CN108588176A - 一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法 - Google Patents

一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于单链DNA构建R‑loop高通量测序文库的方法。本发明通过利用抗体特异性的对DNA/RNA杂合链进行捕获,随即进行单链DNA建库,目的是解决R‑loop测序建库过程中插入片段长度、R‑loop捕获、加接头等问题,具有精准、高效、高通量、灵敏、可重复、操作简单等优点。

Description

一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法。
背景技术
RNA可与其基因组模板共转录,或转录后产生RNA-DNA杂合体和置换的单链DNA形成三链结构,这些不寻常的核酸结构被称为R-loop。研究表明,R-loop被认为在几种人类疾病如癌症和神经退行性综合征中起作用。文献报道,肿瘤抑制因子BRCA2经常在癌症,特别是乳腺癌中突变和失活,而BRCA2表达量下调被证明会导致R-loop积累,说明R-loop与癌症发生与转移有密不可分的关系;R-loop被证实与人类智力迟钝-脆弱X综合征相关。总之,随着越来越多的研究表明R-loop表达量与各癌症等人类疾病密切相关,借助测序技术破译R-loop与疾病机理之间的相互联系已成为研究热点。
目前,全基因组中R-Loop检测方法存在严重的技术缺陷,测序数据质量不佳,易出现假阳性。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,通过利用抗体特异性的对DNA/RNA杂合链进行捕获,随即进行单链DNA建库,目的是解决R-loop测序建库过程中插入片段长度、R-loop捕获、加接头等问题,具有精准、高效、高通量、灵敏、可重复、操作简单等优点。
本发明的基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,按照以下步骤进行:
(1)进行基因组DNA片段化处理及纯化;
(2)在步骤(1)后直接加入复合物[S9.6]/Protein A,实现DNA/RNA杂合链的捕获;
(3)在步骤(2)后直接加入酶和缓冲液组分,实现末端修饰;
(4)在步骤(3)后直接进行变性,变性条件为95℃下10min,变性后立即置冰上;
(5)在步骤(4)后直接加入3'接头、酶和缓冲液,实现3'接头连接;
(6)在步骤(5)后直接加入5'接头、酶和缓冲液,实现5'接头连接;
(7)在步骤(6)后直接加入扩增体系,进行文库的放大;
(8)在步骤(7)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化,纯化后的产物即为上机文库。
其中,所述的片段化方式包括物理法,如超声和酶法,基因组DNA片段化成200-500bp,片段化的DNA加入磁珠进行纯化。
所述的DNA来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织(FFPE)、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液,同时可用于其它动物物种、植物、细菌以及病毒。
所述的缓冲液包括:5~500mM Tris-HCl(pH7.0~9.0)、5~500mM NaCl、1~100mMEDTA。
所述的步骤(5)中的3'接头包含连接引物和固定引物,连接引物为测序引物,连接引物碱基需修饰,所述的碱基修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰;固定引物5'端为测序引物序列,3'端为序列特异性引物序列,固定引物序列碱基需修饰,修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3 Spacer修饰,所述的序列特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物,如NNNNNN,N=A或C或G或T,多聚物寡核酸,如oligo dT,其中基因特异性引物长度为15-60bp,随机引物长度为3-20bp,多聚物寡核酸长度为10-60bp。
所述的步骤(6)中的5'接头包含连接引物和固定引物,连接引物为测序引物,固定引物5'端为测序引物序列,3'端为序列特异性引物序列,序列特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物,如NNNNNN,N=A或C或G或T,多聚物寡核酸,如oligo d,基因特异性引物长度为15-60bp,随机引物长度为3-20bp,多聚物寡核酸长度为10-60bp,固定引物序列碱基需修饰,修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3 Spacer修饰。
所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。
与现有技术相比,本发明的特点和有益效果是:本发明是一种基于单链DNA建库的DNA/RNA杂合链抗体的免疫共沉淀及高通量测序技术,通过巧妙设计接头和试剂,利用抗体特异性的对DNA/RNA杂合链进行捕获,随即进行单链DNA建库,产生基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库,整个流程构建R-loop测序文库需八步,即片段化、捕获、末端修饰、变性、3'加接头、5'加接头、PCR富集和文库纯化。本发明方法具有精准、高效、高通量、灵敏、可重复、操作简单等优点。
附图说明
图1是本发明的基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法流程图;
图2是2%琼脂糖凝胶电泳检测文库图;
其中:M:100bp DNA ladder(宝生物工程(大连)有限公司);1:R-loop文库。
具体实施方式
现以Illumina平台为例,结合实施例对本发明进一步说明。
本实施例中涉及的核苷酸序列如基因序列表所示。
实施例1:
本实施例的基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,按照以下步骤进行:
初始序列设计如下:
3'连接引物:AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(见序列表序列1)
3'固定引物:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN(见序列表序列2)
5'连接引物:AGATGTGTATAAGAGACAG(见序列表序列3)
5'固定引物:NNNNNNCTGTCTCTTATACACATCT(见序列表序列4)
TS-Index核酸序列:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGCCAGGTGACTGGAGTTC(见序列表序列5)
TN5UNI BLK核酸序列:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(见序列表序列6)
(1)进行基因组DNA片段化处理及纯化;
取1mL全血按照Blood&Cell Culture DNA Mini Kit(13323,QIAGEN)说明书进行gDNA提取,片段化结束后,加入1.8X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上,静置3-5min。弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗脱,重复2~3次,用90μL无核酶水进行洗脱;
(2)在步骤(1)后直接加入复合物[S9.6]/Protein A,实现DNA/RNA杂合链的捕获;
取一新1.5mL无核酶管,加入10μL Protein A磁珠、3μL抗体S9.6和11μL 1X Bing/Wash Buffer,室温下低速涡旋15min,瞬时离心;加入1mL 1X Bing/Wash Buffer,室温下混匀3min,瞬时离心,置磁力架上静置3-5min,弃上清,重复1~2次;用11μL 1X Bing/WashBuffer洗脱磁珠,洗脱后的磁珠液即是[S9.6]/Protein A磁珠;
