CN103789197A

CN103789197A - 一种提取微小rna的试剂盒及其提取方法

Info

Publication number: CN103789197A
Application number: CN201410055283.XA
Authority: CN
Inventors: 陈静; 葛阳
Original assignee: SHANGHAI DIDA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI DIDA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-02-18
Filing date: 2014-02-18
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2034-02-18
Also published as: CN103789197B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种提取微小RNA的试剂盒及其提取方法。其中，该试剂盒包括盒体、装有第一磁珠液的试剂瓶、装有第二磁珠液的试剂瓶、装有裂解液的试剂瓶、装有洗脱液的试剂瓶以及装有洗涤液的试剂瓶；盒体的内底壁上设置有泡沫垫；且泡沫垫的边沿与盒体的内侧壁相贴；泡沫垫上设置有五个凹槽，每个凹槽内分别设置有一个试剂瓶；第一磁珠液内包括多个表面修饰有能够与微小RNA配对的靶向序列或随机序列的第一磁珠；第二磁珠液内包括多个表面修饰有带负电荷的亲水性高分子聚合物的第二磁珠。本发明的这种试剂盒可更高效的提取血浆或者血清中的微小RNA，特别适合提取血浆或者血清样品中含量较低或者低拷贝的微小RNA。

Description

一种提取微小RNA的试剂盒及其提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种提取微小RNA的试剂盒及其提取方法。

背景技术

微小RNA（miRNAs）是一类长度为21～25个核糖核苷酸的非编码内源性小单链RNAs分子。1993年，Lee等首次在线虫体内发现第一个miRNA（lin-4），能在翻译水平通过抑制核蛋白lin-14的表达来调节线虫的幼虫发育进程。随后，科学家们应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，发现miRNAs广泛存在于灵长类、啮齿类、鸟类、鱼类、蝇类、蠕虫类、植物、病毒中。从2002年有统计的200多种到2008年底的将近9000种，miRNAs的发现呈现爆发性增长，并且不断有新物种中的miRNAs被发现。

人类miRNAs基因仅约占基因总数的2%-3%，但却能调控人体内1/3的蛋白表达，这种转录后调控作用直接影响了这些靶基因的功能，参与了生物体内的多个系统的生理、病理过程。miRNAs在生物体中的作用涉及发育、老化、分泌、代谢、病毒感染、免疫反应、肿瘤等等方面，尤其是作为癌基因或者抑癌基因在肿瘤发生发展中的作用显的尤为重要。miRNAs基础与临床研究的最终目的是要为疾病的诊断、治疗、预防提供有效的方向。对多个肿瘤细胞系和正常细胞系miRNAs表达谱的分析表明，特定的miRNAs表达谱能够标识特定的肿瘤生物特征或病理生理过程。

有研究表明，不同类型的消化系统肿瘤有特定的miRNAs异常表达，和mRNA表达谱的零散不同，miRNAs在特定肿瘤中聚集成簇表达，如miR-192、miR-194、miR-215在肠源性肿瘤中成簇高表达，因此miRNAs可以作为癌症诊断的工具。

由于血清或血浆中miRNAs比较稳定，且其具有潜在的疾病标志物的巨大价值。对于肿瘤患者诊断具有较好的敏感性及特异性，加上取材的相对无创性，显示出了其作为肿瘤标志物的优势。

在相关技术中，现在有一些miRNAs提取试剂盒可以用于血清或血浆中miRNAs提取，例如，美国Qiagen公司的miRNeasy minikit。但是，利用这种试剂盒其提取miRNAs的效率较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取微小RNA的试剂盒以及提取方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种提取微小RNA的试剂盒，包括盒体、装有第一磁珠液的试剂瓶、装有第二磁珠液的试剂瓶、装有裂解液的试剂瓶、装有洗脱液的试剂瓶以及装有洗涤液的试剂瓶；

