JP6417603B2 - Ｒｎａの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法およびｄｎａエレメントの分析方法 - Google Patents

Ｒｎａの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法およびｄｎａエレメントの分析方法 Download PDF

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Description

本発明は、ＲＮＡの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法およびＤＮＡエレメントの分析方法に関する。
疾患等の生物学的事象の解明において、遺伝子発現の制御の多様性の関与が示唆されており、前記多様性の解明には、遺伝子の発現プロファイルの分析が、極めて重要となっている。前記遺伝子の発現プロファイルは、例えば、どの遺伝子が、生体のどの部位（細胞、組織等）で、どの時点において、どのような発現挙動を示しているかというような情報である。
前記発現プロファイルの分析方法として、現在、ＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression）が報告されている（特許文献１、非特許文献１）。ＣＡＧＥは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されたＲＮＡについて、キャッピングされた５’末端のキャップ構造を利用して、５’末端領域をゲノムワイドに一塩基レベルで同定・定量する方法である。具体的には、転写されたＲＮＡの５’末端領域を、逆転写したｃＤＮＡタグとして取り出し、得られたｃＤＮＡタグの配列を決定することにより、例えば、プロモーター等の機能性ＤＮＡエレメントを、ゲノム上にマッピングできる。また、重複したｃＤＮＡタグの配列を決定してマッピングすれば、同じ位置にマップされたタグの数によって、各ＤＮＡエレメントの発現量を計測することもできる。このように、ＣＡＧＥは、発現プロファイルをゲノムワイドに解析できるため、例えば、疾患の原因の解明、診断方法および治療方法の開発への利用が進められている。
他方、前述のような発現プロファイルの分析対象であるＤＮＡエレメントとして、エンハンサーがある。エンハンサーは、遺伝子の上流、下流および内部に存在し、遺伝子発現を増大させる作用を有する数百塩基長のシス調節ＤＮＡ領域である。そして、様々な疾患との関連性が指摘されている。このため、生物学的事象において重要な役割を果たすと考えられるエンハンサーについても、発現プロファイルの解析は、非常に重要である。
エンハンサーは、近年、基本転写因子やＲＮＡポリメラーゼがリクルートされ、エンハンサーの両端から、両方向性にＲＮＡ（以下、「エンハンサーＲＮＡ」という）が合成されていることが報告されている。そして、エンハンサーＲＮＡは、ｍＲＮＡと同様に、５’末端のキャップ構造を有することも明らかとなっている。そこで、エンハンサーについても、５’末端のキャップ構造を利用するＣＡＧＥを用いた解析が進められ、エンハンサーＲＮＡの転写開始点が同定され、これをもとに、転写されるエンハンサー（以下、「活性エンハンサー」ともいう）として、約４４，０００箇所の同定も報告されている（非特許文献２）。
特表２００５−５３５３１１号公報
シラキら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 15776-15781 (2003) アンダーソン（Andersson）ら、Nature 507(7493) 455-461（2014）
しかしながら、発明者は、ＣＡＧＥによるエンハンサーの解析について、新たな問題点を見出すに到った。
まず、エンハンサーのＲＮＡ産物であるエンハンサーＲＮＡは、合成（転写）されても、活発に分解される。このため、ある患者の単独の細胞種由来のサンプルを使用した場合、検出されるエンハンサーＲＮＡは、その細胞において転写された全エンハンサーＲＮＡの極一部にすぎず、高感度な同定を行うことは困難である。他方、前述した非特許文献２において、転写開始点の同定は、細胞内のトータルＲＮＡが使用され、また、エンハンサーは、約１，０００種類もの細胞および組織から得た膨大なＣＡＧＥデータを蓄積し、これらの蓄積データから総合的に解析することで、前述のような数万カ所の同定が行われている。しかし、様々な細胞および組織からの膨大なＣＡＧＥデータを使用しているということは、発現プロファイルにおいて重要な「どこで」エンハンサーＲＮＡが発現しているかという点について、同定の感度が不十分となるおそれがある。特に、癌患者において、エンハンサーの変異と癌化との関連性も示唆されていることから、様々な細胞および組織のＣＡＧＥデータを蓄積することで導き出される同定結果ではなく、単独のサンプルのみからエンハンサーを同定することが、今後の医療分野においては重要である。
