KR20230126529A - 췌장암 진단을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

췌장암 진단을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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김지예
김민우
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이효정
이수지
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Abstract

본 발명은 췌장암 진단을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 췌장암 진단과 관련된 miRNA 유전자 바이오마커, 췌장암 진단용 조성물, 키트, 이를 이용한 췌장암 진단을 위한 정보제공방법 및 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 다양한 조합의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 기존의 췌장암 진단용 바이오마커인 CA19-9와 조합하여 사용하는 경우, 높은 임상적 민감도와 특이도를 보이므로, 췌장암 진단에 도움을 줄 수 있다.

Description

췌장암 진단을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 {Extracellular vesicles-derived miRNA gene biomarkders for diagnosis of pancreatic cancer and use thereof}
본 발명은 췌장암 진단을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 췌장암 진단과 관련된 miRNA 유전자 바이오마커, 췌장암 진단용 조성물, 키트, 이를 이용한 췌장암 진단을 위한 정보제공방법 및 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
췌관선암종(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 췌장암의 가장 흔한 유형이며, 암 관련 사망의 주요 원인이다. PDAC는 매우 조용하고 진단 시 원격 전이 단계의 진행성 질환(advanced disease)에 때때로 도달하였다. PDAC의 무증상 특성으로 인해, 이는 일반적으로 다른 질병에 대한 건강 검진 중 우연히 발견된다. 의심할 여지 없이, 컴퓨터 단층 촬영, 자기 공명 영상 및 초음파 촬영과 같은 영상 기술에 따른 조직 생검은 진단 정확도가 높은 결정적인 방법이지만, 때때로 분석이 불가능하여 진단에 방해가 된다. 종양 부피가 충분하지 않거나 접근할 수 없는 위치, 예를 들어, 전이가 발생한 원거리 장기 부위인 경우에는 제한될 수 있다. 또한, 반복적인 영상 촬영 및 조직 수집은 환자에게 부담을 증가시킨다. 오늘날 액체 생검은 기존의 진단 방법에 대한 대안이 아니라 보완적인 잠재적 진단 방식이다. 액체 생검은 종양의 공간적 및 시간적 이질성에 대한 전사체 및 단백질체 정보를 제공할 수 있습니다. 단일 조직 생검 샘플은 편향되고 논란의 여지가 있는 반면, 액체 생검은 상대적으로 비침습적이고, 반복하기 쉬우며, 종양의 전반적인 정보를 제공한다. 액체 생검으로 얻은 분자 정보는 외과의에게 치료를 안내하고 수술을 계획하는데 있어서 더 상세한 정보를 제공할 수 있다. 이처럼 액체생검을 통해 암 환자의 스크리닝, 진단, 예후, 치료는 가까운 미래에 극적으로 바뀔 수 있다.
액체생검을 통해 암의 단서를 찾기 위한 기존 혈액검사에는 췌장암 진단 및 모니터링에 활용할 수 있는 혈청 탄수화물 항원 19-9(CA19-9) 순환 바이오마커가 있다. 그러나, 일부 양성 췌담도 질환 (benign pancreatobiliary diseases) 환자에서 CA19-9의 증가가 관찰되어 CA19-9가 높은 암 표지자 특이성을 갖지 않음을 시사한다 [Katsanos, K.H. et al., High CA 19-9 levels in benign biliary tract diseases. Report of four cases and review of the literature. Eur. J. Intern. Med. 2002, 13, 132-135.; Mann, D.V. et al., Elevated tumour marker CA19-9: Clinical interpretation and influence of obstructive jaundice. Eur. J. Surg. Oncol. 2000, 26, 474-479.]. 위양성 외에도, 액체 생검의 다른 한계는 순환하는 바이오마커가 일반적으로 혈액에 낮은 농도로 존재하고 빠르게 분해될 수 있다는 것이다 [Arneth, B., Update on the types and usage of liquid biopsies in the clinical setting: A systematic review. BMC Cancer 2018, 18, 527.]. 최근에 광범위한 연구에 따르면 PDAC 환자에서 여러 microRNA (miRNA)가 조절되지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 혈청 miRNA 발현 패턴은 초기 암에서 전이암까지 다양한 단계의 췌장암을 식별할 수 있는 잠재력을 가질 수 있다 [Baradaran, B. et al., Dysregulation of key microRNAs in pancreatic cancer development. Biomed. Pharmacother. 2019, 109, 1008-1015.]. 인접 세포로의 miRNA의 전달은 주로 세포외 소포체 (Extracellular vesicle, EV)에 의해 유도되며, 이는 모세포의 특성을 반영하는 유용한 마커 (단백질, mRNA, miRNA 및 DNA)를 포함한다. Evs는 순환하는 혈액에 풍부하고 오랫동안 순환할 수 있으며 모세포에서 유래된 분자 정보를 보호한다. 따라서, 종양 유래 Evs는 암 진단을 위한 잠재적인 바이오마커로 제안되어 왔다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 췌장암 진단용 miRNA 유전자 바이오마커, 이를 이용한 췌장암 진단용 조성물, 키트, 정보제공방법 및 췌장암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 췌장암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
이와 관련하여, 본 발명은 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 췌장암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 췌장암 진단용 조성물 및 키트는 다음의 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA 유전자 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다:
(i) miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290;
(ii) miR-10b, miR-21, miR-155 및 miR-1290;
(iii) miR-10b, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 및
(iv) miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 췌장암 진단용 조성물 및 키트는 CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, 펩타이드 핵산 (peptide nucleic acid, PNA), 나노입자 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계는 다음의 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA 유전자 조합의 발현 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다:
(i) miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290;
(ii) miR-10b, miR-21, miR-155 및 miR-1290;
(iii) miR-10b, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 및
(iv) miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 췌장 세포, 췌장 조직 및 이들로부터 유래된 세포외 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 췌장암 진단을 위한 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우 췌장암으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 췌장암 진단을 위한 정보제공방법은 (d) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 췌장암 진단을 위한 정보제공방법은 (e) 상기 (d) 단계에서 측정된, CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우 췌장암으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 췌장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시료에 췌장암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 시료는 췌장암 환자로부터 분리된 췌장암 세포, 췌장암 조직 및 이들로부터 유래된 세포외 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 췌장암 치료제의 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 췌장암 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 다양한 조합의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 초기 암에서 전이암까지 다양한 단계의 췌장암을 효과적으로 진단하는데 적용될 수 있다. 또한, 기존의 췌장암 진단용 바이오마커인 CA19-9와 조합하는 경우, 높은 임상적 민감도와 특이도를 보이므로, 췌장암 진단에 도움을 줄 수 있다.