所述盒体的内底壁上设置有泡沫垫；且所述泡沫垫的边沿与所述盒体的内侧壁相贴；

所述泡沫垫上设置有五个凹槽，每个所述凹槽内分别设置有一个所述试剂瓶；

所述第一磁珠液内包括多个表面修饰有能够与微小RNA配对的靶向序列或随机序列的第一磁珠；所述第二磁珠液内包括多个表面修饰有带负电荷的亲水性高分子聚合物的第二磁珠。

本发明实施例提供的提取微小RNA的试剂盒，其内部设置了装有第一磁珠液的试剂瓶、装有第二磁珠液的试剂瓶、装有裂解液的试剂瓶、装有洗脱液的试剂瓶以及装有洗涤液的试剂瓶；在进行微小RNA提取的过程中，可利用装有裂解液的试剂瓶中的裂解液将血清或者血浆样品中被包裹的核酸（包括微小RNA）游离，在通过将含有游离核酸的样品与第一磁珠液混合，由于第一磁珠液中含有表面修饰能够与微小RNA配对的靶向序列或随机序列，因此游离的微小RNA可以被第一磁珠捕获，并吸附在第一磁珠的表面；而在利用第一磁珠捕获微小RNA的过程中，可以在混合液中加入第二磁珠液，第二磁珠液中含有的第二磁珠起到增强磁场的作用，进而使得第一磁珠在磁吸的过程中不被或者很少被移除，提高了第一磁珠的获得率。捕获有微小RNA的第一磁珠再通过洗涤液洗涤之后，其表面所吸附的大量的杂质（核酸杂质以及少量的蛋白质）可被去除；最后再通过洗脱液试剂瓶中的洗脱液，在65-75℃下孵育8-12分钟后冰浴1-3分钟，将第一磁珠表面吸附的微小RNA的洗脱之后，即可得到微小RNA。

通过荧光定量PCR证明，通过本发明的微小RNA提供的试剂盒所抽提的微小RNA其检测所得的Ct值（荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）比现有技术中Qiagen公司的miRNeasy minikit所提取的微小RNA低，因此，本发明实施例提供的这种试剂盒可更高效的提取血浆或者血清中的微小RNA，特别适合提取血浆或者血清样品中含量较低或者低拷贝的微小RNA。

可选的，所述盒体为一个具有开口的矩形盒体，且所述矩形盒体的开口与底壁相对；所有所述凹槽均由从所述矩形盒体的底壁到所述开口的方向延伸。

可选的，所有所述试剂瓶均为圆柱形，所有所述凹槽的横截面均为圆形；每个所述凹槽的内壁与其对应设置的所述试剂瓶的外壁相贴合。

可选的，所述第一磁珠的平均粒径为40-80nm。

可选的，所述第二磁珠的平均粒径大于500nm。

本发明实施例还提供了一种微小RNA的提取方法，包括以下步骤：

在血清或者血浆样品中加入所述裂解液进行裂解，得到裂解混合物，将所述裂解混合物离心，得到上清液；

在所述上清液中加入第一磁珠液，并进行混匀，得到第一磁珠表面捕获有微小RNA的第一混合液；

在所述第一混合液中加入第二磁珠液，并进行混匀，得到第二混合液；

将所述第二混合液放置在外加磁场下进行磁吸，并将所述第二混合液中的液体除去，得到混合磁珠；

在所述混合磁珠中加入洗涤液，并使得吸附在所述混合磁珠表面杂质溶解，将溶有杂质的洗涤液吸除；

将洗涤后的所述混合磁珠晾干后加入洗脱液，进行震荡混匀，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脱液中，得到含有微小RNA的磁珠液；

将含有微小RNA的磁珠液中的液体与混合磁珠分离，并保存至离心管中，得到微小RNA。

通过上述的方法在提取血清或者血浆样品中的微小RNA时，由于第一磁珠的表面修饰有能够与微小RNA配对的随机序列或者靶向序列；因此，在将上清液和第一磁珠液按照既定的体积比混合后，上清液中的游离微小RNA可以与第一磁珠表面的序列配对并结合，进而被第一磁珠捕获，得到第一混合液。更为重要的，当第一混合液与第二磁珠液混合之后，第二磁珠会对外加磁场产生强烈的磁场增强作用，使得吸附有大量游离的微小RNA（包括一些低拷贝微小RNA和含量极低的微小RNA）的第一磁珠在磁吸的过程中不被或者很少被遗失，提高了第一磁珠的获得率，进而直接提高了微小RNA的抽提效率。吸附有微小RNA的第一磁珠在通过洗涤以及洗脱之后则可得到微小RNA。