つぎに、エンハンサーＲＮＡは、合成と分解とが同時並行して起こっているため、検出されるエンハンサーＲＮＡの発現量は、あくまでも合成量と分解量との平衡に基づくみかけ上の量にすぎない。このため、例えば、エンハンサーＲＮＡの発現量について、経時的な変化や、絶対量の定量を行うことができない。しかし、発現プロファイルの解析において、エンハンサーＲＮＡの合成の絶対量の定量により、エンハンサー活性を定量することは、非常に重要である。
この問題は、エンハンサーには限られず、例えば、エンハンサーと同様に活発に分解される数多くのタンパク質非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）や、転写因子等の調節因子として知られるタンパク質をコードしているＲＮＡ等においても同様である。
そこで、本発明は、例えば、エンハンサー等の機能性ＤＮＡエレメントについて、より高感度な同定と、高精度な活性化の定量とを実現するための、ＲＮＡの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法およびＤＮＡエレメントの分析方法を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の解読方法は、ＲＮＡの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法であり、
鋳型ＲＮＡを用いて、
前記ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸もしくは前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸、
前記ＲＮＡの３’末端領域のＲＮＡ核酸もしくは前記ＲＮＡの３’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸、
前記ＲＮＡ全長のセンスストランドもしくはアンチセンスストランドにおける部分領域のＲＮＡ核酸、および、
これらの組み合わせ
からなる群から選択された少なくとも一つの核酸、または、２つ以上の配列が連結された配列を有する核酸を調製し、前記核酸を配列解読する調製解読工程を含み、前記調製解読工程において、使用する前記鋳型ＲＮＡが、新生ＲＮＡ（Ｎａｓｃｅｎｔ ＲＮＡ）であることを特徴とする。
また、本発明の分析方法は、ＤＮＡエレメントの分析方法であり、前記本発明の解読方法により、ＲＮＡの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する解読ステップと
前記解読した配列情報に基づき、前記ＲＮＡの合成をコードするＤＮＡエレメントをゲノム配列にマッピングするマッピングステップとを含むことを特徴とする。
本発明によれば、例えば、エンハンサー等の機能性ＤＮＡエレメントについて、より高感度な同定と、転写量の定量を実現できる。
本発明の工程の一例を示す概略図である。 コンカテマーへの５’末端特異的タグのクローニングのための工程の一例を示す概略図である。 ５’末端タグの直接配列決定の工程の一例を示す概略図である。 実施例１におけるウェスタンブロットの結果を示す図である。 実施例２におけるリード数を示すグラフである。 実施例３におけるリード数の再現性を示すグラフである。 実施例４におけるエンハンサー候補のマッピングを示す図である。
本発明の解読方法は、例えば、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
前記調製解読工程において、ｎＡｎＴ−ｉＣＡＧＥ法に基づく手法を用いる。
本発明の解読方法は、例えば、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
前記調製解読工程が、
前記核酸にリンカーが結合したリンカー付加核酸を調製する調製ステップと、
前記リンカー内に認識部位を有し且つ前記核酸内に切断部位を有する制限酵素を用いて、前記リンカー付加核酸を切断する切断ステップと、
得られた切断物から、前記ＲＮＡの５’末端領域に対応するフラグメントを回収する回収ステップとを含む。
本発明の解読方法は、例えば、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
前記調製解読工程において、テンプレートスイッチ法に基づく手法を用いる。
本発明の解読方法は、例えば、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
前記調製解読工程において、HeliScopeCAGE法に基づく手法を用いる。
本発明の解読方法は、例えば、前記新生ＲＮＡが、単一種の細胞由来のＲＮＡまたは単一の組織由来のＲＮＡである。
本発明の解読方法は、例えば、前記新生ＲＮＡが、転写過程における鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼIIと合成中のＲＮＡとの複合体から単離されたＲＮＡである。
