CN105793438A - 未知序列的双股线性核酸的全长扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明揭露了一种用以扩增样本中未知序列的所有线性、双股核酸分子的转接子(adaptor)。该转接子包含(1)第一个寡核苷酸(称为P‑oligo):在5’端带有磷酸,且在3’端不带有额外的T(胸腺嘧啶)核苷酸(nucleotide);以及(2)第二个寡核苷酸(称为T‑oligo):3’端带有额外的T,但5’端不带有磷酸。除了在该T‑oligo内的3’‑T之处,P‑oligo与T‑oligo在序列上互补,所以可以形成双股的转接子。该转接子与未知序列的核酸(即目标核酸)中3’端上额外的腺嘌呤(3’‑A)接合,形成”转接子‑目标核酸”的结构。该T‑oligo接着被作为用于T oligo‑引发的聚合酶链式反应(T oligo‑primed polymerase chain reaction,TOP‑PCR)的唯一引物(primer),藉以扩增整段未知序列的核酸分子。
Description
技术领域
本发明主要关于DNA增殖。
背景技术
测序技术的进步已为癌症突变检测提供了一个更好的选择。第二代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)是一种具有优越分辨率足以侦测单一核苷酸的差异的尖端技术。然而,NGS在来自循环血浆DNA(cpDNA),其中可能带有少量的肿瘤循流DNA(circulating DNA,ctDNA),的癌症突变分析上的应用仍处于早期阶段。这是因为在血浆内的DNA含量极低,且并无可靠的方法可以自血浆中扩增少量DNA。一般通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的DNA扩增方式使用一个或多个成对(pair)的引物(primer)来界定目标区域(target regions)的边界以及通过嗜热性DNA聚合酶提供合成作用。
当应用于线性DNA的全长扩增时,使用成对引物的策略有本质上的缺点,因为每个目标DNA(target DNA)片段的末端必需接合两种不同的转接子(adaptors),其会使不同的PCR引物连接而进行环状DNA扩增。因为每个目标DNA的末端具有相同的机会与任一转接子连接,一半的目标DNA片段仅与一种转接子接合,造成有50%的机会损失序列信息,因为这样的片段无法以指数速率扩增,因此在测序与下游分析时会错误地造成代表性不足。当涉及到低含量DNA分子的NGS分析时,这个问题会变得很严重,例如在单一细胞转录组(transcriptome)内的低含量分子或在体液样本内的低含量DNA分子,如血浆,其中目标DNA或RNA种类的主要部分含量都远低于测序基因库(sequencing library)的建构或一般实验室仪器定量的最低含量要求。当考虑到疾病诊断时,这问题又会变得更为严重,因为每天要检验大量的临床DNA样本,而且有各种不良因素,例如石蜡包埋、长期或不当的储存,量少或浓度低,样本少或质量差。因此,极需要一种在样本中有效且非选择性的DNA扩增方法,可把“所有”DNA/RNA分子当作目标并且扩增,而不偏好任何序列。
发明内容
本发明涉及一种称为“T-寡核苷酸引发的聚合酶链式反应(T-oligo primed PCR,TOP-PCR)”的新方法的研发。
一方面,本发明涉及一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法。该方法包含以下步骤:
(a)提供未知序列、线性、双股的目标核酸;
(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股核酸的3’-尾端使成为带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)的未知序列的核酸;