可选的，在所述在血清或者血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，将所述裂解混合物离心，得到上清液的步骤中，

所述裂解液中包括表面活性剂、异硫氰酸盐、胍盐、锂盐、RNA酶抑制剂以及pH值为6.5-8.5的pH缓冲液。

所述裂解的时间为：10-20分钟；所述离心的转速为10000-12000转/分钟；所述离心的时间为5-15分钟。

可选的，在所述步骤在所述混合磁珠中加入洗涤液，并使得吸附在所述混合磁珠表面杂质溶解，再将溶有杂质的洗涤液吸除的步骤中；

所述洗涤液包括乙醇、异丙醇或乙醇和异丙醇的混合液。

可选的，在所述将所述洗涤后的混合磁珠晾干后加入洗脱液，进行震荡混匀，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脱液中，得到含有微小RNA的磁珠液的步骤中；

所述洗脱液为超纯水。

附图说明

图1示出了本发明实施例一提供的提取微小RNA的试剂盒的示意图；

图2示出了本发明实施例三提供的微小RNA提取方法的流程图；

图3示出了应用本发明实施例的试剂盒手动提取血清中微小RNA的荧光定量PCR检测结果及其与商业化试剂盒抽提效率的对比；

图4示出了应用本发明实施例的试剂盒自动高通量提取血清中微小RNA的荧光定量PCR检测结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例一

请结合图1，在本发明的实施例中提供了一种提取微小RNA的试剂盒，包括盒体101、装有第一磁珠液的试剂瓶102、装有第二磁珠液的试剂瓶103、装有裂解液的试剂瓶104、装有洗脱液的试剂瓶105以及装有洗涤液的试剂瓶106；

盒体101的内底壁上设置有泡沫垫107；且泡沫垫107的边沿与盒体101的内侧壁相贴；

泡沫垫107上设置有五个凹槽，装有第一磁珠液的试剂瓶102、装有第二磁珠液的试剂瓶103、装有裂解液的试剂瓶104、装有洗脱液的试剂瓶105以及装有洗涤液的试剂瓶106分别设置在五个凹槽上；

第一磁珠液内包括多个表面修饰能够与微小RNA配对的靶向序列或随机序列的第一磁珠；第二磁珠液内包括多个表面修饰有带负电荷的亲水性高分子聚合物的第二磁珠。

本发明实施例提供的提取微小RNA的试剂盒，其内部设置了装有第一磁珠液的试剂瓶102、装有第二磁珠液的试剂瓶103、装有裂解液的试剂瓶104、装有洗脱液的试剂瓶105以及装有洗涤液的试剂瓶106；在进行微小RNA提取的过程中，可利用装有裂解液的试剂瓶104中的裂解液将血清或者血浆样品中被包裹的核酸（包括微小RNA）游离，在通过将含有游离核酸的样品与第一磁珠液混合，由于第一磁珠液中含有表面修饰能够与微小RNA配对的靶向序列或随机序列，因此游离的微小RNA可以被第一磁珠捕获，并吸附在第一磁珠的表面；而在利用第一磁珠捕获微小RNA的过程中，可以在混合液中加入第二磁珠液，第二磁珠液中含有的第二磁珠起到增强磁场的作用，进而使得第一磁珠在磁吸的过程中不被或者很少被遗失，提高了第一磁珠的获得率。捕获有微小RNA的第一磁珠再通过洗涤液洗涤之后，其表面所吸附的大量的杂质（核酸杂质以及少量的蛋白质）可被去除；最后再通过洗脱液试剂瓶中的洗脱液将表面吸附有微小RNA的第一磁珠洗脱之后，即可得到微小RNA。

