CN108192955A - 一种低频突变dna片段检测方法及文库建立方法 - Google Patents

一种低频突变dna片段检测方法及文库建立方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108192955A
CN108192955A CN201810045597.XA CN201810045597A CN108192955A CN 108192955 A CN108192955 A CN 108192955A CN 201810045597 A CN201810045597 A CN 201810045597A CN 108192955 A CN108192955 A CN 108192955A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
library
low frequency
primer
capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810045597.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108192955B (zh
Inventor
陆利
秦闯华
徐根明
潘艺
赵谦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Dadi Biological Science And Technology Co Ltd
Original Assignee
Hunan Dadi Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Dadi Biological Science And Technology Co Ltd filed Critical Hunan Dadi Biological Science And Technology Co Ltd
Priority to CN201810045597.XA priority Critical patent/CN108192955B/zh
Publication of CN108192955A publication Critical patent/CN108192955A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108192955B publication Critical patent/CN108192955B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种低频突变DNA片段检测方法及文库建立方法。本发明通过采用杂交捕获和分子标签技术，同时结合特殊的文库构建方式，解决现有检测技术中捕获DNA片段效率低、建库过程中引入错误突变、检测限低，灵敏度低技术问题，提高了文库特异性、降低了假阳性率、提高了模板利用率。

Description

一种低频突变DNA片段检测方法及文库建立方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种低频突变DNA片段检测方法及文库建立方法。
背景技术
基因突变具有普遍性、随机性、低频性和不定向性的特点。以第二代测序技术(Next Generation Sequencing)为手段检测体细胞突变在肿瘤研究和肿瘤诊断中起到重要作用。在肿瘤样本和循环肿瘤核酸中，由于突变细胞只占很小部分，并且DNA严重碎片化，如果高效且准确利用这些DNA对早期肿瘤的诊断、监测、靶向干预具有重大指导意义。
传统检测碎片化方法主要是通过对待测区域进行PCR扩增富集。因设计的PCR引物分布于待测区域两侧，因此要求待测区域保持完整性。而待测区域碎片化是随机的，保持完整性的很少。因此模板可用量有限，严重影响检测限。
目前用于低频突变DNA样本检测方法有：1)直接PCR法(扩增子法)，该方法虽然操作比较简单，但是模板利用率低，以及假阳性率太高；2)杂交捕获法，该方法可以提高模板利用率，但是特异性不强，数据浪费严重；3)基于分子标签的建库方法，可以降低假阳性率，但模板利用率不高。如以贝瑞和康的cSMART为代表的分子标签建库方法相对于普通PCR扩增法，模板利用率提高，分子标签可以错误纠正，降低假阳性。大致步骤如下：1)DNA末端补平；2)3’末端加碱基dA；3)分子标签接头连接；4)文库预扩增；5)分子环化；6)背靠背引物开环；7)通用引物扩增。该流程操作较长，开环需要1对(2条)引物同时反应，模板利用率还有待提高。
发明内容
针对现技术存在的问题，本发明提供一种低频突变DNA片段检测方法及文库建立方法，目的是通过采用杂交捕获和分子标签技术，同时结合特殊的文库构建方式，解决现有检测技术中捕获DNA片段效率低、建库过程中引入错误突变、检测限低，灵敏度低技术问题，提高特异性、降低假阳性率、提高模板利用率。
实现本发明目的的低频突变DNA片段检测方法按照以下步骤进行：
(1)根据碎片化DNA样本的待检位点或待检区域设计引物，所述的引物包括一条特异性引物和二条通用性引物；
(2)采用包含特异性引物的杂交反应液对碎片化DNA进行特异性捕获，得到捕获的特异性DNA片段；
(3)采用延伸反应液对捕获的特异性DNA片段进行延伸，得到特异性延伸产物；
(4)采用连接反应液对特异性延伸产物连接分子标签接头，得到连接接头特异性捕获产物；
(5)对连接接头特异性捕获产物进行PCR富集，得到特异性PCR富集产物；
(6)对特异性PCR富集产物检测。
其中，所述的碎片化DNA样本包括血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋(FFPE)DNA、刑侦样本DNA。
所述的碎片化DNA的待检位点或待检区域包括点突变、缺失插入、基因融合和基因扩增区，特异性引物的设计位点或区域为待检位点或待检区域的上游或下游。
