gly 130 135 140 Val Gly Lys Gly Gly Ala Leu Glu Leu His Gly Gln Lys Lys Leu Ser 145 150 155 160 Trp Thr Phe Leu Asn Lys Thr Leu His Pro Gly Gly Met Ala Glu Gly 165 170 175 Gly Tyr Phe Phe Glu Arg Ser Trp Gly His Arg Gly Val Ile Val His 180 185 190 Val Ile Asp Pro Lys Ser Gly Thr Val Ile His Ser Asp Arg Phe Asp 195 200 205 Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Glu Ser Glu Arg Leu Val Gln Tyr Leu Asn 210 215 220 Ala Val Pro Asp Gly Arg Ile Leu Ser Val Ala Val Asn Asp Glu Gly 225 230 235 240 Ser Arg Asn Leu Asp Asp Met Ala Arg Lys Ala Met Thr Lys Leu Gly 245 250 255 Ser Lys His Phe Leu His Leu Gly Phe Arg His Pro Trp Ser Phe Leu 260 265 270 Thr Val Lys Gly Asn Pro Ser Ser Ser Val Glu Asp His Ile Glu Tyr 275 280 285 His Gly His Arg Gly Ser Ala Ala Ala Arg Val Phe Lys Leu Phe Gln 290 295 300 Thr Glu His Gly Glu Tyr Phe Asn Val Ser Leu Ser Ser Glu Trp Val 305 310 315 320 Gln Asp Val Glu Trp Thr Glu Trp Phe Asp His Asp Lys Val Ser Gln 325 330 335 Thr Lys Gly Gly Glu Lys Ile Ser Asp Leu Trp Lys Ala His Pro Gly 340 345 350 Lys Ile Cys Asn Arg Pro Ile Asp Ile Gln Ala Thr Thr Met Asp Gly 355 360 365 Val Asn Leu Ser Thr Glu Val Val Tyr Lys Lys Gly Gln Asp Tyr Arg 370 375 380 Phe Ala Cys Tyr Asp Arg Gly Arg Ala Cys Arg Ser Tyr Arg Val Arg 385 390 395 400 Phe Leu Cys Gly Lys Pro Val Arg Pro Lys Leu Thr Val Thr Ile Asp 405 410 415 Thr Asn Val Asn Ser Thr Ile Leu Asn Leu Glu Asp Asn Val Gln Ser 420 425 430 Trp Lys Pro Gly Asp Thr Leu Val Ile Ala Ser Thr Asp Tyr Ser Met 435 440 445 Tyr Gln Ala Glu Glu Phe Gln Val Leu Pro Cys Arg Ser Cys Ala Pro 450 455 460 Asn Gln Val Lys Val Ala Gly Lys Pro Met Tyr Leu His Ile Gly Glu 465 470 475 480 Glu Ile Asp Gly Val Asp Met Arg Ala Glu Val Gly Leu Leu Ser Arg 485 490 495 Asn Ile Ile Val Met Gly Glu Met Glu Asp Lys Cys Tyr Pro Tyr Arg 500 505 510 Asn His Ile Cys Asn Phe Phe Asp Phe Asp Thr Phe Gly Gly His Ile 515 520 525 Lys Phe Ala Leu Gly Phe Lys Ala Ala His Leu Glu Gly Thr Glu Leu 530 535 540 Lys His Met Gly Gln Gln Leu Val Gly Gln Tyr Pro Ile His Phe His 545 550 555 560 Leu Ala Gly Asp Val Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Asp Pro Pro Thr Tyr 565 570 575 Ile Arg Asp Leu Ser Ile His His Thr Phe Ser Arg Cys Val Thr Val 580 585 590 His Gly Ser Asn Gly Leu Leu Ile Lys Asp Val Val Gly Tyr Asn Ser 595 600 605 Leu Gly His Cys Phe Phe Thr Glu Asp Gly Pro Glu Glu Arg Asn Thr 610 615 620 Phe Asp His Cys Leu Gly Leu Leu Val Lys Ser Gly Thr Leu Leu Pro 625 630 635 640 Ser Asp Arg Asp Ser Lys Met Cys Lys Met Ile Thr Glu Asp Ser Tyr 645 650 655 Pro Gly Tyr Ile Pro Lys Pro Arg Gln Asp Cys Asn Ala Val Ser Thr 660 665 670 Phe Trp Met Ala Asn Pro Asn Asn Asn Leu Ile Asn Cys Ala Ala Ala 675 680 685 Gly Ser Glu Glu Thr Gly Phe Trp Phe Ile Phe His His Val Pro Thr 690 695 700 Gly Pro Ser Val Gly Met Tyr Ser Pro Gly Tyr Ser Glu His Ile Pro 705 710 715 720 Leu Gly Lys Phe Tyr Asn Asn Arg Ala His Ser Asn Tyr Arg Ala Gly 725 730 735 Met Ile Ile Asp Asn Gly Val Lys Thr Thr Glu Ala Ser Ala Lys Asp 740 745 750 Lys Arg Pro Phe Leu Ser Ile Ile Ser Ala Arg Tyr Ser Pro His Gln 755 760 765 Asp Ala Asp Pro Leu Lys Pro Arg Glu Pro Ala Ile Ile Arg His Phe 770 775 780 Ile Ala Tyr Lys Asn Gln Asp His Gly Ala Trp Leu Arg Gly Gly Asp 785 790 795 800 