(c)提供带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸(oligo);
(d)提供带有3’-胸线嘧啶核苷酸(3’-T)且不带有5’-磷酸(5’-p)之第二股寡核苷酸(oligo),该带有3’-T的第二股寡核苷酸与该带有5’-p的第一股寡核苷酸在除了该第二股寡核苷酸的3’-T以外之处互补;
(e)使第一与第二股寡核苷酸退火(anneal)以产生带有3’-T突出端的同类转接子(homogeneous adaptor);
(f)接合(ligate)该转接子至该带有3’-A突出端的未知序列的目标核酸上,以形成“转接子-未知序列的目标核酸”的结构,使之带有贴附于其上每一端的转接子;以及
(g)进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),以该未知序列的转接子-接合的目标核酸作为模板(template),且以该带有3’-T的第二股寡核苷酸作为唯一引物(primer),以获得PCR产物,使其中该未知序列的核酸的全长被扩增。
在本发明的一个实施方式中,该方法包含只有一次连接(ligation)步骤。
在本发明的另一实施方式中,该转接子不会自我接合。
在本发明的另一实施方式中,该未知序列的线性、双股核酸为体液DNA。
在本发明的另一实施方式中,该未知序列的线性、双股核酸为获自于癌症病患的血浆的循流DNA。
在本发明的另一实施方式中,该转接子具有一3’-T突出端与一3’-非A突出端。
在本发明的另一实施方式中,该转接子具有一3’-突出端与一平端。
另一方面,本发明涉及一种用于癌症特异性突变的评估及/或用于癌症诊断的方法。该方法包含下列步骤:
(i)根据权利要求1所述的扩增未知序列的线性、双股核酸的全长,以获得PCR产物,其中该线性、双股核酸为来自病患的体液循环DNA(circulating DNA,ctDNA);
(ii)测序该PCR产物以获得该体液ctDNA的序列;
(iii)定位(map)该体液ctDNA的序列相对于在公众已知的基因(genome)序列数据库中的位置,以辨识序列变异的存在与否;
(iv)当序列变异的存在被辨识出时,在该体液ctDNA与来自血沉棕黄层(buffycoat)、白血球细胞的DNA、与基因库的序列进行交叉比对;
(v)基于该交叉基因库比对的结果,评估癌症特异性突变或正常变异的存在与否。
在本发明的一个实施方式中,前述方法需要下列元素:
(1)该测序步骤为与来自相同个体的血沉棕黄层或白血球细胞的基因组DNA(genomic DNA)并行进行;
(2)该定位步骤为通过定位该体液ctDNA的序列以及该血沉棕黄层或白血球细胞的基因组DNA的序列相对于在该公众已知的基因组序列(genomic sequence)数据库中的位置而进行;
(3)该交叉基因库比对辨识在该体液ctDNA内以及在该血沉棕黄层或白血球细胞DNA内的变异;以及
(4)该评估步骤进一步包含自在该体液ctDNA中发现的变异减去在该血沉棕黄层或白血球细胞DNA内的变异,以辨识潜在的癌症突变。
在本发明的另一个实施方式中,该变异选自SNPs、插入,以及缺失。
在本发明的另一实施方式中,在步骤(b)之前该方法进一步包含对该未知序列的线性、双股核酸或该体液ctDNA进行末端修复(end-repair)反应。
在本发明的另一实施方式中,该体液选自血液、唾液、精液、阴道分泌物,以及羊水。
在本发明的另一实施方式中,该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于20个拷贝数。
在本发明的另一实施方式中,该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于10个拷贝数。
在本发明的另一实施方式中,该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于5皮克(picogram,pg)。
