KR20240039492A - 비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 혈청 엑소좀 유래 sf3b4 마커 조성물 - Google Patents
비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 혈청 엑소좀 유래 sf3b4 마커 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 혈청 엑소좀 유래 SF3B4 마커 조성물에 관한 것으로서, SF3B4에 대하여 혈장 단백질에서의 발현 수준 및 간암 환자 혈청에서 존재하는 엑소좀 내부의 SF3B4의 발현을 분석하여, 가장 적합한 액체 생검 마커로의 가능성을 확인하고, 현재 신뢰성 있는 바이오마커가 없는 조기 간암에서 진단적 정확도가 높은 새로운 비침습적 바이오마커를 발굴하였다. 이와 같이, 엑소좀을 이용하여 조직 검사 없이 암세포 유전체 및 단백체를 확인함으로, 향후 간암처럼 조직 검사에 따른 위험이 큰 질환군에서 유용한 진단 바이오마커로 활용될 가능성이 매우 높다.
Description
본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 혈청 엑소좀 유래 SF3B4 마커 조성물에 관한 것이다.
간암은 한국인에게 많이 생기는 암종 중 하나로, 2018년 국가암등록통계 및 통계청 자료에서 간암은 발생율 6위, 사망율 2위의 예후가 나쁜 악성 종양이다. 간암 환자 대부분은 기저 간경변증으로 인해 조직 검사시 출혈의 위험성이 높아 상당한 위험을 부담해야 하는데, 이에, 혈액을 기반으로 간암을 조기 진단하고 유전 정보를 획득하는 액체 생검 기술 (Liquid biopsy) 개발이 필요하다. 조직검사는 상당한 위험 부담을 감수해야 하는 것에 비해 혈액으로 진단이 가능하므로 침습적이지 않고 간편하다. 혈액은 조직검사와 달리 치료 과정 중 여러 번 채혈이 가능, 치료 과정 중 치료 반응이나 잔존암 예측에 적합하다.
엑소좀 (exosome)은 암세포를 포함한 대부분의 유핵 세포로부터 생성/분비되는 30-150nm 크기의 작은 나노 소포체 (nano-vesicle)로서, 액체 생검 기술의 선두 주자로 혈액, 소변, 복수, 타액 등 다양한 체액에서 검출되는데, 모세포 (parent cell)의 특이 유전 정보를 수하물(exosomal cargo)로 싣고, 표적 세포에 전달한다. 최근, 엑소좀은 세포-세포간 교류 (cell-cell communication)의 핵심 물질로 주목받고 있으며, 암세포 유래 엑소좀은 종양 침투 및 전이의 핵심 물질로 지목되고 있다. 암세포 엑소좀은 모세포 유전 정보를 종양 미세환경의 다른 표적 세포에 전달하여 정상 세포를 악성화시키는데, 모세포인 암세포 아바타 역할을 수행하는 것으로 추측되고 있다.
한편, 이전부터 간암 진단 마커로 활용되는 알파태아단백(alpha-fetoprotein; AFP)의 경우, 간암 진단 예민도가 60% 가량에 불과한데, 현재까지 간암은 신뢰성 있는 혈청 바이오마커가 없어, 조기 진단 및 예후, 치료 반응 예측을 위한 차세대 혈청 간암 바이오마커 발굴이 절실한 상황이다.
본 발명의 목적은 혈청 엑소좀 유래 SF3B4를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 간암 환자에게 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암 치료 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈청 엑소좀 유래 SF3B4를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 혈액 유래 혈청 엑소좀 시료로부터 SF3B4의 발현수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 SF3B4의 발현수준이 대조군 시료보다 높을 경우 간암으로 판단하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 간암 환자에게 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 혈청 엑소좀 유래 SF3B4 마커 조성물에 관한 것으로서, SF3B4에 대하여 혈장 단백질에서의 발현 수준 및 간암 환자 혈청에서 존재하는 엑소좀 내부의 SF3B4의 발현을 분석하여, 가장 적합한 액체 생검 마커로의 가능성을 확인하고, 현재 신뢰성 있는 바이오마커가 없는 조기 간암에서 진단적 정확도가 높은 새로운 비침습적 바이오마커를 발굴하였다. 이와 같이, 엑소좀을 이용하여 조직 검사 없이 암세포 유전체 및 단백체를 확인함으로, 향후 간암처럼 조직 검사에 따른 위험이 큰 질환군에서 유용한 진단 바이오마커로 활용될 가능성이 매우 높다.