通过荧光定量PCR证明，通过本发明的微小RNA提供的试剂盒所抽提的微小RNA其检测所得的Ct值（荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）比现有技术中Qiagen公司的miRNeasy minikit所提取的微小RNA低。因此，本发明实施例提供的这种试剂盒可更高效的提取血浆或者血清中的微小RNA，特别适合提取血浆或者血清样品中含量较低或者低拷贝的微小RNA。

为了使得本发明实施例一的提取微小RNA的试剂盒得到更好的应用，更加有效应用到生物技术领域中，本发明实施例还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是在上述实施例一的试剂盒的基础上做出的详细的阐述和解释，请参考图1：

实施例二

在本实施例中，为了便于在盒体101内设置泡沫垫107和多个试剂瓶：优选的，盒体101为一个具有开口的矩形盒体，且矩形盒体的开口与底壁相对；所有凹槽均由从矩形盒体的底壁到开口的方向延伸。

另外，为了能够便于试剂瓶放置在其对应的凹槽上，其还为了防止在运输的过程中，盒体101倒伏之后试剂瓶易于与凹槽脱离，进而造成试剂瓶破碎等意外现象的发生，优选的，所有试剂瓶均为圆柱形，所有凹槽的横截面均为圆形；每个凹槽的内壁与其对应设置的试剂瓶的外壁相贴合。

此外，在本实施例中，为了增大第一磁珠的比表面积，进而具有更好的捕获微小RNA的效果，优选的，第一磁珠的平均粒径为40-80nm。而第二磁珠主要起到磁场增强的作用，因此，其粒径应设置加大，优选的，以其平均粒径大于500nm为佳。

接下来，本发明实施例还提供了一种利用上述实施例的试剂盒提取微小RNA的方法；请参考实施例三以及图2：

实施例三

本实施例具体包括以下步骤：

步骤101：在血清或者血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，将裂解混合物离心，得到上清液；

此步骤为将样品进行裂解的过程，通过加入的裂解液，样品中被包裹的核酸游离，通过离心之后，大颗粒的杂质则形成沉淀，而微小RNA则包含在上清液中，以进行后续的分离。

另外，在上述步骤中，为了提高裂解效率，使得样品中的微小RNA尽可能的释放完全，优选的，裂解液中包括表面活性剂、异硫氰酸盐、胍盐、锂盐、RNA酶抑制剂、pH值为6.5-8.5的缓冲液，或这些试剂的组合。

并且，优选的裂解的时间为：10-20分钟；离心的转速为10000-12000转/分钟；离心的时间为5-15分钟。在上述条件下，裂解的效果更好，大量的微小RNA以及含量以及的微小RNA或者低拷贝的微小RNA均会游离，进而会被第一磁珠更好的吸附。

步骤102：在上清液中加入第一磁珠液，并进行混匀，得到第一磁珠表面捕获有微小RNA的第一混合液；

在步骤102中，第一磁珠液中的第一磁珠可以将上清液中的微小RNA捕获，进而使得上清液中大量的微小RNA特异性的结合在第一磁珠的表面，而为了提高结合的效率，优选的，第一磁珠占第一磁珠液的0.5-1.5%，在第一混合液中，第一磁珠液与上清液的体积为：1:2.5-1:20。

步骤103：在第一混合液中加入第二磁珠液，并进行混匀，得到第二混合液;

在该步骤中，所加入的第二磁珠液，其主要起到磁场增强的作用，进而使得第一磁珠获得率提高。优选的，其中，按照重量百分数计，在第二磁珠液中，第二磁珠占第二磁珠液的0.5-1.5%，在第二混合液中，第二磁珠液与第一磁珠液的体积比为：1:5-1:20；而且为了增大第一磁珠的比表面积，进而具有更好的捕获微小RNA的效果，优选的，第一磁珠的平均粒径为40-80nm。而第二磁珠主要起到磁场增强的作用，因此，其粒径应设置加大，优选的，以其平均粒径大于500nm为佳。