所述的特异性引物由三部分组成；第一部分为与目标序列特异性互补序列，命名为靶向序列，靶向序列长度为20～100碱基对，退火温度(Tm)为50～80℃；第二部分由随机核苷酸组成，命名为分子标签序列，分子标签序列由8～20个随机核苷酸组成；第三部分为测序引物序列。
所述的包含特异性引物的杂交反应液包括：25～250mM Tris-HCl、2～20mMMgCl2、0.5～4mM ATP、1～100mM DTT、质量/体积比0.05～1％Tween 20、0.1～100μM特异性引物、5～20％杂交增强剂，其中的百分比以无菌水体积为计算基准。
进一步地，所述的杂交增强剂为核酸变性剂或表面活性剂。
进一步地，所述的杂交增强剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甲醛、尿素、甜菜碱或十二烷基硫酸钠(SDS)。
所述的延伸反应液包括：1～100mM dNTP和5～100U DNA聚合酶。
进一步地，DNA 聚合酶为野生型DNA聚合酶，无3’-5’外切酶活性。
进一步地，DNA聚合酶包括：rTaq DNA Polymerase、2G Robust DNA Polymerase、Glod360DNA Polymerase、、Bst DNA Polymerase,Full Length、Crimson Taq DNAPolymerase、PlatinumTM Taq Green Hot Start DNA Polymerase、DreamTaq DNAPolymerase。
所述的连接反应液包括：10～250mM Tris-HCl、2～20mM MgCl2、1～4mM ATP、1～200Mm DTT、质量/体积比0.05～1％Tween 20、质量/体积比5～50％PEG6000、DNA连接酶，0.1～50μM带有分子标签的接头，其中的百分比以无菌水体积为计算基准。
进一步地，DNA连接酶包括：T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶和E·coli DNA连接酶。
所述的分子标签接头为完全或部分互补的双链，包括分子标签序列和测序引物序列，其中分子标签序列由8～20个随机核苷酸组成。
针对DNA含量极低如5ng的DNA样本，在对所述碎片化DNA进行特异性捕获之前，需先连接分子标签接头，再进行预扩增的步骤。
本发明的低频突变DNA片段的文库建立方法按照以下步骤进行：
(1)使用杂交反应液，杂交捕获目标碎片化DNA，获得目标碎片化DNA；
(2)在步骤(1)后直接加入延伸反应液，对捕获碎片化DNA进行延伸，合成双链；
(3)在步骤(2)后直接加入连接反应液，对捕获碎片化DNA双链连上接头，获得预文库；
(4)在步骤(3)后，对预文库进行纯化，以除去未用完的连接接头；
(5)在步骤(4)后，对预文库进行扩增富集，获得完整的文库；
(6)在步骤(5)后，对扩增产物进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
其中，所述的杂交反应液包括：25～250mM Tris-HCl、2～20mM MgCl2、0.5～4mMATP、1～100mM DTT、质量/体积比0.05～1％Tween 20、0.1～100μM特异性引物、5～20％杂交增强剂，其中的百分比以无菌水体积为计算基准。
进一步地，所述的杂交增强剂为核酸变性剂或表面活性剂。
进一步地，所述的杂交增强剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甲醛、尿素、甜菜碱或十二烷基硫酸钠(SDS)。
所述的延伸反应液包括：1～100mM dNTP和5～100U DNA聚合酶。
进一步地，DNA聚合酶为野生型DNA聚合酶，无3’-5’外切酶活性。
进一步地，DNA聚合酶包括：rTaq DNA Polymerase、2G Robust DNA Polymerase、Glod360DNA Polymerase、、Bst DNA Polymerase,Full Length、Crimson Taq DNAPolymerase、PlatinumTM Taq Green Hot Start DNA Polymerase、DreamTaq DNAPolymerase。
所述的连接反应液包括：10～250mM Tris-HCl、2～20mM MgCl2、1～4mM ATP、1～200Mm DTT、质量/体积比0.05～1％Tween 20、质量/体积比5～50％PEG6000、DNA连接酶，0.1～50μM接头，其中的百分比以无菌水体积为计算基准。
进一步地，DNA连接酶包括：T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶和E·coli DNA连接酶。
所述的接头为完全或部分互补的双链，包括分子标签序列和测序引物序列，其中分子标签序列由8～20个随机核苷酸组成。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
本发明中DNA突变点检测原理图如图3所示，首次采用特异性单引物对待检区域进行富集，扩大了引物的适用范围、增加有效模板使用量，特别是大大提高检测低频突变样本的检测限。
本发明特异性单引物捕获，可以提高捕获有效模板量，保证文库有足够的测序深度。
本发明中的特异性单引物由靶向序列、分子标签条序列、测序引物序列组成，不仅可以提高单引物的特异性，还降低PCR扩增固有的突变概率，提高检测的灵敏度。
本发明设计的特异性引物，能有效地从含有大量野生型DNA片段中捕获稀少的突变DNA片段。
本发明利用所有捕获碎片化DNA做模板，远高于传统方法；同时采用杂交延伸方法代替PCR方法对目标片段进行富集，减少PCR引入错误，提高检测的灵敏性。
本发明设计的特异性引物，能应用于数据分析中，以便从扩增测序错误中区分真实突变以保证高准确性。
本发明中特异性单引物由靶向序列、分子标签序列和测序引物序列组成，既提高了单引物的特异性，又可提高数据分析质量，提高低频突变检测结果的准确性。
