JP2024515076A - 一本鎖ｄｎａの増幅 - Google Patents

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Abstract

本発明は、一本鎖ＤＮＡの選択的増幅のための方法、キット及び組成物に関する。本発明は、正規化ｃＤＮＡ画分を生成するのに有用であり、プレ結合アダプターを有するＤＮＡテンプレートを増幅するために、様々なＲＮＡ及びＤＮＡシーケンシング用途に使用することができる。我々は、一本鎖ｃＤＮＡの選択的増幅の方法について述べる。我々は、ｃＤＮＡサンプルから低存在量のｃＤＮＡを選択的に増幅するための方法及び選択的増幅キットに使用するオリゴヌクレオチド二量体組成物についても述べる。【選択図】なし

Description

本発明は、一本鎖ＤＮＡの選択的増幅のための方法、キット及び組成物に関する。本発明は、正規化ｃＤＮＡ画分を生成するのに有用であり、プレ結合アダプターを有するＤＮＡテンプレートを増幅するために、様々なＲＮＡ及びＤＮＡシーケンシング用途に使用することができる。
ＲＮＡシーケンシングは、生物学を理解するための強力なツールとなった（Ｓｔａｒｋ，Ｒ．、Ｇｒｚｅｌａｋ，Ｍ．及びＨａｄｆｉｅｌｄ，Ｊ． ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｔｈｅ ｔｅｅｎａｇｅ ｙｅａｒｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０、６３１～６５６（２０１９））。その応用範囲は医薬品開発から農業の改善まで多岐にわたる。ＲＮＡシーケンシングは一般的に、生物学的サンプル間の差異を特定するために使用される。病気に対する抵抗性を研究するための感染動物と対照動物のサンプルや、成長と発育を理解するための時間経過を経た同じ種類のサンプルのサンプルなどである。ＲＮＡシーケンシングから得られる主な結果は、サンプル中で発現しているすべての遺伝子及びアイソフォームの発見と発現の定量化である。多くの細胞や組織は、一般にハウスキーピング遺伝子として知られる同じ高発現遺伝子の多くを共有している。これらの遺伝子は一般的に、基本的な細胞機能を担っているため、細胞特異的な特徴を提供しない。これらのハウスキーピング遺伝子は一般的に、サンプル内のＲＮＡの大部分を占めるため、ＲＮＡシーケンシングデータは通常、これらの非情報性ＲＮＡからのシーケンスリードに支配される。この現象は、ＲＮＡシーケンシングプロジェクトから良好な結果を得る上で、主に２つの弊害をもたらし、１つ目は、問題の状態に特異的な遺伝子やアイソフォームの検出が困難であること、２つ目は、生成されたデータの大部分が冗長であることである。
１つ目の主な弊害は、２つの結果を有する。１つ目は、目的の遺伝子を検出するのに必要なシーケンス量は、目的の遺伝子の相対的存在量が低いために生じるサンプリングの非効率性を処理するのに十分な量でなければならないということである。２つ目は、場合によっては、低存在量の標的遺伝子を同定することが単に非現実的である可能性があるということである。このことは、ヒトゲノムのアノテーションが現在も進行中の取り組みであることからも明らかであり、何千ものシーケンシングプロジェクトが行われた後でも、新規アイソフォームや遺伝子が定期的に報告されているにもかかわらず、ヒトのトランスクリプトームの全容はいまだに解明されていない。真核生物のトランスクリプトームは、組合せ順列を生み出す選択的スプライシングからその複雑さを得ているため、新規ＲＮＡの探索はおそらく絶え間ない努力となるだろう。
これら２つの結果は、シーケンシング実験から理想的な結果を得る研究者の能力を制限することで、最終的に科学の進歩を妨げることになる。これらの結果はまた、ＲＮＡシーケンシングをより幅広い用途に適用することが非現実的であることの一因でもある。例えば、診断や処置追跡に使用する場合、必要とされるシーケンスの量は時間的にもコスト的にも法外となるだろう。
２つ目の主な弊害（冗長データの生成）にも２つの主な結果がある。１つ目は、より多くのデータがより多くの処理時間を必要とし、ＲＮＡシーケンシング実験の全体的なコストと時間を増加させることである。これらのコストは、必要な追加計算によるエネルギーと、データ処理を担当するバイオインフォマティシャンの作業時間の両方である。２つ目の結果は、冗長データにより、より多くのストレージが必要になることである。シーケンシングが普及するにつれ、データストレージは重要な問題になっている。ＲＮＡシーケンシング技術がより多くの役割を担うためには、ストレージ要件を減らすために、より効率的なデータ生成が必要である。
高存在量のハウスキーピング遺伝子が目的の遺伝子のサンプリング効率を低下させる問題に対処するため、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の正規化が開発された（Ａｌｅｘ Ｓ．Ｓｈｃｈｅｇｌｏｖ、Ｐａｖｅｌ Ａ．Ｚｈｕｌｉｄｏｖ、Ｅｋａｔｅｒｉｎａ Ａ．Ｂｏｇｄａｎｏｖａ、Ｄ．Ａ．Ｓ． Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄ． ５章、（２０１４））。ＲＮＡシーケンシングは一般的に、ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換することに依存しているため、ｃＤＮＡ正規化はｃＤＮＡの生化学的特性を利用して、ｃＤＮＡライブラリー内に固有の遺伝子とアイソフォームの均一な分布を生成する。理論的には、すべての固有のＲＮＡ配列が同じ相対的存在量で表される場合、最大の非標的サンプリング効率が得られる。したがって、正規化の目的は、ｃＤＮＡライブラリーをこの基準にできるだけ近くなるように再分布することである。
全長ｃＤＮＡの正規化には、これまでに開発された２つの方法があり、二重特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）法（Ｚｈｕｌｉｄｏｖ，Ｐ．Ａ．ら、Ｓｉｍｐｌｅ ｃＤＮＡ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｋａｍｃｈａｔｋａ ｃｒａｂ ｄｕｐｌｅｘ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２、ｅ３７ （２００４））、及びヒドロキシアパタイトカラム法（Ａｎｄｒｅｗｓ－Ｐｆａｎｎｋｏｃｈ，Ｃ．、Ｆａｄｒｏｓｈ，Ｄ．Ｗ．、Ｔｈｏｒｐｅ，Ｊ．及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｓ．Ｊ． Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ， ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ， ａｎｄ ＲＮＡ ｇｅｎｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌａｇｅｓ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６、５０３９～５０４５ （２０１０））である。どちらの方法も、ｃＤＮＡ鎖の変性と再ハイブリダイゼーションに依存している。一本鎖ｃＤＮＡが溶液中を移動するにつれて、存在量の多い配列ほど、再ハイブリダイゼーションするのにマッチする相補的な配列が見つかる確率が高くなる。したがって、再ハイブリダイゼーションが限界に達すると、残りの一本鎖ｃＤＮＡは正規化された配列ライブラリーを表す。
２つの方法の違いは、再ハイブリダイズした二本鎖ｃＤＮＡ分子から一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを単離するアプローチにある。
ＤＳＮ法では、二本鎖ＤＮＡを特異的に切断する酵素を用いて、溶液中のすべての二本鎖ｃＤＮＡを分解する。その後、溶液を精製し、ある長さ以上のｃＤＮＡ配列をサイズ選択する。これらの配列は、次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅される。
カラム法では、変性及び再ハイブリダイズしたｃＤＮＡライブラリーを、ヒドロキシアパタイト顆粒を充填した加熱カラムに通す。ヒドロキシアパタイトはより大きなＤＮＡ分子と優先的に結合する。結合するＤＮＡの大きさは、ｃＤＮＡライブラリーを溶解するリン酸緩衝液の濃度によって制御される。したがって、リン酸緩衝液の濃度は、ある範囲内の配列長のｃＤＮＡ分子に特異的に調整されなければならない。ｃＤＮＡは、リン酸緩衝液の濃度を上げながらカラムを通して溶出され、ＤＮＡ分子のサイズが大きくなるにつれて抽出される。一本鎖ｃＤＮＡは、再ハイブリダイズしたｃＤＮＡのおよそ２分の１のサイズになるため、平均ｃＤＮＡ配列長がわかっていれば、一本鎖画分の溶出は管理されうる。得られた溶出液は、一本鎖ｃＤＮＡが濃縮され、その後ＰＣＲを用いて増幅されることを目的としている。
ＤＳＮ法でもカラム法でも、ＰＣＲ増幅を容易にするために（適切なプライマーが使用されうるように）、正規化の前にｃＤＮＡの末端に既知のアダプターを付けておく必要がある。
どちらの方法も、本質的にｃＤＮＡの大きな画分が枯渇する減法的なものであるため、出発ｃＤＮＡの量は一般的に、ＤＳＮ法では１μｇ以上、カラム法では４μｇ以上が必要である。
ＤＳＮ法はすべての二本鎖ｃＤＮＡを切断する酵素を用いるので、理論的には、存在量の高い配列にマッチするセグメントで存在量の低い配列を除去することができる。この効果はＰＣＲキメラを形成する確率を増加させることもできる。ＰＣＲキメラは不完全な一本鎖ｃＤＮＡ配列が他の配列のプライマーとして働き、自然界では起こらないような形で配列が結合する場合に形成される。ＰＣＲキメラは新規アイソフォームの偽陽性であり、真の代替アイソフォームと区別することは極めて困難である。ＰＣＲキメラの検証には一般的に、徹底的な生化学的アッセイが必要である。低存在量配列の枯渇とＰＣＲキメラの可能性の増大の両方が、ＤＳＮ法を多くのＲＮＡシーケンシング用途に適さないものにしている。
カラム法では、狭いサイズ範囲内で高存在量画分と低存在量画分を分離することしかできないため、長いｃＤＮＡ配列に対して大きな偏りがある。この影響は、より長いＲＮＡ配列の表現が失われることである。この影響は、カラム法を多くのＲＮＡシーケンシング用途に適さないものにする。
したがって、本発明はこのような問題を念頭に置いて考案されたものである。
最も広い態様において、本発明は、ｃＤＮＡサンプルから低存在量のｃＤＮＡを選択的に増幅するための方法、組成物及びキットを提供する。本発明は、ｃＤＮＡサンプルの非枯渇正規化、特にｃＤＮＡサンプル内の低存在量ｃＤＮＡの量を増加させることによるｃＤＮＡサンプルの正規化を提供する。従来の正規化技術と比較した本発明の利点は、
１．必要な出発材料の量がはるかに少ないこと
２．遺伝子が欠落する過剰枯渇のリスクが低減されること
３．転写産物の発見／検出において偽陽性を生じる可能性のあるＰＣＲアーティファクトを生成する傾向が低減されること
４．テンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）のクリーンアップ（アダプターを含まないｃＤＮＡのクリーンアップ）が、方法、組成物、キットを採用した場合に行われること
を含む。
本発明によれば、一本鎖ｃＤＮＡの選択的増幅の方法であって、
（ｉ）それぞれのテンプレートが既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプターを有する、二本鎖ｃＤＮＡテンプレートを含むｃＤＮＡサンプルを用意するステップ、
（ｉｉ）ｃＤＮＡサンプルを変性させ、一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを作製するステップ、