도 1은 엑소좀 분리 및 RNA 추출 과정을 나타낸다.
도 2는 SF3B4의 혈청 엑소좀 간암 진단 마커로써의 특이성 확인을 위한 엑소좀 분리 결과를 나타낸다.
도 3은 SF3B4의 혈청 엑소좀 간암 진단 마커로써의 진단력 평가 결과를 나타낸다.
도 4는 SF3B4의 간질환 코호트에서의 진단력 평가 결과를 나타낸다.
도 5는 조기 간암 판별 여부를 판단하기 위하여 mUICC 병기를 나누어 AUC를 측정하고 기존 간암 혈청 마커인 AFP와 비교하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 기존 혈액 마커인 AFP와 혈청 엑소좀 SF3B4를 combination으로 하여 진단력을 평가한 결과를 나타낸다.
도 7은 각 질환군 AFP와 엑소좀 SF3B4의 양성율 및 간암 환자의 AFP 양성 유무에 따른 엑소좀 SF3B4 양성율 평가 결과를 나타낸다.
도 8은 엑소좀 SF3B4 이외 ELISA 및 autoAb SF3B4의 간암 진단력 결과를 나타낸다.
도 2는 SF3B4의 혈청 엑소좀 간암 진단 마커로써의 특이성 확인을 위한 엑소좀 분리 결과를 나타낸다.
도 3은 SF3B4의 혈청 엑소좀 간암 진단 마커로써의 진단력 평가 결과를 나타낸다.
도 4는 SF3B4의 간질환 코호트에서의 진단력 평가 결과를 나타낸다.
도 5는 조기 간암 판별 여부를 판단하기 위하여 mUICC 병기를 나누어 AUC를 측정하고 기존 간암 혈청 마커인 AFP와 비교하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 기존 혈액 마커인 AFP와 혈청 엑소좀 SF3B4를 combination으로 하여 진단력을 평가한 결과를 나타낸다.
도 7은 각 질환군 AFP와 엑소좀 SF3B4의 양성율 및 간암 환자의 AFP 양성 유무에 따른 엑소좀 SF3B4 양성율 평가 결과를 나타낸다.
도 8은 엑소좀 SF3B4 이외 ELISA 및 autoAb SF3B4의 간암 진단력 결과를 나타낸다.
본 발명은 혈청 엑소좀 유래 SF3B4를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 "SF3B4"는 NCBI accession no. NM_005850.5 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한, 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.
또한, 본 발명은 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 SF3B4의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 SF3B4에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 간암은 조기 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 혈액 유래 혈청 엑소좀 시료로부터 SF3B4의 발현수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 SF3B4의 발현수준이 대조군 시료보다 높을 경우 간암으로 판단하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계는 컷오프(cut-off) 값에 의하여 수행되는 것으로, 상기 컷오프(cut-off) 값은 상기 SF3B4에 대해서 Ct값(Threshold Cycle)이 0.85일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 간암은 조기 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 SF3B4의 발현수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 또는 단백질 칩을 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 간암 환자에게 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암 치료 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 SF3B4 발현 억제제는 SF3B4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 SF3B4 활성 억제제는 SF3B4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1.
엑소좀
분리 및 검증
(1) 간암 세포, 정상 간세포 배양액, 환자 혈청에서의 엑소좀 분리 및 RNA 추출
간암 세포, 정상 간세포 배양액은 10mL을, 정상 및 간염, 간경화, 간암 환자 혈청은 300ul를 사용하고 Exosome RNA isolation kit (SeraMir™ Exosome RNA Amplification (Cat #RA806A-1))로 추출하였다.
간암 세포, 정상 간세포 배양액에서의 엑소좀 분리: 150mm dish에 기른 세포를 PBS로 2번 washing 한 후 serum free media 15mL을 넣고 72시간 배양하였다. 배양액 10mL을 15mL conical tube에 담고 3000g에서 15분간 원심분리하여 cell debris를 제거, 새로운 15mL conical tube에 상층액만 옮겨 담아 ExoQuick™ 2mL를 넣고 Vortex 해준 후, 4℃에 하루 보관한 후, 1500g에서 30분간 원심분리하여 생성된 Pellet에서 RNA를 추출하였다.