此外，本发明的低频突变DNA片段文库构建方法，步骤简单、大大节省了实验时间，提高建库效率
本发明提供的建库方法，可以可以用于Roche、Illumina、ThermoFisher、PacificBiosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因等不同的高通量测序平台，适用性广，易于推广。
附图说明
图1是本发明中低频突变DNA片段文库构建流程图；
图2是本发明特异性引物设计原理图；
其中：a为传统引物，粗实线为可用模板数；b为本发明设计引物，可利用的模板为粗实线和细实线的碎片化DNA；代表待检测突变位点；代表本发明中特异性引物；→代表传统PCR引物；A为设计特异性引物分布于待检测区域上游；B为设计特异性引物分布于待检测区域下游；
图3是本发明DNA突变点检测原理图；
其中：b为特异性单引物，既可设计于待测区域左侧，又可设计于待测区域右侧；为待测的点突变、插入、缺失以及基因融合；P5、P7为通用引物；
图4是本发明实施例1中2％琼脂糖凝胶电泳检测文库结果图；
图5是本发明实施例2中2％琼脂糖凝胶电泳检测文库结果图；
其中：S0：突变频率0％的EGFR cfDNA标准品文库；
S1：突变频率0.1％的EGFR cfDNA标准品文库；
S2：突变频率1％的EGFR cfDNA标准品文库；
S3：突变频率5％的EGFR cfDNA标准品文库。
具体实施方式
具体实施方式中以Illumina平台为例，结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
本实施例中目标检测基因为EGFR基因18号外显子，其文库构建流程如图1所示，按照以下步骤进行：
(1)首先对EGFR基因18号外显子进行靶向测序，按照图2的原理，针对EGFR的18号外显子设计特异性引物，本实施例的引物可利用的模板数远高于传统方法，增加捕获有效模板数、提高低频突变样本检测灵敏度。
EGFR 18号外显子序列如下：
CTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAG
其中下划线碱基为突变位点；
EGFR 18号外显子及其上下游内含子序列如下：
CAGTTAATAGGCGTGGAAACAGACATAGAAATTGTGTTTGTTGAAAGGTAGCTGTTCAGTTAAAGAACACCTGTATCAGAGCCTGTGTTTCTACCAACTTCTGTCAAGCTCTGTAGAGAAGGCGTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGCCCATGCCGTGGCTGCTGGTCCCCCTGCTGGGCCATGTCTGGCACTGCTTTCCAGCATGGTGAGGGCTGAGGTGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGTGTTTGGGAAACTCCAGTGTTTTTCCCAAGTTATTGAGAGGAAATCTTTTATAACCACAGTAATCAGTGGTCCTGTGAGACCAATTCACAGACCAAAGGCATTTTTATGAAAGGGGCCATT
特异性上游引物：
5’-AGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNNNNNAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGC-3’
特异性下游引物：
AGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNNNNNGACCTTACCTTATACACCGTGCCGAACGCA
通用引物序列如下：
P 5端引物：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG3’
P7端引物：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index-GTGACTGGAGTTC
(2)采用包含特异性引物的杂交反应液对碎片化DNA进行特异性捕获，得到捕获的特异性DNA片段；本实施例中碎片化DNA来自正常人血浆，取2ml正常人血浆，按照MagMAXTMCell Free DNA Isolation Kit(ThermoFisher Cat.A29319)说明书操作提取游离DNA：
(a)样本裂解；
(b)磁珠结合；
(c)磁珠洗涤；
(d)洗脱，获得游离DNA；
按照下表配制捕获反应体系：
组分 用量
杂交反应液 5μL
游离DNA 41.5μL
特异性引物 1μL
涡旋震荡混匀，瞬时离心，置于热循环仪上按照下列程序执行杂交捕获：
94℃3min；
92℃2min；以2℃、2min为梯度依次递减，重复2次；
60℃2min；
60℃overnight；
(3)将反应管保持在60℃，加入延伸反应液，轻弹混匀，瞬时离心，72℃孵育30～60min；
(4)将反应管从热循环仪上取下置于室温冷却，加入连接反应液，涡旋混匀，瞬时离心，置于热循环仪上按照下列程序进行孵育：
20℃15min；
65℃10min；
其中连接接头设计如下：
Top-Adapter：
5’-CCTAGTCATCCCTGGCTCTCCGATCTNNNNNNNNT-3’
Bottom-Adapter：
5’P-NNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
以上序列需退火成双链；
将反应管从热循环仪上取下，加入30μL Ampure XP beads进行纯化，26μLElution Buffer洗脱；
(5)对连接接头特异性捕获产物进行PCR富集，得到特异性PCR富集产物；
按照下表配制PCR反应体系：
组份 用量
2x KAPA HiFi Hostart buffer 25μL
