CN108570712A - 一种用于降解组测序文库构建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于降解组测序文库构建的方法包括miRNA靶基因mRNA片段的分选、miRNA靶基因mRNA片段5’端的接头连接、随机引物进行反转录、miRNA靶基因cDNA的扩增步骤。本发明技术方案无需特定3’端接头连接，操作简单，用时少，并大大降低对样品量的要求，能准确找到动植物miRNA作用于靶基因的具体位点，摆脱了生物信息学预测的限制，真正从实验中找到了miRNA的作用靶基因，具有高效、快捷、直观、准确的特点。

Description

一种用于降解组测序文库构建的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体涉及一种用于降解组测序文库构建的方法。

背景技术

miRNA(microRNA)是一类长度约为22核苷酸的内源性非编码RNA，可以调控相关基因的表达，几乎参与了动植物体内所有重要的生命活动。通常，miRNA通过与靶基因(mRNA)部分或完全配对，引起基因的翻译抑制或者基因的内切酶剪切来实现对基因表达的调控，在动物体内以基因的翻译抑制居多，在植物体内则以靶基因被剪切占多数。利用成熟的miRNA微阵列芯片或是qPCR技术可以高效快速地筛选出动植物体内差异表达的miRNA，而鉴定miRNA调控的靶基因是阐释其复杂调控机制的关键。

不同于动物，植物miRNA通常与靶基因进行完全或接近完全的配对引起靶基因的剪切从而调控基因的表达。最初科研人员利用这一特征对植物miRNA的靶基因展开了生物信息学预测，并获得了许多有意义的研究成果。然而，由于预测方法无法区分预测靶基因的真伪，所有预测结果必须经实验证实以去伪存真。这极大地影响了靶基因的探索效率。同时在一些情况下，如miRNA与靶基因间存在较高错配时，预测方法可能会丢失许多真实的靶基因。

伴随下一代测序(Next Generation Sequencing)或称高通量测序(High-throughput Sequencing)的出现和发展，近来出现了一种新的实验方法称为降解组测序(Degradome Sequencing)，它结合了高通量测序技术与生物信息学分析各自的优势对这些mRNA降解片段进行大规模鉴定，进而鉴定miRNA调控靶基因，已成功应用于拟南芥及水稻等植物的miRNA靶基因筛选。降解组测序的原理是，在植物体内绝大多数的miRNA是利用剪切作用调控靶基因的表达，且剪切常发生在miRNA与mRNA互补区域的第十位核苷酸上。靶基因经剪切产生二个片段，5’剪切片段和3’剪切片段。其中3’剪切片段，包含有自由的5’单磷酸和3’polyA尾巴，可被RNA连接酶，连接产物可用于下游高通量测序；而含有5’帽子结构的完整基因，含有帽子结构的5’剪切片段或是其他缺少5’单磷酸基团的RNA是无法被RNA酶连接，因而无法进入下游的测序实验；对测序数据进行深入地比对分析，可以直观地发现在mRNA序列的某个位点会出现一个波峰，而该处正是候选的miRNA剪切位点。利用降解组测序，科研人员摆脱了生物信息学预测的限制，真正从实验中找到了miRNA的作用靶基因。

发明内容

本发明目的在于提供了一种用于降解组测序文库构建的方法，该方法降低实验样品量的要求，无需特定3’端接头连接，能准确找到动植物miRNA作用于靶基因的具体位点，操作简单、用时少且结果直观。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：一种用于降解组测序文库构建的方法，包括以下步骤：

(1)通过mRNA Capture Beads分选miRNA靶基因的mRNA片段；

(2)5’接头连接mRNA片段：取20μL步骤(1)分选出的mRNA溶液中加入2μL RNA 5’Adapter B在PCR仪65℃孵育5min，冰上放置2min后加入以下试剂到PCR管中，轻轻混匀，在PCR仪37℃孵育2h；

