CN110452958A - 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用,接头与碎片化DNA序列连接,由两条链组成,一条是长链M‑ADT‑L,一条是部分互补的短链M‑ADT‑S;引物由一条内侧特异性引物和一条外侧特异性引物的嵌套式单侧特异性引物组成。本发明还提供了利用上述接头和引物构建碎片化DNA甲基化测序文库的方法,在尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化检测中,本发明的单侧特异性引物组的比对到目标区序列比例明显高于单引物靶向捕获(即U:87.2%>75.1%,D:83.1%>72.5%),且适用于领域内的大多数测序平台,可以检测几乎全部的临床样本,具有较高的特异性、灵敏度和稳定性,有效解决了临床上针对不同测序平台及不同样本获得的目标基因的甲基化检测所面临的难题。

Description

一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于基因检测领域,具体涉及一种微量碎片化核酸甲基化检测的引物、试剂盒及其应用。
背景技术
循环游离DNA(cfDNA)是源自细胞坏死,细胞凋亡和DNA活性释放的细胞外核酸片段的混合物。在健康个体中,血浆中cfDNA的浓度范围为1~10ng/mL,cfDNA的水平可能在感染状态,组织损伤或癌症中增加。
据相关文献报道,cfDNA的甲基化特异性与其起源细胞一致,即甲基化标记在癌组织和cfDNA中是保守的,可作为液体活检的预后或预测生物标志物。DNA甲基化是已知影响基因表达的重要表观遗传标志,甲基化标准物主要取决于其CpG位点的甲基化水平。DNA甲基化的异常分布是许多癌症的重要标志之一,并且在癌发生早期存在基因甲基化水平的变化。cfDNA甲基化可作为癌症诊断、产前诊断和器官移植监测的生物标志物,因此,cfDNA甲基化检测是一种非常有前景的方法。
本发明通过巧妙构思设计了甲基化接头和单侧特异性引物序列组,以及构建了基于重盐处理的cfDNA甲基化高通量测序文库的新方法。该方法整个流程如附图1所示,构建cfDNA甲基化测序文库需八步,即末端修饰、加接头、纯化和硫化处理、预文库扩增、靶向富集、靶向富集产物纯化、PCR富集和文库纯化,有效解决了临床上对不同样本获得的目标基因的甲基化检测所面临的难题。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题,本发明的一个目的在于提供一种用于低起始量碎片化核酸甲基化检测的接头,所述接头与碎片化DNA序列连接,由两条链组成,一条是长链,称作M-ADT-L,一条是部分互补的短链,称作M-ADT-S;所述M-ADT-L和/或所述M-ADT-S序列中进行特定的修饰;所述M-ADT-L包括通用引物结合区、随机序列区、接头互补区。
优选地,所述碎片化DNA为循环游离DNA(cfDNA)。
优选地,所述的随机序列区有6~12随机碱基组成,所述随机碱基为A、T、G、C四种中任一种。
优选地,所述的修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰。
优选地,所述M-ADT-L序列为:
5’-GTGAC*TGGAGTTC*AGAC*GTGTGC*TC*TTC*C*GATC*TDDDDDDDDDDY*-3’(SEQ IDNO.1);
所述M-ADT-S序列为:
5’-P-DDDDDDDDDDACGTCACGCAGGGGAGAGCCAGGGATGACTAGG-3’(SEQ ID NO.2);
其中,接头M-ADT-L链序列中标记‘*’的碱基C都进行5’mC修饰,接头M-ADT-L链和M-ADT-L链需退火形成双链接头。
本发明的另一目的在于提供以目标序列的甲基化位点为检测点设计的甲基化检测特异性引物序列组,所述引物序列组为单侧特异性引物组,由一条内侧特异性引物和一条外侧特异性引物的嵌套式引物组成;所述内侧特异性引物包括特异性序列结合区和非互补结合区,所述非互补结合区为测序引物结合序列,所述内侧特异性引物离待测CpG位点距离为1~50个碱基;所述外侧特异性引物与目标区域序列互补,所述外侧特异性引物5’端含有生物素修饰;所述外侧特异性引物与所述内侧特异引物存在重叠区,重叠碱基数10~30个碱基。
优选地,所述单侧特异性引物组为如下(1)-(5)中任一组或多组:
(1)以cg00017221甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
cg00017221-outmer-U:
5’-Biotin-CACRCRCTACCRCCTAACAAAAAC*-3’(SEQ ID NO.3)
cg00017221-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCTACCRCCTAACAAAAACRCATCTTTAAATC*-3’(SEQ IDNO.4)
cg00017221-outmer-D:
5’-Biotin-CCAATAACCCTCTTCRAACACCTACCAAAT*-3’(SEQ ID NO.5)
cg00017221-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCTACTTCRAACACCTACCAAATTTACAAATCCC*-3’(SEQ IDNO.6);
(2)以BMP3基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
BMP3-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CATGCACCCTCACCCCRACTAATTT*-3’(SEQ ID NO.7);
BMP3-bis-inner–D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCRACTAATTTAAAATTCAACCCTCA*-3’(SEQ ID NO.8);
BMP3-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CRCRTCRACTCCCRACRTCRCTAC*-3’(SEQ ID NO.9);
BMP3-bis-inner–U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCGACRTCRCTACRAAACACTCC*-3’(SEQ ID NO.10);
(3)以TWIST1基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
TWIST1-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CCRCRACCAAAACAATCTCCTCCRA*-3’(SEQ ID NO.11);
TWIST1-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGAACAATCTCCTCCRACCRCTTCCTAA*-3’(SEQ ID NO.12);
TWIST1-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CTTCCTCCRACRAACRCRAAACRAT*-3’(SEQ ID NO.13);
TWIST1-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGACRCRAAACRATTTCCTTCCCC*-3’(SEQ ID NO.14);
(4)以CDH1基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
CDH1-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-ATAATAAAAATAAAAAATAA*-3’(SEQ ID NO.15);
CDH1-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGAAATAAATAATAAAAAAC*-3’(SEQ ID NO.16);
CDH1-bis-Outmer–D:
5’-Biotin-ACRCCCCCACCRCCCRCRCRAAC*-3’(SEQ ID NO.17);
CDH1-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCRCRCRAACCCACCCCRCRAAC*-3’(SEQ ID NO.18);
(5)以NID2基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
NID2-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CCCAAATAAAAAAATAACCCA*-3’(SEQ ID NO.19);
NID2-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCRAATCATCCTCTCATCCRAAC*-3’(SEQ ID NO.20);
NID2-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CCRCTACRAAATTCCCTTTACRCT*-3’(SEQ ID NO.21);
NID2-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCCTTTACRCTAAACTCATCTCCT*-3’(SEQ ID NO.22);
其中“*”表示硫代修饰。
本发明的另一目的在于提供一种基于重盐处理构建cfDNA甲基化高通量测序文库的方法,具有低起始量、步骤精简、效率高和结果重复性好的优点,包括如下步骤:
1)对碎片化核酸进行提取纯化;
2)在步骤1)后直接加入酶和缓冲液等组分,实现使碎片化核酸末端修饰修复补平和碱基A的添加;
3)在步骤2)后直接加入接头、酶和缓冲液等组分,实现使步骤1)接头连接接头;
4)在步骤3)后直接加入磁珠进行纯化,无核酶水洗脱;