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡサンプルを再会合させて、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートと会合後の二本鎖ｃＤＮＡテンプレートの混合物を作製するステップ、
（ｉｖ）５’アダプター複合体を少なくとも１つの会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’プレ結合アダプターにアニールし、及び３’アダプター複合体を同じ会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’プレ結合アダプターにアニールするステップ、それぞれのアダプター複合体は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、
（ｖ）５’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’プレ結合アダプターにライゲーションし、及び３’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、同じ会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’プレ結合アダプターにライゲーションするステップ、並びに
（ｖｉ）ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを用いて、ｃＤＮＡサンプルを選択的に増幅するステップ、
を含む方法、が提供される。
一実施形態では、
（Ａ）５’アダプター複合体が、
（ｉ）会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’プレ結合アダプターにライゲーションするための前方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）５’プレ結合アダプター及び前方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための前方リンク－オリゴヌクレオチドであって、５’プレ結合アダプターに相補的な領域及び前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、前方リンク－オリゴヌクレオチド、
を含み、
アニーリング時に、前方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が５’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において前方リグ－オリゴヌクレオチドの５’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、前方オリゴヌクレオチド二量体であり、並びに、
（Ｂ）３’アダプター複合体が、
（ｉ）会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’プレ結合アダプターにライゲーションするための後方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）３’プレ結合アダプター及び後方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための後方リンク－オリゴヌクレオチドであって、３’プレ結合アダプターに相補的な領域及び後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、後方リンク－オリゴヌクレオチド、
を含み、
アニーリング時に、後方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が３’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において後方リグ－オリゴヌクレオチドの３’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、後方オリゴヌクレオチド二量体である。
好適には、
（Ａ）前方リンク－オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）５’プレ結合アダプターに相補的な領域に近接する前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
（ｉｉ）前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域に近接する前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、前方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
を含み、及び／又は
（Ｂ）後方リンク－オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）３’プレ結合アダプターに相補的な領域に近接する後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
（ｉｉ）後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域に近接する後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、後方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
を含む。
好適には、テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは約１ｂｐ～約２０ｂｐの間の長さである。テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは、２ｂｐ～１９ｂｐの間、３ｂｐ～１８ｂｐの間、２ｂｐ～１７ｂｐの間、３ｂｐ～１６ｂｐの間、２ｂｐ～１５ｂｐの間、３ｂｐ～１４ｂｐの間、２ｂｐ～１３ｂｐの間、３ｂｐ～１２ｂｐの間、２ｂｐ～１１ｂｐの間、３ｂｐ～１０ｂｐの間、２ｂｐ～９ｂｐの間、３ｂｐ～８ｂｐの間、２ｂｐ～７ｂｐの間、３ｂｐ～６ｂｐの間、２ｂｐ～５ｂｐの間、３ｂｐ～５ｂｐの間、又は２ｂｐ～４ｂｐの間であってもよい。好ましくは、テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは３ｂｐである。
テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは、少なくとも２ｂｐ、又は少なくとも３ｂｐであってもよい。好ましくは、テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは少なくとも３ｂｐである。
好適には、前方リンク－オリゴヌクレオチド及び前方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さは約３００ｂｐ未満であり、及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチド及び後方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さは約３００ｂｐ未満である。
好適には、前方及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドは２００ｂｐ未満の長さを有する。
好適には、前方オリゴヌクレオチド二量体及び／又は後方オリゴヌクレオチド二量体は、少なくとも１つの非平滑末端を有する。
好適には、前方リンク－オリゴヌクレオチド及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドは、ライゲーション部位のいずれかの側に少なくとも５ｂｐの相補的結合を提供する。
好適には、前方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列は、後方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列と異なり、非相補的である。
好適には、前方オリゴヌクレオチド二量体及び後方オリゴヌクレオチド二量体の少なくとも一方は、３０℃を超える温度で会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニール可能である。
好適には、前方オリゴヌクレオチド二量体の濃度及び／又は後方オリゴヌクレオチド二量体の濃度は、ｃＤＮＡサンプル中の予測される全一本鎖ｃＤＮＡ濃度又は全ｃＤＮＡの濃度を超える。
好適には、ｃＤＮＡサンプルを再会合させるステップは、０～２４時間、任意選択で０～８時間、１～７時間、１～２４時間又は７～２４時間の持続時間を有する。
第２の態様では、本発明は、既知の５’及び３’プレ結合アダプターを有する会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’及び３’末端へのオリゴヌクレオチドのライゲーションによる一本鎖ｃＤＮＡの選択的増幅のための、上記の方法において使用するためのオリゴヌクレオチド二量体組成物であって、組成物が、
（Ａ）
（ｉ）会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’プレ結合アダプターにライゲーションするための前方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）５’プレ結合アダプター及び前方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための前方リンク－オリゴヌクレオチドであって、５’プレ結合アダプターに相補的な領域及び前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、前方リンク－オリゴヌクレオチド、
を含み、
アニーリング時に、前方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が５’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において前方リグ－オリゴヌクレオチドの５’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、前方オリゴヌクレオチド二量体、並びに、
（Ｂ）
（ｉ）会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’プレ結合アダプターにライゲーションするための後方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）３’プレ結合アダプター及び後方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための後方リンク－オリゴヌクレオチドであって、３’プレ結合アダプターに相補的な領域及び後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、後方リンク－オリゴヌクレオチド、
を含み、
アニーリング時に、後方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が３’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において後方リグ－オリゴヌクレオチドの３’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、後方オリゴヌクレオチド二量体、