在本发明的另一实施方式中,该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于0.01皮克(picogram)。
在本发明的另一实施方式中,该未知序列的转接子接合的目标核酸不会环状化或形成环形核酸。
在本发明的另一实施方式中,该PCR是在异类(heterogeneous)引物不存在下进行的。
在本发明的另一实施方式中,该接合步骤是在异类转接子不存在下进行的。
未知序列的核酸长度可能约100bp-2kb。若核酸模板的长度超过2kb,则PCR的效率可能会降低。
从以下较佳实施方式的描述结合以下图式,这些及其他方面将会变得明显,虽然其中的变化与改变可能受到影响而不背离本发明的新颖概念的精神与范围。
附图说明本发明的一或多个实施方式,且与书面描述一起用于解释本发明的原理。只要有可能,相同的参考编号被用于整份图式中以指示一实施方式中的相同或相似的组件。
附图说明
图1所示为以测量的来自一转移性卵巢癌病患的原始血浆DNA样本。以的定量中,使用1微升(microliter)的原始血浆DNA样本。在35bp与10,380bp上的两高峰为核酸的大小参考标记(size marker)。基于已知分布在血浆中的DNA大小,所有的DNA分子,若存在于血浆样本中,被预期存在于这二个标记之间。FU表示“荧光单位”(Fluorescence Unit)。生物分析仪使用荧光标记来侦测DNA浓度。基于T-oligo引物PCR(TOP-PCR)扩增的血浆DNA的量(以估计,参见图2),显示于此图的血浆DNA的总量估计为每微升0.1毫皮克(femtogram,fg)。
图2所示为经过20个循环的TOP-PCR扩增作用之后的血浆DNA。自一16μl库存中取出共8μl血浆DNA,并用于末端修复、末端加腺嘌呤(A-tailing),以及接合至一同类转接子,接着以AMPure XP珠纯化。纯化的DNA样本以TOP-PCR扩增20个循环并以AMPure再次纯化。该洗提物被保持在5μl的无核酸酶水中,其中1μl被用于分析。DNA(在424bp上具有一高峰)的总量以定量为102pg/μl。基于这些数据,在该原始的16μl的库存中的血浆DNA浓度大约是0.1fg/μl(参见图1)。
图3所示为经过30个循环的TOP-PCR扩增作用之后的血浆DNA。总共8μl的原始血浆DNA被用于末端修复、末端加腺嘌呤,以及接合至一同类转接子,然后以该转接子的T寡核苷酸进行30个循环TOP-PCR的扩增。取1μl扩增后的血浆DNA用测量。DNA分子的大小范围自约100bp至超过2,000bp。
图4所示为经过30个循环的TOP-PCR扩增作用以及音波振动处理之后的血浆DNA。音波振动处理以COVARISTM音波振动器进行。DNA片段的尺寸范围现为约100至1,000bp之间。
图5所示为血浆DNA分析的整体工作流程。
图6所示为以TOP-PCR拯救的血浆ctDNA样本、来自癌症病患基因组的DNA样本,以及对照组正常新鲜的血浆ctDNA的粒线体DNA图谱。来自不同来源的血浆DNA样本以一同类转接子系统扩增,并且以MISEQTM测序仪测序。在包含在hg19(UCSC数据库)的人类粒线体基因组中定位出所产生的序列读值的位置并加以显示。A)来自TOP-PCR扩增的(降解的,degraded)一卵巢癌病患的血浆DNA的粒线体DNA图谱。B)来自相同卵巢癌病患的血沉棕黄层DNA的粒线体DNA图谱。C)来自相同卵巢癌病患的肿瘤组织的粒线体DNA图谱。D)来自TOP-PCR扩增的(降解的)一发病早期乳癌病患的血浆DNA的粒线体DNA图谱。E)来自TOP-PCR扩增的(新鲜的)一正常女性对照组的血浆DNA的粒线体DNA图谱。
