CN116814740A - 检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，涉及文库构建技术领域。包括以下步骤：从待测样本中提取DNA、用SEQ ID NO.1～37所示的核苷酸序列为引物、使用建库试剂中的通用引物和接头、从待测样本中提取纯化RNA、通过逆转录生成相应的cDNA，纯化cDNA、用SEQ IDNO.38～64所示的核苷酸序列为引物、使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增以及对测序文库进行质检。该检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，可以同时检测27个融合变异，这些基因突变及融合变异都与甲状腺癌分子分型有关，因此其检测结果可以用来辅助临床医生为甲状腺癌患者进行分子分型，还可以指导患者靶向用药及预后评估。
Description
技术领域
本发明涉及文库构建技术领域，具体为一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法。
背景技术
甲状腺癌(thyroid carcinoma)是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，是头颈部最为常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1％，包括乳头状癌(PTC)、滤泡状癌(FTC)、未分化癌(ATC)和髓样癌(MTC)四种病理类型，其中DTC生物行为温和，预后较好，PTC最为常见。ATC的恶性程度极高，中位生存时间仅7～10个月。MTC的预后居于两者之间。各种类型的甲状腺癌恶性程度不同，治疗方式和预后大相径庭。
研究发现，基因变异是甲状腺癌发生的基本驱动因素，甲状腺癌的发生常与MAPK、PI3K/AKT信号通路相关。MAPK/ERK信号通路的主要参与分子包括Ras、Raf、MEK和ERK等，PI3K/AKT信号通路参与分子包括PTEN、PI3K、AKT和mTOR等，目前已经发现该通路中的多种激酶抑制剂能够抑制肿瘤细胞。因此，基于分子标记物的基因检测结果不仅可以辅助甲状腺癌分子分型，还能在甲状腺癌治疗和预后方面提供指导。
通过对甲状腺癌相关的28个基因突变和27个基因融合变异进行检测，可以用来辅助临床医生为甲状腺癌患者进行精准的分子分型，还可以指导患者靶向用药及预后评估，无疑具有非常重要的临床应用价值；鉴于此，我们提出了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，解决了上述背景技术提到的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，所述文库构建方法包括以下步骤：
S1、从待测样本中提取DNA，对提取的DNA进行浓度和纯度检测；
S2、以步骤S1提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.1～37所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；
S3、以步骤S2所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到DNA测序文库；
S4、从待测样本中提取纯化RNA，对提取的RNA进行浓度和纯度检测；
S5、以步骤S4提取的RNA为模板，通过逆转录生成相应的cDNA，纯化cDNA；
S6、以步骤S5所述cDNA为模板，用SEQ ID NO.38～64所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；
S7、以步骤S6所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到cDNA测序文库；
S8、对步骤S3和步骤S7所述测序文库进行质检。
可选的，所述核苷酸序列SEQ ID NO.1～37所示的DNA特异性引物混合池浓度为2μM。
可选的，所述核苷酸序列SEQ ID NO.38～64所示的RNA特异性引物混合池浓度为6μM。
可选的，所述扩增产物纯化使用的磁珠为KAPA Pure磁珠。
一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，所述引物组合包括DNAPCR引物和RNA PCR引物。
可选的，所述DNA PCR引物包括AKT1基因突变检测引物对、ALK基因突变检测引物对、APC基因突变检测引物对、ATM基因突变检测引物对、BRAF基因突变检测引物对、CDKN2A基因突变检测引物对、CTNNB1基因突变检测引物对、DICER1基因突变检测引物对、EIF1AX基因突变检测引物对、EZH1基因突变检测引物对、GNAS基因突变检测引物对、HRAS基因突变检测引物对、IDH1基因突变检测引物对、KMT2C基因突变检测引物对、KRAS基因突变检测引物对、MEN1基因突变检测引物对、NRAS基因突变检测引物对、PIK3CA基因突变检测引物对、PTEN基因突变检测引物对、RET基因突变检测引物对、SPOP基因突变检测引物对、STK11基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对、TP53基因突变检测引物对、TSC2基因突变检测引物对、TSHR基因突变检测引物对、ZFHX3基因突变检测引物对、ZNF148基因突变检测引物对。