(3)在步骤(2)后直接加入酶和缓冲液组分,实现末端修饰;
配制表1 DNA/RNA杂合链捕获体系,室温下混匀20min;
表1 DNA/RNA杂合链捕获体系
组分 体积(μL)
5X Bing/Wash Buffer 20
DNA样本 50
[S9.6]/Protein A磁珠 10
无核酶水 20
总体积 100
上述混匀结束后,瞬时离心,置磁力架上静置3-5min,弃上清;加入1mL 1X Bing/Wash Buffer,室温下混匀3min,瞬时离心,置磁力架上静置3-5min,弃上清,重复洗涤2次;加入50μL无核酶水吹打混匀磁珠,65℃孵育15min;瞬时离心,置磁力架上静置3-5min,将上清移至新无核酶离心管中,即为富集的DNA/RNA杂合链;
反应结束后,加入90μL AMPure XP beads,混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上,静置3-5min。弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗脱,重复2~3次,用50μL无核酶水进行洗脱;
纯化结束后,配制表2末端修饰体系。热循环仪中37℃孵育15min;
表2末端修饰体系
组分 体积(μL)
上步产物 25
T4PNK 1
10X T4 DNA Ligase Buffer 3
无核酶水 1
总体积 30
(4)在步骤(3)后直接进行变性,变性条件为95℃下5min,变性后立即置冰上;
(5)在步骤(4)后直接加入3'接头、酶和缓冲液,实现3'接头连接;
具体是按表3配制反应体系,按下面程序进行3'接头退火;
表3 3'接头退火体系
组分 体积(μL)
3'连接引物(100μM) 10
3'固定引物(100μM) 10
5X Annealing Buffer 10
无核酶水 20
总体积 50
3'接头退火程序:
配制表4接头连接体系。热循环仪中20℃孵育1h;
表4接头连接体系
组分 体积(μL)
产物 30
3'接头 2
T4 DNA Ligase 1
10X T4 DNA Ligase Buffer 5
25%PEG4000 10
无核酶水 2
总体积 50
反应结束后,加入90μL AMPure XP beads,混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上,静置3-5min。弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗脱,重复2~3次,用30μL无核酶水进行洗脱;
(6)在步骤(5)后直接进行变性,变性条件为95℃下5min,变性后立即置冰上;
(7)在步骤(6)后直接加入5'接头、酶和缓冲液,实现5'接头连接;
具体是按表5配制反应体系,按下面程序进行5'接头退火;
表5 5'接头退火体系
组分 体积(μL)
5'连接引物(100μM) 10
5'固定引物(100μM) 10
5X Annealing Buffer 10
无核酶水 20
总体积 50
5'接头退火程序
配制表6接头连接体系。热循环仪中20℃孵育1h;
表6 5'接头连接体系
组分 体积(μL)
产物 30
5'接头 2
T4 DNA Ligase 1
10X T4 DNA Ligase Buffer 5
25%PEG4000 10
无核酶水 2
总体积 50
反应结束后,加入90μL AMPure XP beads,混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上,静置3-5min。弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗脱,重复2~3次,用30μL无核酶水进行洗脱;
(8)在步骤(7)后直接加入扩增体系,进行文库的放大;
按表7配制反应体系,按下面程序进行文库扩增;
表7 PCR进行文库放大反应体系
文库扩增程序
(9)在步骤(8)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化,纯化后的产物即为上机文库;
反应结束后,加入50μL AMPure XP beads,混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上,静置3-5min。弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗脱,重复2~3次,用20μL 10mM Tris-HCl进行洗脱。纯化完成后,取5μL纯化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,140V,30min,得到上机文库。
对上机文库进行检测:
(1)qPCR质检
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作,使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测,参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
PCR定量分析结果如表8所示:
表8 qPCR检测结果
样品 RNA文库
qPCR浓度(nM) 86
建库文库达到上机要求浓度,可用于上机测试。
(2)上机测序
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序。
上机质控数据如表9所示:
表9测序数据质控
文库名称 总序列数 比对到基因组序列数 比对到基因组序列比例 冗余度
R-loop文库 9652137 9454322 97.95% 2.05%
(3)文库电泳检测分析
电泳分析结果如图2所示,文库主带清楚且主要分布在500bp左右,条带亮度明亮,与预期结果一致。
实施例2:
本实施例对R-loop文库测序真实性进行验证:
(1)两例R-loop文库测序结果
核酸序列1:
CACCAACCCTCTGCAGTGCGCATGTGCCCCGCCCCCAGGCCTGGCAAGCAGGTGCCGGGTTCTGAGAACCTGCAGGAACCACCACCATTCTCTGGGCGTTGGTTCCCCATCAGCATTTCCGAAAGCCAGGTCTGGGGCAGTGTGGACGGAA(见序列表序列7)
核酸序列2:
GGTCCCGGAGGCGGGGCGGTCTCGGAGGTAGGGGCCGTCCTGGAGGCGGGGCCGTCTCGGAGGCGGGACTGTCCTGGGGACTGAGCTGTCTCGGAGGTGGAGTCCTGCGGTCCCGGAGGCGGGTTGTACCGTAGGCGGGGCTCT(见序列表序列8)
(2)序列设计
F1核酸序列:CAGGTGCCGGGTTCTGAG(见序列表序列9)
R1核酸序列:CGTCCACACTGCCCCAG(见序列表序列10)
F2核酸序列:CGGTCTCGGAGGTAGGGG(见序列表序列11)
R2核酸序列:CTACGGTACAACCCGCCTC(见序列表序列12)
(3)实验步骤
①对实例1中步骤(2)的[S9.6]/Protien A磁珠捕获纯化产物进行DNaseⅠ消化处理;
②RT
步骤①反应结束后,分别采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher,货号:K1622)和AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase(AppliedBiosystems,货号:4398892)进行cDNA合成和PCR反应。
③对扩增结果进行一代测序分析。
实验结果如表10所示:
表10核酸序列比对结果
名称 核酸序列1 核酸序列2
比对数 100% 100%
通过序列比对,发现一代测序结果与实例1中测序结果完全一致,说明利用本发明的方法构建的R-loop文库具备真实性,测序结果为R-loop结构区域。