图7所示为显示以TOP-PCR进行血浆DNA扩增作用的示意图。互补的寡核苷酸(标示为T-oligo与P-oligo)为以寡核苷酸合成仪合成。只有P-oligo在5’-端具有一磷酸基团。在室温下退火使得这二个寡核苷酸形成一同类的粘性转接子,其只能接合血浆DNA分子的末端(termini)。因为在T-oligo中并无5’-磷酸基团,因此防止了该转接子自我接合。使用T-oligo作为TOP-PCR扩增作用唯一的PCR引物可以有效率地扩增目标血浆DNA分子,以用于测序及其延续的分析。
图8的示意图用以说明转接子的设计。
具体实施方式
本发明在以下的实施例中被更具体地描述,这些实例仅为说明,因为其中许多改变与变化对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明的各种实施方式现将进行详细的描述。参考附图,相同的数字在所有视图中指示相同的组件。在本文描述中以及其后整份申请专利范围所用,除非文中清楚的指示,否则“一”、“一个”以及“该”的含义包括复数引用。此外,如本文描述中以及其后整份申请专利范围所用,除非文中清楚的指示,否则“在之内”的含义包括“在之内”以及“在之上”。再者,在说明书中可能使用标题及副标题以方便读者阅读,其不影响本发明的范围。此外,本说明书中所用的某些术语更特定地被定义如下。
定义
在本说明书中所用的术语一般具有其在本领域中、在本发明的范围之内,以及在用到各术语的特定内容中的普通含义。被用来描述本发明的某些术语在以下内容中,或是在本说明书的其他地方被讨论,以提供关于本发明的描述的实践者附加的指导。为了方便起见,某些术语可能被凸显出来,例如使用斜体字及/或引号。使用凸显标示对一术语的范围及含义并无影响;在相同的内容中,一术语的范围及含义仍相同,不论其是否被凸显出来。可以理解的是,相同的事物可以使用多于一种的方式阐述。因此,本文中讨论的一或多个术语可能使用替代性语言以及同义词,不论一个术语在本文中被阐述或讨论与否,并非任何特殊的意义要被置于其上。某些术语的同义词被提供。详述一或多个同义词并不排除其他同义词的使用。在此说明书中任何地方使用的实例,包括本文中讨论的任何术语的实施例都仅仅是说明性的,且不以任何方式限制本发明或任何示例性术语的范围及含义。同样地,本发明并不限于本说明书中所提供的各种实施方式。
除非另有定义,本文使用的所有技术及科学术语具有如本发明所属技术领域中的技术人员一般所了解的相同含义。在冲突的情况下,以本文件,包含定义,为准。
如本文所用,“约”、“大约”或“近似地”应当一般性地表示在一给予的数值或范围的20%以内,优选在10%之内,且更优选在5%之内。本文所提供的数值数量是近似的,意指若未明白地表示,该术语“约”、“大约”或“近似地”可以被推断。
“覆盖”一词在测序中意指“一特定位置被测序多少次”。例如,若共有30个序列读值(以测序仪产生)被定位于一特定的基因组位置上,则此一位置的(测序)覆盖为30倍。另一例子为,若在染色体10号的1,000,000位置为“腺嘌呤”,且在一基因库中我们有25个序列读值被定位至此位置(即,25个读值覆盖在此一位置上),则这个位置具有25倍的覆盖。此单位应为“覆盖的次数或倍数”。然而,“覆盖”本身在基因组学中已经是一个广泛的术语。
“不连续的模式(discontinous pattern)”与“分割的模式(segmentedpatterns)”等词是可互换的。
“癌症突变”与“癌症基因突变”等词是可互换的。最初,癌症突变为指在癌症细胞或癌症组织中发现的基因突变,如单一碱基的误差、插入、缺失、倒位等。随着起因自密集的癌症研究而来的增进的知识,变得清楚的是,癌症是一种非常复杂的疾病,其起因于在多种层次上的多种失调,包括遗传上的改变与表观遗传的修饰作用、粒线体与核DNA畸变、粒线体不稳定,以及代谢紊乱。
“转接子”为由退火的二股寡核苷酸所组成。该寡核苷酸的长度可能为10-20,优选为20,个核苷酸。长度少于10个核苷酸可能会降低退火的专一性。长度多于20个核苷酸可能不符合成本效益。在本发明的一个实施方式中,该T寡核苷酸具有11bp的长度,如,序列:5’-AGACTCCGACT-3’(SEQ ID NO:2)。该说明性的P寡核苷酸序列为5'-GTCGGAGTCTgcgc-3'(SEQID NO:1)。转接子的实例揭示于美国专利公开案第20120231508号,其为以引用的方式将其全部并入本文。