5)在步骤4)后直接按照EZ DNA Methylation-Gold TM Kit(D5005,ZYMO)说明书进行重盐转化,使非甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U),甲基化的胞嘧啶(C)保留为C硫化;
6)在步骤5)后直接配制扩增体系,所述扩增体系包括引物、酶和缓冲液组分,进行预文库的放大;
7)在步骤6)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化,纯化后的产物即为预文库;
8)在步骤7)后直接加入所述扩增体系,进行靶向富集;
9)在步骤8)后直接加入磁珠对靶向富集后的文库进行纯化和捕获;
10)在步骤9)后直接加入所述扩增体系,进行文库放大;
11)在步骤10)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化,纯化后的产物即为上机文库。
优选地,所述上机文库适用于包括Roche、Illumina、ThermoFisher、PacificBiosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因的高通量测序平台。
本发明的另一目的在于提供一种低起始量基因甲基化检测的试剂盒的制备方法,包括将上述碎片化DNA连接甲基化接头和上述上机文库构建中所采用的试剂制备成试剂盒的步骤。
本发明的另一目的在于提供一种低起始量基因甲基化检测的试剂盒,包括上述碎片化DNA连接甲基化接头、上述上机文库构建中所采用的试剂和单侧特异性引物组;所述单侧特异性引物由一条内侧特异性引物和一条外侧特异性引物的嵌套式引物组成;所述内侧特异性引物包括特异性序列结合区和非互补结合区,所述非互补结合区为测序引物结合序列,所述内侧特异性引物离待测CpG位点距离为1~50个碱基;所述外侧特异性引物与目标区域序列互补,所述外侧特异性引物5’端含有生物素修饰;所述外侧特异性引物与所述内侧特异引物存在重叠区,重叠碱基数10~30个碱基。
优选地,所述试剂盒还包括一种重盐转化增强剂,其包括:非人源DNA、非人源RNA、反应稳定剂。
优选地,所述重盐转化增强剂添加于被处理的核酸中和/或添加于重盐转化之后纯化回收之前。
优选地,所述重盐转化增强剂的使用量是被处理核酸量的0.1~10倍。
优选地,所述试剂盒检测的样本类型包括:全血、血清、尿液、汗液、唾液、石蜡组织切片、新鲜组织。
本发明的甲基化测序文库构建流程及碎片化的甲基化DNA检测原理如下:
本发明的甲基化测序文库构建整个流程如附图1所示,共需八步,即末端修饰、加接头、纯化和硫化处理、预文库扩增、靶向富集、靶向富集产物纯化、PCR富集和文库纯化。
碎片化的甲基化DNA检测原理如图2所示,碎片化的甲基化DNA或非甲基化DNA通过连接体系连接甲基化接头,连接接头产物通过重盐转化,甲基化DNA中的CpG位点中的C保持不变,非甲基化DNA中的CpG位点中的C转化成U,实现了甲基化模板和非甲基化模板的差异。再进行预扩增富集放大,富集产物通过嵌套式的特异性引物进行扩增子靶向捕获,捕获产物进行PCR富集。上机测序,实现CpG位点甲基化检测。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明提供的甲基化接头是由一条长链和一条部分互补的短链组成,如附图1所示,长链由通用引物结合区、随机序列区、接头互补区组成,两条链可以进行特定的修饰,所述甲基化接头设计方法巧妙,可使碎片化核酸先连接接头再进行重盐处理,提升连接效率,进而提高检测灵敏度,比对到目标区序列比例高,平均值超过76%。
(2)本发明提供的基于循环游离DNA(cfDNA)甲基化检测的试剂盒及其检测方法,如附图2所示,采用单侧巢式PCR扩增子靶向捕获技术,提高模板利用率,具有较好的特异性,比对到基因组序列的比例高,超过63%。尤其是,本发明所述试剂盒针对目标基因的甲基化位点设计了单侧特异性引物组,实验结果表明,在尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化检测中,本发明的单侧特异性引物组的比对到目标区序列比例明显高于单引物靶向捕获(即U:87.2%>75.1%,D:83.1%>72.5%);在临床上检测较为困难且干扰因素较多的粪便样本,本发明试剂盒的比对到目标区序列比例仍然能够达到82.3%和87.1%。可见本发明的试剂盒不仅具有较高的特异性和灵敏,而且检测结果稳定,能够适用于几乎全部的临床上常用的样本类型检测,满足于临床实际应用的需求。
(3)发明提供的基于重盐处理构建cfDNA甲基化高通量文库构建方法可用于低起始量、碎片化核酸样本甲基化文库构建,其中采用的重盐转化增强剂可以提高重盐转化效率及核酸得率,本发明整个文库构建流程短,操作简单,耗时短,成本低,可以用于不同的测序平台,适用性广,易于推广,满足于目前各大检测机构或部门的多样化测序平台使用的实际需求。
附图说明
图1是本发明的甲基化测序文库构建的整个流程图。
图2是本发明的碎片化的甲基化DNA检测原理图。
图3是构建FFPE样本碎片化gDNA甲基化文库的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果,其中M:100bp DNA ladder(宝生物工程(大连)有限公司);1:引物集D反应管文库;2:引物集U反应管文库。
图4是粪便样本结直肠癌BMP3基因甲基化文库的2%琼脂糖凝胶电泳检测结果,其中M:100bp DNA ladder(宝生物工程(大连)有限公司);1:引物集D反应管文库;2:引物集U反应管文库。
图5是尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化文库的2%琼脂糖凝胶电泳检测文库结果,其中M:100bp DNA ladder(宝生物工程(大连)有限公司);1:引物集D反应管文库;2:引物集U反应管文库。
图6是尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化文库(单引物靶向捕获)的2%琼脂糖凝胶电泳检测文库结果,其中M:100bp DNA ladder(宝生物工程(大连)有限公司);1:单引物靶向捕获D反应管文库;2:单引物靶向捕获U反应管文库。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明,以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施,但实施例并不作为本发明的限定。
以下实施例仅以Illumina平台为例,但并不限于此,本发明也同样适用于Roche、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因等的高通量测序平台,其所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1FFPE样本碎片化gDNA甲基化文库构建及检测
1.1接头引物设计
1.1.1甲基化接头序列
M-ADT-L引物序列:
5’-GTGAC*TGGAGTTC*AGAC*GTGTGC*TC*TTC*C*GATC*TDDDDDDDDDDY*-3’(SEQ IDNO.1);
M-ADT-S引物序列:
5’-P-DDDDDDDDDDACGTCACGCAGGGGAGAGCCAGGGATGACTAGG-3’(SEQ ID NO.2);
其中,接头A链引物序列中标记‘*’的碱基C都进行5’mC修饰,接头A和B引物需退火形成双链接头。
1.1.2以cg00017221甲基化位点为检测点设计甲基化检测特异性引物序列
cg00017221-outmer-U:
5’-Biotin-CACRCRCTACCRCCTAACAAAAAC*-3’(SEQ ID NO.3);
cg00017221-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCTACCRCCTAACAAAAACRCATCTTTAAATC*-3’(SEQ IDNO.4);
cg00017221-outmer-D:
5’-Biotin-CCAATAACCCTCTTCRAACACCTACCAAAT*-3’(SEQ ID NO.5);
cg00017221-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCTACTTCRAACACCTACCAAATTTACAAATCCC*-3’(SEQ IDNO.6);
其中,“*”表示硫代修饰。
1.1.3通用性引物设计
Pre-lib-Primer-M引物:
5’-CCTAATCATCCCTAACTCTC-3’(SEQ ID NO.23);
TS-Index核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAG[INDEX]GACTGGAGTTCAGACGTGT-3’(SEQ IDNO.24);
P7核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQ ID NO.25);
TN5UNI BLK核酸序列:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAA GAGACAG-3’(SEQ ID NO.26)。
1.2实验步骤
1.2.1FFPE样本中gDNA的提取
取3例编号分别为MF001、MF002、MF003的FFPE样本;每例样本取5片石蜡切片,按照MagMAXTM FFPE DNA/RNA Ultra Kit(life,cat.A31881)说明书操作,提取DNA,包括以下步骤:
a)样本脱蜡
b)样本消化
c)磁珠结合
d)清洗
e)洗脱
1.2.2FFPE样本gDNA的片段化
参照TIANSeq快速DNA片段化/末端修复/dA添加模块(cat.NG301,天根生化试剂有限公司)试剂盒说明书,按照下表配置FFPE gDNA片段化反应体系:
组份 体积(μL)
10×FEA Reaction Buffer 2.5
5×FEA Enzyme Mix 5
gDNA 100ng
ddH2O 补足至25
Total 25
1.2.3末端修复补平加碱基A
按照下表配制末端修饰体系:
末端修饰反应体系
组分 体积(μL)
片段化产物 25
Buffer 1 7
Eyzme 1 3
无核酶水 补充至50μL
总体积 50
注:Buffer1、Eyzme1为本发明中自配试剂