정상 및 간염, 간경화, 간암 환자 혈청에서의 엑소좀 분리: 환자 혈청 300ul에 ExoQuick™ 72ul를 넣고 Vortex 해준 후, 4℃에 하루 보관한 후, 13,000rpm, 4℃, 2분동안 원심분리 하여 생성된 Pellet에서 RNA를 추출하였다.
Pellet에 Lysis buffer 350ul를 넣어 준 후 pipetting하여 풀어주고 RT에서 5분동안 incubation 하였다. EtOH 200ul를 첨가한 후 10초간 Vortex를 진행하였다.
Spin Column과 Collection Tube를 준비하여 Sample 전량을 Column에 옮겨준 후 상온에서 13,000rpm, 1분 동안 원심분리하여 Collection Tube에 내려온 용액을 제거 후 Wash Buffer 400ul를 넣어주고 상온에서 13,000rpm 1분간 원심분리 및 Collection Tube에 내려온 용액을 제거 후 반복작업 후 13,000rpm, 2분간 원심분리를 진행하여 최종 건조시켰다.
Collection Tube 대신 Spin Column을 e-tube와 결합시킨 후 Elution buffer 30ul를 첨가하여 2,000rpm 2분간 원심분리 후, 13,000rpm, 1분간 최종 원심분리하는 작업을 2번 반복하였다. 최종 수득한 용액으로 Nano Drop을 이용해 농도를 측정하였다(도 1).
(2) 환자 buffy coat와 혈청에서 RNA 추출
EDTA-containing tube 혹은 혈청 분리 tube에 채혈한 혈액을 수집하고 2,000g, 4℃, 5분간 원심분리하여 buffy coat와 혈청을 분리하였다.
정상 및 간암 환자의 buffy coat와 혈청 300ul를 사용하고 TRIzol™ reagent(Invitrogen)로 RNA를 추출하였다.
2. 검증용 간질환
코호트
혈액 및 임상정보 수집
아주대학교 병원에서 IRB를 통과 후, 인체자원은행을 통해 간질환 코호트 159명 (정상 26명, 만성간염 26명, 간경화 32명, 간암 75명)의 혈청 및 임상정보를 분양 받아 연구를 진행하였다.
3. qRT-PCR 분석을 통하여 간질환 코호트 환자 혈청 및 혈청 엑소좀에서 SF3B4의 발현량 측정
SF3B4의 발현을 측정하기 위하여 buffy coat와 환자 혈청 300ul를 사용하였고, TRIzol reagent(Cat #15596018)(Ivitrogen), Exosome RNA isolation kit (SeraMir™ Exosome RNA Amplification (Cat #RA806A-1))(SBI, System Biosciences)를 사용, PrimeScript™ RT Master Mix(Perfect Real Time)(Cat #RR036A)(TaKaRa), miScript RT Ⅱ kit (Cat #218161)(QIAGEN)를 사용하여 cDNA 합성을 진행하였다.
Buffy coat RNA 혹은 혈청 RNA와 RNA Free Water (RFW)를 합하여 8ul에 맞추고, 5X PrimeScript RT Master Mix를 2ul 넣어서 총 10ul로 cDNA 합성을 진행하였다.
혈청 엑소좀 RNA와 RNA Free Water (RFW)를 합하여 12ul에 맞추고, miScript RT Ⅱ Buffer를 8ul (5X miScript Hiflex buffer 4ul, 10X miScript Nucleics Mix 2ul, miScript Reverse TranScriptase Mix 2ul) 넣어서 총 20ul로 cDNA 합성을 진행하였다.
cDNA 조건은 다음과 같이 설정하였다.
(PrimeScript RT master mix 사용시)
A.
Stage 1 : 37℃, 15분
B.
Stage 2 : 85℃, 5초 후 10℃, -ing
(miScript RT Ⅱ kit 사용시)
A.
Stage 1 : 37℃, 60분
B.
Stage 2 : 95℃, 5분 후 10℃, -ing
합성된 cDNA는 1/20 희석하여 사용하였다.