を含む、オリゴヌクレオチド二量体組成物を提供する。
一実施形態では、
（Ａ）前方リンク－オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）５’プレ結合アダプターに相補的な領域に近接する前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
（ｉｉ）前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域に近接する前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、前方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
を含み、及び／又は
（Ｂ）後方リンク－オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）３’プレ結合アダプターに相補的な領域に近接する後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
（ｉｉ）後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域に近接する後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、後方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
を含む。
好適には、テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは約１ｂｐ～約２０ｂｐの間の長さである。テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは、２ｂｐ～１９ｂｐの間、３ｂｐ～１８ｂｐの間、２ｂｐ～１７ｂｐの間、３ｂｐ～１６ｂｐの間、２ｂｐ～１５ｂｐの間、３ｂｐ～１４ｂｐの間、２ｂｐ～１３ｂｐの間、３ｂｐ～１２ｂｐの間、２ｂｐ～１１ｂｐの間、３ｂｐ～１０ｂｐの間、２ｂｐ～９ｂｐの間、３ｂｐ～８ｂｐの間、２ｂｐ～７ｂｐの間、３ｂｐ～６ｂｐの間、２ｂｐ～５ｂｐの間、３ｂｐ～５ｂｐの間、又は２ｂｐ～４ｂｐの間であってもよい。好ましくは、テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは３ｂｐである。
テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは、少なくとも２ｂｐ、又は少なくとも３ｂｐであってもよい。好ましくは、テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングは少なくとも３ｂｐである。
好適には、前方リンク－オリゴヌクレオチド及び前方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さは約３００ｂｐ未満であり、及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチド及び後方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さは約３００ｂｐ未満である。
好適には、前方及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドは２００ｂｐ未満の長さを有する。
好適には、前方オリゴヌクレオチド二量体及び／又は後方オリゴヌクレオチド二量体は、少なくとも１つの非平滑末端を有する。
好適には、組成物の使用において、前方リンク－オリゴヌクレオチド及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドは、ライゲーション部位のいずれかの側に少なくとも５ｂｐの相補的結合を提供する。
好適には、前方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列は、後方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列と異なり、非相補的である。
好適には、前方オリゴヌクレオチド二量体及び／又は後方オリゴヌクレオチド二量体は、３０℃を超える温度で会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニール可能である。
本発明のさらなる態様は、任意選択で、新規ＲＮＡの発見及び／又は低存在量のＲＮＡの検出のための、さらに任意選択で、シーケンシングが単一細胞シーケンシングである、ＲＮＡ又はＤＮＡシーケンシングの工程における、上記の方法又は上記のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、新規微生物の発見及び／又は低存在微生物の検出のためのメタゲノムシーケンシング工程における、上記の方法又は上記のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡサンプルをスクリーニングする、又は感染症の存在について遺伝子サンプルをスクリーニングする工程における、上記の方法又は上記のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用を提供する。
本発明のさらなる態様は、核酸バイオマーカー、任意選択で疾患バイオマーカー、さらに任意選択で癌バイオマーカーを検出する工程における、上記の方法又は上記のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用を提供する。
特定の実施形態では、本発明のすべての態様によれば、方法は、結果を報告することをさらに含む。結果は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列、微生物若しくは疾患の有無の表示、及び／又は疾患バイオマーカーの有無若しくはレベルの表示、の形態であってもよい。
本発明のさらなる態様は、ｃＤＮＡサンプルから低存在量のｃＤＮＡを選択的に増幅するため及び／又は既知のアダプター配列を含むｃＤＮＡを選択的に増幅するための選択的増幅キットであって、ｃＤＮＡサンプルは、既知の５’及び３’プレ結合アダプターを有するｃＤＮＡテンプレートを含み、キットは、上記のオリゴヌクレオチド二量体組成物を調製するための手段と、上記の選択的増幅方法を実施するための手段とを含む、選択的増幅キット、を提供する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド二量体組成物を調製するための手段は、本明細書に記載の、前方リグ－オリゴヌクレオチド、前方リンク－オリゴヌクレオチド、後方リグ－オリゴヌクレオチド及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド二量体組成物を調製するための手段は、本明細書に記載の前方オリゴヌクレオチド二量体及び／又は後方オリゴヌクレオチド二量体を含んでもよい。
選択的増幅の方法を実施するための手段は、前方及び／又は後方のリグ－オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを含んでもよい。
特定の実施形態では、キットはハイブリダイゼーション緩衝液をさらに含んでもよい。ハイブリダイゼーション緩衝液は、ＨＥＰＥＳ １Ｍ（ｐＨ＝７．５）、ＮａＣｌ ５Ｍ、及びＨ２Ｏを含んでもよい。キットはまた、リガーゼ及び／又はリガーゼ緩衝液を含んでもよい。任意の好適なリガーゼが使用されてもよい。リガーゼはニック修復リガーゼ又は平滑末端リガーゼであってもよい。任意選択で、リガーゼはＴａｑ ＤＮＡリガーゼであってもよい。好適なリガーゼ緩衝液もよく知られており、市販されている。
さらなる実施形態では、キットは、ｃＤＮＡサンプルとして使用する前にｃＤＮＡにリン酸基を付加するためのプライマーをさらに含んでもよい。これらのプライマーは、既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプター配列に基づいている。
特定の実施形態では、キットは、ポリメラーゼ、ジヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＭｇＣｌ２、及び緩衝液のうちの１つ又は複数、最大すべてを含むＰＣＲのための好適な試薬をさらに含んでもよい。任意の好適なポリメラーゼが利用されてもよい。一般に、ＤＮＡポリメラーゼは、本発明に記載の核酸標的を増幅するために使用される。例は、Ｔａｑ又はＰｆｕポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ、及びこれらの酵素の様々な誘導体を含む。好適な緩衝液もよく知られており、市販されており、ＰＣＲ増幅に必要な成分の大部分を含むＰＣＲマスターミックスに含まれることがある。
さらなる実施形態では、キットは、逆転写酵素を含む、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するための好適な試薬をさらに含んでもよい。任意の好適な逆転写酵素が利用されてもよい。好適な緩衝液もよく知られており、市販されており、逆転写に必要な成分の大部分を含む逆転写マスターミックスに含まれることがある。
本発明のさらなる態様は、
前方リグ－オリゴヌクレオチド、前方リンク－オリゴヌクレオチド、後方リグ－オリゴヌクレオチド及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチド、並びに
前方及び／又は後方リグ－オリゴヌクレオチドに特異的なプライマー
を含む、本明細書に記載の方法において使用するための試薬セットを提供する。
前方リグ－オリゴヌクレオチド、前方リンク－オリゴヌクレオチド、後方リグ－オリゴヌクレオチド及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物として提供されることがある。
試薬のセットは、ハイブリダイゼーション緩衝液（任意選択で、ＨＥＰＥＳ １Ｍ（ｐＨ＝７．５）、ＮａＣｌ ５Ｍ及びＨ２Ｏを含む）、リガーゼ、リガーゼ緩衝液、ｃＤＮＡにリン酸基を付加するためのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はｄＮＴＰ、のうちの１つ又は複数、最大すべてをさらに含んでもよい。
一実施形態では、試薬のセットは、
前方リグ－オリゴヌクレオチド、前方リンク－オリゴヌクレオチド、後方リグ－オリゴヌクレオチド及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチド、
前方及び／又は後方リグ－オリゴヌクレオチドに特異的なプライマー、
ハイブリダイゼーション緩衝液、
リガーゼ、
リガーゼ緩衝液、及び
ｃＤＮＡにリン酸基を付加するためのプライマー対
を含む。
本方法のもう一つの重要な態様は、既知のアダプター配列を持つｃＤＮＡを選択できることである。この態様は、個々の細胞にリードを割り当てるためにアダプターが必要な単一細胞シーケンシングに応用できる。この用途では、細胞を識別するバーコード／アダプターを持たないｃＤＮＡ配列がｃＤＮＡライブラリー内に生じる。これらはテンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）アーティファクトとして知られており、由来細胞に割り当てることができないため、単一細胞シーケンシングプロジェクトでは望ましくない。本方法は、所望のアダプター配列を持つｃＤＮＡ配列を選択するためのみに適用することができ、それゆえにＴＳＯアーティファクトのシーケンシングを効果的に制限することができる。本方法はまた、ＴＳＯアーティファクトを除去するため、及び細胞あたりのトランスクリプトーム適用範囲を向上させるために、単一細胞ｃＤＮＡライブラリーで実施することもできる。