P5端引物 1μL
P7端引物 1μL
纯化产物 23μL
按照下表，执行PCR扩增程序：
使用60μL Ampure XP beads进行纯化，30μL Elution Buffer洗脱；
(6)对特异性PCR富集产物检测：
取其中5μL纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳分析结果如图4所示(M:100bp DNA ladder,宝生物工程(大连)有限公司)，文库主带清楚且主要分布在300bp左右，条带亮度明亮，与预期结果一致。
qPCR质检：
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作，使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测，参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量。
qPCR检测结果如下：
样品 1
qPCR浓度(nM) 89.04
建库文库达到上机要求浓度，可用于上机测试。
上机测序：
按照MiSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及150bp双端测序。
将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，用于评估文库的特异性，分析结果见下表。
实施例2：
本发明实施例2是对检测方法的检测限进行测试，按照以下步骤进行：
(1)低频突变标准品准备：
使用cfDNA标准品(Horizon Discovery,HD780)进行EGFR基因21外显子L858R位点检测，突变频率分别为0％、0.1％、1％、5％，分别命名为：S0、S1、S2、S3。
(2)文库构建：
S0、S1、S2、S3分别按照实施例1中杂交捕获方法进行捕获，后续步骤按照实施例1中步骤进行文库构建。
(3)qPCR质检及上机测序：
按照实施例1中方法对文库进行qPCR质控和上机测序。
实验结果：
1)文库电泳检测分析结果：
根据电泳分析结果如图5(M:100bp DNA ladder，宝生物工程(大连)有限公司)所示，文库主带清楚且主要分布在200bp左右，条带亮度明亮，与预期结果一致。
qPCR文库定量分析结果：
qPCR检测结果如下：
文库名称 S0 S1 S2 S3
qPCR浓度(nM) 108 110 112 117
建库文库达到上机要求浓度，可用于上机测试。
2)测序数据分析结果：
文库名称 S0 S1 S2 S3
理论突变频率(％) 0 0.10 1.0 5.0
测定突变频率(％) 0 0.095 0.97 4.87
偏差(％) 0 5.0 3.0 2.6
测定数据与理论数据偏差在5％以内，符合检测允许偏差范围；且可以检测突变频率为0.1％以上的样本，方法灵敏度高。

Claims (10)

1.一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)根据碎片化DNA样本的待检位点或待检区域设计引物，所述的引物包括一条特异性引物和二条通用性引物；
(2)采用包含特异性引物的杂交反应液对碎片化DNA进行特异性捕获，得到捕获的特异性DNA片段；
(3)采用延伸反应液对捕获的特异性DNA片段进行延伸，得到特异性延伸产物；
(4)采用连接反应液对特异性延伸产物连接分子标签接头，得到连接接头特异性捕获产物；
(5)对连接接头特异性捕获产物进行PCR富集，得到特异性PCR富集产物；
(6)对特异性PCR富集产物检测。
2.根据权利要求1所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于所述的碎片化DNA样本包括血浆DNA、尿液DNA、汗液DNA、唾液DNA、精液DNA、胸水DNA、腹水DNA、粪便DNA、化石DNA、石蜡包埋(FFPE)DNA、刑侦样本DNA。
3.根据权利要求1所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于所述的碎片化DNA的待检位点或待检区域包括点突变、缺失插入、基因融合和基因扩增区，特异性引物的设计位点或区域为待检位点或待检区域的上游或下游。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于所述的特异性引物由三部分组成；第一部分为与目标序列特异性互补序列，命名为靶向序列，靶向序列长度为20～100碱基对，退火温度(Tm)为50～80℃；第二部分由随机核苷酸组成，命名为分子标签序列，分子标签序列由8～20个随机核苷酸组成；第三部分为测序引物序列。
5.根据权利要求1、权利要求3或权利要求4所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于所述的包含特异性引物的杂交反应液包括：25～250mM Tris-HCl、2～20mMMgCl2、0.5～4mM ATP、1～100mM DTT、质量/体积比0.05～1％Tween 20、0.1～100μM特异性引物、5～20％杂交增强剂，其中的百分比以无菌水体积为计算基准。
6.根据权利要求1所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于所述的延伸反应液包括：1～100mM dNTP和5～100U DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于所述的连接反应液包括：10～250mM Tris-HCl、2～20mM MgCl2、1～4mM ATP、1～200Mm DTT、质量/体积比0.05～1％Tween 20、质量/体积比5～50％PEG6000、DNA连接酶，0.1～50μM带有分子标签的接头，其中的百分比以无菌水体积为计算基准。