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
程序为:37℃,20min;72℃,20min,4℃,∞。
1.2.4甲基化接头连接
按照下表配制反应体系,试剂末端修复产物进行接头连接。
接头组装体系
组分 体积(μL)
上一步产物 50
ADT-M 4
连接反应液 44
无核酶水 2
总体积 100
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
程序为:20℃,15min;65℃,10min,4℃,∞。
1.2.5连接产物纯化
接头连接孵育完成后,加入0.8X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用21μL无核酶水进行洗脱。
1.2.6重盐转化
按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(D5005,ZYMO)说明书进行重盐转化,重盐转化产物40ul洗脱。具体步骤如下:
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
98℃ 10min
64℃ 2.5h
4℃ 16-20h
孵育完成后,按照下列步骤完成纯化:
a.平衡回收柱;
b.硫化产物与回收柱膜结合;
c.核酸修复;
d.清洗;
e.洗脱。
1.2.7纯化产物预扩增
硫化产物通过PCR进行富集,按下表配制反应体系:
预文库扩增体系
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
1.2.8预文库产物纯化
靶向富集扩增结束后,加入1.2X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用26μL DBBuffer进行洗脱。
1.2.9特异性引物第一轮靶向捕获
将纯化的预文库,按照DNA输入量50ng进行第一轮靶向捕获。按下表配制反应体系:
PCR1反应管1(U)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
预文库 23
cg00017221-outmer-U 1
P7(10μM) 1
PCR1反应管2(D)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
预文库 23
cg00017221-outmer-D 1
P7(10μM) 1
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
1.2.10产物纯化
a.将Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads磁珠从4℃取出并重悬,室温平衡30min;取2μL磁珠于新的离心管内,将离心管置于磁力架上,静置1min,弃上清;加入200μL Wash Buffer进行洗涤,重复2~3次;用25μL DB Buffer重悬磁珠待用。
b.将1.2.9中纯化产物加入重悬后磁珠中,置于旋转混匀仪上室温孵育30min;将反应管置于磁力架上,静置2min,弃上清;加入200μL Wash Buffer进行洗涤,65℃孵育10min,转速800转/min进行清洗,重复2~3次;用24μL Binding Buffer重悬磁珠待用。
1.2.11特异性引物第二轮靶向捕获
对第一轮靶向捕获产物进行第二轮靶向捕获,按照下表配制第二轮靶向捕获:
PCR2反应管1(U)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
第一轮靶向捕获产物 23
cg00017221-inner-U 1
P7(10μM) 1
PCR2反应管2(D)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
第一轮靶向捕获产物 23
cg00017221-inner-D 1
P7(10μM) 1
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
1.2.12产物纯化
靶向富集扩增结束后,加入1.2X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用26μL DBBuffer进行洗脱。
1.2.13通用PCR富集
对第二轮靶向捕获产物进行PCR富集,按下表配制反应体系。
Post-PCR进行文库放大反应体系
组分 体积(μL)
第二轮靶向捕获产物U/D 23
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25
P7(25μM) 1
TN5UNI BLK(25μM) 1
总体积 50
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
1.2.14文库纯化
加入50μL AMPure XP beads,混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上,静置3-5min。弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用22μL Binding Buffer进行洗脱。纯化完成后,取5μL纯化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,120V,30min。
1.2.9qPCR质检
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作,使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测,参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
1.2.10上机测序
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序。
1.3实验结果
1.3.1文库电泳检测分析结果
根据电泳分析结果,如附图3可知,文库主带清楚且主要分布在300bp左右,条带亮度明亮,与预期结果一致。
qPCR检测结果如下:
样品 文库
qPCR浓度(nM) 69
建库文库达到上机要求浓度,可用于上机测试。
1.3.3测序数据分析结果
将高通量测序下机数据经过质控过滤后,进行BWA比对,用于评估文库的特异性,结果如下表1。
表1 FFPE样本碎片化gDNA甲基化文库的测序数据分析结果
实施例2粪便样本结直肠癌BMP3基因甲基化检测
2.1接头引物设计
2.1.1接头序列设计
M-ADT-L引物序列:
5’-GTGAC*TGGAGTTC*AGAC*GTGTGC*TC*TTC*C*GATC*TDDDDDDDDDDY*-3’(SEQ IDNO.1);
M-ADT-S引物序列:
5’-P-DDDDDDDDDDACGTCACGCAGGGGAGAGCCAGGGATGACTAGG-3’(SEQ ID NO.2);
其中,接头A链引物序列中标记‘*’的碱基C都进行5’mC修饰,接头A和B引物需退火形成双链接头。
2.1.2特异性引物序列
BMP3基因启动子区域部分序列:
5’-CTATCTCGCTGCACCCGGCCGCGTCCCGGGCTCCGTGCGCCCTCGCCCCAGCTGGTTTGGAGTTCAACCCTCGGCTC[CG]C[CG]C[CG]GCTCCTTGCGCCTTCGGAGTGTCCCGCAGCGACGCCGGGAGCCGACGCGCCGCGCGGGTACCTAGCCATGGCTGGGGCGAGCAGGCTGCTCTTTCTGTGGCTGGGCTGCTTCTGCGTGAGCC-3’(SEQ ID NO.27);
其中,‘[]‘表示关注的CpG位点。
BMP3基因启动子区域重盐转化序列:
其中“[]”表示关注的CpG位点。灰色背景斜体字区域表示内侧特异性引物设计区域;下划线表示外侧特异性引物设计区域,内侧与外侧引物存在10-30nt重叠。
BMP3-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CATGCACCCTCACCCCRACTAATTT*-3’(SEQ ID NO.7);
BMP3-bis-inner–D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCRACTAATTTAAAATTCAACCCTCA*-3’(SEQ ID NO.8);
BMP3-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CRCRTCRACTCCCRACRTCRCTAC*-3’(SEQ ID NO.9);
BMP3-bis-inner–U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCGACRTCRCTACRAAACACTCC*-3’(SEQ ID NO.10);
其中,“*”表示硫代修饰。
2.1.3通用引物序列
TS-Index核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAG[INDEX]GACTGGAGTTCAGACGTGT-3’(SEQ IDNO.24);
P7核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQ ID NO.25);
TN5UNI BLK核酸序列:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO.26)。
2.2实验步骤
2.2.1粪便样本中gDNA的提取
参照粪便基因组DNA提取试剂盒(cat.NA012-1,常州金麦格生物科技有限公司)说明书及自配试剂完成核酸的提取。
2.2.2gDNA片段化处理
参照TIANSeq快速DNA片段化/末端修复/dA添加模块(cat.NG301,天根生化试剂有限公司)试剂盒说明书,按照下表配置FFPE gDNA片段化反应体系:
组份 体积(μL)
10×FEA Reaction Buffer 2.5
5×FEA Enzyme Mix 5
gDNA 100ng
ddH2O 补足至25
Total 25