ＴＳＯクリーンアップは、本発明の方法がｃＤＮＡサンプルの正規化に使用される場合に行われる。しかし、ＴＳＯクリーンアップは正規化せずに実施することもでき、その場合、ｃＤＮＡサンプルを再会合させて、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートと会合後の二本鎖ｃＤＮＡテンプレートの混合物を作製するステップを含める必要はない。
したがって、本発明のさらなる態様によれば、既知のアダプター配列を含むｃＤＮＡの選択的増幅の方法であって、
（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡテンプレートを含むｃＤＮＡサンプルを用意するステップ、テンプレートの一部は既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプターを有する、
（ｉｉ）ｃＤＮＡサンプルを変性させ、一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを作製するステップ、
（ｉｉｉ）５’アダプター複合体を少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’プレ結合アダプターにアニールし、及び３’アダプター複合体を同じ一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’プレ結合アダプターにアニールするステップ、それぞれのアダプター複合体は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、
（ｖ）５’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’プレ結合アダプターにライゲーションし、及び３’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、同じ一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’プレ結合アダプターにライゲーションするステップ、並びに
（ｖｉ）ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを用いて、ｃＤＮＡサンプルを選択的に増幅するステップ、
を含む方法、が提供される。
上記の一本鎖ｃＤＮＡの選択的増幅の方法の実施形態は、既知のアダプター配列を含むｃＤＮＡの選択的増幅の方法に準用され、簡潔さの理由から繰り返さない。オリゴヌクレオチド二量体組成物は、既知のアダプター配列を含むｃＤＮＡの選択的増幅のための本明細書で定義される方法における使用に好適である。本明細書で定義される、既知のアダプター配列を含むｃＤＮＡの選択的増幅の方法は、任意選択で、新規ＲＮＡの発見及び／又は低存在量ＲＮＡの検出のための、さらに任意選択で、シーケンシングが単一細胞シーケンシングである、ＲＮＡ又はＤＮＡシーケンシングの工程において使用することができる。同様に、本方法は、新規微生物の発見及び／又は低存在微生物の検出のためのメタゲノムシーケンシング工程において、ＤＮＡ若しくはＲＮＡサンプルをスクリーニングする、又は感染症の存在について遺伝子サンプルをスクリーニングする工程において、又は核酸バイオマーカー、任意選択で疾患バイオマーカー、さらに任意選択で癌バイオマーカーを検出する工程において使用することができる。本明細書で定義されるキット及び試薬のセットは、既知のアダプター配列を含むｃＤＮＡの選択的増幅のための方法における使用にも好適である。
一部の実施形態では、本発明のすべての態様によれば、ｃＤＮＡサンプルは、７００ｎｇ、５００ｎｇ、１００ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、又は１ｎｇ以下の出発ｃＤＮＡを含む。ｃＤＮＡサンプルは、１～５００ｎｇ、５～１００ｎｇ、又は１０～５０ｎｇの出発ｃＤＮＡを含んでもよい。
特定の実施態様において、本発明のすべての態様によれば、サンプルからのＲＮＡはまずｃＤＮＡに逆転写される。サンプルの種類は、血液サンプル（特に血漿由来、血清も）、唾液、尿、リンパ液などの他の体液を含む。その他のサンプルの種類は、凍結組織やホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）材料を含む固形組織を含む。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などであってもよい。このような実施形態では、ＲＮＡは、一般的に、逆転写酵素を用いて逆転写され、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を形成する。逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は、当技術分野において周知である。任意の好適な逆転写酵素を使用することができ、好適な逆転写酵素の例は当技術分野で広く入手可能である。最初のｃＤＮＡ分子は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を生成するまでは一本鎖であってもよい。市販のキット（ＮＥＢＮｅｘｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ／Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＆ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅなど）を用いて、ＲＮＡを５’及び３’アダプターをもつ二本鎖ｃＤＮＡに変換することができる。５’及び３’アダプターに基づくプライマーを用いて、ｃＤＮＡにリン酸基を付加することができる。ｃＤＮＡをｃＤＮＡサンプルとして使用する前に、ｃＤＮＡ精製ステップ（例えばＰｒｏＮｅｘやＡｍｐｕｒｅビーズを用いる）を実施することもできる。
本発明は少量の出発ｃＤＮＡしか必要としないので、ｃＤＮＡは少量のＲＮＡから、及び／又はｃＤＮＡの生成中に追加のＰＣＲサイクルを必要とせずに生成されうる。ＲＮＡサンプルは３μｇ、２μｇ、１μｇ、５００ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇ以下の出発ＲＮＡを含んでもよい。ＲＮＡサンプルは、１ｎｇ～３μｇ、１０ｎｇ～２μｇ、又は１００ｎｇ～１μｇの出発ＲＮＡを含んでもよい。
〔詳細な説明〕
次に、本発明の上記及びその他の態様を、以下の例及び添付の図を参照して、例示のためにのみ、さらに詳細に説明する。
一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの末端へのライゲーション配列の付加を示す概略図である。 本発明に従うｃＤＮＡ正規化工程の一実施形態の概略図である。 一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニールされた前方及び後方オリゴヌクレオチド二量体構造の概略図であり、図３Ａはその詳細であり、図３Ｂは本明細書に記載される実施例の配列表現を用いた説明図である。 一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニールされた前方及び後方オリゴヌクレオチド二量体構造の概略図であり、図３Ａはその詳細であり、図３Ｂは本明細書に記載される実施例の配列表現を用いた説明図である。 一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニールされた前方及び後方オリゴヌクレオチド二量体構造の概略図であり、図３Ａはその詳細であり、図３Ｂは本明細書に記載される実施例の配列表現を用いた説明図である。 入力ｃＤＮＡのゲル電気泳動による長さ分布を示すグラフの図である。 本発明に従うｃＤＮＡ正規化工程の実施形態から得られる正規化ｃＤＮＡのゲル電気泳動からの長さ分布を示すグラフの図である。 Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｃＤＮＡシーケンシングを用いた、入力ｃＤＮＡと本発明に従って正規化した正規化ｃＤＮＡの飽和曲線を示す図である。
現在のｃＤＮＡ正規化技術の問題に対処するために、本発明者らは改良された選択的増幅法を開発した。本方法は、上記のＤＳＮ法やカラム法と同じ変性及び再ハイブリダイゼーション工程を利用する。しかしながら、本方法は、非枯渇又は相加メカニズムを用いることにより、現在のアプローチとは異なる。言い換えれば、本発明はサンプル中の低存在量のｃＤＮＡの量を増加させる方法と手段を提供する。これらの方法及び手段は、シーケンシング工程におけるｃＤＮＡの正規化、又は微生物若しくはバイオマーカーの発見、検出若しくは同定など、低存在量のｃＤＮＡの増幅から利益を得る他の工程に使用することができる。
本発明の文脈では、以下の用語及び方法の説明は、本開示をより良く説明し、本開示の実施における指針を提供するために提供される。
「選択的増幅」という語句は、本発明者らによって開発された、他のＤＮＡテンプレートよりも特定のＤＮＡテンプレートを優先的に増幅する方法、例えば、一本鎖と二本鎖のｃＤＮＡの混合物を含むサンプル中の一本鎖ｃＤＮＡのみを増幅する方法を説明するために使用される。この用語は、本明細書では、低存在量のＤＮＡのような特定のカテゴリーのＤＮＡを優先的に増幅することを説明するためにも使用される。
「アダプター」という用語は、ｃＤＮＡテンプレートにアダプターをライゲーションすることによって、ＲＮＡシーケンシングで一般的に使用されるような、ＤＮＡテンプレートの末端に付加される短いＤＮＡ配列を説明するために使用される。「３’プレ結合アダプター」とは、ｃＤＮＡテンプレートの３’末端に付加された既知のヌクレオチド配列を有するアダプターを指す。「５’プレ結合アダプター」とは、ｃＤＮＡテンプレートの５’末端に付加された既知のヌクレオチド配列を有するアダプターを指す。
「正規化」及び「正規化画分」という用語は、サンプル内の異なる転写産物の存在量を平準化する工程を指す。正規化は、高存在量の転写産物の量を減少させる従来技術の方法、又は低存在量の転写産物を選択的に増幅する本発明の方法によって達成することができる。
本発明の文脈で使用される「会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレート」という語句は、一本鎖ｃＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物を形成するために、二本鎖ｃＤＮＡのサンプルを解離及び再会合（すなわち、変性及び再ハイブリダイゼーション）させることによって生成された一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを指す。再会合後も一本鎖のままの一本鎖ｃＤＮＡは、会合後の一本鎖ｃＤＮＡと呼ばれる。再会合ステップが実施されない場合、本明細書で定義される実施形態において、「会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレート」という語句は、「一本鎖ｃＤＮＡテンプレート」と互換性がある。
本明細書で使用される「ライゲーションアダプターｃＤＮＡテンプレート」という語句は、ｃＤＮＡテンプレートにアダプターをライゲーションすることによって形成されるｃＤＮＡテンプレートを指す。