도 1은 PDAC 진단을 위한 액체 생검에서 EV의 임상적 유용성에 대한 개략도이다.
도 2a 내지 2c는 세포와 EV의 표면에 있는 췌장암 관련 표면 마커를 특성화한 것으로, 도 2a는 Alexa Fluor 488 및 PECy7-표지된 항체를 사용한 세포 (상단) 및 EV (하단)에서의 ITGA2, ITGAV, EpCAM 및 GPC1 발현의 대표적인 형광 활성화 세포 분류 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS) 히스토그램이고, 도 2b는 세포의 표면 마커 발현 (X축) 대 EV 표면 마커 발현 (Y축) 간의 상관관계를 나타낸 것이다. 여기서, 점선 컷오프 라인은 평균 형광 강도 (Mean fluorescence intensity, MFI) 값 2000에서 나타난다. 도 2c는 정상 췌장 대조군 세포주 HPNE와 비교하여 췌장암 세포(빨간색) 및 EV(파란색)에서 표면 마커 발현의 히트맵을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3c는 자기 비드를 이용한 면역침전으로 췌장 종양 세포 유래 EV의 농축에 관한 것으로, 도 3a는 HPNE, AsPC-1, BxPC-3, Mia PaCa-2 및 PANC-1 세포주에서 분리된 EV의 입자 크기 분포이다. 여기서, 곡선 아래의 면적은 농축된 배양 배지에서 분리된 입자의 절대 수를 나타낸다. 도 3b는 EV의 평균 입자 크기를 나타낸 그래프로, EV 평균 입자 크기는 3번 분석되어 그래프로 표시되었다. 도 3c는 면역친화성 포획 후 자기 마이크로비드의 표면에 결합된 EV의 SEM 이미지를 나타낸 것으로, 마이크로비드는 췌장암 관련 표면 마커 ITGAV, ITGA2 및 GPC1에 대한 항체로 기능화되었다. 스케일 바는 200 nm를 나타낸다. 도 3d는 NTA로 측정된 EV의 양을 나타낸 것으로, 바 그래프는 5번의 독립된 실험에서 표준 편차가 있는 평균 EV 농도의 일반적인 분석을 보여준다.
도 4a 및 4b는 각각 HPNE 세포 (도 4a) 및 EV (도 4b)에서 발현에 정규화된 췌장암 세포 및 EV에서 miRNA 발현의 배수 변화를 보여주는 막대 차트이다. 13개의 후보 miRNA는 실시간 정량적 PCR에 의해 세포 (도 4a) 및 EV (도 4b)에서 분석되었다. 도 4c는 HPNE 세포 및 EV에서의 발현으로 정규화된 AsPC-1, BxPC-3, Mia PaCa-2 및 PANC-1 암 세포 및 EV에서의 miRNA 발현의 평균 배수 변화를 보여주는 표로, EV에서 상향 조절된 miRNA는 볼드체로 표시되었다.
도 5a 및 5b는 RefFinder를 사용한 후보 기준 유전자 선택에 관한 것으로, 도 5a는 Bestkeeper (빨간색), NormFinder (주황색), Delta Ct 방법 (녹색) 및 GeNorm (파란색) 통계 알고리즘에 따라 40개의 혈장 샘플의 EV에서 13개 후보 miRNA의 안정성을 나타낸 그래프이고, 도 5b는 RefFinder 분석에 의해 생성된 순위를 보여준다. 여기서, 최상위 기준 유전자는 볼드체로 표시되었다. 도 5c는 RefFinder로 계산한 안정성 값에 따른 췌장 종양 조직의 12개 후보 miRNA의 종합적인 발현 안정성을 나타낸 것으로, 최상위 기준 유전자는 볼드체로 표시되었다.
도 6a는 췌장암 관련 표면 마커 후보를 나타낸 것으로, 각 암에 대해 색상으로 구분된 막대는 환자의 백분율을 나타낸다 (최대 12명의 환자). 암 조직에서 ITGA2 단백질 발현은 8명의 환자 중 7명이 높은/중간 발현을 나타내고, 암 조직에서 ITGAV 단백질 발현은 9명의 환자 중 7명이 높은/중간 발현을 나타냈다. 암 조직에서 GPC1 단백질 발현은 11명의 환자 중 1명이 높은/중간 발현을 나타내고, 11명의 환자 중 2명은 중간/낮은 발현을 나타냈다. 암 조직에서 EpCAM 단백질 발현은 12명의 환자 중 8명이 높은/중간 발현을 나타냈다. 도 6b 및 6c는 정상 대조군과 비교하여 20명의 PDAC 환자의 샘플에서 차등 miRNA 발현을 나타낸 것으로, 도 6b는 PDE, TEV 및 종양 조직에서 후보 miRNA 발현의 변화 배수를 보여주고, 도 6c는 PDE에서 후보 miRNA의 평균 배수 변화, 표준 편차 및 P 값을 보여준다. PDE에서 상향 조절된 miRNA 후보는 볼드체로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01 양성 대조군 대 PDAC 각 그룹. 도 6d는 종양 조직에서 miRNA와 EV에서 miRNA의 배수 변화 사이의 상관 관계를 분석하여 나타낸 것으로, PDE의 miRNA (왼쪽 패널의 y축), TEV (오른쪽 패널의 y축) 및 종양 조직 (두 패널의 x축) 사이의 피어슨 상관 계수 분석 결과를 보여준다. PDE는 췌장암 특이적 항체 (ITGA2, ITGAV 및 GPC1)로 기능화된 자기 마이크로비드를 사용하여 면역 포획에 의해 분리되었고, TEV는 실시예에 설명된 프로토콜에 따라 전체 엑소좀 분리 키트를 사용하여 침전에 의해 분리되었다.
