JP7202556B2 - 遺伝子標的エリアの富化方法及びキット - Google Patents
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Description
(2)前記の工程(1)で提供された捕捉伸長生成物の3’端をリンカーDNAに連接することにより、ライゲーション生成物を提供する工程、
を含む、遺伝子標的エリアの富化方法。
本発明の第一態様は、遺伝子標的エリアの富化方法であって、
実施例1で使用されたオリゴヌクレオチド配列は表1に示すとおりである。
主要な試薬と材料
工程1、サンプルの準備
工程2、捕捉伸長
表2、表3、表4に応じてそれぞれ捕捉伸長反応系を調製する。
表6に応じて延伸生成物のPCR検出系を調製する。
表12に応じてPCR検出体系を調製して工程4の連接効率を検出する。
表14に記載の反応系及び手順で工程4で得られたライゲーション生成物に対してPCR増幅を行う。
工程 7. 配列決定及びデータ分析
実験結果及び分析
結果における捕捉伸長倍率、捕捉効率及び連接効率の計算方式は以下のとおりである。
捕捉伸長倍率=捕捉後のEGFR遺伝子出力コピー数/捕捉前のEGFR遺伝子入力コピー数
捕捉効率=(捕捉伸長倍率-1)/捕捉伸長サイクル数×100%
連接効率=(連接生成物出力コピー数/延伸生成物入力コピー数)×100%
本実施例における全てのプロセスデータ(例えば捕捉効率、連接効率)の分析はいずれもQCサンプルに由来する。
結果1、異なるタイプのポリメラーゼは異なるプローブの捕捉伸長結果への影響。
結果2、異なる延伸サイクル数は一部のプローブの延伸結果への影響。
表16に係る捕捉伸長反応系は表2を参照し、使用されたcfDNAサンプルがQCサンプルであり,延伸効率の検出方法は工程3を参照する。
試験結果から、サイクルの数の増加は捕捉伸長効率を効率的に向上できることが分かる。
結果3、dNTPが標識分子をカップリングするか否かは捕捉伸長結果への影響。
表17に係る捕捉伸長反応系は表2及び表4を参照し、使用されたcfDNAサンプルがQCサンプルであり、延伸効率の検出方法は工程3を参照する。
結果から分かるように,BiotinをカップリングしたdCTPを捕捉伸長系に配合し、延伸生成物を効果的に標識し、捕捉効率を向上させることができる。
結果4、dNTPが標識分子をカップリングするか否かは連接結果への影響。
結果5、5’端で異なり修飾されたプローブと異なるリガーゼが連接効率への影響。
結果から分かるように、5’端がリン酸化修飾されたプローブを使用して熱安定RNAリガーゼを配合して連接効果を顕著に向上させることができる。
結果6、異なる3’端で修飾されたリンカーDNAの連接効率への影響。
結果により、3’端の閉鎖修飾されたリンカーDNAを使用して自己連接及び誤連接を低減し、連接効率を顕著に向上させることが分かる。
結果7、連接後の異なる処理は生成物の検出率への影響。
結果8、異なる反応条件におけるサンプルのデータ。
実施例2
実施例2で用いたオリゴヌクレオチド配列は表25に示すとおりである。
主要な試薬と材料
工程1、サンプル準備
工程2、捕捉伸長
表26に応じて捕捉伸長反応系を調製する。
工程3、一本鎖連接
表28に応じて調製された連接反応系及び条件で連接反応を行う。
工程5、配列決定及びデータ分析
配列決定結果の分析は表30と表31に示すとおりである。
実施例3
実施例3及び4で用いられたオリゴヌクレオチド配列は表32に示すとおりである:
工程2、異なる特異的プライマー/プローブの組み合わせのqPCR検出
EGFR遺伝子L858R部位の三重特異性、二重特異性、単一特異的検出体系はそれぞれ表33-35に示すとおりである。
実施例 4.
この実施例で使用したオリゴヌクレオチド配列を表 32 に示す。
主な試薬・材料:実施例3と同じ。
工程 1. サンプルの準備
工程 2. 異なる特異的プライマー/プローブの組み合わせによる qPCR 検出
男性特異的 SRY 遺伝子の三重特異性、二重特異性、および単一特異性検出システムは、それぞれ表 46-48 に示されている。
要約すると、本発明は、従来技術の様々な欠点を効果的に克服し、高い産業的価値を有する。
Claims (10)
- 遺伝子標的エリアの富化方法であって、
(1)特異的プローブにより標的エリアを含む断片化DNAを増幅することにより、捕捉伸長生成物を提供する工程であって、前記特異的プローブは前記断片化DNAの標的エリアと相補的な配列を含み、前記の特異的プローブの3’末端のヌクレオチドは、前記特異的プローブの3’末端に連接反応が発生することを阻止するために、修飾される工程と、
(2)工程(1)で得られた捕捉伸長生成物の3’末端をリンカーDNAに連接させ、ライゲーション生成物を得る工程とを含み、
前記工程(1)の増幅系は3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有する高忠実なDNAポリメラーゼ及びdNTPを含み、
前記特異的プローブの3’末端にC3 Spacerが修飾され、
前記C3 Spacerは、前記特異的プローブ前記断片化DNAの標的エリアと結合した後に、前記高忠実なDNAポリメラーゼにより、前記特異的プローブの3’末端から切除され、
前記リンカーDNAは、5’端がリン酸化修飾され、3’端のヒドロキシがC3 Spacerに置き換えられる、ことを特徴とする、遺伝子標的エリアの富化方法。 - 前記工程(1)において、前記断片化DNAは二本鎖DNA、一本鎖DNA及びcDNAを含み、前記断片化DNAの長さは25~200 bpである、ことを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子標的エリアの富化方法。
- 前記dNTPにさらに標識分子がカップリングされてあり、前記標識分子はビオチンであることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子標的エリアの富化方法。
- 前記工程(2)の連接システムは一本鎖リガーゼを含み、
前記一本鎖リガーゼはT4 RNAリガーゼ又は熱安定性RNAリガーゼであり、
前記工程(2)には、連接反応後、シリカゲルカラムによる精製又は加熱処理で連接生成物に残留した熱安定RNAリガーゼの酵素活性を除去する工程を含む、ことを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子標的エリアの富化方法。 - 前記リンカーDNAは配列決定システムにより識別可能な配列、サンプルラベル配列、及び分子ラベル配列のうちの一種又は複数種の組み合わせを含む、ことを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子標的エリアの富化方法。
- 前記工程(1)において、磁気ビーズで捕捉伸長生成物を精製する工程を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の遺伝子標的エリアの富化方法。
- 前記遺伝子標的エリアの富化方法が遺伝子検出に用いられる、ことを特徴とする請求項1に記載の遺伝子標的エリアの富化方法。
- 断片化DNA標的エリアを富化するためのキットであって、請求項1~6のいずれか一項に記載の遺伝子標的エリアの富化方法に適用される特異的プローブ及びリンカーDNAを含むことを特徴とするキット。
- RNAリガーゼ、標識分子をカプリングしてあるdNTP、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有する高忠実なDNAポリメラーゼ、ヌクレアーゼから選択された一種或いは多種をさらに含む、ことを特徴とする請求項8に記載のキット。
- さらに検出プライマー1、検出プライマー2及びプローブ3を含み、三者のうちの少なくとも一つは遺伝子特異的配列を含むことを特徴とする請求項9に記載のキット。
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