本発明は、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの末端にアニーリングするのに好適な「アダプター複合体」を包含する。「アダプター複合体」という用語は、複数の成分を含むアダプターを指す。
本発明の文脈で使用される「前方オリゴヌクレオチド二量体」、「前方ｋ－リンカー」及び「前方二量体」という用語は、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’末端にアニールすることができるアダプター複合体を指す。本発明の文脈で使用される「後方オリゴヌクレオチド二量体」、「後方ｋ－リンカー」及び「後方二量体」という用語は、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’末端にアニールすることができるアダプター複合体を指す。
本発明の文脈で使用される「前方リグ－オリゴヌクレオチド」及び「前方リグ」という用語は、前方二量体のオリゴヌクレオチド成分を指す。本発明の文脈で使用される「後方リグ－オリゴヌクレオチド」又は「後方リグ」という用語は、後方二量体のオリゴヌクレオチド成分を指す。
本発明の文脈で使用される「前方リンク－オリゴヌクレオチド」及び「前方リンク」という用語は、前方二量体のオリゴヌクレオチド成分を指す。本発明の文脈で使用される「後方リンク－オリゴヌクレオチド」及び「後方リンク」という用語は後方二量体のオリゴヌクレオチド成分を指す。
「オーバーハング」という用語は、本発明の文脈において、本発明の二量体の配列のオーバーハング領域を表すために使用され、ここで、オーバーハング領域は、一旦会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニールされると、それが対になる領域と非相補的であり、オーバーハング領域がその対になる領域と結合しないようになっている。
一本鎖ｃＤＮＡは、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを用いて選択的に増幅される。一本鎖ＤＮＡがテンプレートであるため、特異的プライマー対の一方のプライマーのプライマー領域は一本鎖ＤＮＡ分子に相補的である。特異的プライマー対のもう一方のプライマーは、増幅サイクル中に形成される相補的な一本鎖ＤＮＡ分子と相補的であり、したがってハイブリダイズするプライマー領域を含む。したがって、一方のプライマーはライゲーションされたオリゴヌクレオチドの一方に相補的であり、他方のプライマーは他のライゲーションされたオリゴヌクレオチドの（少なくとも部分的な）配列を含む。
カラム法
上記のように、ヒドロキシアパタイトカラム法は、ｃＤＮＡ鎖の変性と再ハイブリダイゼーションに依存している。一本鎖ｃＤＮＡが溶液中を移動するにつれて、存在量の多い配列ほど、再ハイブリダイゼーションするのにマッチする相補的な配列が見つかる確率が高くなる。カラム法では、変性及び再ハイブリダイズしたｃＤＮＡライブラリーを、ヒドロキシアパタイト顆粒を充填した加熱カラムに通す。ヒドロキシアパタイトはより大きなＤＮＡ分子と優先的に結合する。一本鎖ｃＤＮＡは、再ハイブリダイズしたｃＤＮＡのおよそ２分の１のサイズになるため、平均ｃＤＮＡ配列長がわかっていれば、一本鎖画分の溶出は管理されうる。得られた溶出液は、一本鎖ｃＤＮＡが濃縮され、その後ＰＣＲを用いて増幅されることを目的としている。
ヒドロキシアパタイトカラム法は、Ａｎｄｒｅｗｓ－Ｐｆａｎｎｋｏｃｈら（Ａｎｄｒｅｗｓ－Ｐｆａｎｎｋｏｃｈ，Ｃ．、Ｆａｄｒｏｓｈ，Ｄ．Ｗ．、Ｔｈｏｒｐｅ，Ｊ．及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｓ．Ｊ． Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ，ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ，ａｎｄ ＲＮＡ ｇｅｎｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌａｇｅｓ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６、５０３９～５０４５（２０１０））に記載されているように４μｇ ｃＤＮＡを出発サンプルとして実施された。ヒドロキシアパタイトカラム法は、２μｇ以下のｃＤＮＡを使用した場合に使用可能な収量を生成しなかった。
カラム法はサイズによる分離に基づいているため、この方法では長いＲＮＡ配列（４ｋｂ以上）の表現が失われ、これは正規化前後の長さ分布で観察できる。
ＤＳＮ法
カラム法と同様、ＤＳＮ法はｃＤＮＡ鎖の変性と再ハイブリダイゼーションに依存している。一本鎖ｃＤＮＡが溶液中を移動するにつれて、存在量の多い配列ほど、再ハイブリダイゼーションする、マッチした相補的な配列が見つかる確率が高くなる。ＤＳＮ法では、二本鎖ＤＮＡを特異的に切断する酵素を用いて、溶液中のすべての二本鎖ｃＤＮＡを分解する。
市販のＥｖｒｏｇｅｎ Ｔｒｉｍｍｅｒ－２ ｃＤＮＡ正規化キットはＤＳＮ法を用いる。このキットは、１μｇのｃＤＮＡを出発サンプルとして、製造者の使用説明書に従って使用された。しかしながら、ロングリードＲＮＡシーケンシングに十分な材料を生成するには、２μｇのｃＤＮＡを使う必要があることがわかった。
ＤＳＮ法は高存在量のＲＮＡを完全に除去することがわかり、これは高存在量のＲＮＡと配列が類似しているＲＮＡについても同様であると予想された。したがって、高存在量のＲＮＡは単に量が減っただけでなく、サンプルから完全に除去されたという過剰枯渇が観察された。表１は、ランク１～２０の過剰枯渇を示し、ＲＮＡが大幅に減少したが完全には除去されなかった低ランク（５５、６４、７７、９２及び９８）の選択を示している。
Figure 2024515076000001
さらに、ＤＳＮ法は人工的なキメラ配列が生成される条件を作り出し、遺伝子予測の偽陽性として現れる可能性がある。
選択的増幅法
本方法を図１～図３に示す。概要としては、図２を参照すると、既知の５’及び３’プレ結合アダプターを有するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡサンプルを変性させて一本鎖ｃＤＮＡサンプルを生成し、次いでこのサンプルを再ハイブリダイズ又は再会合させて一本鎖及び二本鎖ｃＤＮＡの混合物を生成する。この一本鎖ｃＤＮＡは低存在量のｃＤＮＡに相当する。再会合させたサンプル中の一本鎖ｃＤＮＡは、次いで５’及び３’プレ結合アダプターにオリゴヌクレオチドを加えることによって修飾される。ｃＤＮＡサンプルは、これらのオリゴヌクレオチドに対するプライマーを用いて増幅される。この工程は、再会合サンプル中の一本鎖ｃＤＮＡのみの含量を選択的に増加させ、それによってサンプル中の低存在量のｃＤＮＡの含量が増加し、正規化されたサンプルを生成する。
選択的増幅法のための入力ｃＤＮＡライブラリーは二本鎖であり、二本鎖テンプレートはそれぞれ、既知のヌクレオチド配列の５’プレ結合アダプターと既知のヌクレオチド配列の３’プレ結合アダプターを含む。本方法は相加方法であるため、先行技術の正規化法と比較して、より少量の出発ｃＤＮＡが必要である。ＤＳＮａｓｅ法では最低１μｇの入力ｃＤＮＡが必要であり、カラム法では最低４μｇの入力ｃＤＮＡが必要である。テストでは、本方法はわずか２０ｎｇの出発ｃＤＮＡで適用できることがわかった。
本方法の第一段階は、入力ｃＤＮＡをハイブリダイゼーション緩衝液と合わせ、溶液を変性温度の摂氏約９８℃まで加熱し、変性した一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを作出することを含む。５～１０分後、次いで溶液を再ハイブリダイゼーション温度の摂氏約６８℃まで下げる。必要な正規化の量に応じて、この温度で０～２４時間の間、溶液をインキュベートする。７時間が再会合ステップの一般的な時間である。このステップは、会合後の二本鎖ｃＤＮＡテンプレート及び会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを含む再会合又は再ハイブリダイゼーションサンプルを生成する。
インキュベーション後、本発明のオリゴヌクレオチド二量体（本発明者らによってＫ－リンカーと呼ばれる）を添加する。これらのオリゴヌクレオチド二量体については、以下に詳述する。この時点で、溶液を摂氏６８℃で０～１時間インキュベートすることができる。５分がこのインキュベーションステップの一般的な時間である。次いで、溶液はＫ－リンカーのアニーリング温度まで下げられ、この温度は一般的には摂氏４０～６０℃、例えば摂氏４４℃である。溶液は１０分～２時間の間、例えば２５分、その温度でインキュベートされる。このステップは、Ｋ－リンカーを会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニールさせる。
このインキュベーション時間の後、ライゲーションミックスとともにＤＮＡリガーゼが添加される。この溶液は同じ温度で０．５～２時間、例えば１時間インキュベートされ、次いで室温までに下げられる。このステップにより、Ｋ－リンカーのオリゴヌクレオチドが、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの両端にライゲーションされた、ライゲーションアダプターｃＤＮＡテンプレートが形成される。この時点で、ｃＤＮＡは精製されてもよいし（例えばＰｒｏｎｅｘ又はＡｍｐｕｒｅビーズを使用）、Ｋ－リンカーの配列に基づいたプライマーを用いたＰＣＲ増幅に直接使用してもよい。
ＰＣＲ増幅後、ｃＤＮＡは適切な方法で精製され、得られたｃＤＮＡは正規化ｃＤＮＡライブラリーに相当する。
会合後の二本鎖ｃＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲ増幅の前に除去することができるが、テストの結果、本発明者らは、溶液中に二本鎖ｃＤＮＡを残しても、正規化工程に悪影響を与えないことを示した。実際、会合後の二本鎖ｃＤＮＡも分析することができ、例えば遺伝子発現の推定値を得るために使用することができる。これには、既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプターに対するプライマーを使用する追加の（ＰＣＲ）選択的増幅ステップが含まれ、分子バーコードがプライマーに含まれる。Ｋ－リンカー配列に基づくプライマーを用いたＰＣＲ増幅が最初に行われ、続いて既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプターに対するプライマーを用いた１回のＰＣＲサイクルが行われる。ＰＣＲは最終サイクルのためのさらなるプライマーを加えるために一時停止することができる。或いは、Ｋ－リンカー配列に基づくプライマーを用いたＰＣＲの後にｃＤＮＡを精製し、既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプターに対するプライマーを用いて新しいＰＣＲを１サイクル行うこともできる。いずれの場合も、産物は、会合後の二本鎖ｃＤＮＡテンプレートに由来する配列と会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートに由来する配列を含む２つの区別可能な画分の混合物となる。分子バーコードの付加は、シーケンシング解析中にソース分子の同定を可能にする。本発明のこの態様は、マルチプレックスシーケンシングに使用することができる。
オリゴヌクレオチド二量体複合体の設計
本発明のオリゴヌクレオチド二量体組成物は、前方及び後方オリゴヌクレオチド二量体（前方及び後方Ｋ－リンカー）を含み、これらは両方とも会合後の一本鎖ｃＤＮＡの同じ鎖にアニールする。