도 7a는 정상 대조군으로부터 PDAC 환자를 구별하는 5개의 후보 miRNA 능력의 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다. 도 7b는 miRNA 다중 패널의 성능을 평가하기 위한 로지스틱 회귀를 나타낸 표이다. 도 7c는 CM 1-4의 ROPCA 점수를 나타낸 것으로, CM 1은 miR-21, miR-155, miR-429, miR-1290 및 CA19-9로 구성되고, CM 2는 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-1290 및 CA19-9로 구성되며, CM 3은 miR-10b, miR-155, miR-429, miR-1290 및 CA19-9로 구성되고, CM 4는 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429, miR-1290 및 CA19-9로 구성된다. 도 7d는 CM 1-4의 ROC 곡선 분석을 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, PDAC는 가장 공격적인 악성 종양 중 하나로 간주되며 사망률이 높고 생존율이 낮다. 따라서, PDAC가 난치성 단계에 도달하기 전에 조기 발견을 위한 비침습적 바이오마커의 발굴이 시급하다. 최근 연구에 따르면, PDAC 환자에서 여러 microRNA (miRNA)가 조절되지 않는 것으로 확인되었고, EV는 모세포의 특성을 반영하는 유용한 마커 (단백질, mRNA, miRNA 및 DNA)를 포함하고 있어, 종양 유래 EV는 암 진단을 위한 잠재적인 바이오마커로 제안되어 왔다.
본 발명자들은 풍부한 miRNA를 포함하는 PDAC-유래 세포외 소포체 (PDAC-derived extracellular vesicle, PDE)의 액체 생검이, PDE가 선택적으로 농축될 수 있고 생물학적으로 안정하기 때문에, PDAC의 조기 진단에 사용될 수 있다고 가정하였다. 이에 따라, 도 1에 나타난 바와 같이, EV 분리를 위해 자기 비드 기반 면역 포획을 사용하여 PDAC-유래 EV (PDE)에서 조절되지 않은 miRNA를 식별하는 것을 목표로 하였다. 이를 위해, 자기 비드를 사용하여 면역 포획으로 PDE를 분리하고, 20명의 췌장암 환자와 20개의 일반 대조군에서 13개의 miRNA 후보를 선별한 후, miR-10b, miR-16, miR-155, miR-429 및 miR-1290을 포함한 5개의 miRNA의 발현이 PDE에서 현저히 더 높다는 것을 확인하고, 이들을 췌장암 진단을 위한 잠재적 바이오마커로 발굴하였다. 또한, CA19-9 (Carbohydrate antigen 19-9)와 함께 miRNA 시그니처는 로지스틱 회귀에 의해 최적화되었으며, miRNA 시그니처 및 CA19-9 조합 마커 (combination markers, CMs)는 PDAC 환자를 정상 대조군과 구별하는데에 효과적임을 확인하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 제1 측면은 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 췌장암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 췌장암 발병 여부를 예측해내는 기준이 되는 miRNA 유전자를 지칭한다. 바이오마커가 miRNA인 경우 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "miRNA"는 특별히 언급하지 않는 한, 헤어핀 모양 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소에 의해 절단되어 RISC라고 칭하는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25염기의 비코딩 RNA를 의도하여 사용된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 miRNA는 특정 염기서열 (또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체 (pre-miRNA, primiRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체 (즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는 구체적으로는 miRBase release 20(http://www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 엄격한 조건 하에서 miRNA의 상보서열과 혼성화되는 염기서열을 갖는 miRNA를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 언급된 miRNA는 miR 유전자의 유전자 산물일 수 있고, 그러한 유전자산물은 성숙 miRNA (예를 들면, 상기와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25염기 또는 19~25염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면, 상기와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.
본 발명에서, 용어"핵산"이란 RNA, DNA, 및 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 핵산에 대하여 사용된다. 또한, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈DNA, 및 합성DNA 모두가 포함된다. 또한, 상기 RNA에는 total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding)RNA 및 합성RNA 모두가 포함된다. 본 발명에 있어서 "합성DNA" 및 "합성RNA"는 소정의 염기서열(천연형 서열 또는 비천연형 서열 중 어느 것이어도 좋음)에 의거하여, 예를 들면 자동핵산 합성기를 사용하여 인공적으로 제작된 DNA 및 RNA를 말한다. 본 발명에 있어서 "비천연형 서열"은 광의의 의미로 사용하는 것을 의도하고 있고, 천연형 서열과 상이한, 예를 들면 1 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 서열(즉, 변이 서열), 1 이상의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 서열(즉, 수식 서열) 등을 포함한다. 또한, 본 발명에서는 폴리뉴클레오티드는 핵산과 호환적으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 췌장암의 발병 여부를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
상기 제1 측면과 관련하여, 본 발명은 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 췌장암 진단용 조성물은 다음의 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA 유전자 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다:
(i) miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290;
(ii) miR-10b, miR-21, miR-155 및 miR-1290;
(iii) miR-10b, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 및
(iv) miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290.
본 발명의 조성물 및 키트에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 전술한 miRNA 유전자 및 CA19-9 조합 마커 (combination markers, CMs)가 PDAC 환자를 정상 대조군과 구별하는데에 효과적임을 확인하였다. CM은 높은 민감도 (AUC, 0.964; 민감도, 100%; 특이도, 80%)와 높은 특이도 (AUC, 0.962; 민감도, 85.71%; 특이도, 100%)를 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 조성물 및 키트는 CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 나노입자 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하 는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 miRNA 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 연수막 암전이의 치료 반응을 모니터링 하거나 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 본 발명에서, 상기 유전자의 mRNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 miRNA 유전자 바이오마커의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"란 miRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 miRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 miRNA 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 연수막 암전이의 치료 반응 또는 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 이용되는 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, miRNA 유전자에 특이적으로 결합하는 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 특정 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고(align), 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 동일성, 더욱 구체적으로 70%의 동일성, 더더욱 구체적으로 80%의 동일성, 가장 구체적으로 90%의 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 CA19-9 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. CA19-9 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, CA19-9 단백질 바이오마커 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 전술한 5종의 miRNA 유전자 중 적어도 하나에 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상술한 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, miRNA 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양함), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 DNA, RNA 또는 miRNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에는 핵산 (예를 들면, 총 RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 췌장암에 대한 바이오마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등이다.