2.2.3末端修复补平加碱基A
按照下表配制末端修饰体系:
末端修饰反应体系
组分 体积(μL)
片段化产物 25
Buffer 1 7
Eyzme 1 3
无核酶水 补充至50μL
总体积 50
注:Buffer1、Eyzme1为本发明中自配试剂。
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
程序为:37℃,20min;72℃,20min,4℃,∞。
2.2.4甲基化接头连接
按照下表配制反应体系,试剂末端修复产物进行接头连接。
接头组装体系
组分 体积(μL)
上一步产物 50
ADT-M 4
连接反应液 44
无核酶水 2
总体积 100
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
程序为:20℃,15min;65℃,10min,4℃,∞。
2.2.5连接产物纯化
接头连接孵育完成后,加入0.8X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用21μL无核酶水进行洗脱。
2.2.6重盐转化
为提供硫化的转化率和保护核酸不降解,使用本发明的硫化转化增强剂。具体硫化步骤如下:
按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(D5005,ZYMO)说明书进行重盐转化,重盐转化产物40ul洗脱。具体步骤如下:
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
98℃ 10min
64℃ 2.5h
4℃ 16-20h
孵育完成后,按照下列步骤完成纯化:
a.平衡回收柱;
b.加入2ul重盐转化增强剂于回收柱内;
c.硫化产物与回收柱膜结合;
d.核酸修复;
e.清洗;洗脱。
2.2.7特异性引物第一轮靶向捕获
将纯化进行第一轮靶向捕获。按表下表配制反应体系:
PCR1反应管1(U)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
重盐转化产物 23
BMP3-bis-Outmer-U 1
TS-INDEX Primer 1
PCR1反应管2(D)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
重盐转化产物 23
BMP3-bis-Outmer-D 1
TS-INDEX Primer 1
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
2.2.8产物纯化
a.将Dynabeads MyOne Streptavidin T1magnetic beads磁珠从4℃取出并重悬,室温平衡30min;取2μL磁珠于新的离心管内,将离心管置于磁力架上,静置1min,弃上清;加入200μL Wash Buffer进行洗涤,重复2~3次;用25μL DB Buffer重悬磁珠待用。
b.将1.2.9中纯化产物加入重悬后磁珠中,置于旋转混匀仪上室温孵育30min;将反应管置于磁力架上,静置2min,弃上清;加入200μL Wash Buffer进行洗涤,65℃孵育10min,转速800转/min进行清洗,重复2~3次;用24μL Binding Buffer重悬磁珠待用。
2.2.9特异性引物第二轮靶向捕获
对第一轮靶向捕获产物进行第二轮靶向捕获,按照下表配制第二轮靶向捕获:
PCR2反应管1(U)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
第一轮靶向捕获产物 23
BMP3-bis-inner–D 1
P7 1
PCR2反应管2(D)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
第一轮靶向捕获产物 23
BMP3-bis-inner–U 1
P7 1
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
2.2.10产物纯化
靶向富集扩增结束后,加入1.2X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用26μL DBBuffer进行洗脱。
2.2.11通用PCR富集
对第二轮靶向捕获产物进行PCR富集,按下表配制反应体系。
组分 体积(μL)
第二轮纯化产物U/D 23
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25
P7(25μM) 1
TN5UNI BLK(25μM) 1
总体积 50
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
2.2.12文库纯化
加入50μL AMPure XP beads,混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上,静置3-5min。弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用22μL Binding Buffer进行洗脱。纯化完成后,取5μL纯化产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,120V,30min。
2.2.13qPCR质检
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作,使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测,参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
2.2.14上机测序
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序。
2.3实验结果
2.3.1文库电泳检测分析结果
根据电泳分析结果,如附图3可知,文库主带清楚且主要分布在300bp左右,条带亮度明亮,与预期结果一致。
2.3.2qPCR定量分析结果
qPCR检测结果如下:
样品 文库
引物集D qPCR浓度(nM) 137.8
引物集U qPCR浓度(nM) 145.9
建库文库达到上机要求浓度,可用于上机测试。
2.3.3测序数据分析结果
将高通量测序下机数据经过质控过滤后,进行BWA比对,用于评估文库的特异性,结果如下表2。
表2粪便样本结直肠癌BMP3基因甲基化检测的测序数据分析结果
实施例3尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化高通量文库构建及测序分析
3.1接头引物设计
3.1.1接头序列设计
M-ADT-L引物序列:
5’-GTGAC*TGGAGTTC*AGAC*GTGTGC*TC*TTC*C*GATC*TDDDDDDDDDDY*-3’(SEQ IDNO.1);
M-ADT-S引物序列:
5’-P-DDDDDDDDDDACGTCACGCAGGGGAGAGCCAGGGATGACTAGG-3’(SEQ ID NO.2);
其中,接头A链引物序列中标记‘*’的碱基C都进行5’mC修饰,接头A和B引物需退火形成双链接头。
3.1.2特异性靶向捕获引物设计
TWIST1启动子区域序列:
5’-CCCACGGACCTAGAGGGCTCTTGGGCGAGATGAGACATCACCCACTGTGTAGAAGCTGTTGCCATTGCTGCTGTCACAGCCACTCCGGATGGGGCTGCCACCGCGGCCAGGACAGTCTCCTCCGACCGCTTCCTGGGCTG[CG]CTAGGGTT[CG]GGGG[CG]CTGCC[CG]CA[CG]CTCCGGCGGGGAAGGAAATCGCCCCGCGCCCGCCGGAGGAAGGCGACGGGGAGGGAAGGGGGAGGGCGGCTAGGAGGCGGGTGGAGGGGCCGGCCGCCCGGGCCAGGTCGTTTTTGAATGGTTTGGGAGGACGAATTGTTAGACCCCGAGGAAGGGAGGTGGGACGGGGGAGGGGGACTGGAAAGCGG-3’(SEQ ID NO.29);
TWIST1启动子区域序列重盐转化序列:
其中,‘[]‘表示关注的CpG位点。灰色背景斜体字区域表示内侧特异性引物设计区域;下划线表示外侧特异性引物设计区域,内侧与外侧引物存在10-30nt重叠。
TWIST1-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CCRCRACCAAAACAATCTCCTCCRA*-3’(SEQ ID NO.11);
TWIST1-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGAACAATCTCCTCCRACCRCTTCCTAA*-3’(SEQ ID NO.12);
TWIST1-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CTTCCTCCRACRAACRCRAAACRAT*-3’(SEQ ID NO.13);
TWIST1-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGACRCRAAACRATTTCCTTCCCC*-3’(SEQ ID NO.14);
CDH1启动子区域序列:
5’-TTCCCTTCTTCCAAGAAAGTTCGGGTCCTGAGGAGCGGAGCGGCCTGGAAGCCTCGCGCGCTCCGGACCCCCCAGTGATGGGAGTGGGGGGTGGGTGGTGAGGGGCGAGCGCGGCTTTCCTGCCCCCTCCAG[CG]CAGAC[CG]AGG[CG]GGGG[CG]TCTGGCCGCGGAGTCCGCGGGGTGGGCTCGCGCGGGCGGTGGGGGCGTGAAGCGGGGTGTAGGGGGTGGGGTGTGGAGAAGGGGTGCCCTGGTGCAAGTCGAGGGGGAGCCAGGAGTCGTGGGGACGATCTTCGAGGGAAGGAGAGGGGCATCCGTAGAAATAAAGGCACCTGCCATGCCAAGAAAGGTCGTAAATAGGAGTGAG-3’(SEQ ID NO.31);