図３及び図３Ａを参照すると、それぞれのＫ－リンカーは２つのオリゴヌクレオチド配列を含み、一方はリンク－オリゴヌクレオチド（「リンク」とも呼ばれる。図３及び図３Ａでは「ＬＵアダプターリンカー」と呼ばれる）と呼ばれ、他方はリグ－オリゴヌクレオチド（「リグ」とも呼ばれる。図３及び図３Ａでは「ＬＵアダプター」と呼ばれる）と呼ばれる。
リンク配列は、既知の３’／５’プレ結合アダプター配列（ｃＤＮＡにあらかじめ付加されている）と相補的な領域及びリグと相補的な領域を含む。
図３と図３Ａにも描かれているように、リンクは一端に既知のプレ結合アダプター配列に非相補的なオーバーハング領域を持つように設計することができ、この領域は「テンプレートオーバーハング」と呼ばれる。リンクの反対側の端には、リグ配列に非相補的な同様のオーバーハングを設けることができ、これは「リグオーバーハング」又は「リグオリゴヌクレオチドオーバーハング」と呼ばれる。
このリンクの目的は、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートのプレ結合アダプターとリグの両方にアニールすることであり、使用時には、ｃＤＮＡテンプレートの一端がリグの一端に隣接するようにすることである。ｃＤＮＡテンプレートとリグをこのように位置づけることで、ＤＮＡリガーゼを使ってｃＤＮＡテンプレートをリグにライゲーションし、したがってｃＤＮＡテンプレートの末端にリグ配列を付加することができる。リグ配列は一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’末端と３’末端の両方に付加される。これらのリグをｃＤＮＡテンプレートの５’末端と３’末端にそれぞれ付加するために、前方Ｋ－リンカーと後方Ｋ－リンカーが使われる。
上記の方法では、一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの両端にリグが付加されると、付加されたリグの配列に基づいたプライマーを用いて、前方及び後方の両方のリグ配列にうまくライゲーションした一本鎖ｃＤＮＡ画分を選択的に増幅する。このようにして、ＰＣＲを用いて、低存在量の会合後の一本鎖ｃＤＮＡ画分のみを増幅することができる。
Ｋ－リンカーの特定の構造は、前方Ｋ－リンカーと後方Ｋ－リンカーがその特異な構造的特徴によって提供される異なる機能を持ち、全体的な正規化性能に利点をもたらす。
一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’末端（図では元のＲＮＡ配列の逆相補体として示されている）に結合する前方Ｋ－リンカーは、ＰＣＲ増幅時にＫ－リンカーがプライマーとして作用しないように設計することができる。
さらなる利点を提供するために、前方Ｋ－リンカーは、選択的増幅工程において平滑末端ライゲーションを行うことができるＤＮＡリガーゼの使用を可能にするために、リグ側に平滑末端を持たない。Ｋ－リンカー複合体のリグ側に非平滑末端を設けることで、他のＫ－リンカー複合体や溶液中の二本鎖ｃＤＮＡとのライゲーションも回避する。
前方リンカーは５’から３’の方向性がテンプレートから離れているので、リンカー自体はテンプレートのプライマーとして作用することはできない。しかし、場合によっては、前方リグやＰＣＲプライマーがＰＣＲ増幅中にリンカーにアニールし、ポリメラーゼ伸長を受けてリンクのテンプレート側配列を取り込む可能性がある。テンプレート側にオーバーハングを持つリンクを設けることで、末端にリグ配列が付加されていないｃＤＮＡ配列、すなわち存在量の多い配列に対して、伸長したリグ／プライマーがプライマーとして作用することを回避する。したがって、後方リンク用のテンプレートオーバーハング構造を提供することができる。
一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの３’末端（図では元のＲＮＡ配列の逆相補体として示されている）に結合する後方Ｋ－リンカーは、ＰＣＲ増幅時にＫ－リンカーがプライマーとして作用しないように設計することができる。これはテンプレートオーバーハングを用いて達成することができ、このことは、上述され、図３及び図３Ａに示される。
後方Ｋ－リンカーは、前方Ｋ－リンカーがリグ側にオーバーハングを持つように設計できるのと同じ理由で、リグ側に平滑末端を持たないようにすることができる。もし後方Ｋ－リンカー複合体のリグ側に平滑末端があれば、場合によっては、リグが他のＫ－リンカー複合体やサンプル中の二本鎖ｃＤＮＡにライゲーションされる可能性があり、このことがｃＤＮＡテンプレートの連結につながる可能性がある。
オーバーハングはまた、Ｋ－リンカー複合体のアニーリング温度を下げ、より高いアニーリング温度が使用されるＰＣＲ増幅中に、互いのプライマーとして作用しにくくする役割を果たす。オーバーハングは意図しないプライミングを減少させることがある。加えて又は代替的に、オーバーハングは意図しないプライミングの量を測定することを可能にする指標を提供することができる。例えば、オーバーハングを持つＫ－リンカー複合体がテンプレートをプライミングすることができれば、シーケンシングデータでオーバーハング配列を見ることができ、意図しないプライミングの産物であると結論づけることができる。
すべてのオーバーハングは、理想的には約１ｂｐ～約２０ｂｐの間、好ましくは３ｂｐであるべきである。より長いオーバーハングを使用することもできるが、オーバーハングが長くなると意図しないプライミングを防ぐ配列組成がより少ないため、設計はより難しくなる。
ｃＤＮＡテンプレートとリンクとの間、及びリンクとリグとの間の相補的領域は、使用するリガーゼの活性温度でアニーリングするのに十分な長さが必要である。ニック修復リガーゼは、一般的にライゲーション部位のいずれかの側に約５個以上の相補的塩基を必要とするこの工程に特に好ましい。
精製過程でのキャリーオーバーを低減するため、リンクと対応するリグの合計の長さは、理想的には約３００ｂｐ未満、好ましくは約２００ｂｐ未満であるべきである。
配列例の表現：
すべての配列構造の例は５’から３’方向で提供されている。図３Ｂにも示されている。
Figure 2024515076000002
本方法で使用されるオリゴヌクレオチドと一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの例：
ＮＥＢ／ＰａｃＢｉｏ ｃＤＮＡ合成キットのプライマー配列
Figure 2024515076000003
オリゴヌクレオチド二量体の調製
一旦設計されれば、二量体は当技術分野でよく知られた標準技術を用いて調製することができる。
オリゴヌクレオチド－ｃＤＮＡテンプレートの増幅
ｃＤＮＡテンプレートの３’末端と５’末端にリグをライゲーションした後、得られた溶液を適切なｃＤＮＡ精製法を用いてｃＤＮＡを精製することができる。精製ステップを省略してもよいが、省略するとＰＣＲ増幅効率が低下する可能性がある。
精製後、又はライゲーション後、得られた材料は、リグ配列に基づいたフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅されうる。プライマー配列は、不要なプライミングを避けるために、テンプレート／リンク／リグの相補的領域よりも高いアニーリング温度を持つように選択することができる。
必要であれば、最初にｑＰＣＲ実験を行って増幅曲線の屈曲点を特定することにより、最適なＰＣＲサイクル数を特定することができる。
次いでＰＣＲ増幅から得られたｃＤＮＡは精製され、シーケンシングなどの下流工程の入力として使用できる。
選択的に増幅されたサンプルのバリデーション
選択的増幅又は正規化の効果は、ゲル電気泳動を用いてｃＤＮＡライブラリーの長さ分布を測定することで間接的に測定することもできるし、シーケンシングを用いて直接測定することもできる。
ゲル電気泳動を用いた正規化の効果を確認するために、入力ｃＤＮＡの長さ分布プロットを正規化ｃＤＮＡと比較することができる。入力ｃＤＮＡは一般的に、長さ分布に沿ってピークを示し、これは高存在量転写配列に対応する（図４）。
正規化されたｃＤＮＡは、鋭いピークのない正規分布に似た長さ分布になる（図５）。これは転写産物配列全体にわたって均一な分布を表す。
シーケンシングを正規化の直接測定に使用する場合、好ましいシーケンシング方法はロングリードシーケンシングである。これにより、異なるアイソフォームの同定が可能になる。直接測定の結果は、遺伝子あたりのリード数のプロットか、シーケンス深度の増加に伴って同定された新しい遺伝子の数を示す飽和プロットのいずれかである可能性がある。
本方法を検証するために、本発明者らは、入力ｃＤＮＡライブラリーと本方法で作製したｃＤＮＡライブラリーの両方についてＮａｎｏｐｏｒｅ ｃＤＮＡシーケンシングを行った。本発明者らはそれぞれのライブラリーの飽和曲線を比較した（図６）。本方法の曲線は、入力ｃＤＮＡの曲線よりも複数のファクターで高い。これは、ｃＤＮＡライブラリーがより均一に分散していることを示している。
選択的増幅の応用
本方法の選択的増幅の主な用途は、低存在量の遺伝子及びアイソフォームの発見及び検出を改善することである。本方法をシーケンシングと組み合わせると、サンプル内のすべての固有の遺伝子を同定するためのサンプリング効率が向上する。これはトランスクリプトームアノテーションや新規遺伝子やアイソフォームの同定に利用できる。トランスクリプトームアノテーションは主に、異なる種の生物学を理解するための比較生物学的取り組みに使用される。新規遺伝子及びアイソフォームの発見は、目的とする形質の原因となる生物学的メカニズムに関与する遺伝子の同定に役立つことができる。例えば、本方法は、疾病に対する生物の応答、又は発癌の場合には疾病の発生に関与する遺伝子でさえ同定するのに役立てるために使用することができる。
本方法は、末端に既知のアダプターを有し、ＰＣＲ法で増幅できる長さの二本鎖ｃＤＮＡライブラリーであれば、どのようなものにも適用できる。このことは、ＤＮＡシーケンシングに用いることができることを意味する。本方法のもう一つの用途は、メタゲノムシーケンシング時のサンプリング効率を高め、サンプル内の存在量の少ない微生物を同定する能力を高めることである。これはマイクロバイオームの理解や、疾患や健康維持に関与する可能性のある微生物の同定に利用できる。
本方法のさらなる用途は、感染症からのゲノム配列の検出を改善することである。これは、ウイルス、細菌、又は真菌のゲノム配列を増幅するために、標的を絞った方法と組み合わせて使用して、全体的な検出限界を向上させることができる。また、ＰＣＲ法又はシーケンシングに基づく方法のいずれかを用いて検査する前に、多くのサンプルをプールしておくマススクリーニングにも使用できる。
本方法のもう一つの重要な態様は、既知のリグ配列を持つｃＤＮＡを選択できることである。この態様は、個々の細胞にリードを割り当てるためにアダプターが必要な単一細胞シーケンシングに応用できる。この用途では、細胞を識別するバーコード／アダプターを持たないｃＤＮＡ配列がｃＤＮＡライブラリー内に生じる。これらはテンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）アーティファクトとして知られており、由来細胞に割り当てることができないため、単一細胞シーケンシングプロジェクトでは望ましくない。本方法は、短い再ハイブリダイゼーションステップとともに適用することで、所望のリグ配列を持つｃＤＮＡ配列を選択することのみができ、それゆえにＴＳＯアーティファクトのシーケンシングを効果的に制限することができる。本方法はまた、ＴＳＯアーティファクトを除去するため、及び細胞あたりのトランスクリプトーム適用範囲を向上させるために、単一細胞ｃＤＮＡライブラリーで実施することもできる。
考察
本方法の選択的ｃＤＮＡ増幅は、低存在量の核酸の非標的発見／検出をより多く達成する革新的な方法である。