본 발명의 제2 측면은 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 췌장암 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 정보제공방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 상기 5종의 miRNA 유전자의 다양한 조합에 대한 발현 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예시적인 조합은 다음의 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 조합이나, 이에 제한되지 않는다:
(i) miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290;
(ii) miR-10b, miR-21, miR-155 및 miR-1290;
(iii) miR-10b, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 및
(iv) miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 용어 "개체"는 췌장암이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치 류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "생물학적 시료"는 정상적인 상태와 구별될 수 있는 췌장암 진단에 특이적인 miRNA 유전자를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 췌장 세포, 췌장 조직 및 이들로부터 유래된 세포외 소포체 (EV)일 수 있고, 가장 바람직하게는 췌장 세포 또는 췌장 조직 유래 세포외 소포체일 수 있다.
EV는 거의 모든 종류의 세포에서 방출되기 때문에 EV를 사용하는 생물학적 환경에서 상당한 이질성이 관찰될 수 있다. 현재 PEG 침전(Total Exosome Isolation kit 및 ExoQuick) 및 초원심분리(UC)를 기반으로 하는 여러 상용 EV 분리 키트가 TEV 분리에 사용된다. TEV 분리는 면역 포획 기반 EV 분리 기술에 비해 더 높은 수율을 나타내지만, TEV는 암 이질성을 포착하거나 종양 특성을 반영할 수 없다. 따라서, 본 발명에서는 후보 암 표면 마커 ITGA2, ITGAV 및 GPC1을 사용하여 TEV와 PDE를 구별하였다.
본 발명의 정보제공방법에 따르면, 상기 (a) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우 췌장암으로 진단할 수 있다.
본 발명의 정보제공방법은 췌장암 진단의 정확도를 향상시키기 위해 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이때, 상기 (d) 단계에서 측정된, CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우 췌장암으로 진단할 수 있다.
예를 들어, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준은 혼성화법 또는 유전자 증폭방법으로 측정될 수 있다.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 miRNA의 존재를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 정보제공방법이 혼성화 방식 중 마이크로어레이 방식으로 실시되는 경우, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화 된다. 바람직한 기질은 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있다. 또한, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 또는 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
혼성화 방법에서 분석 대상이 되는 핵산 시료는 뇌척수액에서 추출한 세포외 RNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 miRNA 유전자 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 상향 조절 (up-regulation)되는 경우에는 췌장암으로 진단된다.
본 발명의 정보제공방법은 면역분석 방법에 의해 실시될 수도 있다. 상기 면역분석 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 포획-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA), inMethodsinMolecularBiology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 제3 측면은 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 췌장암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 췌장암 치료제 스크리닝 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 시료에 췌장암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 췌장암 환자로부터 분리된 것으로, 전술한 췌장암 진단을 위한 정보제공방법에 사용되는 시료와 동일하다.
본 발명의 용어, "췌장암 치료제의 후보물질"은 췌장암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 췌장암을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능한 예상 물질을 모두 포함한다.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 상기 (b) 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에 따르면, 상기 (b) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 췌장암 치료제로 판단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
췌장암 세포주에서의 EV 특성화
1-1. 세포주 및 세포 배양
다음의 4가지 췌장암 세포주와 정상 췌장 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA, USA)에서 구입하였다: AsPC-1 (CRL-1682), BxPC-3 (CRL-1687), Mia PaCa-2 (CRL-1420), PANC-1 (CRL-1469) 및 hTERT-불멸화된 인간 췌장 상피 네스틴 발현 (hTERT-immortalized human pancreatic epithelial Nestin-expressing, HPNE; CRL-4023). 모든 세포주는 ATCC에서 제공한 취급 정보에 설명된대로 완전 성장 배지에서 배양되었다. HPNE는 hTERT 유전자를 포함하는 레트로바이러스 발현 벡터(pBABEpuro)로 형질도입함으로써 불멸화되었다.
1-2. EV 농축 및 분리
세포주에서 EV를 방출시키기 위해, 각 세포주를 24시간 동안 일반 배지가 있는 150mm 세포 배양 접시에서 70-80% 컨플루언시 (confluency)로 배양한 다음 일반 배지를 10% EV-고갈된 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 배지로 교체하였다. 다음으로, 세포는 72시간 동안 더 배양하고 상층액을 수집하여 20분 동안 2000× g에서 원심분리하고 죽은 세포와 파편이 없는 EV를 수득하였다. 그런 다음, EV 용액을 Macrosep Advance Centrifugal Device (100K, Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)를 사용하여 농축하고 2000× g에서 2시간 동안 원심분리하였다. 농축된 EV는 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에 보관되었다. EV가 고갈된 FBS는 4 ℃에서 6시간 동안 120,000× g (SW28 로터, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)에서 초원심분리를 사용하여 생성한 다음 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 세포 배양 상층액을 한외여과하였다.
1-3. 표면 프로파일의 유세포 분석을 통한 췌장암 세포주에서의 EV 특성화
EV가 PDAC를 포함한 대부분의 암 유형에서 암 관련 마커로 확인된 후보 표면 단백질을 고도로 발현하는지 확인하기 위해, 형광 강도를 유세포 분석법으로 측정하였다.
종양 관련 표면 마커를 표적하는 항체로 코팅된 15 μm 마이크로비드(SVP 150-4, SPHERO?? Streptavidin Coated Particles, Spherotech Inc., Lake Forest, IL, USA)에 결합된 세포 및 EV의 표면 프로파일을 유세포 분석을 통해 분석하였다. 세포 및 EV 샘플을 1% 소 혈청 알부민 및 0.1% 아지드화 나트륨이 포함된 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 각 샘플을 4 ℃ 암실에서 1회 시험 용량의 형광 표지 항체와 함께 30분 동안 배양하고, 과잉 반응을 방지하기 위해 FACS 버퍼로 2회 씻어낸 다음 유세포 분석기 (FACS LSRFortessa system, Becton Dickinson, Franklin 미국 뉴저지주 레이크스)를 사용하여 분석하였다. Alexa Fluor 488 항체 표지 키트 (A20181, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 항체를 형광으로 표지하였다. EV 분석에는 일반 EV 마커 CD63 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 대한 PE-Cy7 표지된 항체가 사용되었다. 항체에 대한 자세한 정보는 표 1과 같다.