本発明の解読方法は、例えば、さらに、生体試料から前記新生ＲＮＡを単離する単離ステップを含み、
単離した前記新生ＲＮＡを、前記鋳型ＲＮＡとして使用する。
本発明の解読方法は、例えば、前記単離ステップにおいて、
前記生体試料から、転写過程における鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼIIと合成中のＲＮＡとの複合体を含むクロマチンを分離し、
前記クロマチンから、前記複合体に含まれる前記合成中のＲＮＡを、新生ＲＮＡとして分離する。
本発明のＤＮＡエレメントの分析方法は、例えば、前記マッピングステップにおいて、前記マッピングにより前記ＤＮＡエレメントを同定する。
本発明のＤＮＡエレメントの分析方法は、例えば、さらに、マッピングした前記ＤＮＡフラグメントの重複数から、前記ＤＮＡエレメントの活性量を定量するステップを含む。
本発明の分析方法は、例えば、前記定量した前記ＤＮＡエレメントの活性量と、
ゲノム上のＤＮＡ変異および遺伝子多型の少なくとも一方とを関連させる。
以下に、本発明について、具体的に説明する。なお、本発明は、これらの記載に制限されない。
［解読方法］
本発明の解読方法は、前述のように、ＲＮＡの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法であり、
鋳型ＲＮＡを用いて、
前記ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸もしくは前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸、
前記ＲＮＡの３’末端領域のＲＮＡ核酸もしくは前記ＲＮＡの３’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸、
前記ＲＮＡ全長のセンスストランドもしくはアンチセンスストランドにおける部分領域のＲＮＡ核酸、および、
これらの組み合わせ
からなる群から選択された少なくとも一つの核酸、または、２つ以上の配列が連結された配列を有する核酸を調製し、前記核酸を配列解読する調製解読工程を含み、
前記調製解読工程において、使用する前記鋳型ＲＮＡが、新生ＲＮＡ（Ｎａｓｃｅｎｔ ＲＮＡ）である。本発明において、調製される前記核酸は、例えば、核酸フラグメントまたはフラグメントということもでき、前記核酸がＤＮＡ核酸の場合、ＤＮＡフラグメントいうこともできる。
本発明の解読方法は、具体的には、鋳型ＲＮＡとして、新生ＲＮＡ、すなわち転写過程における新規合成中のＲＮＡを使用して、前記核酸を調製し、前記核酸の配列を解読する方法である。この方法によれば、ＤＮＡエレメントの分析において、例えば、以下のような効果がある。
まず、前述のように、例えば、エンハンサーの場合、合成完了後のエンハンサーＲＮＡには、活発な分解が生じる。しかし、本発明の解読方法は、鋳型ＲＮＡとして、合成完了後のＲＮＡではなく、新規合成中の新生ＲＮＡを鋳型として使用するため、例えば、合成と分解との平衡関係を示す見かけ上存在するＲＮＡに対応する核酸ではなく、分解される前のＲＮＡに対応する核酸、つまり、見かけ上ではなく実際に合成されたＲＮＡに対応する核酸を得ることができる。このため、例えば、単一細胞種や単一組織について、エンハンサー等のＤＮＡエレメントの分析を行う場合であっても、より高感度な同定が可能となる。
また、実際に合成されたＲＮＡに対応する核酸が得られることから、合成と分解の平衡状態を示す見かけ上のＲＮＡ量ではなく、合成されたＲＮＡ量を測定できるため、実質的に、絶対定量が可能になるといえる。このため、例えば、エンハンサー等のＤＮＡエレメントの場合、転写されたＲＮＡの絶対定量により、間接的に、エンハンサー活性等のＤＮＡエレメント活性を絶対定量することもできる。
以上のことから、本発明によれば、例えば、未知のＤＮＡエレメントの同定および活性定量、単一細胞種または単一組織におけるＤＮＡエレメントの同定および活性定量等が、高感度且つ高精度で可能になるといえる。
前記「新生ＲＮＡ；Ｎａｓｃｅｎｔ ＲＮＡ」とは、ＤＮＡを鋳型とする転写過程において、新規に合成中のＲＮＡであることを意味する。
前記新生ＲＮＡは、例えば、転写過程における鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼIIと合成中のＲＮＡとの複合体に含まれるＲＮＡであり、前記複合体から単離されたＲＮＡ（前記合成中のＲＮＡ）が使用できる。
前記新生ＲＮＡは、例えば、転写過程において５’末端にキャッピングが行われた、５’末端にキャップ構造（以下、「５’キャップ構造」ともいう）を有するＲＮＡである。
前記新生ＲＮＡの調製方法は、特に制限されない。前記新生ＲＮＡの調製方法としては、例えば、Jerome Wuarinらの文献（Molecular and Cellular Biology, Nov. 1994, p.7217-7225）等が参照できる。