步骤104：将第二混合液放置在外加磁场下进行磁吸，并将第二混合液中的液体除去，得到混合磁珠；

在该步骤中，其主要目的是为了将磁珠和第二混合液中的液体分离，在外加磁场的作用下，所有的磁珠均会被吸附进而偏向一侧，而此时，则可将第二混合液中的液体通过移液枪吸出。

步骤105：在混合磁珠中加入洗涤液，并使得吸附在混合磁珠表面杂质溶解，再将溶有杂质的洗涤液吸除；

得到混合磁珠之后，需要将混合磁珠上吸附的一些核酸杂质或者少量的蛋白质以及其他杂质洗涤，进而提高所提取的微小RNA的纯度，而洗涤液可以将第一磁珠吸附的杂质溶解，进而得到除杂的效果，优选的，洗涤液可为不同比例的乙醇、异丙醇或乙醇和异丙醇的混合液。或者洗涤液可以为不含有有机溶液的缓冲液体系，不含有有机溶液的缓冲液为pH值在6.5-8.5之间的缓冲液体系，较优pH值范围为7.5-8.5之间；不含有有机溶液的缓冲液中可含有少量非离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂浓度不超过体积比1%。上述试剂作为高效的有机溶剂，可以将第一磁珠表面吸附的杂质溶解，进而得到提出微小RNA的效果，更优选的，洗涤的次数可以为多次。

步骤106：将洗涤后的混合磁珠晾干后加入洗脱液，进行震荡混匀，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脱液中，得到含有微小RNA的磁珠液；

优选的，震荡混匀之后，在65-75℃下孵育8-12分钟后冰浴1-3分钟，可使得大量的吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脱液中，得到含有微小RNA的磁珠液。

在将混合磁珠洗涤之后，需要将第一磁珠上特异性吸附的微小RNA洗脱，进而得到抽提产品，在本实施例中，具体使用洗脱液将第一磁珠上的微小RNA进行洗脱，此外，洗脱液可以是超纯水，也可以是适合反转录反应的缓冲溶液。

将混合磁珠晾干后在65-75℃下孵育8-12分钟后冰浴1-3分钟，此时，被特异吸附的微小RNA溶解在洗脱液中，进而会得到含有微小RNA的磁珠液（即微小RNA与磁珠分离的液体）。

步骤107：将含有微小RNA的磁珠液中的液体与混合磁珠分离，并保存至离心管中，得到微小RNA。

优选的，为了顺利实现磁珠和液体的分离，步骤107可以按照以下操作进行：将含有微小RNA的磁珠液放置在外加磁场下进行磁吸，并将含有微小RNA的磁珠液中的液体吸取后保存至离心管中，得到微小RNA。

再次通过磁吸的方式，使得磁珠与含有微小RNA的磁珠液中的液体分离，进而得到微小RNA。得到的微小RNA可以在低温下保存，或者直接进行后续反转录的操作。

此外，在上述步骤中，第一磁珠的表面修饰有大量含有10-30nt的poly A的随机序列或靶向序列；或者修饰有含有10-30nt的polydT，使用前与过量的含有10-30nt的poly A的随机序列或靶向序列预杂交，封闭磁珠与mRNA的杂交位点，同时增强序列的延展性，降低位阻效应，进而使得游离的微小RNA结合。

需要指出的是，本发明还针对上述的提取方法还提供了以下具体的实施例，请参考以下内容：

实施例四

1、将装有表面修饰有含有10-30nt的poly dT的第一磁珠的第一磁珠液试剂瓶缓慢颠倒混匀5-10次，随后将10μl小磁珠悬液与200μl的裂解液放入新的离心管中；

2、在新的离心管中加入含有12-18nt的poly A的靶向序列，其构成的整体序列为：SEQ ID NO:1：5’–poly A(15nt)-TGTAGGCCAG–3’；