표적 판매사 카탈로그 번호 숙주 종
Integrin a2 (비오티닐화됨) R&D Systems BAM1233 마우스
Integrin av (비오티닐화됨) STEMCELL 60043BT 마우스
Glypican (비오티닐화됨) R&D Systems BAF4519 염소
EpCAM (비오티닐화됨) Abcam Ab79079 마우스
CD63 (비오티닐화됨) BD Biosciences 561982 마우스
5개의 서로 다른 모세포주의 상층액에서 EV는 인테그린 알파 2(ITGA2), 인테그린 알파 V(ITGAV), 상피세포 부착 분자(EpCAM) 및 글리피칸-1(GPC1)에 대한 항체와 결합된 마이크로비드를 사용하여 분리되었다. 정상 췌관 세포주 HPNE의 인테그린 마커 수준과 비교하여, AsPC-1, BxPC-3 및 Mia PaCa-2 세포와 EV에서 인테그린 마커 수준이 더 높은 경향이 있다. 그러나, EpCAM 및 GPC1의 수준은 세포와 EV 사이에 일관되지 않은 패턴을 보여주었다 (도 2a). 특히, 췌장암에서 낮게 발현될 것으로 예상되었던 GPC1 (도 6a)은 실제로 EV에서 높게 발현되었다. 이는 EV와 세포의 표면 단백질체가 약간의 불일치를 보일 수 있음을 나타낸다. 면역캡처된 EV의 더 나은 특성화를 위해, 단백질 발현 패턴의 산점도를 만들었다 (도 2b). 세포와 EV 사이에 통계적으로 유의한 상관관계는 관찰되지 않았지만, GPC1은 EV에서 높게 발현되었고 (사분면 1), 인테그린 마커는 세포와 EV 모두에서 높게 발현되었다 (사분면 2). 또한, 세포 및 EV의 표면 마커의 상대 발현은 히트맵에 표시되었다 (도 2c). ITGA2, ITGAV, EpCAM 및 GPC1 발현의 평균 폴드 변화는 각각 세포에서 37.1, 14.3, 36.1 및 1.8이었고 EV에서 72.0, 66.4, 11.5 및 51.9였다. 이러한 결과를 기반으로, ITGA2, ITGAV 및 GPC1을 사용하여 후속 실험에서 종양 유래 EV를 분리하였다.
종양 세포 유래 EV 분리를 위한 자기 비드를 사용한 면역포획
임상 분석에 적용할 수 있는 대량신속처리(high-throughput) EV 분리 방법을 확립하기 위해, ITGA2, ITGAV 및 GPC1을 포함하는 EV를 선택적으로 농축할 수 있는 자기 비드를 활용하였다.
2-1. 나노입자추적분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA)
먼저, 췌장암 세포주와 정상 세포주에서 분리한 EV 샘플로 시스템을 테스트하였다. PBS에 재현탁된 EV의 농도 및 크기 분포는 NanoSight NS300 시스템 (Malvern Panalytical, Malvern, UK)을 사용하여 나노입자추적분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA)에 의해 측정되었다. 제조업체의 소프트웨어 매뉴얼에 따라 기본 설정으로 NTA 3.1 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행했으며, 입자 신호를 초과하지 않는 EV를 명확하게 시각화하도록 카메라 초점을 조정하였다.
NTA를 통해 EV 농도는, 직경이 50-300 nm 범위인 입자 크기로 mL 당 최대 1 Х 1010 EV로 추정할 수 있었다(도 3a). 5개 세포주의 배양 상청액에서 분리된 EV의 평균 입자 크기는 HPNE의 경우 185.0 nm, AsPC-1의 경우 201.5 nm, BxPC-3의 경우 149.4 nm, Mia PaCa-2의 경우 227.5 nm, PANC-1의 경우 178.9 nm였다(도 3b).
2-2. 주사전자현미경(Scanning electron microscopy, SEM)
SEM은 형태 및 크기와 함께 종양 세포 유래 EV의 존재를 확인하는데 사용되었다(도 3c). 항체 결합 자기 비드에 췌장암 유래 EV의 부착을 확인하기 위해, 전계 방출 SEM (MERLIN, Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 표본을 관찰하였다. 관찰에 앞서 EV는 카르노브스키 고정액 (Karnovsky's fixative, pH 7.4, 0.1M 인산염 버퍼에 용해된 2% 글루타르알데하이드 및 2% 파라포름알데하이드)에서 24시간 동안 고정되었고, 0.1M 인산 버퍼로 30분 동안 두 번 세척하였다. EV를 2시간 동안 1% OsO4로 후-고정하고, 점진적으로 상승하는 에탄올 시리즈 (50-100%)와 임계점 건조기 (CPD300, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 탈수한 후 이온 스퍼터 (ACE600, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 백금으로 코팅하였다.
인산완충식염수(PBS)에서 EV의 등가 농도(109개 입자/mL)를 자기 비드와 함께 배양하여 면역친화성으로 EV를 분리하였다 (도 3d). NTA 결과와 유사하게, 자기 비드로 분리된 EV는 직경이 <250 nm이고 대부분이 구형이었다. EV의 응집이 우려될 수 있지만, 고속원심분리를 사용하여 고농축 EV 용액을 제조할 때 시험관 내 (in vitro) 실험에서만 나타나는 사소한 형태적 변화로 간주하였다. ITGA2, ITGAV 및 GPC1이 분리 시 포화에 도달할 만큼 HPNE 유래 EV에서 충분히 높게 발현되지 않기 때문에, 비드당 HPNE 정상 세포 유래 EV의 수는 상대적으로 낮았다. 종양 유래 EV는 생물학적 환경에서 정상 조직에서 방출되는 많은 양의 다른 EV에 둘러싸여 있을 수 있기 때문에, 다른 오염 물질과 분리하기 위해서는 자기 비드 기반 EV 분리 방법이 필요하다.
차등 발현되는 miRNA 후보의 확인
여러 실험 및 생물정보학 데이터베이스를 기반으로, 4개의 췌장암 세포주(도 4a) 및 HPNE 세포와 EV로 정규화된 종양 세포 유래 EV(도 4b)에서 RT-qPCR 발현 분석을 위해, 13개의 miRNA를 선택하였다.