Claims (7)

1.一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,其特征在于按照以下步骤进行:
(1)进行基因组DNA片段化处理及纯化;
(2)在步骤(1)后直接加入复合物[S9.6]/Protein A,实现DNA/RNA杂合链的捕获;
(3)在步骤(2)后直接加入酶和缓冲液组分,实现末端修饰;
(4)在步骤(3)后直接进行变性,变性条件为95℃下10min,变性后立即置冰上;
(5)在步骤(4)后直接加入3'接头、酶和缓冲液,实现3'接头连接;
(6)在步骤(5)后直接加入5'接头、酶和缓冲液,实现5'接头连接;
(7)在步骤(6)后直接加入扩增体系,进行文库的放大;
(8)在步骤(7)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化,纯化后的产物即为上机文库。
2.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,其特征在于所述的片段化方式包括物理法,如超声和酶法,基因组DNA片段化成200-500bp,片段化的DNA加入磁珠进行纯化。
3.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,其特征在于所述的DNA来源包括人类的全血、新鲜组织、石蜡包埋组织(FFPE)、口腔脱落细胞、细胞系、粪便、尿液、外泌体以及其它体液,同时可用于其它动物物种、植物、细菌以及病毒。
4.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,其特征在于所述的缓冲液包括:5~500mM Tris-HCl(pH7.0~9.0)、5~500mM NaCl、1~100mMEDTA。
5.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,其特征在于所述的步骤(5)中的3'接头包含连接引物和固定引物,连接引物为测序引物,连接引物碱基需修饰,所述的碱基修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰;固定引物5'端为测序引物序列,3'端为序列特异性引物序列,固定引物序列碱基需修饰,修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3 Spacer修饰,所述的序列特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物,如NNNNNN,N=A或C或G或T,多聚物寡核酸,如oligo dT,其中基因特异性引物长度为15-60bp,随机引物长度为3-20bp,多聚物寡核酸长度为10-60bp。
6.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,其特征在于所述的步骤(6)中的5'接头包含连接引物和固定引物,连接引物为测序引物,固定引物5'端为测序引物序列,3'端为序列特异性引物序列,序列特异性引物序列包括基因特异性引物、随机引物,如NNNNNN,N=A或C或G或T,多聚物寡核酸,如oligod,基因特异性引物长度为15-60bp,随机引物长度为3-20bp,多聚物寡核酸长度为10-60bp,固定引物序列碱基需修饰,修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3 Spacer修饰。
7.根据权利要求1所述的一种基于单链DNA构建R-loop高通量测序文库的方法,其特征在于所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。
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