可选的，所述RNA PCR引物包括EML4-ALK融合检测引物对、STRN-ALK融合检测引物对、TFG-ALK融合检测引物对、CCDC6-RET融合检测引物对、NCOA4-RET融合检测引物对、PRKAR1A-RET融合检测引物对、TRIM33-RET融合检测引物对、ERC1-RET融合检测引物对、KTN1-RET融合检测引物对、PCM1-RET融合检测引物对、GOLGA5-RET融合检测引物对、TRIM24-RET融合检测引物对、HOOK3-RET融合检测引物对、FGFR3-BAIAP2L1融合检测引物对、FGFR3-TACC3融合检测引物对、FGFR2-BICC1融合检测引物对、FGFR2-CASP7融合检测引物对、TPM3-NTRK1融合检测引物对、IRF2BP2-NTRK1融合检测引物对、SQSTM1-NTRK1融合检测引物对、TPR-NTRK1融合检测引物对、ETV6-NTRK3融合检测引物对、EML4-NTRK3融合检测引物对、RBPMS-NTRK3融合检测引物对、SQSTM1-NTRK3融合检测引物对、AKAP9-BRAF融合检测引物对、PAX8-PPARγ融合检测引物对。
一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，包括用于检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的引物、逆转录试剂、建库试剂、阳性DNA质控品、阳性RNA融合质控品、阴性RNA融合质控品、无核酸酶水。
可选的，所述逆转录试剂包括：有RNA逆转录酶、5×缓冲液、0.1M DTT、dNTPs、RNA酶抑制剂、随机引物。
可选的，所述建库试剂含有DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs、通用引物、接头。
本发明提供了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法。具备以下有益效果：
(1)、该检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，可以同时检测27个融合变异，这些基因突变及融合变异都与甲状腺癌分子分型有关，因此其检测结果可以用来辅助临床医生为甲状腺癌患者进行分子分型，还可以指导患者靶向用药及预后评估。
(2)、该检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，引物组合、试剂盒及建库方法具有检测灵敏度高、特异性好、重复性好的特点。
附图说明
图1为本发明文库构建的原理图；
图2为本发明文库构建的流程图；
图3为本发明构建的DNA文库片段分布图；
图4为本发明构建的cDNA文库片段分布图；
图5为本发明10个不同的临床样本构建文库的BRAF基因T1799A位点测序深度图；
图6为本发明同一实验人员对同一临床样本构建5次文库的BRAF基因T1799A位点测序深度；
图7为本发明不同实验人员对同一临床样本构建5次文库的BRAF基因T1799A位点测序深度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
请参阅图1-图7，本发明提供一种技术方案：一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，包括以下步骤：
S1、从待测样本中提取DNA，对提取的DNA进行浓度和纯度检测，使用NanoDrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果；
S2、以步骤S1提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.1～37所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；
S3、以步骤S2扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到DNA测序文库；
S4、从待测样本中提取纯化RNA，对提取的RNA进行浓度和纯度检测；
S5、以步骤S4提取的RNA为模板，通过逆转录生成相应的cDNA，纯化cDNA；
S6、以步骤S5cDNA为模板，用SEQ ID NO.38～64所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；
S7、以步骤S6扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到cDNA测序文库；
S8、对步骤S3和步骤S7测序文库进行质检；
核苷酸序列SEQ ID NO.1～37所示的DNA特异性引物混合池浓度为2μM。核苷酸序列SEQ ID NO.38～64所示的RNA特异性引物混合池浓度为6μM。扩增产物纯化使用的磁珠为KAPA Pure磁珠。
