KR20230144442A - 급성기 만성골수성백혈병 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 급성기 만성골수성백혈병 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 만성골수성백혈병 진단용 신규 바이오마커와 함께 환자 검체에서 상기 바이오마커를 검출 또는 측정할 수 있는 최적의 항체 및 프라이머 쌍을 포함하는 만성골수성백혈병 진단 조성물 및 키트를 제공하며, 이를 통해 만성골수성백혈병의 급성기 진행 여부를 신속하고 정확하게 판별하여 환자 맞춤 치료법을 선택할 수 있다.
Description
본 발명은 급성기 만성골수성백혈병 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
백혈병은 혈액 또는 골수 속에 종양세포 (백혈병 세포)가 출현하는 질병으로, 백혈병 세포의 종류에 따라 골수성백혈병과 림프성백혈병으로 나뉘며 임상소견과 검사소견 그리고 경과에 따라 급성과 만성으로 구분한다.
만성골수성백혈병(Chronic myelogenous leukemia, CML)은 필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome)를 포함하는 조혈모세포의 클론이 비정상적으로 확장되면서 생기는 혈액암이다. 필라델피아 염색체는 9번 염색체와 22번 염색체의 각각에서 일정 부분이 절단된 후 두 조각이 서로 위치를 바꾸어 이동하는 전위(translocation)에 의한 것으로, 염색체 전위로 인해 9번 염색체의 ABL 유전자와 22번 염색체의 BCR 유전자의 융합이 일어나 BCR-ABL 융합 유전자가 비정상적인 티로신 키나아제(tyrosine kinase)의 활성을 갖는 BCR-ABL 융합 단백질을 생성하며, 이들 중 발암 단백질인 P210은 골수구 전구세포들의 세포자연사(apoptosis)를 억제함으로써 이들 세포의 비정상적인 증폭을 초래한다.
만성골수성백혈병 환자의 병기는 크게 만성기(chronic phase), 가속기(accelerated phase) 및 급성기(blast phase)로 구분되며, 각 시기마다 환자의 치료 성적과 생존율이 다르다. 진단 시 환자의 90% 이상은 만성기 상태에 있으며 약 3 ~ 4년간 지속되며, 보통 특별한 증상이 없으며 치료에 의해 증상 및 징후, 혈액학적 소견 등이 조절될 수 있지만 만성기가 지속적으로 유지될 수는 없다. 혈액검사에서는 혈소판의 증가와 빈혈을 보이며, 골수검사에서도 백혈구 계열의 세포가 적혈구 계열보다 50배나 증가되고 미성숙 아세포(blast)가 10% 이하인 양상을 보인다. 이후 만성기에서 급성기로 바로 급격히 전환될 수도 있지만 대체로 중간에 가속기를 거치게 된다. 가속기에는 약물치료에도 불구하고 혈액검사상 백혈구 수가 계속 증가하고 혈소판 감소를 보이며, 호염구가 증가하고 말초혈액에서 미성숙 아세포가 증가한다. 자연적인 경과로 골수의 30% 이상이 악성 골수 아세포와 전골수세포로 가득 차게 되고 하나의 미성숙 아세포가 수백만 개의 쓸모 없는 백혈구를 생산하면 급성기에 도달한 것으로, 만성기에서 급성기로 이행되는 시기는 수년에서 10년 이상까지 개인차가 있지만, 75 ~ 80%에서 2.5 ~ 3년 후 급성기로 진행되는 것으로 알려져 있다. 급성기인 경우 약물 저항성이 매우 높고 병의 진행이 급격히 진행되어 생존율이 매우 낮다.
하지만 만성골수성백혈병은 증상이나 혈액검사 또는 골수검사에 의한 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 수 변화에 의존하여 병의 진행을 판단하게 되며, 특히 급성기 전환에 따른 분자생물학적, 세포유전학적 변화에 대해서는 연구가 부족한 실정이다. 따라서 환자의 생존율과 생존 기간을 최대한 늘리기 위한 최적의 치료 방법을 선택하기 위해서는 급성기 만성골수성백혈병을 객관적으로, 그리고 정량적으로 예측할 수 있는 바이오마커에 대한 연구 및 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 급성기 만성골수성백혈병 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 급성기 만성골수성백혈병을 진단하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 급성기 만성골수성백혈병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 “급성기 만성골수성백혈병(blast crisis chronic myelogenous leukemia, bc-CML)”은 만성골수성백혈병의 병기 중 마지막 단계로, 약물 저항성이 매우 높고 병의 진행이 급격히 진행되어 생존율이 매우 낮다.