3-1. RT-qPCR에 의한 miRNA 발현 패턴 분석
세포주 (AsPC-1, BxPC-3, Mia PaCa-2, PANC-1 및 HPNE)에서 TRIzol 시약(Invitrogen, Pleasanton, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. HPNE 세포주를 정상 대조군으로 사용하였다. TEV의 총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Total Exosome RNA 및 Protein Kit(Invitrogen)를 사용하여 추출하였다. RNA 순도와 양은 NanoDrop 3000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 결정하였다. 추출된 RNA는 TaqMan microRNA 역전사 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 역전사되었다. 13개의 miRNA(miR-9, miR-10b, miR-16, miR-21, miR-96, miR-103, miR-138, miR-155, miR-429, miR-1290, miR-3976, miR-4644 및 miR-4732)의 차등 발현 수준은 TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG, 2x (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 TaqMan miRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 CFX96 실시간 PCR 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 cDNA 증폭 반응을 수행하여 측정하였다. miRNA 발현 수준의 정규화는 EV에서 miRNA에 대한 기준 대조군으로 miR-16을 사용하여 수행하였다. 실험은 3회 수행되었으며, ΔΔCT 방법을 사용하여 상대적 발현을 결정하였다.
분석된 miRNA 중 EV에서 8개(miR-10b, miR-16, miR-21, miR-96, miR-103, miR-155, miR-429 및 miR-1290)가 상향 조절되었고 4개(miR-16, miR-4732, miR-4644 및 miR-138)은 하향 조절되었다(도 4c). 모세포와 방출된 EV 사이의 전반적인 miRNA 발현 패턴은 유사하였다. 그러나, miR-9 및 miR-3976은 모세포에서 높게 발현되었지만, EV에서는 그렇지 않았다. EV에서 1.5배 이상 상향 조절된 7개의 miRNA (miR-10b, miR-21, miR-96, miR-103, miR-155, miR-429 및 miR-1290)를 확인하였다. 이 miRNA들는 임상 환경에서 췌장암 진단을 위한 후보 액체 생검 PDE 바이오마커이다.
3-2. miRNA의 안정성 결정
정확하고 임상적으로 관련이 있으며 신뢰할 수 있는 miRNA RT-qPCR 데이터를 얻기 위해, 각 miRNA의 안정성을 결정하였다. EV 내 miRNA의 정규화를 위한 표준 내부 대조군이 확립되어 있지 않기 때문에, 혈장에서 안정적으로 발현되는 miRNA를 기준 miRNA로 사용하고, 20명의 PDAC 환자와 20명의 담낭염(Cholecystitis, CL) 대조군에서 안정성을 검증하였다. BestKeeper, NormFinder, Delta Ct 방법 및 GeNorm을 포함한 통계 알고리즘을 사용하여 각 샘플 Cq 값에 대해 적절한 기준 miRNA 유전자를 확인하였다 (도 5a). 기준 유전자의 종합적인 순위는 RefFinder에 의해 생성되었으며, 이는 4가지 알고리즘에 의해 생성된 결과를 고려한다. 이 순위에 따라, miR-16은 40개의 혈장 샘플의 PDE에서 가장 안정적인 기준 miRNA 유전자였으며 (도 5b), RNU6B는 20개의 종양 조직과 20개의 인접 조직 샘플에서 가장 안정적인 miRNA 유전자였다 (도 5c). 이러한 결과는 다른 기준 유전자 검증 연구와 일치하여 유전자 안정성 분석의 실험 설정이 신뢰할 수 있음을 나타낸다.
조직 및 혈장 내 miRNA 후보 비교 분석
4-1. 임상 코호트
총 40명의 피험자 (PDAC가 있는 암 환자 20명 및 CL이 있는 비-암환자 20명)가 본 연구에 참여하였다. 연구 목적을 위한 조직 및 일치된 혈액 샘플의 사용에 대한 사전 동의를 모든 참가자로부터 얻었다. 임상 샘플은 연세대학교 의과대학 독립윤리위원회 지침 (IRB No. 4-2020-1292, 2021년 1월 4일 승인)에 따라 한국 세브란스병원을 방문한 경험이 있는 피험자들로부터 수득하였다. PDAC 환자로부터 췌장암 조직을 외과적으로 제거하는 동안 경험이 풍부한 외과의의 판단 하에 암 조직 및 인접한 정상 췌장 조직을 수집하였다. 동일한 환자의 수술 전 혈장 샘플을 마취 전에 수집히였다. 분석에 포함하기 위한 피험자 적격성 기준은 다음을 포함한다: (1) 혈액 및 조직 표본 획득 전에 화학 요법 또는 방사선 요법을 받지 않음, (2) 암 코호트 등록을 위한 PDAC의 확인된 병리학적 진단, 및 (3) 담석과 같은 담낭의 비암성 상태를 갖는 양성 질환의 확인된 진단. 이 연구에 등록된 피험자의 임상 특성은 표 2 및 3에 요약되어 있다.