本发明提供一种技术方案：一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，引物组合包括DNA PCR引物和RNA PCR引物；
DNA PCR引物包括AKT1基因突变检测引物对、ALK基因突变检测引物对、APC基因突变检测引物对、ATM基因突变检测引物对、BRAF基因突变检测引物对、CDKN2A基因突变检测引物对、CTNNB1基因突变检测引物对、DICER1基因突变检测引物对、EIF1AX基因突变检测引物对、EZH1基因突变检测引物对、GNAS基因突变检测引物对、HRAS基因突变检测引物对、IDH1基因突变检测引物对、KMT2C基因突变检测引物对、KRAS基因突变检测引物对、MEN1基因突变检测引物对、NRAS基因突变检测引物对、PIK3CA基因突变检测引物对、PTEN基因突变检测引物对、RET基因突变检测引物对、SPOP基因突变检测引物对、STK11基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对、TP53基因突变检测引物对、TSC2基因突变检测引物对、TSHR基因突变检测引物对、ZFHX3基因突变检测引物对、ZNF148基因突变检测引物对；
RNA PCR引物包括EML4-ALK融合检测引物对、STRN-ALK融合检测引物对、TFG-ALK融合检测引物对、CCDC6-RET融合检测引物对、NCOA4-RET融合检测引物对、PRKAR1A-RET融合检测引物对、TRIM33-RET融合检测引物对、ERC1-RET融合检测引物对、KTN1-RET融合检测引物对、PCM1-RET融合检测引物对、GOLGA5-RET融合检测引物对、TRIM24-RET融合检测引物对、HOOK3-RET融合检测引物对、FGFR3-BAIAP2L1融合检测引物对、FGFR3-TACC3融合检测引物对、FGFR2-BICC1融合检测引物对、FGFR2-CASP7融合检测引物对、TPM3-NTRK1融合检测引物对、IRF2BP2-NTRK1融合检测引物对、SQSTM1-NTRK1融合检测引物对、TPR-NTRK1融合检测引物对、ETV6-NTRK3融合检测引物对、EML4-NTRK3融合检测引物对、RBPMS-NTRK3融合检测引物对、SQSTM1-NTRK3融合检测引物对、AKAP9-BRAF融合检测引物对、PAX8-PPARγ融合检测引物对。
基因突变位点如下表所示：
27个融合基因变异数据如下表所示：
PCR引物序列数据如下表所示：
本发明提供了一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，包括上述所有用于检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的引物、逆转录试剂、建库试剂、阳性DNA质控品、阳性RNA融合质控品、阴性RNA融合质控品、无核酸酶水。
逆转录试剂包括：有RNA逆转录酶、5×缓冲液、0.1M DTT、dNTPs、RNA酶抑制剂、随机引物，可以选择市售SuperScript III Reverse Transcriptase(Thermo Fisher)和RNaseOUTTMRecombinant Ribonuclease Inhibitor(Thermo Fisher)。
建库试剂含有DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs、通用引物、接头，可以选择市售二代测序快速DNA建库试剂盒。
阳性DNA质控品为正常人基因组DNA。阳性RNA融合质控品为人RET/CCDC6融合RNA。阴性RNA融合质控品为人非融合RNA。试剂盒的存储温度为-20℃。所用的甲状腺癌实体组织样本可以是新鲜的手术组织和/或穿刺组织、冷冻的手术组织和/或穿刺组织、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样本中的一种或多种。检测样本为新鲜手术组织和/或穿刺组织。
实施例2：
一种基于高通量测序技术检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法。
本实施例的检测方法包括以下步骤：
1、样本DNA和RNA提取：参照说明书，使用HiPure FFPE DNA Kit(针对FFPE组织)和Universal Genomic DNA Kit(针对新鲜组织)/RNApure FFPE Kit试剂盒分别提取DNA和RNA，使用NanoDrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果，使用无核酸酶水将核酸样本稀释至10-50ng/μL作为扩增建库的核酸起始浓度。
2、DNA文库构建：
2a、DNA靶区域扩增：
按照下列反应体系和扩增条件进行第一轮PCR扩增：
| 组分 | 加入量 |
| GS PCR MMX | 12.5μL |
| P-CGT-01oligo pool | 6.5μL |
| DNA(20-100ng) | 6μL |
| 总体积 | 25μL |
DNA多重PCR扩增程序设置：
2b、第一轮PCR产物纯化：
在上一步反应产物中加入20μL的超纯水；
加入60μL的KAPA Pure Beads，室温孵育5min；