(3)磁珠纯化连接产物；

(4)反转录：取10μL经纯化后的连接产物分别加入1μL RT Primer(R)和1μL 10mMdNTP混匀后于65℃变性5min，立即置于冰上；加入以下试剂到PCR管中：

轻轻混匀，于PCR仪上25℃保温2min，加入1μL反转录酶吹打混匀在PCR仪上25℃保温10min，42℃保温40min，70℃保温15min；

(5)磁珠富集法纯化步骤(4)获得的cDNA产物；

(6)PCR扩增：98℃变性30s，10-15个PCR循环，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，72℃后续延伸10min，4℃保持；

(7)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物并回收目的片段，获得高通量测序所需的降解组文库。

本发明创造性的点在于步骤1、3、4、5，以往方法常利用3’端接头连接分选出miRNA靶基因的mRNA片段，接着把所获得的3’接头-mRNA混合物连上5’接头，使用冷冻干燥法纯化产物，然后反转录获得cDNA，最后进行PCR反应及凝胶回收目的片段。相比于该方法，本发明的优势之处在于无需3’端接头连接，避免接头自接，简化操作步骤；同时通过磁珠富集法纯化产物，捕获效率高。

本发明的有益效果是：大大降低样品起始量，无需特定3’端接头连接，简化操作步骤，用时少，能准确找到动植物miRNA作用于靶基因的具体位点，摆脱了生物信息学预测的限制，真正从实验中找到了miRNA的作用靶基因，具有高效、快捷、直观、准确的特点。

附图说明

图1为PCR产物扩增结果，1-6为样品的六个重复，M为50bp DNA Marker。图2为切取预期大小分子条带，1-6为样品的六个重复，M为50bp DNA Marker。

具体实施方式

以下以大豆叶片降解组文库的构建为例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

1、材料与试剂

mRNA Capture Beads提取试剂盒购自Vazyme公司；RNase Inhibitor购自Promega公司；5’Adapter B、反转录试剂盒与PCR试剂盒购自吴江汇杰公司。

2、操作流程

A.大豆鲜嫩叶片mRNA的提取

1.准备65℃和80℃水浴锅；

2.将mRNA Capture Beads从4℃取出，静置使其温度平衡至室温；

3.将20μg total RNA用Nuclease-free水补加到50μL；

4.吸取混合均匀的mRNA Capture Beads加入到总RNA样品中；

5.65℃水浴5min后，4℃放置，使RNA变性；

6.室温轻弹5min，置于磁力架上放置5min，弃上清；

7.用200μL Beads Wash Buffer清洗步骤6中的磁珠，两次；

8.用50μL 10mM Tris-HCL重悬磁珠，混匀后置于水浴锅中80℃2min，25℃hold，将mRNA洗脱下来；

9.加入50μL Beads Binding Buffer，充分混匀后室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上；

10.将样品置于磁力架5min，小心移除上清；

11.用200μL Beads Wash Buffer清洗磁珠，两次；

12.用20μL Nuclease-free水重悬磁珠，混匀后置于水浴锅中80℃2min，立即置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心吸取20μL上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。

B.使用5’接头连接mRNA片段

1.准备65℃的PCR仪；

2.取2μL RNA 5’Adapter B加入到步骤A分选出的20μL mRNA溶液中，吹打混匀；

3.在PCR仪中65℃孵育5min，立即冰上放置2min；

4.加入以下试剂到该PCR管中，轻轻混匀，于PCR仪中37℃孵育2h。

C.Beads纯化连接产物

1.转移40μL Ligation产物至一新1.5mL离心管中，加入24μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

2.加入16μL 100％乙醇，吹打混匀后室温静置5min；

3.将离心管置于磁力架上3min，小心吸弃上清；

4.保持离心管在磁力架上，加入100μL新鲜配制的80％乙醇，放置30s，吸弃上清，重复乙醇清洗步骤1次；

5.两次乙醇清洗后，室温放置5min，确保乙醇完全去除(注：为防止吸弃beads，在第一次弃乙醇时，可调整移液枪到95μL，富余5μL，第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇，最后用小枪头，吸弃残余的5μL乙醇；)