既存の正規化アプローチと異なる点は、現行のアプローチが枯渇法を用いるのに対し、相加法を用いることである。相加法は、極少量の出発ｃＤＮＡで本方法を使用することを可能にする。相加法はまた、ＤＳＮａｓｅ法に固有の過剰な枯渇や人工的キメラ化を防ぐ。本方法はまた、ＰＣＲ増幅が長さに偏りがある程度までしか長さに偏りがない。それゆえに、より長いｃＤＮＡ分子でもうまく実行できる。
したがって、本方法、アダプター、組成物、二量体及びキットは、広範な商業的及び学術的用途を有することがわかる。本発明のさらなる態様を形成するこれらの用途のそれぞれについて、いくつかの例を以下に挙げる。
新規ＲＮＡ発見のためのＲＮＡ／ＤＮＡシーケンシング
低存在量のＲＮＡ検出のためのＲＮＡ／ＤＮＡシーケンシング
サンプル内のすべてのＲＮＡ又はＤＮＡを検出するためのＲＮＡ／ＤＮＡシーケンシング（単一細胞シーケンシングの用途を含む）。
新規微生物の発見のためのメタゲノムシーケンシング
低存在量の微生物の検出のためのメタゲノムシーケンシング
サンプル内のすべての発現微生物の検出のためのメタゲノムシーケンシング
ｑＰＣＲ及びマイクロアレイアッセイを含む標的アプローチでより良いシグナル／ノイズの区別を提供するためのＤＮＡライブラリー処理ステップ。
ＤＮＡ及びＲＮＡ配列の検出が必要な診断パイプライン（癌の有無や癌の種類を判定する癌診断を含む）における使用。
遺伝子編集によるＲＮＡ産生の問題をスクリーニングするための遺伝子編集の品質管理など、ＲＮＡ／ＤＮＡスクリーニングパイプラインにおける使用。
医療処置に対する生物学的状態をモニターするための処置追跡における使用。
医薬品開発において、医薬品の設計や開発（ワクチン開発を含む）に役立つバイオマーカーの同定における使用。
細菌、ウイルス、及び真菌などの感染症の有無に関するサンプルのスクリーニングにおける使用。

Claims (26)

  1. 一本鎖ｃＤＮＡの選択的増幅の方法であって、
    （ｉ）それぞれのテンプレートが既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプターを有する、二本鎖ｃＤＮＡテンプレートを含むｃＤＮＡサンプルを用意するステップ、
    （ｉｉ）前記ｃＤＮＡサンプルを変性させ、一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを作製するステップ、
    （ｉｉｉ）前記ｃＤＮＡサンプルを再会合させて、会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートと会合後の二本鎖ｃＤＮＡテンプレートの混合物を作製するステップ、
    （ｉｖ）５’アダプター複合体を少なくとも１つの会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記５’プレ結合アダプターにアニールし、及び３’アダプター複合体を同じ会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記３’プレ結合アダプターにアニールするステップであって、それぞれのアダプター複合体は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、ステップ、
    （ｖ）前記５’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、前記会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記５’プレ結合アダプターにライゲーションし、及び前記３’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、同じ会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記３’プレ結合アダプターにライゲーションするステップ、並びに
    （ｖｉ）前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡサンプルを選択的に増幅するステップ、
    を含む方法。
  2. 既知のアダプター配列を含むｃＤＮＡの選択的増幅の方法であって、
    （ｉ）二本鎖ｃＤＮＡテンプレートを含むｃＤＮＡサンプルを用意するステップであって、前記テンプレートの一部が既知の５’プレ結合アダプター及び既知の３’プレ結合アダプターを有する、ステップ、
    （ｉｉ）前記ｃＤＮＡサンプルを変性させ、一本鎖ｃＤＮＡテンプレートを作製するステップ、
    （ｉｉｉ）５’アダプター複合体を少なくとも１つの一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記５’プレ結合アダプターにアニールし、及び３’アダプター複合体を同じ一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記３’プレ結合アダプターにアニールするステップであって、それぞれのアダプター複合体が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、ステップ、
    （ｖ）前記５’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、前記一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記５’プレ結合アダプターにライゲーションし、及び前記３’アダプター複合体からのオリゴヌクレオチドを、同じ一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記３’プレ結合アダプターにライゲーションするステップ、並びに
    （ｖｉ）前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡサンプルを選択的に増幅するステップ、
    を含む方法。
  3. （Ａ）前記５’アダプター複合体が、
    （ｉ）前記（会合後の）一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記５’プレ結合アダプターにライゲーションするための前方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
    （ｉｉ）前記５’プレ結合アダプター及び前記前方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための前方リンク－オリゴヌクレオチドであって、前記５’プレ結合アダプターに相補的な領域及び前記前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、前記前方リンク－オリゴヌクレオチド、
    を含み、
    アニーリング時に、前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が前記５’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの前記５’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、前方オリゴヌクレオチド二量体であり、並びに、
    （Ｂ）前記３’アダプター複合体が、
    （ｉ）前記（会合後の）一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記３’プレ結合アダプターにライゲーションするための後方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
    （ｉｉ）前記３’プレ結合アダプター及び前記後方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための後方リンク－オリゴヌクレオチドであって、前記３’プレ結合アダプターに相補的な領域及び前記後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、前記後方リンク－オリゴヌクレオチド、
    を含み、
    アニーリング時に、前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が前記３’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの前記３’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、後方オリゴヌクレオチド二量体である、
    請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. （Ａ）前記前方リンク－オリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）前記５’プレ結合アダプターに相補的な前記領域に近接する前記前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、前記（会合後の）一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
    （ｉｉ）前記前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な前記領域に近接する前記前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、前記リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
    を含み、及び／又は
    （Ｂ）前記後方リンク－オリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）前記３’プレ結合アダプターに相補的な前記領域に近接する前記後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、前記（会合後の）一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、前記テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
    （ｉｉ）前記後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な前記領域に近接する前記後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、前記リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