8.根据权利要求1所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于所述的分子标签接头为完全或部分互补的双链，包括分子标签序列和测序引物序列，其中分子标签序列由8～20个随机核苷酸组成。
9.根据权利要求1所述的一种低频突变DNA片段检测方法，其特征在于针对含量极低的DNA样本，在对所述碎片化DNA进行特异性捕获之前，需先连接分子标签接头，再进行预扩增的步骤。
10.如权利要求1所述的一种低频突变DNA片段的文库建立方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)使用杂交反应液，杂交捕获目标碎片化DNA，获得目标碎片化DNA；
(2)在步骤(1)后直接加入延伸反应液，对捕获碎片化DNA进行延伸，合成双链；
(3)在步骤(2)后直接加入连接反应液，对捕获碎片化DNA双链连上接头，获得预文库；
(4)在步骤(3)后，对预文库进行纯化，以除去未用完的连接接头；
(5)在步骤(4)后，对预文库进行扩增富集，获得完整的文库；
(6)在步骤(5)后，对扩增产物进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
CN201810045597.XA 2018-01-17 2018-01-17 一种低频突变dna片段检测方法及文库建立方法 Active CN108192955B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810045597.XA CN108192955B (zh) 2018-01-17 2018-01-17 一种低频突变dna片段检测方法及文库建立方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810045597.XA CN108192955B (zh) 2018-01-17 2018-01-17 一种低频突变dna片段检测方法及文库建立方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108192955A true CN108192955A (zh) 2018-06-22
CN108192955B CN108192955B (zh) 2021-11-02

Family

ID=62590042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810045597.XA Active CN108192955B (zh) 2018-01-17 2018-01-17 一种低频突变dna片段检测方法及文库建立方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108192955B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110240999A (zh) * 2018-03-09 2019-09-17 林云富 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法
CN110452958A (zh) * 2019-08-12 2019-11-15 湖南大地同年生物科技有限公司 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用
CN110656156A (zh) * 2019-10-14 2020-01-07 湖南大地同年生物科技有限公司 一种超低频突变核酸片段检测方法、文库构建方法、引物设计方法和试剂
CN110669823A (zh) * 2018-07-03 2020-01-10 中国医学科学院肿瘤医院 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
CN113774496A (zh) * 2021-10-11 2021-12-10 湖南大地同年生物科技有限公司 一种液相捕获文库构建方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132056A1 (en) * 2001-07-20 2004-07-08 Affymetrix, Inc. Method of target enrichment and amplification
CN105392897A (zh) * 2013-03-19 2016-03-09 定向基因组学公司 靶序列的富集
WO2017021449A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Target enrichment by single probe primer extension
CN107002080A (zh) * 2014-12-18 2017-08-01 深圳华大基因研究院 一种基于多重pcr的目标区域富集方法和试剂
WO2017210469A2 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 F. Hoffman-La Roche Ag Immuno-pete

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132056A1 (en) * 2001-07-20 2004-07-08 Affymetrix, Inc. Method of target enrichment and amplification
CN105392897A (zh) * 2013-03-19 2016-03-09 定向基因组学公司 靶序列的富集
CN107002080A (zh) * 2014-12-18 2017-08-01 深圳华大基因研究院 一种基于多重pcr的目标区域富集方法和试剂