前記新生ＲＮＡを調製するための試料は、例えば、生体試料である。前記生体試料の種類は、特に制限されず、例えば、細胞、組織等があげられる。前記細胞は、例えば、１種類の細胞でもよいし、２種類以上の細胞の混合物でもよいし、前記組織は、例えば、１種類の組織でもよいし、２種類以上の組織の混合物でもよい。本発明は、前述のように、ＲＮＡの分解に影響されないＤＮＡフラグメントが得られるため、単一細胞または単一組織におけるＤＮＡエレメントの分析にも利用できる。したがって、本発明は、前記生体試料として、例えば、１種類の細胞（単一細胞種）または１種類の組織（単一組織）を使用することが好ましい。
前記細胞の種類は、特に制限されず、あらゆる細胞を使用できる。本発明の製造方法により得られたＤＮＡフラグメントを用いて、後述する本発明の分析方法を行うことにより、例えば、疾患に関与するＤＮＡエレメントの分析等も可能となる。具体例としては、例えば、血液細胞、リンパ芽球様細胞、腫瘍細胞等があげられる。
前記新生ＲＮＡは、例えば、以下のようにして調製できる。まず、細胞から、常法により、核を含む核分画を分離する。つぎに、前記核分画を変性処理して、クロマチンを含むクロマチン分画を分離する。クロマチン分画には、転写過程における鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼIIと合成中のＲＮＡとの複合体が含まれている。前記複合体は、非常に安定なため、前記変性処理によっても、その構造は維持される。前記変性処理には、例えば、高濃度の塩および尿素を含む変性バッファーが使用できる。前記変性バッファーの組成は、例えば、３００ｍｍｏｌ／Ｌ 塩、４ｍｏｌ／Ｌ 尿素、１％ 界面活性剤等が例示でき、前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム、前記界面活性剤としては、例えば、ＮＰ−４０（Nonidet P-40）等の非イオン系界面活性剤等があげられる。そして、前記クロマチン分画に対してＲＮＡ抽出処理を行うことで、前記複合体に含まれている合成中のＲＮＡを回収する。回収されたＲＮＡが、前記新生ＲＮＡである。前記ＲＮＡ抽出は、例えば、市販のＲＮＡ抽出試薬が使用でき、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（商標）ＲＮＡ単離試薬等が使用できる。
本発明の解読方法は、例えば、さらに、生体試料から前記新生ＲＮＡを単離する単離ステップを含んでもよい。そして、前記単離ステップで単離した前記新生ＲＮＡを、前記鋳型ＲＮＡと使用してもよい。前記単離ステップは、例えば、前記生体試料から、転写過程における鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼIIと合成中のＲＮＡとの複合体を含むクロマチンを分離し、前記クロマチンから、前記複合体に含まれる前記合成中のＲＮＡを、新生ＲＮＡとして分離することにより行える。なお、前記新生ＲＮＡの単離方法は、例えば、前述した調製方法を援用できる。
本発明の解読方法において、前記調製する核酸は、まず、下記（１）〜（４）があげられ、また、下記（５）でもよい。
（１）前記ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸もしくは前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸
（２）前記ＲＮＡの３’末端領域のＲＮＡ核酸もしくは前記ＲＮＡの３’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸
（３）前記ＲＮＡ全長のセンスストランドもしくはアンチセンスストランドにおける部分領域のＲＮＡ核酸
（４）前記（１）〜（４）の任意の組み合わせ
（５）２つ以上の配列が連結された配列を有する核酸
前記（５）において、例えば、「２つ以上の配列」における「配列」とは、前記（１）〜（４）の核酸の配列であり、「２つ以上の配列が連結された配列」とは、前記（１）〜（４）のいずれかの配列が２つ以上連結されている配列である。前記連結は、例えば、直接的な連結でもよいし、リンカー等を介した間接的な連結でもよい。
本発明の解読方法は、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含む場合、例えば、前記調製解読工程において、いわゆるＣＡＧＥを原理とする各種方法を用いることができる。前記核酸は、例えば、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸または前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸でもよいし、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸と前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の両方を含んでもよい。