    を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングが約１ｂｐ～約２０ｂｐの間の長さである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記前方リンク－オリゴヌクレオチド及び前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さが約３００ｂｐ未満であり、及び／又は前記後方リンク－オリゴヌクレオチド及び前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さが約３００ｂｐ未満である、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記前方及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドが２００ｂｐ未満の長さを有する、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記前方オリゴヌクレオチド二量体及び／又は前記後方オリゴヌクレオチド二量体が、少なくとも１つの非平滑末端を有する、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記前方リンク－オリゴヌクレオチド及び／又は前記後方リンク－オリゴヌクレオチドが、ライゲーション部位のいずれかの側に少なくとも５ｂｐの相補的結合を提供する、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記前方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列が、前記後方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列と異なり、非相補的である、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記前方オリゴヌクレオチド二量体及び前記後方オリゴヌクレオチド二量体の少なくとも一方が、３０℃を超える温度で前記（会合後の）一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニール可能である、請求項３～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記前方オリゴヌクレオチド二量体の濃度及び／又は前記後方オリゴヌクレオチド二量体の濃度が、前記ｃＤＮＡサンプル中の予測される全一本鎖ｃＤＮＡ濃度又は全ｃＤＮＡの濃度を超える、請求項３～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 既知の５’及び３’プレ結合アダプターを有する会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの５’及び３’末端へのオリゴヌクレオチドのライゲーションによる一本鎖ｃＤＮＡの選択的増幅のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法において使用するためのオリゴヌクレオチド二量体組成物であって、前記組成物が、
    （Ａ）
    （ｉ）前記会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記５’プレ結合アダプターにライゲーションするための前方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
    （ｉｉ）前記５’プレ結合アダプター及び前記前方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための前方リンク－オリゴヌクレオチドであって、前記５’プレ結合アダプターに相補的な領域及び前記前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、前記前方リンク－オリゴヌクレオチド、
    を含み、
    アニーリング時に、前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が前記５’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの前記５’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、前方オリゴヌクレオチド二量体、並びに、
    （Ｂ）
    （ｉ）前記会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの前記３’プレ結合アダプターにライゲーションするための後方リグ－オリゴヌクレオチド、及び
    （ｉｉ）前記３’プレ結合アダプター及び前記後方リグ－オリゴヌクレオチドにアニールするための後方リンク－オリゴヌクレオチドであって、前記３’プレ結合アダプターに相補的な領域及び前記後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む、前記後方リンク－オリゴヌクレオチド、
    を含み、
    アニーリング時に、前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの末端が前記３’プレ結合アダプターの末端に隣接し、ライゲーション部位において前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの前記３’プレ結合アダプターへのライゲーションを可能にする、後方オリゴヌクレオチド二量体、
    を含む、オリゴヌクレオチド二量体組成物。
  14. （Ａ）前記前方リンク－オリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）前記５’プレ結合アダプターに相補的な前記領域に近接する前記前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、前記会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、前記テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
    （ｉｉ）前記前方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な前記領域に近接する前記前方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、前記リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
    を含み、及び／又は
    （Ｂ）前記後方リンク－オリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）前記３’プレ結合アダプターに相補的な前記領域に近接する前記後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるテンプレートオーバーハング領域であって、前記会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートの対応する領域に非相補的である、前記テンプレートオーバーハング領域、及び／又は
    （ｉｉ）前記後方リグ－オリゴヌクレオチドに相補的な前記領域に近接する前記後方リンク－オリゴヌクレオチドの末端におけるリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域であって、前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの対応する領域に非相補的である、前記リグ－オリゴヌクレオチドオーバーハング領域、
    を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  15. 前記テンプレートオーバーハング及び／又はリグ－オリゴヌクレオチドオーバーハングが約１ｂｐ～約２０ｂｐの間の長さである、請求項１３又は請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  16. 前記前方リンク－オリゴヌクレオチド及び前記前方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さが約３００ｂｐ未満であり、及び／又は前記後方リンク－オリゴヌクレオチド及び前記後方リグ－オリゴヌクレオチドの合計の長さが約３００ｂｐ未満である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  17. 前記前方及び／又は後方リンク－オリゴヌクレオチドが２００ｂｐ未満の長さを有する、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  18. 前記前方オリゴヌクレオチド二量体及び／又は前記後方オリゴヌクレオチド二量体が、少なくとも１つの非平滑末端を有する、請求項１３～１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  19. 組成物の使用において、前記前方リンク－オリゴヌクレオチド及び／又は前記後方リンク－オリゴヌクレオチドが、ライゲーション部位のいずれかの側に少なくとも５ｂｐの相補的結合を提供する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  20. 前記前方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列が、前記後方オリゴヌクレオチド二量体のヌクレオチド配列と異なり、非相補的である、請求項１３～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  21. 前記前方オリゴヌクレオチド二量体及び／又は前記後方オリゴヌクレオチド二量体が、３０℃を超える温度で前記会合後の一本鎖ｃＤＮＡテンプレートにアニール可能である、請求項１３～２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物。
  22. 任意選択で、新規ＲＮＡの発見及び／又は低存在量のＲＮＡの検出のための、さらに任意選択で、シーケンシングが単一細胞シーケンシングである、ＲＮＡ又はＤＮＡシーケンシングの工程における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法又は請求項１３～２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用。
  23. 新規微生物の発見及び／又は低存在微生物の検出のためのメタゲノムシーケンシング工程における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法又は請求項１３～２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用。
  24. ＤＮＡ若しくはＲＮＡサンプルをスクリーニングする、又は感染症の存在について遺伝子サンプルをスクリーニングする工程における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法又は請求項１３～２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用。
  25. 核酸バイオマーカー、任意選択で疾患バイオマーカー、さらに任意選択で癌バイオマーカーを検出する工程における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法又は請求項１３～２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物、の使用。
  26. ｃＤＮＡサンプルから低存在量のｃＤＮＡを選択的に増幅するための選択的増幅キットであって、前記ｃＤＮＡサンプルは、既知の５’及び３’プレ結合アダプターを有するｃＤＮＡテンプレートを含み、前記キットは、請求項１３～２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド二量体組成物を調製するための手段と、請求項１～１２のいずれか一項に記載の選択的増幅方法を実施するための手段とを含む、選択的増幅キット。
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