WO2017021449A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Target enrichment by single probe primer extension
WO2017210469A2 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 F. Hoffman-La Roche Ag Immuno-pete

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110240999A (zh) * 2018-03-09 2019-09-17 林云富 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法
CN110240999B (zh) * 2018-03-09 2022-09-06 浙江品级基因科技有限公司 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法
CN110669823A (zh) * 2018-07-03 2020-01-10 中国医学科学院肿瘤医院 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
CN110669823B (zh) * 2018-07-03 2022-05-24 中国医学科学院肿瘤医院 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
CN110452958A (zh) * 2019-08-12 2019-11-15 湖南大地同年生物科技有限公司 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用
CN110452958B (zh) * 2019-08-12 2023-08-25 湖南大地同年生物科技有限公司 一种微量碎片化核酸甲基化检测的接头、引物、试剂盒及其应用
CN110656156A (zh) * 2019-10-14 2020-01-07 湖南大地同年生物科技有限公司 一种超低频突变核酸片段检测方法、文库构建方法、引物设计方法和试剂
CN113774496A (zh) * 2021-10-11 2021-12-10 湖南大地同年生物科技有限公司 一种液相捕获文库构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108192955B (zh) 2021-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220090184A1 (en) Size-Selection of Cell-Free DNA for Increasing Family Size During Next-Generation Sequencing
CN108192955A (zh) 一种低频突变dna片段检测方法及文库建立方法
JP7189401B2 (ja) インサイチュ増幅により無細胞核酸分子を調製する方法
CN105861678B (zh) 一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法
WO2020140693A1 (zh) 基因目标区域富集方法及试剂盒
WO2018184495A1 (zh) 一步法构建扩增子文库的方法
CN107739754A (zh) 片断dna检测方法、片断dna检测试剂盒及其应用
WO2018186930A1 (en) Method and kit for constructing nucleic acid library
WO2023035889A1 (zh) 基因融合的检测方法和装置
CN107893109A (zh) 一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法
CN107022619A (zh) Kras基因突变检测引物探针及其试剂盒
CN110468211B (zh) 膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法
US20230374574A1 (en) Compositions and methods for highly sensitive detection of target sequences in multiplex reactions
CN104790042A (zh) 高通量测序文库及其构建方法
CN116497087A (zh) 选择性扩增目标序列的方法及其应用
Loewe Combinational usage of next generation sequencing and qPCR for the analysis of tumor samples
US20230112730A1 (en) Compositions and methods for oncology precision assays
CN110603334A (zh) Pcr引物对及其应用
Nikiforova et al. Amplification-based methods
CN106636442A (zh) 一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒
JP2022544779A (ja) ポリヌクレオチド分子の集団を生成するための方法
CN117343929B (zh) 一种pcr随机引物及用其加强靶向富集的方法
CN108070637A (zh) 一种基于自环放大原理的循环dna预扩增方法
CN109929930A (zh) 用于人pik3ca基因突变检测的试剂盒及临床应用
CN116814740A (zh) 检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant