CN105907747A - 一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法 - Google Patents

一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，利用磁珠从总RNA中纯化mRNA，得到mRNA和清液；S2，将清液用乙醇沉淀的方法回收得到RNA；以及S3，利用S1中得到的mRNA构建mRNA文库和利用S2中得到的RNA构建小RNA文库。本发明充分利用同一份真核生物总RNA的mRNA和小RNA而进行mRNA文库和小RNA文库的构建，在很大程度上解决了样本量限制的问题。

Description

一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法
技术领域
本发明涉及生物学领域，具体而言，涉及一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法。
背景技术
利用二代测序的方法分析生物体内的转录情况已经成为一种普遍的研究手段。对于真核生物mRNA，因其3’端有polyA结构，可以使用mRNA DIRECTTM纯化试剂盒从总RNA中富集到mRNA，其原理是磁珠上锚定的PolyT可以通过氢键和PolyA结合，从而特异性的富集mRNA，得到的mRNA可使用ultra RNA文库构建试剂盒建库。而对于真核生物的小RNA(小RNA)，可以利用其5’磷酸基团和3’羟基的特殊结构在两端直接连接接头进行建库，然后通过PAGE电泳回收目标片段文库，具体而言，可以使用NEBNext Multiplex小RNA文库构建试剂盒建库。
其中，mRNA DIRECTTM纯化试剂盒纯化mRNA包括以下步骤：(1)磁珠的纯化；(2)总RNA的变性；(3)mRNA和磁珠的结合；(4)磁珠的洗涤；(5)mRNA的洗脱；(6)mRNA的再结合；(7)mRNA的洗涤和洗脱。
用ultra RNA文库构建试剂盒构建转录组文库的流程如下：(1)RNA片段化；(2)第一链cDNA合成；(3)第二链cDNA合成；(4)双链cDNA纯化；(5)末端修复和加A；(6)接头的连接；(7)带接头cDNA的纯化；(8)片段选择加接头的DNA；(9)USER酶消化和PCR富集；(10)PCR产物纯化。
用NEBNext Multiplex小RNA文库构建试剂盒构建小RNA文库的流程如下：(1)3’端接头的连接；(2)反转录引物的杂交；(3)5’端接头的连接；(4)反转录；(5)PCR富集文库；(6)PAGE电泳回收目标片段文库。
目前，二代测序中无论是构建mRNA文库还是构建小RNA文库都是独自使用总RNA为起始来进行的，对mRNA和小RNA的联合分析需要同时构建两种文库，而在实际的研究过程中常常出现因样本量的限制(如一些临床样本和珍稀真核生物样本等)而不能获得足够的总RNA用于同时构建两种文库，进而导致研究不能进一步开展。
发明内容
本发明旨在提供一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法，以解决现有技术二代测序中针对真核生物因样本起始量低的限制而不能同时构建mRNA文库和小RNA文库进行后期的联合分析的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，利用磁珠从总RNA中纯化mRNA，得到mRNA和清液；S2，将清液用乙醇沉淀的方法回收得到RNA；以及S3，利用S1中得到的mRNA构建mRNA文库和利用S2中得到的RNA构建小RNA文库。
进一步地，S1具体包括磁珠的纯化、总RNA的变性、mRNA和磁珠的结合、磁珠的洗涤、mRNA的洗脱、mRNA与磁珠的再结合、mRNA的洗涤和洗脱。
进一步地，构建mRNA文库具体包括RNA片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、双链cDNA纯化、末端修复和加A、接头的连接、带接头cDNA的纯化、片段选择加接头的DNA、USER酶消化和PCR富集以及PCR产物纯化。
进一步地，构建小RNA文库具体包括3’端接头的连接、反转录引物的杂交、5’端接头的连接、反转录、PCR富集文库、电泳回收目标片段文库。
进一步地，S2具体包括：将清液转移到另一个离心管，使用无RNA酶水调整到180μl加入18μl的3M的醋酸钠，2μl 10mg/ml的糖原，涡旋混合后加入三倍体积的冰预冷的无水乙醇600μl，再涡旋混合，在-20℃放置至少1个小时或者-80℃放置30min以上，12000rpm离心30min，弃上清液，加入预冷的70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液，晾干RNA沉淀，用6μl无RNA酶水溶解RNA沉淀，用于小RNA文库的构建。
进一步地，加入预冷的70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液的步骤重复2次。
应用本发明的技术方案，在利用磁珠从总RNA中纯化mRNA的过程中，当mRNA通过PolyT的作用结合到磁珠上后，将分离到的清液用乙醇沉淀的方法回收其中的RNA，因该部分RNA中含有小RNA，故可以用于小RNA文库的构建，而磁珠上富集的mRNA则用于mRNA文库的构建。本发明充分利用同一份真核生物总RNA的mRNA和小RNA而进行mRNA文库和小RNA文库的构建，在很大程度上解决了样本量限制的问题。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明一种典型实施方式的真核生物样本的mRNA和小RNA建库的流程示意图；