この場合、前記新生ＲＮＡを鋳型として調製される前記核酸は、前記新生ＲＮＡの３’末端領域に対応する核酸ではなく、前記新生ＲＮＡの５’末端領域に対応するＤＮＡフラグメントである。このため、例えば、前記ＤＮＡフラグメントの配列情報を決定することにより、前記新生ＲＮＡの５’末端領域の配列情報、つまり転写開始点からの配列情報を決定できる。これによって、例えば、ゲノムワイドにおけるＤＮＡエレメントの同定、すなわちゲノムにおけるＤＮＡエレメントの位置の同定が、より高精度となる。これにより、例えば、未知のエンハンサー等の機能性ＤＮＡエレメントの同定が可能となる。
本発明の解読方法は、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含む場合、例えば、前記調製解読工程において、いわゆるｎＡｎＴ−ｉＣＡＧＥ法に基づく手法を用いることができる。前記ｎＡｎＴ−ｉＣＡＧＥ法は、特に制限されず、例えば、Murata et al. 2014 Methods Mol Biol. 1164 67-85を参照できる。
本発明の解読方法は、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含む場合、例えば、前記調製解読工程において、テンプレートスイッチ法に基づく手法を用いることができる。前記テンプレートスイッチ法（nano-CAGE法）は、特に制限されず、例えば、Plessy et al. 2010 Nature Methods 7, 528-534が参照できる。
本発明の解読方法は、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含む場合、例えば、前記調製解読工程において、HeliScopeCAGE法に基づく手法を用いることができる。前記HeliScopeCAGE法には、特に制限されず、例えば、Kanamori-Katayama et al. 2011 Genome Res. 21 (7): 1150-1159等を援用できる。
本発明の解読方法は、前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含む場合、例えば、前記調製解読工程において、いわゆるＣＡＧＥ法に基づく手法を用いることができる。前記ＣＡＧＥ法は、特に制限されず、例えば、国際公開ＷＯ２００３／１０６６７２、特表２００５−５３５３１１、特開２００９-７２０６２等を援用できる。
ＣＡＧＥ法に基づく本形態において、前記調製解読工程は、例えば、前記鋳型ＲＮＡを用いて、前記核酸にリンカーが結合したリンカー付加核酸を調製する調製ステップと、
前記リンカー内に認識部位を有し且つ前記核酸内に切断部位を有する制限酵素を用いて、前記リンカー付加核酸を切断する切断ステップと、
得られた切断物から、前記ＲＮＡの５’末端領域に対応するフラグメントを回収する回収ステップとを含む。前記核酸が前記ＲＮＡの５’末端領域に対応するＤＮＡ核酸の場合、例えば、前記リンカー付加核酸は、リンカー付加ＤＮＡ核酸であり、前記ＲＮＡの５’末端に対応するフラグメントは、前記ＲＮＡの５’末端に対応する（相補的な）ＤＮＡフラグメントである。また、前記核酸が前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の場合、例えば、前記リンカー付加核酸は、リンカー付加ＲＮＡ核酸であり、前記ＲＮＡの５’末端に対応するフラグメントは、前記ＲＮＡの５’末端に対応する（同一の）ＲＮＡフラグメントである。
前記調製ステップにおいて、前記リンカー付加ＤＮＡ核酸の調製は、特に制限されず、例えば、以下のような形態が例示できる。
（１）前記鋳型ＲＮＡに対するＤＮＡ核酸を合成し、前記ＤＮＡ核酸に前記リンカーを結合することにより、前記リンカー付加ＤＮＡ核酸を調製する。
（２）前記鋳型ＲＮＡの５’末端のキャップ構造を、前記リンカーに対応するオリゴヌクレオチドに置換し、得られた５’末端置換型の鋳型ＲＮＡに対するＤＮＡ核酸を合成することにより、前記リンカー付加ＤＮＡ核酸を調製する。
前記（１）の調製ステップは、例えば、下記ステップ（１ａ）およびステップ（１ｂ）を含む。
（１ａ）前記鋳型ＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ核酸を調製するステップ
（１ｂ）前記ＤＮＡ核酸に、少なくとも１つの前記リンカーを結合するステップ
前記リンカーは、その内部に、前記切断ステップで使用する制限酵素の認識部位を有する配列である。前記リンカーが結合した前記リンカー付加ＤＮＡ核酸は、例えば、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域に対応するＤＮＡ核酸内に、前記制限酵素の切断部位が存在する。このため、前記切断ステップにおいて、前記リンカー付加ＤＮＡ核酸は、前記制限酵素により切断され、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域に対応するＤＮＡフラグメントが切り出される。