CDH1启动子区域序列重盐转化序列:
其中,‘[]‘表示关注的CpG位点。灰色背景斜体字区域表示内侧特异性引物设计区域;下划线表示外侧特异性引物设计区域,内侧与外侧引物存在10-30nt重叠。
CDH1-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-ATAATAAAAATAAAAAATAA*-3’(SEQ ID NO.15);
CDH1-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGAAATAAATAATAAAAAAC*-3’(SEQ ID NO.16);
CDH1-bis-Outmer–D:
5’-Biotin-ACRCCCCCACCRCCCRCRCRAAC*-3’(SEQ ID NO.17);
CDH1-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCRCRCRAACCCACCCCRCRAAC*-3’(SEQ ID NO.18);
其中,“*”表示硫代修饰。
NID2基因启动子区域部分序列:
5’-CGGGGTAAAAGCTCCTGGCCAGGGCTGCCTGGAGCTGCCCCTTCCACTCCGCCCCCAGGGAGCTCCCGGGTCATCCTCTCATCCGGGCTGCCCCG[CG]GCCCCCAAGGAGCCCCACCCC[CG]GGACCAAATGGCC[CG]CAAGGTTTGGGGCAG[CG]G[CG]TTGCAGGAGATGAGCTCAGCGCAAAGGGAACCCCGCAGCGGCGAGTGCGGCTGCTGGCCTGCGCGCTGTGGCCCCAACAGGCTGGCAGGGCGCGGGCGGGTGGCGGGGTTGCGGTATGAGCTTTGCTCCCTGCCCTGGGGTCCCGG-3’(SEQ ID NO.33);
NID2基因启动子区域重盐转化序列:
其中,‘[]‘表示关注的CpG位点。灰色背景斜体字区域表示内侧特异性引物设计区域;下划线表示外侧特异性引物设计区域,内侧与外侧引物存在10-30nt重叠。
NID2-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CCCAAATAAAAAAATAACCCA*-3’(SEQ ID NO.19);
NID2-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCRAATCATCCTCTCATCCRAAC*-3’(SEQ ID NO.20);
NID2-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CCRCTACRAAATTCCCTTTACRCT*-3’(SEQ ID NO.21);
NID2-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCCTTTACRCTAAACTCATCTCCT*-3’(SEQ ID NO.22);
其中,“*”表示硫代修饰。
3.1.3通用引物设计
Pre-lib-Primer-M引物:
5’-CCTAATCATCCCTAACTCTC-3’(SEQ ID NO.23);
TS-Index核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAG[INDEX]GACTGGAGTTCAGACGTGT-3’(SEQ IDNO.24);
P7核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQ ID NO.25);
TN5UNI BLK核酸序列:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO.26)。
3.2实验步骤
3.2.1游离DNA提取
按照磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709,天根)说明书进行cfDNA提取,按照Quibt 3.0仪器对cfDNA进行浓度定量。
3.2.2末端修复补平加碱基A
按照下表配制反应体系,进行cfDNA末端修复补平及添加碱基A:
组分 体积(μL)
cfDNA 1~10ng
Buffer 1 7
Eyzme 1 3
无核酶水 补充至50μL
总体积 50
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序
程序为:37℃,20min;72℃,20min,4℃,∞。
3.2.3接头连接
按末端修复补平加碱基A的反应产物进行接头连接,按照下表配制连接反应体系:
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
程序为:20℃,15min;65℃,10min,4℃,∞。
3.2.4连接产物纯化
接头连接孵育完成后,加入0.8X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用21μL无核酶水进行洗脱。
3.2.5连接产物重盐转化
为提供硫化的转化率和保护核酸不降解,使用本发明的硫化转化增强剂。具体硫化步骤如下:
按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(D5005,ZYMO)说明书进行重盐转化,重盐转化产物40ul洗脱。具体步骤如下:
组份 体积(μL)
CT Conversion Reagent 130
连接纯化产物 18
重盐转化增强剂 2
总体积 150
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
98℃ 10min
64℃ 2.5h
4℃ 16-20h
孵育完成后,按照下列步骤完成纯化:
a.平衡回收柱;
b.加入2ul重盐转化增强剂于回收柱内;
c.硫化产物与回收柱膜结合;
d.核酸修复;
e.清洗;洗脱。
3.2.6特异性引物第一轮靶向捕获
将纯化进行第一轮靶向捕获。按表下表配制反应体系:
PCR1反应管1(U)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
重盐转化产物 23
Bis-Outmer-U 1
TS-INDEX Primer 1
PCR1反应管2(D)
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
3.2.7产物纯化
a.将Dynabeads MyOne Streptavidin T1magnetic beads磁珠从4℃取出并重悬,室温平衡30min;取2Μl磁珠于新的离心管内,将离心管置于磁力架上,静置1min,弃上清;加入200Μl Wash Buffer进行洗涤,重复2~3次;用25Μl DB Buffer重悬磁珠待用。
b.将1.2.9中纯化产物加入重悬后磁珠中,置于旋转混匀仪上室温孵育30min;将反应管置于磁力架上,静置2min,弃上清;加入200Μl Wash Buffer进行洗涤,65℃孵育10min,转速800转/min进行清洗,重复2~3次;用24Μl Binding Buffer重悬磁珠待用。
3.2.8特异性引物第二轮靶向捕获
对第一轮靶向捕获产物进行第二轮靶向捕获,按照下表配制第二轮靶向捕获:
PCR2反应管1(U)
PCR2反应管2(D)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
第一轮靶向捕获产物 23
Bis-inner–U 1
P7 2
TN5-UNI-BLK 2
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
3.2.9产物纯化
靶向富集扩增结束后,加入1.2X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用26μL DBBuffer进行洗脱。获得上机文库
3.2.10qPCR质检
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作,使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测,参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
3.2.11上机测序
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序。
3.3实验结果
3.3.1文库电泳检测分析结果
根据电泳分析结果如附图4可知,文库主带清楚且主要分布在300bp左右,条带亮度明亮,与预期结果一致。
3.3.2qPCR定量分析结果
qPCR检测结果如下:
样品 文库
D-qPCR浓度(nM) 79.8
U-qPCR浓度(nM) 68.7
建库文库达到上机要求浓度,可用于上机测试。
3.3.3测序数据分析结果
将高通量测序下机数据经过质控过滤后,进行BWA比对,用于评估文库的特异性,结果如下表3。
表3尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化高通量文库的测序数据分析结果
实施例4尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化单引物靶向捕获
以NID2基因甲基化检测为例
4.1接头引物设计
4.1.1接头序列设计
M-ADT-L引物序列:
5’-GTGAC*TGGAGTTC*AGAC*GTGTGC*TC*TTC*C*GATC*TDDDDDDDDDDY*-3’(SEQ IDNO.1);
M-ADT-S引物序列:
5’-P-DDDDDDDDDDACGTCACGCAGGGGAGAGCCAGGGATGACTAGG-3’(SEQ ID NO.2);
其中,接头A链引物序列中标记‘*’的碱基C都进行5’mC修饰,接头A和B引物需退火形成双链接头。
4.1.2特异性引物设计
NID2基因启动子区域部分序列