Val Trp Leu Asp Ser Cys Arg Phe Ala Asp Asn Gly Ile Gly Leu Thr 805 810 815 Leu Ala Ser Gly Gly Thr Phe Pro Tyr Asp Asp Gly Ser Lys Gln Glu 820 825 830 Ile Lys Asn Ser Leu Phe Val Gly Glu Ser Gly Asn Val Gly Thr Glu 835 840 845 Met Met Asp Asn Arg Ile Trp Gly Pro Gly Gly Leu Asp His Ser Gly 850 855 860 Arg Thr Leu Pro Ile Gly Gln Asn Phe Pro Ile Arg Gly Ile Gln Leu 865 870 875 880 Tyr Asp Gly Pro Ile Asn Ile Gln Asn Cys Thr Phe Arg Lys Phe Val 885 890 895 Ala Leu Glu Gly Arg His Thr Ser Ala Leu Ala Phe Arg Leu Asn Asn 900 905 910 Ala Trp Gln Ser Cys Pro His Asn Asn Val Thr Gly Ile Ala Phe Glu 915 920 925 Asp Val Pro Ile Thr Ser Arg Val Phe Phe Gly Glu Pro Gly Pro Trp 930 935 940 Phe Asn Gln Leu Asp Met Asp Gly Asp Lys Thr Ser Val Phe His Asp 945 950 955 960 Val Asp Gly Ser Val Ser Glu Tyr Pro Gly Ser Tyr Leu Thr Lys Asn 965 970 975 Asp Asn Trp Leu Val Arg His Pro Asp Cys Ile Asn Val Pro Asp Trp 980 985 990 Arg Gly Ala 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Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gln 1190 1195 1200 Leu Lys Thr Lys Asp His Phe Leu Glu Val Lys Met Glu Ser Ser 1205 1210 1215 Lys Gln His Phe Phe His Leu Trp Asn Asp Phe Ala Tyr Ile Glu 1220 1225 1230 Val Asp Gly Lys Lys Tyr Pro Ser Ser Glu Asp Gly Ile Gln Val 1235 1240 1245 Val Val Ile Asp Gly Asn Gln Gly Arg Val Val Ser His Thr Ser 1250 1255 1260 Phe Arg Asn Ser Ile Leu Gln Gly Ile Pro Trp Gln Leu Phe Asn 1265 1270 1275 Tyr Val Ala Thr Ile Pro Asp Asn Ser Ile Val Leu Met Ala Ser 1280 1285 1290 Lys Gly Arg Tyr Val Ser Arg Gly Pro Trp Thr Arg Val Leu Glu 1295 1300 1305 Lys Leu Gly Ala Asp Arg Gly Leu Lys Leu Lys Glu Gln Met Ala 1310 1315 1320 Phe Val Gly Phe Lys Gly Ser Phe Arg Pro Ile Trp Val Thr Leu 1325 1330 1335 Asp Thr Glu Asp His Lys Ala Lys Ile Phe Gln Val Val Pro Ile 1340 1345 1350 Pro Val Val Lys Lys Lys Lys Leu 1355 1360 <210> 2 <211> 510 <212> PRT <213> homo sapien <400> 2 Met Arg Pro Gly Leu Ser Phe Leu Leu Ala Leu Leu Phe Phe Leu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gly Asp Leu Gly Asp Val Gly Pro Pro Ile Pro Ser Pro 20 25 30 Gly Phe Ser Ser Phe Pro Gly Val Asp Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser 35 40 45 Ser Ser Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Arg Ser Leu Gly Ser Gly Gly 50 55 60 Ser Val Ser Gln Leu Phe Ser Asn Phe Thr Gly Ser Val Asp Asp Arg 65 70 75 80 Gly Thr Cys Gln Cys Ser Val Ser Leu Pro Asp Thr Thr Phe Pro Val 85 90 95 Asp Arg Val Glu Arg Leu Glu Phe Thr Ala His Val Leu Ser Gln Lys 100 105 110 Phe Glu Lys Glu Leu Ser Lys Val Arg Glu Tyr Val Gln Leu Ile Ser 115 120 125 Val Tyr Glu Lys Lys Leu Leu Asn Leu Thr Val Arg Ile Asp Ile Met 130 135 140 Glu Lys Asp Thr Ile Ser Tyr Thr Glu Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys 145 150 155 160 Val Glu Val Lys Glu Met Glu Lys Leu Val Ile Gln Leu Lys Glu Ser 165 170 175 Phe Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Asp Gln Leu Glu Val Glu Ile Arg 180 185 190 Asn Met Thr Leu Leu Val Glu Lys Leu Glu Thr Leu Asp Lys Asn Asn 195 200 205 Val Leu Ala Ile Arg Arg Glu Ile Val Ala Leu Lys Thr Lys Leu Lys 210 215 220 Glu Cys Glu Ala Ser Lys Asp Gln Asn Thr Pro Val Val His 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Ala Pro 20 25 30 Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu 35 40 45 Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Val Arg Asn Leu Leu Pro Ala Trp Pro 50 55 60 Gly Leu Ser Arg Ala Lys Asp Gln Pro Glu Pro Gln Ile Ser Phe Asp 65 70 75 80 Ser Gly Ser Ser Val Leu Pro Gly His Tyr Glu Glu Lys Pro Leu Trp 85 90 95 Leu Val Lys Trp Arg Glu Glu Gly Cys Val Phe Asn Ser Phe Asn Ser 100 105 110 Val Ser Ile Ala Glu Ala Gly Ala Val Cys Gln Thr Leu Asp Gly Leu 115 120 125 Gln Ala His Thr Asp Thr 130 <210> 13 <211> 1212 <212> PRT <213> homo sapien <400> 13 Met Glu Pro Arg Pro Thr Ala Pro Ser Ser Gly Ala Pro Gly Leu Ala 1 5 10 15 Gly Val Gly Glu Thr Pro Ser Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Arg Val 20 25 30 Glu Leu Pro Gly Thr Ala Val Pro Ser Val Pro Glu Asp Ala Ala Pro 35 40 45 Ala Ser Arg Asp Gly Gly Gly Val Arg Asp Glu Gly Pro Ala Ala Ala 50 55 60 Gly Asp Gly Leu Gly Arg Pro Leu Gly Pro Thr Pro Ser Gln Ser Arg 65 70 75 80 Phe Gln Val Asp Leu Val Ser Glu Asn Ala Gly Arg Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly 100 105 110 Ala Lys Gln Thr Pro Ala Asp Gly Glu Ala Ser Gly Glu Ser Glu Pro 115 120 125 Ala Lys Gly Ser Glu Glu Ala Lys Gly Arg Phe Arg Val Asn Phe Val 130 135 140 Asp Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ala Glu Asp Ser Leu Ser Asp Ala Ala 145 150 155 160 Gly Val Gly Val Asp Gly Pro Asn Val Ser Phe Gln Asn Gly Gly Asp 165 170 175 Thr Val Leu Ser Glu Gly Ser Ser Leu His Ser Gly Gly Gly Gly Gly 180 185 190 Ser Gly His His Gln His Tyr Tyr Tyr Asp Thr His Thr Asn Thr Tyr 195 200 205 Tyr Leu Arg Thr Phe Gly His Asn Thr Met Asp Ala Val Pro Arg Ile 210 215 220 Asp His Tyr Arg His Thr Ala Ala Gln Leu Gly Glu Lys Leu Leu Arg 225 230 235 240 Pro Ser Leu Ala Glu Leu His Asp Glu Leu Glu Lys Glu Pro Phe Glu 245 250 255 Asp Gly Phe Ala Asn Gly Glu Glu Ser Thr Pro Thr Arg Asp Ala Val 260 265 270 Val Thr Tyr Thr Ala Glu Ser Lys Gly Val Val Lys Phe Gly Trp Ile 275 280 285 Lys Gly Val Leu Val Arg Cys Met Leu Asn Ile Trp Gly Val Met Leu 290 295 300 Phe Ile Arg Leu Ser Trp Ile Val Gly Gln Ala Gly Ile Gly Leu Ser 305 310 315 320 Val Leu Val Ile Met Met Ala Thr Val Val Thr Thr Ile Thr Gly Leu 325 330 335 Ser Thr Ser Ala Ile Ala Thr Asn Gly Phe Val Arg Gly Gly Gly Ala 340 345 350 Tyr Tyr Leu Ile Ser Arg Ser Leu Gly Pro Glu Phe Gly Gly Ala Ile 355 360 365 Gly Leu Ile Phe Ala Phe Ala Asn Ala Val Ala Val Ala Met Tyr Val 370 375 380 Val Gly Phe Ala Glu Thr Val Val Glu Leu Leu Lys Glu His Ser Ile 385 390 395 400 Leu Met Ile Asp Glu Ile Asn Asp Ile Arg Ile Ile Gly Ala Ile Thr 405 410 415 Val Val Ile Leu Leu Gly Ile Ser Val Ala Gly Met Glu Trp Glu Ala 420 425 430 Lys Ala Gln Ile Val Leu Leu Val Ile Leu Leu Leu Ala Ile Gly Asp 435 440 445 Phe Val Ile Gly Thr Phe Ile Pro Leu Glu Ser Lys Lys Pro Lys Gly 450 455 460 Phe Phe Gly Tyr Lys Ser Glu Ile Phe Asn Glu Asn Phe Gly Pro Asp 465 470 475 480 Phe Arg Glu Glu Glu Thr Phe Phe Ser Val Phe Ala Ile Phe Phe Pro 485 490 495 Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ala Gly Ala Asn Ile Ser Gly Asp Leu Ala 500 505 510 Asp Pro Gln Ser Ala Ile Pro Lys Gly Thr Leu Leu Ala Ile Leu Ile 515 520 525 Thr Thr Leu Val Tyr Val Gly Ile Ala Val Ser Val Gly Ser Cys Val 530 535 540 Val Arg Asp Ala Thr Gly Asn Val Asn Asp Thr Ile Val Thr Glu Leu 545 550 555 560 Thr Asn Cys Thr Ser Ala Ala Cys Lys Leu Asn Phe Asp Phe Ser Ser 565 570 575 Cys Glu Ser Ser Pro Cys Ser Tyr Gly Leu Met Asn Asn Phe Gln Val 580 585 590 Met Ser Met Val Ser Gly Phe Thr Pro Leu Ile Ser Ala Gly Ile Phe 595 600 605 Ser Ala Thr Leu Ser Ser Ala Leu Ala Ser Leu Val Ser Ala Pro Lys 610 615 620 Ile Phe Gln Ala Leu Cys Lys Asp Asn Ile Tyr Pro Ala Phe Gln Met 625 630 635 640 Phe Ala Lys Gly Tyr Gly Lys Asn Asn Glu Pro Leu Arg Gly Tyr Ile 645 650 655 Leu Thr Phe Leu Ile Ala Leu Gly Phe Ile Leu Ile Ala Glu Leu Asn 660 665 670 Val Ile Ala Pro Ile Ile Ser Asn Phe Phe Leu Ala Ser Tyr Ala Leu 675 680 685 Ile Asn Phe Ser Val Phe His Ala Ser Leu Ala Lys Ser Pro Gly Trp 690 695 700 Arg Pro Ala Phe Lys Tyr Tyr Asn Met Trp Ile Ser Leu Leu Gly Ala 705 710 715 720 Ile Leu Cys Cys Ile Val Met Phe Val Ile Asn Trp Trp Ala Ala Leu 725 730 735 Leu Thr Tyr Val Ile Val Leu Gly Leu Tyr Ile Tyr Val Thr Tyr Lys 740 745 750 Lys Pro Asp Val Asn Trp Gly Ser Ser Thr Gln Ala Leu Thr Tyr Leu 755 760 765 Asn Ala Leu Gln His Ser Ile Arg Leu Ser Gly Val Glu Asp His Val 770 775 780 Lys Asn Phe Arg Pro Gln Cys Leu Val Met Thr Gly Ala Pro Asn Ser 785 790 795 800 Arg Pro Ala Leu Leu His Leu Val His Asp Phe Thr Lys Asn Val Gly 805 810 815 Leu Met Ile Cys Gly His Val His Met Gly Pro Arg Arg Gln Ala Met 820 825 830 Lys Glu Met Ser Ile Asp Gln Ala Lys Tyr Gln Arg Trp Leu Ile Lys 835 840 845 Asn Lys Met Lys Ala Phe Tyr Ala Pro Val His Ala Asp Asp Leu Arg 850 855 860 Glu Gly Ala Gln Tyr Leu Met Gln Ala Ala Gly Leu Gly Arg Met Lys 865 870 875 880 Pro Asn Thr Leu Val Leu Gly Phe Lys Lys Asp Trp Leu Gln Ala Asp 885 890 895 Met Arg Asp Val Asp Met Tyr Ile Asn Leu Phe His Asp Ala Phe Asp 900 905 910 Ile Gln Tyr Gly Val Val Val Ile Arg Leu Lys Glu Gly Leu Asp Ile 915 920 925 Ser His Leu Gln Gly Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Glu Lys Ser 930 935 940 Pro Gly Thr Lys Asp Val Val Val Ser Val Glu Tyr Ser Lys Lys Ser 945 950 955 960 Asp Leu Asp Thr Ser Lys Pro Leu Ser Glu Lys Pro Ile Thr His Lys 965 970 975 Val Glu Glu Glu Asp Gly Lys Thr Ala Thr Gln Pro Leu Leu Lys Lys 980 985 990 Glu Ser Lys Gly Pro Ile Val Pro Leu Asn Val Ala Asp Gln Lys Leu 995 1000 1005 Leu Glu Ala Ser Thr Gln Phe Gln Lys Lys Gln Gly Lys Asn Thr 1010 1015 1020 Ile Asp Val Trp Trp Leu Phe Asp Asp Gly Gly Leu Thr Leu Leu 1025 1030 1035 Ile Pro Tyr Leu Leu Thr Thr Lys Lys Lys Trp Lys Asp Cys Lys 1040 1045 1050 Ile Arg Val Phe Ile Gly Gly Lys Ile Asn Arg Ile Asp His Asp 1055 1060 1065 Arg Arg Ala Met Ala Thr Leu Leu Ser Lys Phe Arg Ile Asp Phe 1070 1075 1080 Ser Asp Ile Met Val Leu Gly Asp Ile Asn Thr Lys Pro Lys Lys 1085 1090 1095 Glu Asn Ile Ile Ala Phe Glu Glu Ile Ile Glu Pro Tyr Arg Leu 1100 1105 1110 His Glu Asp Asp Lys Glu Gln Asp Ile Ala Asp Lys Met Lys Glu 1115 1120 1125 Asp Glu Pro Trp Arg Ile Thr Asp Asn Glu Leu Glu Leu Tyr Lys 1130 1135 1140 Thr Lys Thr Tyr Arg Gln Ile Arg Leu Asn Glu Leu Leu Lys Glu 1145 1150 1155 His Ser Ser Thr Ala Asn Ile Ile Val Met Ser Leu Pro Val Ala 1160 1165 1170 Arg Lys Gly Ala Val Ser Ser Ala Leu Tyr Met Ala Trp Leu Glu 1175 1180 1185 Ala Leu Ser Lys Asp Leu Pro Pro Ile Leu Leu Val Arg Gly Asn 1190 1195 1200 His Gln Ser Val Leu Thr Phe Tyr Ser 1205 1210 1206