표 1에 기재한 서열을 가진 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 M.biotech (Hanam, Korea)에서 구입하여 사용하였다. qPCR Master Mix (2X, High ROX) (Gendepot, Cat #Q5602)는 5ul 사용하여 총 용량 10ul로 qRT-PCR을 진행하였다.
| Gene | Accession No. | Forward sequence | Reverse sequence |
| SF3B4 | NM_005850.5 | 5'- AGTCAACACCCACATGCCAA -3' | 5'- GGGTCCAGGTTCCCAATGAAA -3' |
| HMBS | NM_001024382.2 | 5'-GGAGGGCAGAAGGAAGAAAACAG-3' | 5'-CACTGTCCGTCTGTATGCGAG-3' |
qRT-PCR 조건은 아래와 같이 설정하였다.
A.
Stage 1 : 95℃, 2분
B.
Stage 2 : 95℃, 15초
C.
58℃, 34초
D.
72℃, 30초
E.
→ stage 2 : 40 cycle.
4.
SF3B4
결과의 통계 분석
Microsoft Office Excel 프로그램을 사용하여 상대적인 농도를 계산한 후, 통계 분석은 MedCalc statistical software 및 SPSS v22 분석 프로그램을 이용하여 분석을 진행하였다.
<
실시예
1> SF3B4의 혈청 엑소좀 간암 진단 마커로써의 특이성 확인을 위한 엑소좀 분리
엑소좀에서의 SF3B4 발현 여부를 확인하기 위하여 Exocarta database에서 다양한 질병의 환자 혈액 유래 엑소좀에서의 SF3B4 발현 여부를 확인하였을 때, 간암 환자 혈액 유래 엑소좀에서 SF3B4가 발현하는 것을 확인하였다.
여러 세포에서 생산되는 small extracellular vesicles의 일종인 엑소좀(exosome)은 세포가 가지고 있는 단백질, 지질, 핵산, 대사물질 등 생물학적 활성을 보이는 다양한 물질을 포함하고 있고, 이들이 다른 세포로 전달되면서 기능을 수행한다고 알려져 있다. 엑소좀의 안정적인 물질을 이동시키기 때문에 비침습적 액체생검에서의 임상적용에 주요 도구로 여겨져 여러 연구결과가 보고되고 있으므로 SF3B4의 발현을 혈청, 정상 간 세포주, 간암 세포주 유래 엑소좀에서 분리한 RNA에서 측정해보기로 하였다.
혈청 엑소좀이 잘 분리되었음을 확인하기 위하여, NTA (Nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 분리된 엑소좀의 크기를 확인하고, 엑소좀 마커인 CD63, CD81, CD9에서 western blot을 통해 단백질을 확인하였을 때, 혈청 엑소좀(serum exosome)에서 발현이 된 것을 확인할 수 있었고, ER 마커인 Bip/Grp78에서는 세포 용해물(cell lysate)에서만 감지되는 것을 확인하였다.
다음으로 SF3B4가 정상 간 세포주보다 간암 세포주에서의 발현이 높은 것을 확인하기 위하여 각각 세포주의 세포 용해물(cell lysate)과 엑소좀(exosome)에서의 SF3B4 발현을 확인하였을 때, 정상 간 세포주보다 간암 세포주에서의 SF3B4 발현이 세포 용해물(cell lysate)과 엑소좀(exosome)에서 모두 높은 것을 확인하였다.
또한, SF3B4가 엑소좀을 통해 다른 세포로 전달되어 발현이 증가되는 것을 확인하기 위하여 간암 세포주의 엑소좀(exosome)을 정상 간 세포에 처리하였을 때, SF3B4 발현 변화를 확인하였다. 정상 간 세포에 간암 세포 유래 엑소좀(exosome)을 농도별로 처리하였을 때, SF3B4 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, endocytosis 억제제를 함께 처리한 경우 엑소좀(exosome)을 처리하여도 SF3B4의 발현이 증가하지 않는 것을 확인하였다(도 2).
<
실시예
2>
SF3B4의
혈청
엑소좀
간암 진단
마커로써의
진단력
평가
간암 세포주 다음으로 간암 환자 혈액 엑소좀에서의 SF3B4 발현을 확인하기 위해 10명의 정상 환자와 10명의 간암환자의 buffy-coat와 혈청에서 qRT-PCR을 이용하여 발현을 측정하였을 때, 정상환자와 간암환자의 발현 차이를 볼 수 없었다. 추출한 혈청 엑소좀 RNA에서 SF3B4의 발현을 확인한 결과 정상군은 거의 발현되지 않는 반면 간암 환자샘플 모두 과발현되는 것을 확인할 수 있었다.