5’-CGGGGTAAAAGCTCCTGGCCAGGGCTGCCTGGAGCTGCCCCTTCCACTCCGCCCCCAGGGAGCTCCCGGGTCATCCTCTCATCCGGGCTGCCCCG[CG]GCCCCCAAGGAGCCCCACCCC[CG]GGACCAAATGGCC[CG]CAAGGTTTGGGGCAG[CG]G[CG]TTGCAGGAGATGAGCTCAGCGCAAAGGGAACCCCGCAGCGGCGAGTGCGGCTGCTGGCCTGCGCGCTGTGGCCCCAACAGGCTGGCAGGGCGCGGGCGGGTGGCGGGGTTGCGGTATGAGCTTTGCTCCCTGCCCTGGGGTCCCGG-3’(SEQ ID NO.33);
NID2基因启动子区域重盐转化序列
5’-CGGGGTAAAAGTTTTTGGTTAGGGTTGTTTGGAGTTGTTTTTTTTATTTCGTTTTTAGGGAGTTTTCGGGTTATTTTTTTATTCGGGTTGTTTCG[CG]GTTTTTAAGGAGTTTTATTTT[CG]GGATTAAATGGTT[CG]TAAGGTTTGGGGTAG[CG]G[CG]TTGTAGGAGATGAGTTTAGCGTAAAGGGAATTTCGTAGCGGCGAGTGCGGTTGTTGGTTTGCGCGTTGTGGTTTTAATAGGTTGGTAGGGCGCGGGCGGGTGGCGGGGTTGCGGTATGAGTTTTGTTTTTTGTTTTGGGGTTTCGG-3’(SEQ ID NO.34);
其中,‘[]‘表示关注的CpG位点。
NID2-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCRAATCATCCTCTCATCCRAAC*-3’(SEQ ID NO.20);
NID2-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCCTTTACRCTAAACTCATCTCCT*-3’(SEQ ID NO.22);
其中,“*”表示硫代修饰。
4.1.3通用引物设计
Pre-lib-Primer-M引物:
5’-CCTAATCATCCCTAACTCTC-3’(SEQ ID NO.23);
TS-Index核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAG[INDEX]GACTGGAGTTCAGACGTGT-3’(SEQ IDNO.24);
P7核酸序列:
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQ ID NO.25);
TN5UNI BLK核酸序列:
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO.26)。
4.2实验步骤
4.2.1游离DNA提取
按照磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709,天根)说明书进行cfDNA提取,按照Quibt 3.0仪器对cfDNA进行浓度定量。
4.2.2末端修复补平加碱基A
按照下表配制反应体系,进行cfDNA末端修复补平及添加碱基A:
组分 体积(μL)
cfDNA 1~10ng
Buffer 1 7
Eyzme 1 3
无核酶水 补充至50μL
总体积 50
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序
程序为:37℃,20min;72℃,20min,4℃,∞。
4.2.3接头连接
按末端修复补平加碱基A的反应产物进行接头连接,按照下表配制连接反应体系:
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
程序为:20℃,15min;65℃,10min,4℃,∞。
4.2.4连接产物纯化
接头连接孵育完成后,加入0.8X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用21μL无核酶水进行洗脱。
4.2.5连接产物重盐转化
为提供硫化的转化率和保护核酸不降解,使用本发明的硫化转化增强剂。具体硫化步骤如下:
按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(D5005,ZYMO)说明书进行重盐转化,重盐转化产物40ul洗脱。具体步骤如下:
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪上,运行下列程序:
98℃ 10min
64℃ 2.5h
4℃ 16-20h
孵育完成后,按照下列步骤完成纯化:
a.平衡回收柱;
b.加入2ul重盐转化增强剂于回收柱内;
c.硫化产物与回收柱膜结合;
d.核酸修复;
e.清洗;洗脱。
4.2.6特异性引物靶向捕获
将纯化进行第一轮靶向捕获。按表下表配制反应体系:
PCR1反应管1(U)
PCR1反应管2(D)
组分 用量(μL)
Gold 360master Mix(2x) 25
重盐转化产物 23
NID2-bis-D 1
TS-INDEX Primer 1
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
4.2.7产物纯化
靶向富集扩增结束后,加入1.2X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用26μL DBBuffer进行洗脱。
4.2.8通用PCR富集
对捕获纯化产物进行PCR富集,按下表配制反应体系。
轻轻吹打混匀,瞬时离心,将反应管置于热循环仪中,运行下列程序:
4.2.9产物纯化
靶向富集扩增结束后,加入1.2X AMPure XP beads,混匀并室温静置5min;反应管置于磁力架上,静置3-5min,弃上清;加200μL 80%乙醇进行洗涤,重复2~3次;用26μL DBBuffer进行洗脱,获得上机文库。
4.2.10qPCR质检
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作,使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测,参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
4.2.11上机测序
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序。
4.3实验结果
4.3.1文库电泳检测分析结果
根据电泳分析结果如附图4可知,文库主带清楚且主要分布在300bp左右,条带亮度明亮,与预期结果一致。
4.3.2qPCR定量分析结果
qPCR检测结果如下:
样品 文库
D-qPCR浓度(nM) 113.6
U-qPCR浓度(nM) 98.5
建库文库达到上机要求浓度,可用于上机测试。
4.3.3测序数据分析结果
将高通量测序下机数据经过质控过滤后,进行BWA比对,用于评估文库的特异性,结果如下表4。
表4尿液上清cfDNA膀胱癌基因甲基化检测的测序数据分析结果
4.3.4甲基化位点检测结果
对mapped到的clean read进行甲基化位点分析,检测结果如下:
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南大地同年生物科技有限公司
<120> 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctdddddd ddddy 45
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
dddddddddd acgtcacgca ggggagagcc agggatgact agg 43
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cacrcrctac crcctaacaa aaac 24
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
agatgtgtat aagagacagc taccrcctaa caaaaacrca tctttaaatc 50
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ccaataaccc tcttcraaca cctaccaaat 30
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
agatgtgtat aagagacagc tacttcraac acctaccaaa tttacaaatc cc 52
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
catgcaccct caccccract aattt 25
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
agatgtgtat aagagacagc ractaattta aaattcaacc ctca 44
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
crcrtcract cccracrtcr ctac 24
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
agatgtgtat aagagacagc cgacrtcrct acraaacact cc 42
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ccrcraccaa aacaatctcc tccra 25
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
agatgtgtat aagagacaga acaatctcct ccraccrctt cctaa 45
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
cttcctccra craacrcraa acrat 25
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
agatgtgtat aagagacaga crcraaacra tttccttccc c 41