3、将加入靶向序列的离心管轻弹混匀后，室温孵育10-15分钟，随后在外加磁场作用下将磁珠与缓冲液分离；

4、将缓冲液移除后再加入200-500μl的新鲜裂解液，得到备用裂解液和备用第一磁珠；

5、将200μl血清或血浆样品与200μl的备用裂解液在离心管内充分作用15分钟后，在10000-12000转/分的转速下，离心5-15分钟，得到上清液；

6、取50μl上清液并加入含有备用第一磁珠的悬液的离心管中，记录样品对应的编号；

7、将第二磁珠液试剂瓶缓慢颠倒混匀5-10次，随后在每个编号的离心管中加入10μl第二磁珠悬液；

8、将离心管手动或利用混匀仪颠倒混匀10-15分钟，随后将离心管放入外加磁场中，磁吸2分钟后吸走管内溶液，移除外加磁场；

9、在离心管中加入800μl洗涤液，手动或利用混匀仪颠倒混匀5分钟，再将离心管放入外加磁场中，磁吸2分钟后吸走管内溶液，移除外加磁场。（为了提高洗涤的效果，此步骤重复一次）。

10、将移走溶液的混合磁珠在空气中晾干，然后再入洗脱液，进行震荡混匀，并在65-75℃下孵育8-12分钟后冰浴1-3分钟，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脱液中，得到含有微小RNA的磁珠液；

11、将含有微小RNA的磁珠液放置在外加磁场下进行磁吸，并将含有微小RNA的磁珠液中的液体吸取后保存至离心管中，得到微小RNA。

在上述步骤中，洗脱液可以为超纯水或者反转录缓冲液；为了通过荧光定量PCR操作，以检测微小RNA的提取效果，一般而言，洗脱液可具体为反转录反应的缓冲液，并直接进行反转录的操作，以期一步法得到微小RNA的相应cDNA片段。

具体的，可以按照以下的操作进行：

A、将移走溶液的混合磁珠在空气中晾干，然后再入反转录缓冲溶液80μl，进行震荡混匀，并在70℃下孵育10分钟后冰浴2分钟，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脱液中，得到含有微小RNA的磁珠液；

B、在含有微小RNA的磁珠液中加入反转录引物（序列为SEQID NO:2）及反转录酶的混合液20μl，其中，SEQ ID NO:2：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGGGAC-3’

其中，20μl反转录酶混合液中含有：

反转录引物(50ng/μl)2μl

其中，反转录过程中的条件按照如下设置：

C、将反转录结束后的离心管再次放入外加磁场中，磁吸2分钟后，小心吸走管内溶液至一新的离心管中，即为反转录好的cDNA片段，可用于后续检测。

对比实验操作：

用Qiagen miRNeasy Mini Kit作为抽提效率的对照，同样取5中上清液50μl按照Qiagen公司抽提手册提取微小RNA，最后用80μl的Qiagen试剂盒洗脱液洗脱；随后的反转录步骤如下：

加入10X转录反应的缓冲液8μl，震荡混匀后，放入70℃水浴或空气浴中孵育10分钟，结束后迅速放入冰浴中处理2分钟左右；加入反转录引物（序列为SEQ ID NO:2）及反转录酶的混合液12μl，其中：

SEQ ID NO:2：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGGGAC-3’

12μl反转录酶混合液中含有：

其中，对照组反转录过程中的条件按照如下设置：

D、荧光定量PCR检测本实施例提取方法以及对照实验中反转录得到的cDNA片段，并用Applied Biosystems7300Fast Real-TimePCR System软件分析结果。

其中，在荧光定量PCR检测中用使用的上游引物（SEQ ID NO:3）、下游引物（SEQ ID NO:4）及Taqman荧光探针序列（SEQ ID NO:5）如下：

SEQ ID NO:3：5’-ACACTCCAGCTGGGAACTGGCCTACAAAG-3’；

SEQ ID NO:4：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3’；

SEQ ID NO:5：5’-TTCAGTTGAGACTGGGAC-3’FAM；

荧光定量PCR检测体系和实验条件如下：

荧光定量PCR的循环次数为40，具体的，在95℃预变性4分钟，94℃变性15秒，58℃复性30秒，72℃延伸35秒。

荧光定量PCR的结果（如图3）表明，在样本中微小RNA浓度较高时，用本试剂盒抽提后检测得到的Ct值（曲线1），比用Qiagen试剂盒抽提后检测得到的Ct值（曲线2）提前一个循环，也就是说抽提得率提高了1倍；在样本中微小RNA浓度较低时，用本试剂盒抽提后检测得到的Ct值（曲线3），比用Qiagen试剂盒抽提后检测得到的Ct值（曲线4）提前3.2个循环，也就是说抽提得率提高了10倍左右，因此，通过本实施例的方法可将目标微小RNA的检出下限降低1个数量级。