“同类的转接子”一词意指单一类型的转接子。
“异类的转接子”一词意指至少二种类型的转接子,其具有相互不同的核苷酸序列。
“单一”引物意指只有一种引物存在,而非一对引物。“异类的引物”一词意指至少2种不同的引物。
“突出端”为在DNA分子的末端上未配对的核苷酸的延伸。这些未配对的核苷酸可以是在3’端或5’端,分别产生3’或5’突出端。当一突出的末端为回文,其为表示该突出端的核苷酸序列是回文的。
“3’-非-A突出端”一词意指该3’-端具有一非-腺嘌呤突出端,亦即,一不具有一额外的腺嘌呤核苷酸的3’-突出端。
“体液-ctDNA”一词意指获得自一体液的循环DNA。
我们已开发出一种称为“T寡核苷酸-引物的聚合酶链式反应(T oligo-primedpolymerase chain reaction,TOP-PCR)”的健全的DNA扩增策略,设计用于有效、非选择性、全长扩增微量线性DNA。与现代分子克隆以及NGS测序策略一致,其为频繁地增加一额外的“腺嘌呤”至一目标DNA的两个3’端上,我们采用了同类的双股转接子策略,为在该3’端(亦即,3’-T突出端)携带一额外的“胸线嘧啶”用于将粘性端接合至所有目标DNA片段。我们能够从少量或部分降解的血浆DNA样本中扩增该DNA片段的全长。藉由这样做,大大地增加了序列分析的分辨率,并可救回旧样本。
根据本发明的方法,该核酸的序列信息是未知或不可得的。该核酸未知的两端被接合到一合适的同类转接子。该转接子由2个已知序列(P-oligo与T-oligo)的寡核苷酸组成,其中T-oligo作为唯一的PCR引物。该核酸接着以该T-oligo退火至该同类转接子的P-oligo上来进行扩增。所有在该样本中未知序列的核酸可以被完全地扩增。
实施例
在不具限制本发明范围的意图下,以下提供了根据本发明的实施方式的示例性的仪器、装置、方法及其相关结果。注意,在实施例中使用标题或副标题以方便读者阅读,其不应限制本发明的范围。此外,本文中提出并讨论某些理论;然而,这些,不论其为对或错,都不应以任何方式限制本发明的范围,只要该发明是根据本发明而不考虑任何特定理论或作用机制来实施的。
本发明涉及一种新颖的检测方法,其可发现任何肿瘤突变,不论是基因内的或基因间的,其可能存在于血浆中。循环血浆DNA可作为通道,只要该突变流经该通道,使我们得以取得并分析任何癌症突变。血浆DNA扩增作用代表极大的挑战,且需要健全的分子扩增策略。我们已经成功地测试了使用TOP-PCR的策略来扩增获得自移转性卵巢癌病患的血浆的ctDNA。该扩增的ctDNA样本与肿瘤(基因组)DNA并行测序,以进行跨组织间的比较。我们辨识了显著数量的并发点突变(亦即,在血浆DNA与肿瘤DNA中都发现的突变),表示在ctDNA与肿瘤DNA之间突变位置上有可侦测的关于数据上的重叠。合并来看,源自于这些概念验证的实验证实了,使用一同类转接子以及在TOP-PCR中使用T寡核苷酸作为单一引物以通过血浆DNA侦测肿瘤突变与癌症诊断的可行性。本方法快速又健全。
使用评估来自一移转性卵巢癌病患的原始、扩增前的血浆DNA样本
虽然没有预期在BIOANALYZERTM下会观察到血浆DNA的量,但为了初始记录,所有的血浆DNA样本都要以或相等的装置进行定量。人们可能想要选择qPCR而非来进行初始定量,但推荐后者是因为使用比qPCR简单,且根据本发明以一同类转接子扩增作用的效果,可以通过使用比较扩增前后的样本而轻易分辨。
实验步骤
来自一卵巢癌病患的1μl的原始血浆DNA(制备于ddH2O中)以(Agilent2100)进行质量鉴定及数量估计。该扩增前的血浆DNA样本,以测量,显示于图1。在此样本中的血浆DNA的数量被发现远低于所能侦测的最小浓度。