Claims (13)

1. 개체의 대장 신생물(neoplasm) 발병 또는 발병 소인에 대한 스크리닝 방법으로서, 상기 개체로부터 유래한 막 미세소낭(membranous microvesicle) 시료 중에서, 다음의 발현 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법:
   (i) 하기에서 선택되는 1 이상의 유전자:
   

   

   
   (ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 하기에서 선택되는 1 이상의 영역:
   

   

   
   

   

   
   

   

   
   여기서, 대조군 레벨과 비교하여 상기 유전자 발현 레벨의 증가는 신생물의 발병 또는 발병 소인을 나타냄.
2. 제1항에 있어서, 상기 신생물은 선종인 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 신생물은 선암인 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 대장 신생물은 결장직장 신생물인 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 상기 유전자로부터 전사된 RNA 레벨 또는 그로부터 역전사된 cDNA의 레벨을 스크리닝하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인 것인 방법.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 상기 유전자의 단백질 발현 산물 또는 그의 단편을 스크리닝하는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 미세소낭은 엑소좀, 아폽토시스 수포, 마이크로파티클, 아폽토시스 자멸사체 또는 세포성 수포인 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 미세소낭은 엑소좀인 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료(생물학적 시료)는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변, 타액, 눈물 또는 복수액 시료인 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자는 하기에서 선택되는 1 이상인 것인 방법:
    (i)
    

    

    
    (ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 하기에서 선택되는 영역:
    

    
12. 제11항에 있어서, 상기 유전자는 하기에서 선택되는 1 이상인 것인 방법:
    (i)
    

    

    
    (ii) Hg19 코디네이트에 의하여 정의되는 하기에서 선택되는 영역:
    

    
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것인 방법.

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