본 발명에서 사용된 “진단”은 아직 진단되지 않거나 진단을 받은 개체를 대상으로 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 바이오마커를 이용하여 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행 여부를 확인하는 것일 수 있다.
여기서 “바이오마커(biomarker)”란 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 물질로서 생체 변화를 알아낼 수 있는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 본 발명에서는 급성기 만성골수성백혈병 진단용 바이오마커로서 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질을 이용할 수 있다.
FLT3는 대부분의 급성골수성백혈병(acute myeloid leukemia) 환자에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 약 30 ~ 40%의 급성골수성백혈병 환자가 FLT3의 활성화 돌연변이를 가지고 있다. 하지만 만성골수성백혈병, 특히 급성기로의 진행 시 FLT3의 급격한 발현 증가에 대해 전혀 알려진 바가 없었다.
또한, TAZ는 혈액암에서 발현을 거의 하지 않는 것으로 알려져 있었다.
하지만 본 발명자들의 환자 검체를 이용한 유전자 및 단백질 발현 분석을 통해 급성기 만성골수성백혈병에서 특이적으로 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질이 발현하는 것이 처음으로 확인하였다.
이러한 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해서는 각 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제가 요구된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 각 유전자 또는 단백질에 각각 상보적이거나 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드, 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA 및 압타머로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)를 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드로 구성되며, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 수준에서 15 ~ 30개의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 FLT3 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 다른 프라이머 쌍에 비해 FLT3 유전자 증폭률이 높아, FLT3 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제로서 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 TAZ 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 다른 프라이머 쌍에 비해 TAZ 유전자 증폭률이 높아, TAZ 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제로서 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 "프로브(probe)"는 자연의 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
이러한 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드는 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로서, 형광물질, 예를 들면, Cy3, Cy5 등과 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 핵산의 혼성화 결과를 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에서는 각 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론항체, 다클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 여기서 “특이적으로 결합하는”이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다. 또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.
상기 항체는 당업계에 공지된 기술을 통해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 단클론항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method) (Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다클론항체는 표적 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 동물로부터 제조 가능하다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 FLT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S), Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343) 및 FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 FLT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 단백질 검출 방법에 따라 검출 효율이 상이하므로, 진단 정확도 및 특이성을 고려하여 선택 가능하다.
예를 들면, 웨스턴 블롯을 통해 FLT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S), Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343) 및 FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437) 모두 사용 가능하며, 면역형광법 및 유세포 분석을 통해 FLT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S)만 사용 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 TAZ 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S) 및 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 TAZ 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 단백질 검출 방법에 따라 검출 효율이 상이하므로, 진단 정확도 및 특이성을 고려하여 선택 가능하다.
예를 들면, 웨스턴 블롯을 통해 TAZ 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S) 및 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199) 모두 사용 가능하며, 면역형광법 및 유세포 분석을 통해 TAZ 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S)만 사용 가능하다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 급성기 만성골수성백혈병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 “급성기 만성골수성백혈병 진단용 키트”는 검사 대상자, 보다 구체적으로 병기가 확인되지 않은 만성골수성백혈병 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 통해 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 이를 통해 검사 대상자의 급성기로의 진행 여부를 신속, 정확하고 간편하게 진단할 수 있다.
상기 키트는 통상적인 mRNA 발현 및 단백질 정량 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 PCR(polymerase chain reaction) 키트, RT-PCR(reverse transcription PCR) 키트, DNA 칩 키트, 단백질 키트 및 어레이 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; b) 상기 생물학적 시료에서 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 측정된 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 급성기 만성골수성백혈병을 진단하기 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 a) 내지 c) 단계에 대해 다음에서 자세히 살펴보며, 전술한 내용과 공통된 내용은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 a) 단계는 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행 여부에 대한 검사가 필요한 개체 또는 대상자로부터 생물학적 시료를 채취하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 피험자는 병기가 확인되지 않은 만성골수성백혈병 환자이거나 만성기 또는 가속기 만성골수성백혈병 환자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 골수, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 b) 단계는 생물학적 시료에서 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 과정이다.