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
ataataaaaa taaaaaataa 20
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
agatgtgtat aagagacaga aataaataat aaaaaac 37
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
acrcccccac crcccrcrcr aac 23
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
agatgtgtat aagagacagc crcrcraacc caccccrcra ac 42
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
cccaaataaa aaaataaccc a 21
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
agatgtgtat aagagacagc raatcatcct ctcatccraa c 41
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ccrctacraa attcccttta crct 24
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
agatgtgtat aagagacagc cctttacrct aaactcatct cct 43
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
cctaatcatc cctaactctc 20
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
caagcagaag acggcatacg agataggact ggagttcaga cgtgt 45
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 26
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60
ag 62
<210> 27
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
ctatctcgct gcacccggcc gcgtcccggg ctccgtgcgc cctcgcccca gctggtttgg 60
agttcaaccc tcggctccgc cgccggctcc ttgcgccttc ggagtgtccc gcagcgacgc 120
cgggagccga cgcgccgcgc gggtacctag ccatggctgg ggcgagcagg ctgctctttc 180
tgtggctggg ctgcttctgc gtgagcc 207
<210> 28
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
ttatttcgtt gtattcggtc gcgtttcggg tttcgtgcgt tttcgtttta gttggtttgg 60
agtttaattt tcggtttcgt cgtcggtttt ttgcgttttc ggagtgtttc gtagcgacgt 120
cgggagtcga cgcgtcgcgc gggtatttag ttatggttgg ggcgagtagg ttgttttttt 180
tgtggttggg ttgtttttgc gtgagtt 207
<210> 29
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
cccacggacc tagagggctc ttgggcgaga tgagacatca cccactgtgt agaagctgtt 60
gccattgctg ctgtcacagc cactccggat ggggctgcca ccgcggccag gacagtctcc 120
tccgaccgct tcctgggctg cgctagggtt cgggggcgct gcccgcacgc tccggcgggg 180
aaggaaatcg ccccgcgccc gccggaggaa ggcgacgggg agggaagggg gagggcggct 240
aggaggcggg tggaggggcc ggccgcccgg gccaggtcgt ttttgaatgg tttgggagga 300
cgaattgtta gaccccgagg aagggaggtg ggacggggga gggggactgg aaagcgg 357
<210> 30
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
tttacggatt tagagggttt ttgggcgaga tgagatatta tttattgtgt agaagttgtt 60
gttattgttg ttgttatagt tatttcggat ggggttgtta tcgcggttag gatagttttt 120
ttcgatcgtt ttttgggttg cgttagggtt cgggggcgtt gttcgtacgt ttcggcgggg 180
aaggaaatcg tttcgcgttc gtcggaggaa ggcgacgggg agggaagggg gagggcggtt 240
aggaggcggg tggaggggtc ggtcgttcgg gttaggtcgt ttttgaatgg tttgggagga 300
cgaattgtta gatttcgagg aagggaggtg ggacggggga gggggattgg aaagcgg 357
<210> 31
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
ttcccttctt ccaagaaagt tcgggtcctg aggagcggag cggcctggaa gcctcgcgcg 60
ctccggaccc cccagtgatg ggagtggggg gtgggtggtg aggggcgagc gcggctttcc 120
tgccccctcc agcgcagacc gaggcggggg cgtctggccg cggagtccgc ggggtgggct 180
cgcgcgggcg gtgggggcgt gaagcggggt gtagggggtg gggtgtggag aaggggtgcc 240
ctggtgcaag tcgaggggga gccaggagtc gtggggacga tcttcgaggg aaggagaggg 300
gcatccgtag aaataaaggc acctgccatg ccaagaaagg tcgtaaatag gagtgag 357
<210> 32
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
tttttttttt ttaagaaagt tcgggttttg aggagcggag cggtttggaa gtttcgcgcg 60
tttcggattt tttagtgatg ggagtggggg gtgggtggtg aggggcgagc gcggtttttt 120
tgtttttttt agcgtagatc gaggcggggg cgtttggtcg cggagttcgc ggggtgggtt 180
cgcgcgggcg gtgggggcgt gaagcggggt gtagggggtg gggtgtggag aaggggtgtt 240
ttggtgtaag tcgaggggga gttaggagtc gtggggacga ttttcgaggg aaggagaggg 300
gtattcgtag aaataaaggt atttgttatg ttaagaaagg tcgtaaatag gagtgag 357
<210> 33
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
cggggtaaaa gctcctggcc agggctgcct ggagctgccc cttccactcc gcccccaggg 60
agctcccggg tcatcctctc atccgggctg ccccgcggcc cccaaggagc cccacccccg 120
ggaccaaatg gcccgcaagg tttggggcag cggcgttgca ggagatgagc tcagcgcaaa 180
gggaaccccg cagcggcgag tgcggctgct ggcctgcgcg ctgtggcccc aacaggctgg 240
cagggcgcgg gcgggtggcg gggttgcggt atgagctttg ctccctgccc tggggtcccg 300
g 301
<210> 34
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
cggggtaaaa gtttttggtt agggttgttt ggagttgttt tttttatttc gtttttaggg 60
agttttcggg ttattttttt attcgggttg tttcgcggtt tttaaggagt tttattttcg 120
ggattaaatg gttcgtaagg tttggggtag cggcgttgta ggagatgagt ttagcgtaaa 180
gggaatttcg tagcggcgag tgcggttgtt ggtttgcgcg ttgtggtttt aataggttgg 240
tagggcgcgg gcgggtggcg gggttgcggt atgagttttg ttttttgttt tggggtttcg 300
g 301

Claims (14)