图2示出了实施例1的mRNA文库检测图；以及
图3示出了实施例1的小RNA文库检测图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，利用磁珠从总RNA中纯化mRNA，得到mRNA和清液；S2，将清液用乙醇沉淀的方法回收得到RNA；以及S3，利用S1中得到的mRNA构建mRNA文库和利用S2中得到的RNA构建小RNA文库。
应用本发明的技术方案，在利用磁珠从总RNA中纯化mRNA的过程中，当mRNA通过PolyT的作用结合到磁珠上后，将分离到的清液用乙醇沉淀的方法回收其中的RNA，因该部分RNA中含有小RNA，故可以用于小RNA文库的构建，而磁珠上富集的mRNA则用于mRNA文库的构建。本发明充分利用同一份真核生物总RNA的mRNA和小RNA而进行mRNA文库和小RNA文库的构建，在很大程度上解决了样本量限制的问题。
优选的，S1具体包括磁珠的纯化、总RNA的变性、mRNA和磁珠的结合、磁珠的洗涤、mRNA的洗脱、mRNA与磁珠的再结合、mRNA的洗涤和洗脱。
优选的，构建mRNA文库具体包括RNA片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、双链cDNA纯化、末端修复和加A、接头的连接、带接头cDNA的纯化、片段选择加接头的DNA、USER酶消化和PCR富集以及PCR产物纯化。
优选的，构建小RNA文库具体包括3’端接头的连接、反转录引物的杂交、5’端接头的连接、反转录、PCR富集文库、电泳回收目标片段文库。
优选的，S2具体包括：将清液转移到另一个离心管，使用无RNA酶水调整到180μl加入18μl的3M的醋酸钠，2μl 10mg/ml的糖原，涡旋混合后加入三倍体积的冰预冷的无水乙醇600μl，再涡旋混合，在-20℃放置至少1个小时或者-80℃放置30min以上，12000rpm离心30min，弃上清液，加入预冷的70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液，晾干RNA沉淀，用6μl无RNA酶水溶解RNA沉淀，用于小RNA文库的构建。
根据本发明一种典型的实施方式，一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法，即利用同一份真核生物总RNA构建mRNA文库和小RNA文库，参照图1的流程示意图，具体实施步骤如下：
总RNA中的mRNA富集以及含小RNA的其余RNA的乙醇沉淀纯化：
1.充分混匀Dynabeads oligo(dT)磁珠，然后取30μl到1.5ml离心管中，置于磁力架上，静置3min，用枪头小心吸取丢弃上清液。
2.加入100μl结合缓冲液充分吹打混匀，瞬时离心，在磁力架上，静置3min，用枪头小心吸取丢弃上清液。
3.重复步骤2一次。
4.再加入50μl结合缓冲液，充分吹打混匀。
5.取1μg总RNA样品补无RNA酶水至50μl。
6.将样品加入到上述Dynabeads oligo(dT)磁珠中，充分吹打混匀，65℃孵育5min，孵育结束后立刻置于冰上2min。
7.混匀仪上室温孵育10min，瞬时离心，在磁力架上静置3min。
(1)将清液转移到另一个1.5ml离心管，使用无RNA酶水调整到180μl
(2)加入18μl的3M的醋酸钠(RNA专用)，2μl的糖原(10mg/ml)，轻微的涡旋混合
(3)加入三倍体积的冰预冷的无水乙醇(600μl)，轻微的涡旋混合
(4)在-20℃放置至少1个小时(或者-80℃放置30min以上)
(5)12000rpm离心30min，小心吸取丢弃上清液
(6)用预冷新鲜配置的70％乙醇，12000rpm离心5min，小心吸取丢弃上清液
(7)重复步骤(6)一次
(8)简短离心去除管壁残留上清，小心吸取上清，置于室温，晾干RNA沉淀用6μl无RNA酶水溶解RNA沉淀，用于后续小RNA文库的构建。
8.加入200μl洗涤缓冲液到磁珠中，充分吹打混匀，置于磁力架上，静置3min。用枪头小心吸取丢弃上清液。
9.重复步骤8一次。
10.加入50μl 10mM Tris-HCl，充分吹打混匀，80℃孵育2min。25℃孵育2min。
11.在上步加入50μl结合缓冲液，枪头吹打混匀，混匀仪上孵育5min，瞬时离心，在磁力架上，静置3min，用枪头小心吸取丢弃上清液。
12.加入200μl洗涤缓冲液，充分吹打混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置3min。用枪头小心吸取丢弃上清液。
13.重复步骤12一次。
14.加入15.5μl 10mM Tris-HCL，充分吹打混匀，80℃孵育2min。
15.立即置于磁力架上，静置3min。用枪头小心吸取14μl上清液到PCR管中用于后续mRNA文库的构建。
用ultra RNA文库构建试剂盒构建mRNA文库：
一、RNA片段化
(1)上述纯化的mRNA 14μl按照表1RNA片段化体系加入试剂：
表1
纯化好的mRNA 14μl
NEBNext第一链合成缓冲液(5X) 4μl
随机引物 1μl
总体积 19μl
充分混匀，瞬时离心。
(2)94℃孵育15min。立刻放置冰上。用于一链合成。
二、第一链cDNA合成
(1)上述反应体系19μl按照表2第一链cDNA合成体系加入试剂：
表2
(2)轻柔的充分混匀，瞬时离心。放入PCR仪内，按照表2的第一链cDNA合成PCR体系进行反应。反应后立刻置于冰上。
三、第二链cDNA合成
(1)上述第一链cDNA 20μl，按照表3第二链cDNA合成反应体系加入反应试剂。
表3
第一链cDNA 20μl
无核酸酶水 22.5μl
第二链合成缓冲液混合物 5μl
第二链合成酶混合物 2.5μl
总体积 50μl
(2)16℃孵育1h。
四、双链cDNA纯化
(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠；并室温孵育30min备用。
(2)按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入90μl(1.8X)重悬好的AMPure XP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步的双链cDNA加入准备好的AMPure XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。
(3)如管壁上有液体可瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液。
(4)加入200μl 80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。
(5)重复步骤4一次。最后使用10μl枪头吸净离心管底部残留的液体。
(6)室温干燥让乙醇尽量挥发干净(干而不裂开)。
(7)加入58μl无RNA酶H2O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。准备PCR管，并将编号写好。用枪头小心吸取56μl上清液到准备好的PCR管内。
五、末端修复和加A
(1)上述纯化好的双链cDNA中按照表4末端修复和加A反应体系加入试剂：
表4
纯化的双链cDNA 56μl
NEBNext末端修复缓冲液(10X) 6.5μl
NEBNext末端修复酶混合物 3μl
总体积 65μl
(2)轻柔混匀。瞬时离心，PCR仪上按照表5程序进行反应：
表5
20℃ 30min
65℃ 30min
4℃ 维持
后立刻放置冰上，立即进入下一步接头连接反应。
六、接头的连接
(1)按照表6接头连接反应体系配制反应体系。
表6
末端修复加A的双链cDNA 65μl
Blunt/TA连接酶混合物 15μl
NEBNext接头(15μM)* 1μl
无核酸酶水 2.5μl
总体积 83.5μl
(2)轻柔混匀，瞬时离心。15min at 20℃。
七、片段选择加接头的DNA
(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。
(2)准备干净的1.5ml离心管，写好对应编号，加入16.5μl无RNA酶H2O(使上步反应终体积为100μl)，再加入57μl重悬的AMPure XP磁珠。
(3)将连接好接头的DNA产物(83.5μl)加入上步准备好的1.5ml离心管中，枪头混匀，室温孵育5min。
(4)瞬时离心。置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取上清液到另一个干净的1.5ml离心管中，12,000rpm离心3min后置于磁力架上。准备干净的离心管并将对应的编号写好。将上清液转入对应的离心管中。
(5)加入25μl重悬好的AMPure XP磁珠，并用枪头混匀。室温孵育5min。
(6)磁力架上静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液。
(7)加入200μl 80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。
(8)重复步骤7一次。最后使用10μl枪头吸取离心管底部残留的液体。
(9)室温干燥X min让乙醇尽量挥发干净。
(10)加入52μl无RNA酶H2O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。
(11)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μl涡旋混匀好的AMPure XP磁珠。吸取上步50μl上清至对应AMPure XP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。于磁力架上静置5min，小心吸取丢弃上清液。
(12)加入200μl 80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。
(13)重复步骤12一次。最后使用10μl枪头吸取离心管底部残留的液体。
(14)室温干燥X min让乙醇尽量挥发干净。
(15)加入22.5μl无RNA酶H2O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μl枪头小心吸取21μl上清至干净的PCR管内。
(16)取1μl进行Qubit定量。将浓度低于0.2ng/μl的标注。用后的Qubit管置于黑暗处备用。
八、USER酶消化和PCR富集
(1)在上述产物中按照表7USER酶消化和PCR富集反应体系加入反应体系。
表7
片段大小选择后的DNA 20μl
USER酶 3μl
NBENext高保真PCR酶混合物(2X) 25μl
通用PCR引物 1μl
标签引物 1μl