本发明还提供了一种利用上述实施例二提供的试剂盒自动提取微小RNA的方法，目的在于为验证运用本试剂盒在核酸自动抽提设备上，对多样本进行抽提时抽提效率的一致性，具体的包括以下步骤，请参考实施例五：

实施例五

（1）、本实施例中使用的自动核酸抽提设备是Kingfisher96(Thermo Fisher)；

（2）、本施实例使用的是修饰有含有15nt的poly dT的第一磁株（平均粒径为50nm，固含量，即第一磁珠占第一磁珠液的重量百分数为1%）：

（3）、在1#磁珠板（1ml深孔板，德国Greiner，780215）中每孔加入200μl裂解液；

（4）、将第一磁珠试剂瓶缓慢颠倒混匀5-10次，随后各取10μl小磁珠悬液分别加入（3）中的深孔板中；

（5）、每孔加入20μl的10uM的靶向序列（SEQ ID NO:1）；盖好贴膜后备用。

（6）、将3ml血清或血浆样品与3ml裂解液在离心管中充分作用15分钟后，在10000～12000转/分的转速下，离心5-15分钟，得到上清液；

（7）、在2#样品板（1ml深孔板）中每孔加入：200μl新鲜裂解液、10μl摇匀的第二磁珠悬液、步骤（6）中的上清液50μl，记录样品加样顺序；盖好贴膜后备用。

（8）、在3#、4#清洗板（2ml深孔板，德国Greiner，780270）中每孔加入800μl洗涤液，盖好贴膜后备用；

（9）、在5#洗脱板（0.5ml深孔板，德国Greiner，786201）中每孔加入80μl洗脱液；本实施例中所用洗脱液为反转录反应的缓冲液，盖好贴膜后备用；

（10）、设定Kingfisher96抽提程序：

a)、1#板磁珠预结合：15分钟；

b)、2#板样品结合：15分钟；

c)、3#板清洗：5分钟；

d)、4#板清洗：5分钟；

e)、空气干燥：5分钟

f)、5#板洗脱：10分钟

（11）、撕掉所有板上的贴膜，将干净的KF96DW深孔板磁套（Thermo Fisher，97002534）放入1#板中，按程序设定分别将1-5#板放入设备中指定位置，然后开始设备自动运行；

（12）、程序运行结束后，将5#洗脱板取出，将每孔中磁珠及溶液全部转移至96孔PCR的对应孔中，进行反转录实验，操作步骤如下：

将96孔PCR板放入PCR仪中，设定程序：70℃10分钟，4℃2分钟；然后加入反转录引物（序列为SEQ ID NO:2）及反转录酶的混合液20μl，其中：

20μl反转录酶混合液中含有：

取一块干净的KF96PCR磁套（Thermo fisher,97002514)放入反转录结束后的96孔PCR板中；再在磁套中插入King Fisher96PCR板磁头，磁吸2分钟后，将磁头、磁套及磁珠全部移除，剩余板内溶液即为反转录好的cDNA片段，可用于后续检测。

（13）、荧光定量PCR检测步骤9f反转录得到的96孔中的cDNA片段：

荧光定量PCR检测体系和实验条件如下：

其中，荧光定量PCR的循环次数为40，具体的，在95℃预变性4分钟，95℃变性15秒，58℃复性30秒，72℃延伸35秒。

应用Applied Biosystems7300Fast Real-Time PCR System软件分析结果。

通过荧光定量PCR的结果（如图4）表明，96个相同样品用本试剂盒抽提后检测得到的Ct值基本一致，96样品的标准差<1Ct，说明96个样品抽提效率一致性良好。

在上述所有实施例中，需要指出的是，第一磁珠的制作材料可以为铁氧化物。第二磁珠可为具有磁性效应的含铁合金或不锈钢珠；其制作材料可为铁氧化物、具有磁性效应的含铁合金或不锈钢材料；第二磁珠的表面修饰有亲水性的含负电荷的高分子聚合物，较优为含羧基的多糖或高分子聚合物，以降低大磁珠对核酸的非特异性吸附。