6.从磁力架上取下离心管并加入10μL Nuclease-free水，重悬beads，室温放置5min；

7.将离心管放回磁力架上直至溶液澄清，转移上清液到新的200μL PCR管中。

D.随机引物对纯化后的连接产物进行反转录

1.取经纯化后的10μL PCR产物分别加入1μL RT Primer(R)和1μL 10mM dNTP充分混匀后于65℃变性5min，立即置于冰上；

2.加入以下试剂到PCR管中：

3.移液枪轻轻吹打混匀，于PCR仪上25℃静置2min，加入1μL反转录酶吹打混匀；

4.在PCR仪上25℃保温10min，42℃保温40min，70℃保温15min，4℃保持。

E.Beads纯化D步产物

1.向RT产物中加入5μL Nuclease-free水，吹打混匀；

2.转移至一新1.5mL离心管中，加入45μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

3.加入21μL 100％乙醇，吹打混匀后室温孵育5min；

4.将离心管置于磁力架上3min，待溶液澄清后小心吸弃上清；

5.保持离心管在磁力架上，加入100μL新鲜配制的80％乙醇，放置30s后吸弃上清，重复乙醇清洗步骤1次；

6.当两次乙醇清洗后，室温放置5min，确保乙醇完全去除(注：为防止吸弃磁珠，在第一次弃乙醇时，可调整移液枪到95μL，富余5μL，第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇，最后用小枪头，吸弃残余的5μL乙醇；)

7.从磁力架上取下离心管并加入23μL Nuclease-free水，重悬beads，室温放置5min；

8.将离心管放回磁力架上直至溶液澄清，转移上清液到新的200μL PCR管中。

F.PCR扩增

1.准备新的200μL的PCR管，按下表在冰上配制PCR反应体系：

2.移液枪轻轻吹打混匀，快速离心；

3.PCR中执行以下程序：98℃变性30s，10-15个PCR循环，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，72℃后续延伸10min，4℃保持。

G.聚丙烯酰胺凝胶电泳回收

利用6％TBE凝胶电泳分离PCR产物，如图1所示；切取预期大小分子并回收得到高通量测序用降解组文库，如图2所示。

通过该公开发明方法成功获得了预期的大豆叶片降解组文库，PCR产物电泳图谱与预期相符，回收得到的目标分子被成功用于高通量测序。

Claims (1)

1.一种用于降解组测序文库构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过mRNA Capture Beads分选miRNA靶基因的mRNA片段；

（2）5’接头连接mRNA片段：取20μL步骤（1）分选出的mRNA溶液中加入2μL RNA 5’Adapter B在PCR仪65℃孵育5min，冰上放置2min后加入以下试剂到PCR管中，轻轻混匀，在PCR仪37℃孵育2h；

10mM ATP 4μL 10×Ligation Buffer 4μL RNase Inhibitor 1μL Ligation Enhancer Mix 8μL Ligation Enzyme Mix 1μL Total final volume 40μL

（3）Beads纯化连接产物；

（4） 反转录：取10μL经纯化后的连接产物分别加入1μL RT Primer(R)和1μL 10mMdNTP混匀后于65℃变性5min，立即置于冰上；加入以下试剂到PCR管中：

5×First Strand Buffer 4μL 100mM DTT 2μL RNase Inhibitor 1μL Total final volume 19μL

轻轻混匀，于PCR仪上25℃保温2min，加入1µL反转录酶吹打混匀在PCR仪上25℃保温10min，42℃保温40min，70℃保温15min；

（5）Beads纯化步骤（4）获得的cDNA产物；

（6）PCR扩增：98℃变性30s，10-15个PCR循环，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸15s，72℃后续延伸10min，4℃保持；

（7）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物并回收目的片段，获得高通量测序所需的降解组文库。