1.一种用于低起始量碎片化核酸甲基化检测的接头,所述接头与碎片化DNA序列连接,由两条链组成,一条是长链,称作M-ADT-L,一条是部分互补的短链,称作M-ADT-S;所述M-ADT-L和/或所述M-ADT-S序列中进行特定的修饰;所述M-ADT-L包括通用引物结合区、随机序列区、接头互补区;所述的随机序列区由6~12随机碱基组成,所述随机碱基为A、T、G、C四种中任一种。
2.根据权利要求1所述的接头,所述的修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3 Spacer修饰。
3.根据权利要求1所述的接头,所述碎片化DNA来自全血、血清、尿液、汗液、唾液、石蜡组织切片、新鲜组织样本;优选地所述碎片化DNA为循环游离DNA(cfDNA)。
4.权利要求1-3任一项所述的接头,所述M-ADT-L序列为:
5’-GTGAC*TGGAGTTC*AGAC*GTGTGC*TC*TTC*C*GATC*TDDDDDDDDDDY*-3’(SEQ IDNO.1);所述M-ADT-S序列为:
5’-P-DDDDDDDDDDACGTCACGCAGGGGAGAGCCAGGGATGACTAGG-3’(SEQ ID NO.2);其中,接头M-ADT-L链序列中标记‘*’的碱基C都进行5’mC修饰,接头M-ADT-L链和M-ADT-L链需退火形成双链接头。
5.一种以目标序列的甲基化位点为检测点设计的甲基化检测特异性引物序列组,所述特异性引物序列组为单侧特异性引物组,由一条内侧特异性引物和一条外侧特异性引物的嵌套式引物组成;所述内侧特异性引物包括特异性序列结合区和非互补结合区,所述非互补结合区为测序引物结合序列,所述内侧特异性引物离待测CpG位点距离为1~50个碱基;所述外侧特异性引物与目标区域序列互补,所述外侧特异性引物5’端含有生物素修饰;所述外侧特异性引物与所述内侧特异引物存在重叠区,重叠碱基数10~30个碱基。
6.根据权利要求1所述的引物序列组,所述引物组为如下(1)-(5)中任一组或多组:
(1)以cg00017221甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
cg00017221-outmer-U:
5’-Biotin-CACRCRCTACCRCCTAACAAAAAC*-3’(SEQ ID NO.3);
cg00017221-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCTACCRCCTAACAAAAACRCATCTTTAAATC*-3’(SEQ ID NO.4);
cg00017221-outmer-D:
5’-Biotin-CCAATAACCCTCTTCRAACACCTACCAAAT*-3’(SEQ ID NO.5);
cg00017221-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCTACTTCRAACACCTACCAAATTTACAAATCCC*-3’(SEQ ID NO.6);
(2)以BMP3基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
BMP3-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CATGCACCCTCACCCCRACTAATTT*-3’(SEQ ID NO.7);
BMP3-bis-inner–D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCRACTAATTTAAAATTCAACCCTCA*-3’(SEQ ID NO.8);
BMP3-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CRCRTCRACTCCCRACRTCRCTAC*-3’(SEQ ID NO.9);
BMP3-bis-inner–U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCGACRTCRCTACRAAACACTCC*-3’(SEQ ID NO.10);
(3)以TWIST1基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
TWIST1-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CCRCRACCAAAACAATCTCCTCCRA*-3’(SEQ ID NO.11);
TWIST1-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGAACAATCTCCTCCRACCRCTTCCTAA*-3’(SEQ ID NO.12);
TWIST1-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CTTCCTCCRACRAACRCRAAACRAT*-3’(SEQ ID NO.13);
TWIST1-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGACRCRAAACRATTTCCTTCCCC*-3’(SEQ ID NO.14);
(4)以CDH1基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
CDH1-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-ATAATAAAAATAAAAAATAA*-3’(SEQ ID NO.15);
CDH1-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGAAATAAATAATAAAAAAC*-3’(SEQ ID NO.16);
CDH1-bis-Outmer–D:
5’-Biotin-ACRCCCCCACCRCCCRCRCRAAC*-3’(SEQ ID NO.17);
CDH1-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCRCRCRAACCCACCCCRCRAAC*-3’(SEQ ID NO.18);
(5)以NID2基因启动子区域甲基化位点为检测点,设计的甲基化检测特异性引物序列:
NID2-bis-Outmer-U:
5’-Biotin-CCCAAATAAAAAAATAACCCA*-3’(SEQ ID NO.19);
NID2-bis-inner-U:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCRAATCATCCTCTCATCCRAAC*-3’(SEQ ID NO.20);
NID2-bis-Outmer-D:
5’-Biotin-CCRCTACRAAATTCCCTTTACRCT*-3’(SEQ ID NO.21);
NID2-bis-inner-D:
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGCCCTTTACRCTAAACTCATCTCCT*-3’(SEQ ID NO.22);
其中“*”表示硫代修饰。
7.一种基于重盐处理构建cfDNA甲基化高通量测序文库的方法,包括如下步骤:
1)对碎片化核酸进行提取纯化;
2)在步骤1)后直接加入试剂组分包括酶和缓冲液,实现使碎片化核酸末端修饰修复补平和碱基A的添加;
3)在步骤2)后直接加入试剂组分包括接头、酶和缓冲液,实现使步骤1)接头连接接头;
4)在步骤3)后直接加入磁珠进行纯化,无核酶水洗脱;
5)在步骤4)后直接按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(D5005,ZYMO)说明书进行重盐转化,使非甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U),甲基化的胞嘧啶(C)保留为C硫化;
6)在步骤5)后直接配制扩增体系,所述扩增体系包括扩增引物、酶和缓冲液组分,进行预文库的放大;
7)在步骤6)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化,纯化后的产物即为预文库;
8)在步骤7)后直接加入所述扩增体系,进行靶向富集;
9)在步骤8)后直接加入磁珠对靶向富集后的文库进行纯化和捕获;
10)在步骤9)后直接加入所述扩增体系,进行文库放大;
11)在步骤10)后直接加入磁珠对扩增后的文库进行纯化,纯化后的产物即为上机文库。
8.根据权利要求8所述的方法,所述接头为权利要求1-4任一项所述的与碎片化DNA序列连接的接头。
9.根据权利要求8或9所述的方法,所述上机文库适用于包括Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因的高通量测序平台。
10.一种应用选自如下(1)或(2):
(1)权利要求1-4任一项所述的与碎片化DNA序列连接的接头或权利要求5-6任一项所述的特异性引物序列组在制备用于检测基因甲基化的试剂或试剂盒中的应用;
(2)权利要求1-4任一项所述的与碎片化DNA序列连接的接头、权利要求5-6任一项所述的特异性引物序列组或权利要求7-9任一项所述方法制备的文库在检测基因甲基化中的应用。
11.一种低起始量基因甲基化检测的试剂盒,包括权利要求1-4任一项所述的与碎片化DNA序列连接的接头及权利要求5或6所述的特异性引物序列组。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,所述试剂盒还包括扩增体系、磁珠、重盐转化增强剂,所述扩增体系包括扩增引物、酶和缓冲液,所述重盐转化增强剂包括:非人源DNA、非人源RNA或反应稳定剂。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,所述重盐转化增强剂添加于被处理的核酸中和/或添加于重盐转化之后纯化回收之前,所述重盐转化增强剂的使用量是被处理核酸量的0.1~10倍。
14.根据权利要求11-13任一项所述的试剂盒,所述试剂盒检测的样本类型包括:全血、血清、尿液、汗液、唾液、石蜡组织切片或新鲜组织。
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