PDAC 나이 성별 진단 T N M AJCC 단계 CA19-9 CEA
C1 54 M PDAC T1c N0 M0 IA 47.3 3.27
C2 73 M PDAC T1a N0 M0 IA 29.7 3.58
C3 64 M PDAC T1c N0 M0 IA 38.5 7.09
C4 35 M PDAC T1c N1 M0 IIB 389 2.33
C5 67 M PDAC T1c N1 M0 IIB 199 6.07
C6 53 F PDAC T2 N1 M0 IIB 8.3 1.58
C7 60 M PDAC T3 N2 M0 III 297 3.42
C8 75 M PDAC T1c N0 M0 IA <2.0 4.62
C9 72 M PDAC T2 N1 M0 IB 91.6 4.82
C10 56 M PDAC T2 N2 M0 IB 92.2 2.62
C11 59 F PDAC T1c N1 M0 IIB 16.1 1.62
C12 59 F PDAC T1c N1 M0 IIB <2.0 3.12
C13 62 M PDAC T2 N2 M0 III 761 1.62
C14 48 F PDAC T2 N1 M0 IIB 176 11.1
C15 52 M PDAC T1b N1 M0 IIB 18.7 2.71
C16 76 M PDAC T1c N0 M0 IA 6.1 2.63
C17 52 M PDAC T1c N0 M0 IA 29.9 2.01
C18 78 M PDAC:
잔여 암종 없음		 T1a N0 M0 IA 124 6.73
C19 75 F PDAC T1c N1 M0 IIB 187 4.91
C20 57 M PDAC T1c N0 M0 IA <2.0 1.42
CL 나이 성별 진단 T N M AJCC 단계 CA19-9 CEA
N1 41 F 만성 담낭염 N/A 3.9 0.81
N2 67 F 만성 담낭염 8.4 0.84
N3 51 F 만성 담낭염 3.7 0.87
N4 51 M 만성 담낭염 <2.0 7.78
N5 66 M 만성 담낭염 10.7 1.94
N6 44 M 만성 담낭염 13.5 3.45
N7 64 M 만성 담낭염 15.8 3.73
N8 39 M 만성 담낭염 2.6 2.73
N9 61 F 만성 담낭염 6.4 1.11
N10 61 M 만성 담낭염 <2.0 2.73
N11 39 F 만성 담낭염 9.3 1.01
N12 46 M 만성 담낭염 3 0.76
N13 46 F 만성 담낭염 6.6 0.71
N14 61 M 만성 담낭염 7 0.92
N15 68 M 만성 담낭염 10.2 1.83
N16 55 M 만성 담낭염 6 0.4
N17 39 F 만성 담낭염 <2.0 1.7
N18 68 M 만성 담낭염 21.5 3.31
N19 39 F 만성 담낭염 28.3 2.32
N20 31 F 만성 담낭염 8.4 0.47
4-2. EV 농축 및 분리
임상 샘플을 사용하는 실험 세팅에서, EV 분리는 총 EV (TEV) 분리와 PDAC 유래 EV(PDE) 분리로 분류되었다. TEV는 상용 침전 기반 Total Exosomes Isolation 키트(Invitrogen, Pleasanton, CA, USA)를 사용하여 200 μL의 혈장으로부터 분리하였고, PDE는 친화성 기반 방법을 사용하여 분리하였다. PDE의 포획을 위해, ITGA2, ITGAV 및 GPC1에 대한 비오티닐화된 항체와 결합된 자기 비드 (Dynabeads™ M-270 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. EpCAM, GPC1, ITGA2 및 ITGAV는 Human Protein Atlas (HPA, www.proteinatlas.org, 2021년 1월 15일에 액세스, 도 6a)에 접근하여 "예상된 막 단백질 (Predicted Membranous protein)", "모든 암에서 검출 (Detected in all cancer)" 및 "췌장암 조직에서 강한/중간 발현"와 같은 분류 기준에 따라 후보 암 표면 마커로 선택되었다. HPA 프로그램은 다양한 오믹스 (omics) 기술을 통합하여 모든 인간 단백질을 맵핑하는 것을 목표로 하는 개방형 데이터베이스이다.
4-3. RT-qPCR에 의한 miRNA 발현 패턴 분석
시험관 내 (in vitro) 세포 EV 분석을 기반으로, miRNA 발현이 PDE와 환자의 총 EV(TEV) 또는 종양 조직 간에 다를 수 있다고 추측하였다. PDAC 환자의 발현 패턴을 분석하기 위해, PDE, TEV 및 조직에서 7개의 후보 miRNA의 발현을 평가하였다 (도 6b).
균질화된 조직 (20쌍의 암 및 인접 정상 조직 샘플)을 샘플로 하여, 실시예 3-1과 동일하게 RT-qPCR을 수행하여 miRNA 발현 패턴 분석하였다. 이때, 인접 정상 조직을 정상 대조군으로 사용하였고, PDE의 총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Total Exosome RNA 및 Protein Kit(Invitrogen)를 사용하여 추출하였다. miRNA 발현 수준의 정규화는 조직 miRNA에 대한 기준 대조군으로 RNU6B를 사용하였다.
7개의 후보 miRNA 중 5개 (miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290)의 발현이 PDE에서 상향 조절되었다. miRNA 분리 방법에 관계없이, miR-96에 대한 발현의 차이는 발견되지 않았다. miR-103 발현은 종양 조직에서만 상향 조절되었다. TEV에서의 발현 분석은 유의한 차이를 나타내지 않았다 (도 6b). 결론적으로, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290의 발현은 비-PDAC 환자의 EV에 비해 PDE에서 1.83-, 1.91-, 2.00-, 3.02- 및 3.61배 더 높았다 (도 6c 및 표 4). 따라서, 상기 5개의 miRNA는 다중 패널 분석을 위해 추가로 검증되었다.
CL vs. PDAC
microRNAs 평균 FC SD P 값 AUC
miR-21 1.84 0.81 <0.001 0.771
miR-155 1.94 0.97 0.001 0.843
miR-429 3.02 1.75 <0.001 0.867
miR-96 2.13 3.59 0.465 0.507
miR-9 1.45 0.81 0.141 0.593
miR-138 1.16 0.64 0.862 0.502
miR-103 1.02 0.49 0.976 0.505
miR-1290 3.61 4.88 0.029 0.786
miR-4732 1.4 0.79 0.697 0.598
miR-484 1.21 0.46 0.32 0.574
miR-10b 1.83 1.24 0.016 0.693
miR-4644 1.05 1.41 0.317 0.631
miR-3976 N/A N/A N/A N/A
4-4. 피어슨 상관관계 분석
피어슨 상관 관계 분석은 TEV와 종양 조직에서의 miRNA 발현 수준보다 PDE와 종양 조직의 miRNA 발현 수준 사이에 더 높은 상관 관계가 관찰되었음을 보여주었다 (도 6d). miRNA 발현의 배수 변화는 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290이 PDE에서 고도로 발현된 반면, 5개의 miRNA 중 2개(miR-21 및 miR-155)만이 종양 조직에서 유의하게 상승되었음을 보여주었다. 또한, miRNA 중 어느 것도 TEV에서 유의하게 증가된 발현을 나타내지 않았다. 따라서, TEV에서 miRNA의 발현은 진단적 가치가 없었다. 이러한 결과는 PDE가 암 이질성을 반영할 수 있고 miRNA가 EV에 패킹되는 프로세스가 선택적일 수 있음을 나타낸다. 요약하면, PDE가 TEV에서 더 선택적으로 분리될수록, EV 내의 바이오마커가 더 정확하게 프로파일링되었다.