放置于磁力架上，弃上清；
200μL 80％乙醇清洗2次；
晾干后25μL超纯水洗脱，进行第二轮PCR扩增。
2c、DNA第二轮PCR扩增：
按照下列反应体系和扩增条件进行第二轮PCR扩增：
| 组分 | 加入量 |
| Indexing PCR MMX | 25μL |
| 超纯水 | 17μL |
| UDI | 2μL |
| 上一步纯化产物 | 6μL |
| 总体积 | 50μL |
不同的样本文库使用不同的接头编号引物。
DNA多重PCR扩增程序设置：
2d、DNA第二轮PCR产物纯化：
上一步反应产物中加入50μL的KAPA Pure Beads，室温孵育5min；
放置于磁力架上，弃上清；
200μL 80％乙醇清洗2次,晾干后25μL超纯水洗脱。
3、cDNA文库构建：
3a、逆转录制备cDNA：
按照下面反应体系和扩增条件进行RNA逆转录：
| 组分 | 加入量 |
| 逆转录酶 | 1μL |
| 5X RT Buffer | 4μL |
| dNTP(10mM) | 1μL |
| Random Primer(100pmol) | 2μL |
| DTT(100mM) | 2μL |
| RNA(20ng-200ng) | 10μL |
| 总体积 | 20μL |
扩增程序设置：
将获得的cDNA作为扩增反应模板备用。
3b、cDNA靶区域扩增：
按照下列反应体系和扩增条件进行PCR扩增：
| 组分 | 加入量 |
| GS PCR MMX | 25μL |
| P-CGT-06Oligo Pool | 5μL |
| 逆转录产物 | 20μL |
| 总体积 | 50μL |
多重PCR扩增程序设置：
3c、酶解消化：
按照下列反应体系进行酶解消化：
| 组分 | 加入量 |
| Exonclease I | 3μL |
| 超纯水 | 2μL |
| 扩增产物 | 50μL |
| 总体积 | 55μL |
消化程序设置：
3d、cDNA第一轮PCR产物纯化：
上一步反应产物中加入66μL的KAPA Pure Beads，室温孵育5min；
放置于磁力架上，弃上清；
200μL 80％乙醇清洗2次；
晾干后25μL超纯水洗脱。
3e、cDNA第二轮PCR扩增：
按照下列反应体系和扩增条件进行第二轮PCR扩增：
| 组分 | 加入量 |
| Indexing PCR MMX | 25μL |
| 超纯水 | 11μL |
| P7+P5 Index Mix | 2μL |
| 上一步纯化产物 | 12μL |
| 总体积 | 50μL |
不同的样本文库需使用不同的接头编号引物。
cDNA多重PCR扩增程序设置：
3f、cDNA第二轮PCR产物回收：
上一步反应产物中加入50μL的KAPA Pure Beads，室温孵育5min；
放置于磁力架上，弃上清；
200μL 80％乙醇清洗2次；
晾干后25μL超纯水洗脱。
实施例3：
如图6所示，一种基于高通量测序技术检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法的重复性实验。利用本发明所述的建库方法，对同1例甲状腺癌样本，由实验室同一技术人员分别进行5次检测，检测方法按照实施例2的步骤进行，5次检测中，以BRAF基因T1799A位点的测序深度为例，其测序深度分别为4821.31、4590.97、4900.21、4613.96、4480.13，BRAF基因T1799A位点突变可以被稳定的检出，检出的突变频率分别为40.12％、41.96％、49.61％、41.87％、40.91％，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，本发明所述建库方法具有良好的检测重复性。
实施例4：
一种基于高通量测序技术检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法的重现性实验。
如图7所示，利用本发明所述的建库方法，对同1例甲状腺癌样本，由实验室5位不同实验人员，分别按照实施例2的步骤进行检测，以BRAF基因T1799A位点的检测结果为例，该位点的测序深度分别为6001.34、6898.97、5711.91、6529.13、6619.18，BRAF基因T1799A位点突变可以被稳定地检出，检出的突变频率分别为33.90％、35.89％、33.42％、37.13％、34.19％。结果表明，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，不同实验操作人员使用本发明所述建库方法检测结果均表现良好。本发明所述建库方法具有良好的检测重现性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述文库构建方法包括以下步骤：
S1、从待测样本中提取DNA，对提取的DNA进行浓度和纯度检测；
S2、以步骤S1提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.1～37所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；
S3、以步骤S2所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到DNA测序文库；