总体积 50μl
(2)轻柔混匀，PCR仪上按照表8程序进行反应：
表8
*注：当第七步的Qubit浓度低于0.2ng/μl的，扩增循环增至11或12个。
九、PCR产物纯化
(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。
(2)按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入50μl重悬好的AMPure XP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步PCR产物加入准备好的磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。
(3)置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液。
(4)加入200μl 80％乙醇漂洗，置于磁力架上，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。
(5)重复步骤4一次。最后使用10μl枪头吸取离心管底部残留的液体。
(6)敞开盖子让乙醇尽量挥发干净，至磁珠干燥。
(7)加入52μl无RNA酶H2O，涡旋混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。
(8)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μl涡旋混匀好的AMPure XP磁珠。吸取上步50μl上清至对应AMPure XP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。置于磁力架上，静置5min。于磁力架上小心吸取丢弃上清液。
(9)加入200μl 80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。
(10)重复步骤9一次。最后使用10μl枪头吸取离心管底部残留的液体。
(11)室温干燥让乙醇尽量挥发干净。
(12)加入22.5μl无RNA酶H2O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μl枪头枪头小心吸取21μl上清至干净的离心管内；当第七步的Qubit浓度低于0.2ng/μl的，最后文库溶于12μl无RNA酶H2O中，吸出10μl上清至干净的离心管内。
(13)取1μl进行Qubit定量。准备干净的0.5ml离心管，取1μl文库按照Qubit浓度稀释至1.5-2ng/μl，用于文库的检测。
用NEBNext Multiplex小RNA文库构建试剂盒构建小RNA文库：
一、连接3’接头
1.将上述乙醇沉淀的6μl RNA(含小RNA)放入新的PCR管中，加入1μl的3’SR接头，混匀，在PCR仪中70℃变性2min之后立刻放在冰上。
2.向上管7μl溶液中按照表9接头连接体系加入试剂并混匀：
表9
3’连接反应缓冲液(2X) 10μl
3’连接酶混合物 3μl
总体积 20μl
3.25℃培养1小时，之后立刻放在冰上。
二、杂交反转录引物
1.向上面反应体系中按照表10反转录引物杂交体系加入试剂并混匀：
表10
无核酸酶水 4.5μl
SR反转录引物 1μl
总体积 25.5μl
2.按照表11程序进行PCR反应：
表11
75℃ 5min
37℃ 15min
25℃ 15min
4℃ 维持
三、连接5’接头
1.取1μl 5’接头(存放在-80℃)至新的PCR管中，70℃变性2min，之后立刻放在冰上。
2.向上管反应体系中按照表12的5’接头连接体系加入下列反应试剂，充分混匀：
表12
3.25℃培养1小时，之后立刻放在冰上。
四、反转录
1.向上步反应体系中按照表13反转录体系加入下列反应试剂，充分混匀：
表13
第一链合成缓冲液 8μl
Murine RNA酶抑制剂 1μl
M-MulV反转录酶(无RNA酶H活性) 1μl
总体积 40μl
2.50℃培养1小时，立即进行PCR反应。
五、PCR扩增
1.向上步反应体系中按照表14PCR扩增体系加入下列反应试剂，充分混匀：
表14
LongAmp Taq酶混合物(2X) 50μl
SR引物 2.5μl
标签引物 2.5μl
无核酸酶水 5μl
总体积 100μl
2.混匀后按表15程序进行PCR反应。
表15
六、PAGE胶电泳纯化文库
1.按表16非变性PAGE胶配制体系配制10％的非变性PAGE。
表16
各成分名 30ml胶用量 40ml胶用量
30％聚丙烯酰胺 10ml 13.3ml
10X TBE 3ml 4ml
ddH2O 17ml 22.7ml
10％过硫酸铵 150μl 200μl
TEMED 30μl 40μl
2.电泳：
(1)点Marker，一般每块胶点两个Marker，各5μl，一个是20bp的Marker，另一个是试剂盒自带Marker(Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest)。
(2)点样品，从100μl的PCR产物中取50μl加入10μl的6×上样缓冲液，混匀后分三个点样孔上样，剩余的50μl放入-80℃保存。
(3)电泳，100V，大约1小时50分钟左右。
(4)电泳跑完，将PAGE胶放在染胶水里染胶(染胶水：3μlGelRed+30ml超纯水，10min)。
3.切胶
凝胶成像之后拍照，灭菌手术刀片切胶，切胶范围137－160bp内的条带，切胶之后再拍照。
4.用21号注射器针头在0.5ml离心管底部打孔，然后把这个离心管套进2ml的离心管里。
5.将切下来的胶块放进0.5ml离心管，4℃13000rpm离心10min。确保凝胶全部通过小孔，收集到2ml离心管里。
6.扔掉0.5ml的离心管，加250μl洗脱缓冲液到盛有碎胶的2ml离心管中(切胶范围比较宽时，加300μl洗脱缓冲液)。
7.室温转动洗脱DNA过夜。(或在金属浴中，50℃1000rpm震荡2h后再室温转动效果更好)。
8.转移洗脱液和碎胶到Spin-X滤网上，室温13000rpm离心10min。
9.沉淀收集DNA，加入1μl糖原(20ug/μl)(或者2μl线性丙烯酰胺),25μl 3M NaAc,750μl-20℃100％乙醇。-80℃至少沉淀30min，4℃13000rpm离心30min。小心吸去上清液，留下离心管底部沉淀。
10.加入1000μl-20℃保存的80％乙醇洗涤(现用现配)，13000rpm离心10min后去上清。
11.重复用80％乙醇洗一次，13000rpm离心10min后去上清，干燥沉淀之后，加入8μl TE溶解沉淀。
12.取1μl进行Qubit定量，记下文库浓度，写上文库编号，准备干净的0.5ml离心管，写好对应的文库编号，取1μl文库按照Qubit浓度稀释至1ng/μl。如果文库浓度低于1ng/μl则不用稀释。对文库质量进行caliper/2100和QPCR检测。
本发明经过广泛的研究和实验，证明可以有效的应用于二代测序领域，成功构建真核生物mRNA文库和小RNA文库用于后期的联合分析研究。
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
以一个鸟类总RNA样本为例，样本总量750ng，按照本发明上述典型的实施方式中所述的流程进行文库的构建，构建的文库通过perkinelmer的caliper或者Agilent的2100生物分析系统对文库的插入片段大小进行检测，用q-PCR仪对文库的摩尔浓度进行检测。
mRNA文库检测结果如图2所示，文库峰型单一，无杂峰、接头及引物二聚体，符合PE125双端测序要求。小RNA文库检测结果如图3所示，峰型单一，主峰在147bp，无杂峰、接头及引物二聚体，符合SE50单端测序要求。q-PCR检测结果显示两个文库的摩尔浓度均大于2nM，均符合上机测序的要求。
已有研究表明小RNA在真核生物的转录中起着重要的调控作用，同时构建mRNA文库和小RNA文库进行二代测序，联合分析可以更加有效的揭示其中的调控机制。在本发明中，我们通过磁珠富集和乙醇沉淀的方法将同一份真核生物总RNA样品分为mRNA和其余RNA两部分，分别用于构建mRNA文库和小RNA文库，使样品的利用率达到了最高，解决了在很多研究项目中因样本量不足而导致的研究无法开展的问题。
另外，本方法操作简单，快速准确，能够广泛用于二代测序领域。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种真核生物样本的mRNA和小RNA建库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，利用磁珠从总RNA中纯化mRNA，得到mRNA和清液；
S2，将所述清液用乙醇沉淀的方法回收得到RNA；以及
S3，利用所述S1中得到的mRNA构建mRNA文库和利用所述S2中得到的RNA构建小RNA文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1具体包括磁珠的纯化、总RNA的变性、mRNA和磁珠的结合、磁珠的洗涤、mRNA的洗脱、mRNA与磁珠的再结合、mRNA的洗涤和洗脱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建mRNA文库具体包括RNA片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、双链cDNA纯化、末端修复和加A、接头的连接、带接头cDNA的纯化、片段选择加接头的DNA、USER酶消化和PCR富集以及PCR产物纯化。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建小RNA文库具体包括3’端接头的连接、反转录引物的杂交、5’端接头的连接、反转录、PCR富集文库、电泳回收目标片段文库。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2具体包括：
将所述清液转移到另一个离心管，使用无RNA酶水调整到180μl加入18μl的3M的醋酸钠，2μl 10mg/ml的糖原，涡旋混合后加入三倍体积的冰预冷的无水乙醇600μl，再涡旋混合，在-20℃放置至少1个小时或者-80℃放置30min以上，12000rpm离心30min，弃上清液，加入预冷的70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液，晾干RNA沉淀，用6μl无RNA酶水溶解所述RNA沉淀，用于小RNA文库的构建。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述加入预冷的70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液的步骤重复2次。
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