综上，本发明实施例提供的这种微小RNA提取试剂盒以及提取方法具备以下有益效果：特别针对于血清血浆中含量极低的微小RNA分子，利用第一磁珠的高比表面积，结合5-10nt的随机或靶向引物，高效结合循环系统中的微小RNA；利用第二磁珠对永磁场的强烈增强作用，将结合了微小RNA的小磁珠高效提取出来;实现了对循环系统中的微小RNA的高效抽提，特别是显著提高了低拷贝微小RNA的抽提效率;同时，可以配合一步法反转录，靶标微小RNA以最低的损失率高效反转录为cDNA片段，从而使得靶标微小RNA的检出下限可以降低至少1个数量级，因此可以更早的检测到循环系统中的微小RNA肿瘤标志物，为极早期肿瘤预测和诊断提供了一种有效的工具；本试剂盒易于通量放大，可与多种高通量磁珠抽提设备兼容，从而亦为高通量筛选新型肿瘤标志物的有效工具，另外，本试剂盒的价格与现有技术中Qiagen公司的miRNeasy mini kit相比，比较便宜，因此，可以大规模应用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提取微小RNA的试剂盒，其特征在于，包括盒体、装有第一磁珠液的试剂瓶、装有第二磁珠液的试剂瓶、装有裂解液的试剂瓶、装有洗脱液的试剂瓶以及装有洗涤液的试剂瓶；

2.根据权利要求1所述的提取微小RNA的试剂盒，其特征在于：

所述盒体为一个具有开口的矩形盒体，且所述矩形盒体的开口与底壁相对；所有所述凹槽均由从所述矩形盒体的底壁到所述开口的方向延伸。

3.根据权利要求2所述的提取微小RNA的试剂盒，其特征在于：

所有所述试剂瓶均为圆柱形，所有所述凹槽的横截面均为圆形；

每个所述凹槽的内壁与其对应设置的所述试剂瓶的外壁相贴合。

4.根据权利要求1-3任一项所述的提取微小RNA的试剂盒，其特征在于；

所述第一磁珠的平均粒径为40-80nm。

5.根据权利要求4所述的提取微小RNA的试剂盒，其特征在于，

所述第二磁珠的平均粒径大于500nm。

6.一种使用权利要求1所述的试剂盒提取微小RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在所述混合磁珠中加入洗涤液，并使得吸附在所述混合磁珠表面杂质溶解，再将溶有杂质的洗涤液吸除；

7.根据权利要求6所述的提取微小RNA的方法，其特征在于，在所述在血清或者血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，将所述裂解混合物离心，得到上清液的步骤中：

所述裂解液中包括表面活性剂、异硫氰酸盐、胍盐、锂盐、RNA酶抑制剂、pH值为6.5-8.5的缓冲液。

8.根据权利要求6所述的提取微小RNA的方法，其特征在于，在所述在血清或者血浆样品中加入裂解液进行裂解，得到裂解混合物，将所述裂解混合物离心，得到上清液的步骤中，

9.根据权利要求6-8任一项所述的提取微小RNA的方法，其特征在于，在所述步骤在所述混合磁珠中加入洗涤液，并使得吸附在所述混合磁珠表面杂质溶解，再将溶有杂质的洗涤液吸除的步骤中；

所述洗涤液包括乙醇、异丙醇或乙醇和异丙醇的混合液。

10.根据权利要求9所述的提取微小RNA的方法，其特征在于，在所述将所述洗涤后的混合磁珠晾干后加入洗脱液，进行震荡混匀，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脱液中，得到含有微小RNA的磁珠液的步骤中；

所述洗脱液为超纯水。