복합 다중 바이오마커의 예측 성능
PDE 단독으로 각 miRNA의 진단력을 평가하기 위해, 동일한 환자 그룹으로 ROC 곡선 분석을 수행하고 우수한 진단 값에 대한 ROC 곡선 아래 면적 (AUC) 컷오프를 >0.65로 설정하였다. 확인된 13개의 miRNA 중 5개의 miRNA (miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290)가 AUC 기준을 충족하였다. 따라서, 췌장암에 대한 진단 바이오마커로서의 잠재력에 대해 추가로 평가하였다. miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290의 AUC 값은 0.693 (95% 신뢰 구간 (CI), 0.529-0.827), 0.771 (95% CI, 0.614-0.888), 0.843 (95% CI, 0.695-0.937), 0.867 (95% CI, 0.529-0.827) 및 0.786 (95% CI, 0.630-0.898)이었다 (도 7a).
암배아항원 (carcinoembryonic antigen, CEA; 컷오프 5ng/mL; AUC 0.771; 민감도 19.0%; 특이도 95.0%) 및 CA19-9 (컷오프 38.5U/mL; AUC 0.780; 민감도 47.62%; 특이도, 100.0%)와 같은 기존 단백질 바이오마커의 임상 기록을 기반으로, 임상 진단에서 miRNA 바이오마커의 중요성은 아직 명확하지 않으며, 이는 추정 바이오마커를 결합하고 PDAC 진단의 정확도에 대한 조합을 평가하도록 권장하였다. 로지스틱 회귀를 사용하여 miRNA 다중 패널의 성능을 평가하였다. 도 7b에 요약된 바와 같이, 최적화된 4개의 miRNA 패널 (패널 1: miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 패널 2: miR-10b, miR-21, miR-155 및 miR-1290; 패널 3: miR-10b, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 패널 4: miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290)을 선택하고, CA19-9 단백질 바이오마커와 결합하였다. miRNA 패널과 CA19-9로 구성된 각 조합 마커 (CM 1-4)는 정상 대조군보다 PDAC 환자에서 ROPCA (Risk of pancreatic cancer algorithm) 점수가 더 높게 나타났으며, 이는 마커가 증가된 PDAC 위험을 식별할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 7c). 가장 민감한 진단력을 가진 CM은 miRNA 패널 3 + CA19-9 (AUC 0.964; 민감도 100%; 특이도 80%)였고, 가장 특이적인 CM은 miRNA 패널 1 + CA19-9 (AUC 0.962; 민감도 85.71%; 특이성, 100%) 이었다 (도 7d).
통계 분석
테스트한 내인성 대조군 miRNA의 적용 가능성은 정규화 유전자의 안정성을 평가하기 위해 개발된 NormFinder, geNorm, BestKeeper 및 RefFinder 알고리즘을 사용하여 평가되었다. 췌장암 환자와 정상 대조군에서 miRNA 발현의 배수 변화는 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었다. miRNA 발현의 배수 변화는 편향을 줄이고, 문헌 [Moore et al., Evaluation of the diagnostic accuracy of the risk of ovarian malignancy algorithm in women with a pelvic mass. Obs. Gynecol. 2011, 118, 280-288.]에서 난소 악성 종양 알고리즘 (ROMA) 위험 예측 방정식의 위험을 개발할 때 사용한 관행에 따르기 위해 자연 로그로 변환되었다. microRNA 패널의 ROC 분석은 모든 비-암 대조군과 비교하여 모든 췌장암 환자에 대해 MedCalc의 로지스틱 회귀 분석 (v20.014, The MedCalc Software Ltd., Ostend, Belgium)을 사용하여 수행하였다. 각 microRNA 바이오마커 조합의 진단력을 평가하기 위해 각 패널에 대한 단변량 ROC 분석을 사용하여 ROC 곡선, AUC 및 표준 오차 (Standard error, SE)를 얻었다. microRNA 바이오마커의 각 조합에 대해 단변량 ROC 분석을 수행한 후, AUC가 0.95이고 AUC가 가장 낮은 SE가 있는 "베스트" 4개의 microRNA 패널을 선택하였다. 그런 다음, 차별화된 진단 성능을 달성하기 위해 4개의 microRNA 패널을 CA19-9 단백질 바이오마커와 결합하였다. 췌장암 위험 알고리즘은 선택된 4개의 microRNA 패널과 CA19-9를 통해 계산되었다. 로지스틱 회귀분석법을 이용한 ROC 분석으로 진단능력을 평가하였다. 이러한 결과를 바탕으로, ROPCA 임의 단위를 개발하고 ROPCA 점수를 활용하여 췌장암을 예측하였다.

Claims (17)

  1. miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자를 포함하는, 췌장암 진단용 바이오마커 조성물.
  2. miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 췌장암 진단용 조성물은 다음의 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA 유전자 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것인, 췌장암 진단용 조성물:
    (i) miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290;
    (ii) miR-10b, miR-21, miR-155 및 miR-1290;
    (iii) miR-10b, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 및
    (iv) miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290.
  4. 제2항에 있어서, 상기 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  5. 제2항에 있어서, CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, 펩타이드 핵산 (peptide nucleic acid, PNA), 나노입자 또는 앱타머를 포함하고, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하 는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 췌장암 진단용 조성물.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 췌장암 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 췌장암 진단용 키트.
  9. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계는 다음의 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 miRNA 유전자 조합의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법:
    (i) miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290;
    (ii) miR-10b, miR-21, miR-155 및 miR-1290;
    (iii) miR-10b, miR-155, miR-429 및 miR-1290; 및
    (iv) miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 췌장 세포, 췌장 조직 및 이들로부터 유래된 세포외 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
  12. 제9항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우 췌장암으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
  13. 제9항 또는 제12항에 있어서, (d) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
  14. 제13항에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 측정된, CA19-9 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우 췌장암으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법.
  15. (a) 시료에 췌장암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 췌장암 치료제의 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 췌장암 환자로부터 분리된 췌장암 세포, 췌장암 조직 및 이들로부터 유래된 세포외 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 췌장암 치료제의 스크리닝 방법.
  17. 제15항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된, miR-10b, miR-21, miR-155, miR-429 및 miR-1290으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 췌장암 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 췌장암 치료제의 스크리닝 방법.
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