본 발명에서의 유전자 또는 단백질 발현 수준은 통상적인 mRNA 발현 및 단백질 정량 분석 방법에 기반하여 제한 없이 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 FLT3 및 TAZ 유전자의 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 FLT3 유전자의 발현 수준은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것일 수 있다.
특히 FLT3 유전자 증폭률이 높은 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 TAZ 유전자의 발현 수준은 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것일 수 있다.
특히 TAZ 유전자 증폭률이 높은 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 FLT3 및 TAZ 단백질의 발현 수준은 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(western blot), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 면역확산(radioimmunodiffusion), 면역침강(immunoprecipitation), 유세포 분석(flow cytometry) 면역조직화학(immunohistochemistry), 면역형광(immunofluorescnce) 및 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 FLT3 단백질의 발현 수준은 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S), Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343) 및 FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것일 수 있다.
예를 들면, 웨스턴 블롯을 통해 FLT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S), Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343) 및 FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437) 모두 사용 가능하며, 면역형광법 및 유세포 분석을 통해 FLT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S)만 사용 가능하다.
또한, 상기 TAZ 단백질의 발현 수준은 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S) 및 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것일 수 있다.
예를 들면, 웨스턴 블롯을 통해 TAZ 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S) 및 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199) 모두 사용 가능하며, 면역형광법 및 유세포 분석을 통해 TAZ 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우에는 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S)만 사용 가능하다.
상기 c) 단계는 생물학적 시료에서 측정된 2개의 유전자 또는 단백질 발현 수준에 근거하여 피험자 또는 개체의 만성골수성백혈병의 급성기 진행 여부를 판단하는 과정이다.
상기 측정된 유전자 또는 단백질 발현 수준은 대조군, 보다 구체적으로는 급성기로 진행되지 않은 만성기 또는 가속기 만성골수성백혈병 환자 시료와 비교 분석하여 급성기 만성골수성백혈병로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 대조군과 비교하여 피험자에서 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 높은 경우 급성기 만성골수성백혈병으로 진단하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 급성기 만성골수성백혈병 진단용 신규 바이오마커와 함께 환자 검체에서 상기 바이오마커를 검출 또는 측정할 수 있는 최적의 항체 및 프라이머 쌍을 포함하는 만성골수성백혈병 진단 조성물 및 키트를 제공하며, 이를 통해 만성골수성백혈병의 급성기 진행 여부을 신속하고 정확하게 판별하여 환자 맞춤 치료법을 선택할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 웨스턴 블롯을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 FLT3 및 TAZ 단백질 발현을 확인한 결과이다. 여기서 CP 및 BC는 각각 만성기 및 급성기 환자 시료를 의미하고, CHR은 백혈구와 혈소판 수치가 정상으로 돌아와 미성숙 세포가 없고 비장 또한 정상 크기로 돌아온 것을 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광법을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 FLT3 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광법을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 TAZ 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 qRT-PCR을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 FLT3 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 qRT-PCR을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 TAZ(WWTR1) 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광법을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 FLT3 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광법을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 TAZ 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 qRT-PCR을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 FLT3 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 qRT-PCR을 통해 만성골수성백혈병 환자 시료에서 TAZ(WWTR1) 유전자 발현을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
준비예 1. 환자 검체 준비
만성골수성백혈병(CML) 환자의 골수로부터 세포를 분리하여 보관 중이던 시료 (만성기 30명과 급성기 29명이며, 이 중 급성기 12명의 연속시료 포함)를 익명화된 임상정보와 함께 확보하였다. 시료를 수집한 당일, -80℃에서 보관된 시료를 37℃ 항온수조에서 녹인 후 800 g에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하여 실험에서 사용하였다.
실시예 1. 웨스턴 블롯을 이용한 FLT3 및 TAZ 검출
환자 세포 내 FLT3 및 TAZ 단백질의 발현을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 실시하였다.