나아가 간 질환별 환자들에서 간암인 환자와 그렇지 않은 환자의 혈청 엑소좀에서 SF3B4 발현을 확인하였을 때에도, 간암 환자에서의 발현이 간암이 아닌 환자에서의 발현보다 높은 것을 확인할 수 있었다(도 3).
<
실시예
3>
엑소좀
SF3B4의
간질환
코호트에서의
진단력
평가
아주대병원 소화기내과 내원 환자에서 SF3B4의 간암 진단력을 평가하기 위해 정상간 (n=26), 만성간염 (n=26), 간경화 (n=32), mUICC I (n=33), mUICC II (n=9), mUICC III/IV (n=33) 간암 환자 혈청 엑소좀에서 qRT-PCR로 SF3B4의 발현을 확인하였다. 비간암 (HC, CH, LC)에 비해 간암 환자 혈청 엑소좀에서의 SF3B4 발현이 통계적으로 유의하게 증가됨을 확인하였다(Welch's t-test, compare to normal liver; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compare to CH; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, compare to LC; §P<0.05, §§P<0.01, §§§P<0.001)(도 4).
비간암 (HC, CH, LC)에 대한 간암 환자의 엑소좀 SF3B4의 발현 cut-off 값은 qRT-PCR 시행 후 나온 Ct값을 정량화하여 정상군에 대한 상대적인 발현비율을 log 10으로 환산하였으며, 최적점은 0.85로 도출되었다. SF3B4가 0.85일 때, 민감도 (Sensitivity)는 76%, 특이도(Specificity)는 85.19%로 나타났다.
<
실시예
4>
엑소좀
SF3B4의
조기 간암
마커로서의
검증 결과
조기 간암 판별 여부를 판단하기 위하여 mUICC 병기를 나누어 AUC를 측정하고 기존 간암 혈청 마커인 AFP와 비교하여 분석하여 통계적으로 유의한 우월성을 확인하였다.
전체 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서 AFP는 AUC가 0.673으로 나타났고, 엑소좀 SF3B4는 AUC 0.884, 정상을 제외한 간암 고위험군인 CH와 LC에서 비교하였을 때, AFP의 AUC는 0.548로, 엑소좀 SF3B4는 0.854로 상당히 높은 진단력을 보였다.
mUICC I과 II를 포함한 조기 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서 AFP는 AUC가 0.582으로 나타났고, 엑소좀 SF3B4은 AUC 0.933, 정상을 제외한 간암 고위험군인 CH와 LC에서 비교하였을 때, AFP의 AUC는 0.565로, 엑소좀 SF3B4는 0.910로 역시 상당한 차이를 보였다.
종양 크기 2cm 이하의 mUICC I 병기의 조기 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서 AFP는 AUC가 0.534으로 나타났고, 엑소좀 SF3B4은 AUC 0.933, 정상을 제외한 간암 고위험군인 CH와 LC에서 비교하였을 때, AFP의 AUC는 0.635로, 엑소좀 SF3B4는 0.910로 유의한 차이를 보였다(도 5).
다음으로 기존 혈액 마커인 AFP와 혈청 엑소좀 SF3B4를 combination으로 하여 진단력을 평가하였을 때, 전체 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서 AUC가 0.916 (95% CI : 0.861 - 0.954)으로 나타났고, 정상을 제외한 간암 고위험군인 CH와 LC에서 비교하였을 때, AUC는 0.894 (95% CI : 0.827 - 0.941) 상당히 높은 진단력을 보였다.
mUICC I과 II를 포함한 조기 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서 AUC가 0.934 (95% CI : 0.875 - 0.971)으로 나타났고, 정상을 제외한 간암 고위험군인 CH와 LC에서 비교하였을 때, AUC는 0.910 (95% CI : 0.835 - 0.959) 상당히 높은 진단력을 보였다.
mUICC I 병기의 조기 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서 AUC가 0.932 (95% CI : 0.869 - 0.971)으로 나타났고, 정상을 제외한 간암 고위험군인 CH와 LC에서 비교하였을 때, AUC는 0.907 (95% CI : 0.827 - 0.959) 상당히 높은 진단력을 보였다(도 6).
정상간에서의 양성 비율을 보았을 때, AFP는 0%, 엑소좀 SF3B4은 4%로 측정되었다. 간염군에서는 AFP는 35%, 엑소좀 SF3B4은 18%로 측정되었다. 간경화군에서는 AFP는 56%, 엑소좀 SF3B4은 22%로 측정되었다. mUICC I 병기 간암 환자군에서는 AFP는 12%, 엑소좀 SF3B4은 82%로 간암 측정 마커인 AFP보다 현저히 높은 양성 비율로 측정되었다. mUICC II에서는 AFP는 56%, 엑소좀 SF3B4은 89%로 나타났다. mUICC III/IV 간암환자에서 AFP가 59%, 엑소좀 SF3B4은 64%로 나타났다. 전반적으로 비간암군에서는 AFP보다 엑소좀 SF3B4의 양성 비율이 현저히 낮았고, 특히 조기 간암 군에서 엑소좀 SF3B4의 양성 비율은 AFP보다 매우 높은 것으로 나타났다.
전체 간암 환자군에서 AFP의 양성 유무에 따라 엑소좀 SF3B4의 양성비율을 비교해 보았을 때, AFP가 음성인 간암 환자에서 SF3B4는 81% 양성으로 나타났다.
UICC I/II 병기 간암 환자군에서 AFP의 양성 유무에 따라 SF3B4의 양성비율을 비교해 보았을 때, AFP가 음성인 간암 환자에서 엑소좀 SF3B4는 85% 양성으로 매우 높은 진단력을 보였다.
mUICC I 병기 간암 환자군에서 AFP의 양성 유무에 따라 SF3B4의 양성비율을 비교해 보았을 때, AFP가 음성인 간암 환자에서 엑소좀 SF3B4는 86% 양성으로 조기 간암 진단력이 매우 낮은 AFP를 극복할 수 있는 마커로의 가능성을 보였다(도 7).
<
실시예
5>
엑소좀
SF3B4
이외 ELISA 및
autoAb
SF3B4
의 간암
진단력
엑소좀 이외에도 간암을 진단할 수 있는 추가 기법에 대해 검토를 진행하였다. 정상군, 간염 환자, 간경화 환자, 간암 환자의 혈장(plasma)를 이용하여 ELISA를 수행한 결과, 정상군 대비 간암 환자 혈장(plasma) 에서의 SF3B4 발현은 높았으나, 비간암 (정상, 간염, 간경화)과 간암 환자 사이에서의 발현 차이에 유의성은 없었다. SF3B4에 대한 자가항체(autoantibody) 측정을 수행하였을 때도 ELISA와 유사한 결과를 보였다.
ROC 분석을 수행한 결과, ELISA와 자가항체(Autoantibody)에서 모두 SF3B4의 발현 값이 기존 간암 혈액 마커로 사용되는 AFP의 진단력보다 통계적으로 유의하게 높지 않은 것을 확인하였다(도 8).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 혈청 엑소좀 유래 SF3B4를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물.
- 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 SF3B4의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 SF3B4에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 간암은 조기 간암인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트.
- (1) 환자에서 분리된 혈액 유래 혈청 엑소좀 시료로부터 SF3B4의 발현수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 측정된 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 측정된 SF3B4의 발현수준이 대조군 시료보다 높을 경우 간암으로 판단하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제6항에 있어서, (3) 단계는 컷오프(cut-off) 값에 의하여 수행되는 것으로, 상기 컷오프(cut-off) 값은 상기 SF3B4에 대해서 Ct값(Threshold Cycle)이 0.85인 것을 특징으로 하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 간암은 조기 간암인 것을 특징으로 하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 간암 환자에게 혈청 엑소좀 유래 SF3B4의 발현 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암 치료 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 SF3B4의 발현 또는 활성 억제제는 SF3B4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)이거나, SF3B4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물인 것을 특징으로 하는 간암 치료 방법.
Priority Applications (2)
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| KR1020220118138A KR20240039492A (ko) | 2022-09-19 | 2022-09-19 | 비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 혈청 엑소좀 유래 sf3b4 마커 조성물 |
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR102025005B1 (ko) | 2018-01-25 | 2019-09-24 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커 및 이의용도 |
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Patent Citations (1)
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| KR102025005B1 (ko) | 2018-01-25 | 2019-09-24 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커 및 이의용도 |
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