末端修复与末端加腺嘌呤
血浆DNA分子被进行末端修复,在每个3’端加上一个“腺嘌呤”作为尾端,且根据本发明接合至一同类转接子上。
以一同类转接子与T寡核苷酸扩增血浆DNA
通过使用该转接子的T寡核苷酸进行TOP-PCR扩增作用。在本发明的一个实施方式中,该T寡核苷酸序列为5’-AGACTCCGACT-3’,如图7所示。
DNA纯化
该TOP-PCR扩增的血浆DNA样本可以AMPURETM XP套组或凝胶切除法进行纯化。
DNA超声波处理
使用Corvaris超声波仪。被超声波处理过的、扩增的血浆DNA样本为以评估(图4),末端修复、末端加腺嘌呤,然后接合至测序的转接子以制备测序基因库。
在一般测序基因库构筑期间,该测序转接子-接合的DNA样本以AMPURETM XP珠纯化,通过一般PCR的方法扩增以扩增该转接子-接合DNA,然后以AMPURETM珠纯化以选择300bp-500bp DNA片段。
测序基因库为以qPCR定量,且加载MISEQTM测序仪以进行丛聚生成。该制备的基因库以250x 250(bp)PE测序进行测序。然后分析该生成的序列读值。
整体工作流程
分析用的工作流程概述并显示于图5。
以TOP-PCR扩增策略揭露癌症病患-特异性的粒线体DNA图谱的不连续性
在此我们使用粒线体DNA(mtDNA)图谱作为一个实施例来示范一同类转接子扩增策略的稳健性。如图6所示,只在老旧的血浆DNA样本中发现mtDNA图谱中间隙(不连续性)的存在。
用于T寡核苷酸引物PCR扩增作用的转接子设计
该转接子由双股寡核苷酸组成。一股被称为T寡核苷酸(T-oligo),其在3’-端上具有一额外的胸腺嘧啶核苷酸(T)。另一股被称为P寡核苷酸(P-oligo),其在5’-端上具有一个磷酸基团,且其3’-端核苷酸不具有额外的胸腺嘧啶。该转接子可为一平端-粘性端(即,一端为平端且另一端为粘性端)或双重粘性端(即,两端都是粘性端)的转接子。参见图8,分别为顶端与底端区块。针对该“平端-粘性端”转接子,该P寡核苷酸短少1个碱基,且除了在该T寡核苷酸的3’端上的胸腺嘧啶之外,与该T寡核苷酸互补(complementary)。针对该“双重粘性端”转接子,该P寡核苷酸较该T寡核苷酸长(图8)。“转接子”有五个必要条件:1)一股(称为T-oligo)需要具有一额外的3’-T(亦即,在该3’端上的“胸腺嘧啶”突出端);2)T-oligo不具有5’-磷酸;3)该另一股(P-oligo)需要一个5’-磷酸;4)除了3’-端胸腺嘧啶之外,T-股的长度比P-股的长度短或相同;以及5)只有T-oligo被用来作为TOP-PCR扩增作用的PCR引物。
癌症基因突变的评估
血沉棕黄层DNA(作为正常对照组)与血浆DNA两者皆需要自相同癌症病患或受试者身上采集。依照其初始浓度,该血浆DNA可以TOP-PCR扩增或不扩增然后测序,而该血沉棕黄层DNA不需要以TOP-PCR扩增且直接测序。接着,血浆DNA序列与该血沉棕黄层DNA序列两者皆对参考的基因组(如,UCSC数据库的hg19)进行定位,以确认在血浆DNA与血沉棕黄层DNA中的变异(尤其是SNPs、插入以及缺失)。自血浆DNA中发现的变异减去在血沉棕黄层DNA中的变异。有些变异(如,在正常健康个体中发现的SNPs)被认为是“正常变异”且因此应当被忽略。在血浆DNA中的其他变异则可能衍生自癌细胞(即,潜在的癌症基因突变)。
跨基因库的比较
案例#1
正常基因组序列数据库:nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
(1)癌症组织:nnnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnn
(2)血浆DNA:nnnnnnnnnnnnnnAnnnnnnnn
(3)白血球(WBC)DNA:nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
跨基因库比较的结果指示一个癌症突变。
案例#2(非突变)
正常基因组序列数据库:nnnnnnnnnnnnnnGnnnnnnnn
(1)癌症组织:nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
(2)血浆DNA:nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
(3)白血球(WBC)DNA:nnnnnnnnnnnnnnTnnnnnnnn
跨基因库比较的结果指示没有突变。
当与现有技术比较时本发明的独特特征/优点
其他团队先前所采用的程序(如,Dawson等人与Forshew等人)冗长且严重依赖商业设备,导致非常有限的基因突变筛选能力的范围。他们的方法只能分析非常有限数量的已知癌症基因且因此不适合全面性检测已知与未知的新的癌症突变。本发明的方法不限制基因或基因位置(基因内与基因间位置皆可被检测)的数量,通过血浆DNA分析,其可用于筛选癌症突变或用于癌症诊断。
本发明的独特特征如下:
(1)与传统PCR引物不同,T oligo是PCR中使用的唯一引物;
(2)以TOP-PCR进行的PCR扩增作用是高效的;
(3)本发明的程序极为简单且直接;
(4)本发明的方法检测所有类型的突变,包括基因内与基因间的癌症突变,不论是已知的或新的,而先前方法则局限于一些已知的基因;以及
(5)本发明的方法适用NGS测序仪,其为当前最灵敏的DNA测序仪器,且亦在目标DNA末端加腺嘌呤以与测序转接子(sequencing adaptor)接合,而其他方法也需要更多仪器,例如数字PCR或rtPCR机器。
本发明的效用
在生物技术发展期间,最强大且最简单的方法具有较高的机会可以通过进化的筛选。根据本发明,该方法比其他方法具有大量优点,因此具有较大的机会被选来用于临床样本以早期检测癌症,或甚至常规用于实验室中。可能生产套组以供根据本发明的检测方法所用。
若RNA分子被转化为cDNA,则TOP-PCR可以扩增RNA。
某些血浆样本已经具有足够的DNA,因此不需要再藉由TOP-PCR扩增这些样本。TOP-PCR对于低量血浆DNA样本特别有用,例如长期储存(如,超过3或4年)的样本,或是经过重复冷冻-解冻循环的样本。
本发明的示例性实施方式的先前描述仅呈现作为阐述及描述的目的,且并不意图耗尽或限制本发明于精确的揭露形式。根据前面所阐述,许多改变与变化是可行的。
选择并描述该实施方式与实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用,以使本领域其他技术人员能够使用本发明及各种实施方式,且带有各种改变以适合预期的特定使用。替代具体实施例对本发明所属技术领域的技术人员而言将变得显而易见,且不悖离其精神与范围。据此,本发明的范围为以所附申请专利范围来界定,而非先前描述及在此描述的示例性实施方式。
某些参考文献,其可能包括专利、专利申请以及各种公开文件,在本发明的描述中被引用并讨论。这些参考文献的引用和/或讨论仅提供用以阐明本发明的描述,且并非承认任何这样的参考文献是本文所述的本发明的“现有技术”。所有在此说明书中被引用且被讨论的参考文献为以引用的方式整个且以相同的范围并入本文,如同每个参考文献独立地并入本文作为参考。
Claims (19)
1.一种扩增未知序列的线性、双股核酸的方法,其包含以下步骤:
(a)提供该未知序列的线性、双股的目标核酸;
(b)将一腺嘌呤核苷酸(A)加至该未知序列的线性、双股核酸的3’-尾端,以获得带有3’-腺嘌呤核苷酸(3’-A)突出端的未知序列的目标核酸;
(c)提供带有5’-磷酸(5’-p)的第一股寡核苷酸(oligo);
(d)提供带有3’-胸线嘧啶核苷酸(3’-T)但不带有5’-磷酸(5’-p)的第二股寡核苷酸(oligo),该带有3’-T的第二股寡核苷酸与该带有5’-p的第一股寡核苷酸在除了该第二股寡核苷酸的3’-T以外之处互补;
(e)使该第一与第二股寡核苷酸退火,以产生带有3’-T突出端的同类转接子;
(f)将该同类转接子接合至该带有3’-A突出端的未知序列的目标核酸上,以形成“转接子-未知序列的目标核酸”的结构,使之带有贴附于其上每一端的转接子;以及
(g)执行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),以该“转接子-未知序列的目标核酸”作为模板,且以该带有3’-T的第二股寡核苷酸作为单一引物,以获得PCR产物,其中该未知序列的核酸的全长被扩增。
2.如权利要求1所述的方法,其包含只有一次的连接步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中该转接子不会自我接合。
4.如权利要求1或2所述的方法,其中该未知序列的线性、双股核酸为体液DNA。
5.如权利要求1所述的方法,其中该未知序列的线性、双股核酸为获自癌症病患的血浆的循环DNA。
6.如权利要求1所述的方法,其中该转接子具有3’-T突出端与3’-非A突出端。
7.如权利要求1所述的方法,其中该转接子具有3’-突出端与平端。
8.一种用于癌症特异性突变的评估及/或用于癌症诊断的方法,其包含下列步骤:
(i)根据权利要求1所述扩增未知序列的线性、双股核酸的全长,以获得PCR产物,其中该线性、双股核酸为来自病患的体液循环DNA(circulating DNA,ctDNA);
(ii)测序该PCR产物,以获得该体液ctDNA的序列;
(iii)定位该体液ctDNA的序列相对于在公众已知的基因组序列数据库中的位置,以辨识序列变异的存在或不存在;
(iv)当序列变异的存在被辨识出时,在该体液ctDNA与来自血沉棕黄层、白血球细胞的DNA、与基因库的序列进行交叉比对;以及
(v)基于该交叉基因库比对的结果,评估癌症特异性突变或正常变异的存在或不存在。
9.如权利要求8所述的方法,其中:
(1)该测序步骤为与来自相同个体的血沉棕黄层或白血球细胞的基因组DNA平行进行;
(2)该定位步骤为通过定位该体液ctDNA的序列以及该血沉棕黄层或白血球细胞的基因组DNA序列相对于在该公众已知的基因组序列数据库中的位置而进行;
(3)该交叉基因库比对辨识在该体液ctDNA内以及在该血沉棕黄层或白血球细胞DNA内的变异;以及
(4)该评估步骤进一步包含自在该体液ctDNA中发现的变异减去在该血沉棕黄层或白血球细胞DNA内的变异,以辨识潜在的癌症突变。
10.如权利要求8或9所述的方法,其中该变异选自SNPs、插入,以及缺失。
11.如权利要求1所述的方法,在步骤(b)之前进一步包含对该未知序列的线性、双股核酸或该体液ctDNA进行末端修复反应。
12.如权利要求4或8所述的方法,其中该体液选自血液、唾液、精液、阴道分泌物,以及羊水。
13.如权利要求1或8所述的方法,其中该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于20个拷贝数。
14.如权利要求13所述的方法,其中该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于10个拷贝数。
15.如权利要求1或8所述的方法,其中该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于5皮克。
16.如权利要求15所述的方法,其中该未知序列的线性、双股核酸的含量为不大于0.01皮克。
17.如权利要求1所述的方法,其中该未知序列的转接子接合的目标核酸不会环状化或形成环形核酸。
18.如权利要求1所述的方法,其中该PCR是在异类引物不存在下进行的。
19.如权利要求1所述的方法,其中该接合步骤是在异类转接子不存在下进行的。
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