세포 1X107를 1% NP-40 세포 용해 버퍼 (150 mM sodium chloride, 1% NP-40 및 50 mM Tris HCL pH 7.5)로 세포 용해를 한 후, 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 획득한 상층액에 4XSB (Tris pH 6.8 50 mM, SDS 8%, Bromophenol blue 0.008%, Glycerol 40% 및 b-Mercaptoethanol 20%)를 1:1로 혼합한 후 99℃에서 8분간 끓여 사용하였다. 각 단백질 샘플은 BSA(bovine serum albumin)로 단백질 정량한 다음 동일한 양의 단백질을 7.5%의 SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 옮겨서 1차 항체와 반응시켰다. 이후 막을 세척한 후 2차 항체와 반응시켰고, 단백질 밴드를 ECL 용액(enhanced chemiluminescence solution)으로 발색하여 확인하였다. 여기서 1차 항체로는 FLT3에 대해 Flt-3/Flk-2 항체 (BV10) (Santa cruz, sc-21788), Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343), FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S) 및 FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437)를 사용하였고, TAZ에 대해 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S) 및 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199)를 사용하였다. 그리고 p-STAT3 토끼 단클론항체(CST, 9145s), STAT3 토끼 단클론항체(CST, 4904s), c-ABL 항체 및 Bcr-Abl 토끼 다클론항체(CST, 2862S), MEK1/2 토끼 단클론항체(CST, 8727s), ERK 토끼 단클론항체(CST, 4695S), Vinculin 토끼 단클론항체(Abcam, ab129002), GAPDH 토끼 다클론항체(Santacruz, sc-25778) 및 Actin 쥐 단클론항체(Santacruz, sc-47778)를 사용하였다. 항체의 희석비율은 GAPDH 1 : 50k, Vinculin 1 : 1500k, STAT3, ERK, MEK1/2 1 : 5k이며, 이외 모든 항체는 1 : 1k로 희석하여 사용하였다. 2차 항체로는 항-토끼 IgG 항체 (Genetex, gtx213110-01) 및 항-쥐 IgG 항체 (Genetex, gtx213111-01)를 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, cp-CML에서는 FLT3가 전혀 발현되지 않았으나. bc-CML의 13명 (44.8%)에서는 FLT3 발현이 확인되었다. 그리고 FLT3 항체 중 sc-21788는 정확성이 떨어져 단백질 밴드가 나타나지 않았으며, sc-101343, 3462S 및 A12437을 이용해 FLT3를 검출할 수 있었다.
한편, 혈액암에서는 거의 발현하지 않는 것으로 알려진 TAZ 단백질도 bc-CML 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다. 사용된 TAZ 항체 모두 TAZ를 검출할 수 있었다.
실시예 2. 면역형광법을 이용한 FLT3 및 TAZ 검출
환자 세포 내 FLT3 및 TAZ 단백질의 발현을 확인하기 위해, 면역형광(immunofluorescence) 분석을 실시하였다.
세포 1X106를 PBS로 세척하여 4℃에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시키고 0.1% 트리톤 X-100 함유 PBS로 투과시켜 2% BSA-PBS로 차단하였다. 그리고 세포를 1차 항체로 16시간 배양한 후 1XTBS-T로 3회 세척하고 2차 항체로 2시간 배양하였다. 이후, 세포를 1XTBS-T로 4회 세척한 후 DAKO 봉입제(mounting medium, Invitrogen #P36930)로 봉입하여 형광현미경 (Leica, DMi8) 하에서 세포를 관찰하였다. 여기서 1차 항체로는 FLT3에 대해 Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343), Flt-3/Flk-2 항체 (BV10) (Santa cruz, sc-21788), FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437), Flt-3/Flk-2 항체 (R&D system, MAB812) 및 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S)를 1 : 200 비율로 희석하여 사용하였고, TAZ에 대해 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), WWTR1 단클론항체 (Sigma, AMAb90730), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S), 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199) 및 TAZ/WWTR1 항체 (Novus, NB600-220)를 1 : 200으로 희석하여 사용하였다. 2차 항체로는 항-토끼 IgG 항체 (Invitrogen, A11034) 및 항-쥐 IgG 항체 (Invitrogen, A11029)를 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, FLT3 항체 중 sc-101343, sc-21788, A12437 및 MAB812는 정확성이 떨어져 cp-CML과 bc-CML을 구분하기 어려운 반면, 3462S는 명확하게 bc-CML에서만 형광 발현이 확인되었다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, TAZ 항체 중 AMAb90730, 8418S, 4883S, sc-101199 및 NB600-220는 정확성이 떨어져 형광 발현을 확인할 수 없으나, 83669S는 명확하게 형광 발현이 확인되었다.
실시예 3. qRT-PCR을 이용한 FLT3 및 TAZ 검출
환자 세포 내 FLT3 및 TAZ 유전자의 발현을 확인하기 위해, qRT-PCR(quantitative RT-PCR)을 실시하였다.