S4、从待测样本中提取纯化RNA，对提取的RNA进行浓度和纯度检测；
S5、以步骤S4提取的RNA为模板，通过逆转录生成相应的cDNA，纯化cDNA；
S6、以步骤S5所述cDNA为模板，用SEQ ID NO.38～64所示的核苷酸序列为引物，进行第一轮PCR扩增，纯化扩增产物；
S7、以步骤S6所述扩增产物为模板，使用建库试剂中的通用引物和接头，进行第二轮PCR扩增，纯化扩增产物，得到cDNA测序文库；
S8、对步骤S3和步骤S7所述测序文库进行质检。
2.根据权利要求1所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述核苷酸序列SEQ ID NO.1～37所示的DNA特异性引物混合池浓度为2μM。
3.根据权利要求1所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述核苷酸序列SEQ ID NO.38～64所示的RNA特异性引物混合池浓度为6μM。
4.根据权利要求1所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的文库构建方法，其特征在于：所述扩增产物纯化使用的磁珠为KAPA Pure磁珠。
5.一种用于如权利要求1-4所述文库构建方法的甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，其特征在于：所述引物组合包括DNA PCR引物和RNA PCR引物。
6.根据权利要求5所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，其特征在于：所述DNA PCR引物包括AKT1基因突变检测引物对、ALK基因突变检测引物对、APC基因突变检测引物对、ATM基因突变检测引物对、BRAF基因突变检测引物对、CDKN2A基因突变检测引物对、CTNNB1基因突变检测引物对、DICER1基因突变检测引物对、EIF1AX基因突变检测引物对、EZH1基因突变检测引物对、GNAS基因突变检测引物对、HRAS基因突变检测引物对、IDH1基因突变检测引物对、KMT2C基因突变检测引物对、KRAS基因突变检测引物对、MEN1基因突变检测引物对、NRAS基因突变检测引物对、PIK3CA基因突变检测引物对、PTEN基因突变检测引物对、RET基因突变检测引物对、SPOP基因突变检测引物对、STK11基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对、TP53基因突变检测引物对、TSC2基因突变检测引物对、TSHR基因突变检测引物对、ZFHX3基因突变检测引物对、ZNF148基因突变检测引物对。
7.根据权利要求5所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变检测引物组合，其特征在于：所述RNA PCR引物包括EML4-ALK融合检测引物对、STRN-ALK融合检测引物对、TFG-ALK融合检测引物对、CCDC6-RET融合检测引物对、NCOA4-RET融合检测引物对、PRKAR1A-RET融合检测引物对、TRIM33-RET融合检测引物对、ERC1-RET融合检测引物对、KTN1-RET融合检测引物对、PCM1-RET融合检测引物对、GOLGA5-RET融合检测引物对、TRIM24-RET融合检测引物对、HOOK3-RET融合检测引物对、FGFR3-BAIAP2L1融合检测引物对、FGFR3-TACC3融合检测引物对、FGFR2-BICC1融合检测引物对、FGFR2-CASP7融合检测引物对、TPM3-NTRK1融合检测引物对、IRF2BP2-NTRK1融合检测引物对、SQSTM1-NTRK1融合检测引物对、TPR-NTRK1融合检测引物对、ETV6-NTRK3融合检测引物对、EML4-NTRK3融合检测引物对、RBPMS-NTRK3融合检测引物对、SQSTM1-NTRK3融合检测引物对、AKAP9-BRAF融合检测引物对、PAX8-PPARγ融合检测引物对。
8.一种用于如权利要求5-7所述的甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，其特征在于：包括用于检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的引物、逆转录试剂、建库试剂、阳性DNA质控品、阳性RNA融合质控品、阴性RNA融合质控品、无核酸酶水。
9.根据权利要求8所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，其特征在于：所述逆转录试剂包括：有RNA逆转录酶、5×缓冲液、0.1MDTT、dNTPs、RNA酶抑制剂、随机引物。
10.根据权利要求8所述的一种检测甲状腺癌分子分型相关基因突变的试剂盒，其特征在于：所述建库试剂含有DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs、通用引物、接头。
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