RNeasy Plus mini kit (QIAGEN, 4134)를 이용하여 세포 2X106로부터 RNA를 추출한 후 Script reverse transcriptase (Bio-Rad, 1708890)를 이용하여 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하였다. 이후 KAPA SYBR FAST Kapa SYBR FAST qPCR Master Mix (KM4103), cDNA 및 프라이머 쌍 (하기 표 1 참조)을 혼합하여 PCR 혼합물(mixture)을 준비하였고, real-time PCR system (Applied Biosystems, 4376600)을 통해 qRT-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분 변성한 후 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 40회 반복하고 95℃에서 15분간 반응하였다.
| 프라이머 명칭 | 프라이머 서열 (5’-3’) | 서열번호 | |
| FLT3 | 프라이머 쌍 1 | F: GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC | 1 |
| R: CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC | 2 | ||
| 프라이머 쌍 2 | F: AAGCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC | 3 | |
| R: CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC | 4 | ||
| 프라이머 쌍 3 | F: TAAACTCTCCAGGCCCCTTC | 5 | |
| R: CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC | 6 | ||
| TAZ | 프라이머 쌍 1 | F: AATGGAGGGCCATATCATTCG | 7 |
| R: GTCCTGCGTTTTCTCCTGTATC | 8 | ||
| 프라이머 쌍 2 | F: TCACCAACACCAGCAGCAGATG | 9 | |
| R: GGATTCTCTGAAGCCGCAGTTTC | 10 | ||
| 프라이머 쌍 3 | F: GAGGACTTCCTCAGCAATGTGG | 11 | |
| R: AAAGTTCCTAAGTCAACGTTTGTT | 12 | ||
그 결과, 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, FLT3에 대해 프라이머 쌍 2와 TAZ에 대해 프라이머 쌍 1을 사용한 경우가 다른 프라이머 쌍에 비해 비특이적으로 증폭되는 mRNA 양이 적고 bc-CML 환자 시료에서 증폭률이 두 배이상 높은 것을 확인하였다.
이러한 결과는 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질 검출 방법에 따라 최적의 제제, 즉 프라이머 쌍 또는 항체를 사용함으로써 급성기로의 진행 가능성이 있는 만성골수성백혈병 환자를 보다 정확하게 선별할 수 있으며, 그에 맞는 환자 맞춤 치료 방법을 제공할 수 있음을 시사한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (11)
- FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 급성기 만성골수성백혈병 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 FLT3 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이고,
상기 TAZ 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 FLT3 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S), Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343) 및 FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이고,
상기 TAZ 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S) 및 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 것인 조성물. - 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 급성기 만성골수성백혈병 진단용 키트.
- a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
b) 상기 생물학적 시료에서 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계
를 포함하는 급성기 만성골수성백혈병을 진단하기 위한 정보의 제공 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 a) 단계의 생물학적 시료는 골수, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 b) 단계의 FLT3 및 TAZ 유전자의 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것인 방법. - 청구항 7에 있어서,
상기 FLT3 유전자의 발현 수준은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것이고,
상기 TAZ 유전자의 발현 수준은 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것인 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 b) 단계의 FLT3 및 TAZ 단백질의 발현 수준은 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(western blot), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 면역확산(radioimmunodiffusion), 면역침강(immunoprecipitation), 유세포 분석(flow cytometry) 면역조직화학(immunohistochemistry), 면역형광(immunofluorescnce) 및 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것인 방법. - 청구항 9에 있어서,
상기 FLT3 단백질의 발현 수준은 FLT3 (8F2) 토끼 단클론항체 (CST, 3462S), Flt-3/Flk-2 (8H5) 항체 (Santa cruz, sc-101343) 및 FLT3 토끼 다클론항체 (ABclonal, A12437)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것이고,
상기 TAZ 단백질의 발현 수준은 TAZ (E8E9G) 토끼 단클론항체 (CST, 83669S), YAP/TAZ (D24E4) 토끼 단클론항체 (CST, 8418S), TAZ (V386) 항체 (CST, 4883S) 및 항-YAP1 항체 (Santa cruz, sc-101199)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것인 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 c) 단계는 대조군과 비교하여 피험자에서 FLT3 및 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 높은 경우 급성기 만성골수성백혈병으로 진단하는 것인 방법.
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