前記ステップ（１ａ）において、前記ＤＮＡ核酸の調製は、例えば、前記鋳型ＲＮＡを用いた逆転写反応により行うことができ、具体的には、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記鋳型ＲＮＡに対応するＤＮＡ核酸を増幅することにより行うことができる。
前記ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、１種類を使用してもよいし、２種類以上のカクテルを用いてもよい。前記ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、熱安定性であることが好ましく、具体例としては、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｏｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍａｔｅｒ Ａｍｐ Ａｍｐｌｉ Ｔｈｅｒｍ ＤＮＡポリメラーゼ等があげられる。
前記増幅においては、例えば、逆転写反応に必要な各種試薬を使用でき、例えば、ランダムプライマー等があげられる。
前記ステップ（１ａ）は、例えば、
前記鋳型ＲＮＡの５’キャップ構造をオリゴヌクレオチドに置換するステップと、
鋳型として前記鋳型ＲＮＡを使用して、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することにより、前記鋳型ＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ核酸を調製するステップ
とを含んでもよい。
前記ステップ（１ａ）は、例えば、
鋳型として前記鋳型ＲＮＡを使用して、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することにより、得られた前記第１のｃＤＮＡ鎖と前記鋳型ＲＮＡとのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを産生するステップと、
前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから、５’キャップ構造を特異的に認識する選択的結合物質を使用して、前記５’キャップ構造を有する特定のｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを選択するステップと、
前記鋳型ＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ核酸を回収するステップ
とを含んでもよい。
前記選択的結合物質は、特に制限されず、例えば、キャップ結合タンパク質またはキャップ結合抗体である。
前記選択的結合物質は、例えば、支持体に結合した状態で使用してもよい。前記支持体は、特に制限されず、例えば、磁性ビーズ、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、セファロースマトリクス、シリカゲルマトリクス、またはガラスビーズ等があげられる。
前記ステップ（１ａ）は、例えば、
鋳型として前記鋳型ＲＮＡを使用して、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することにより、得られた前記第１のｃＤＮＡ鎖と前記鋳型ＲＮＡとのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを産生するステップと、
前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから、前記鋳型ＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ核酸を回収するステップ
とを含んでもよい。
前記ステップ（１ａ）は、例えば、
鋳型として前記鋳型ＲＮＡを使用して、第１のｃＤＮＡ鎖を合成することにより、得られた前記第１のｃＤＮＡ鎖と前記鋳型ＲＮＡとのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを産生するステップと、
前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに、５’キャップ構造に対する選択的結合物質（第１物質）をコンジュゲートするステップと、
前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを、もう一つのマッチする選択的結合物質（第２物質）を固定した支持体に接触させるステップと、
前記支持体に固定された前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから、前記鋳型ＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ核酸を回収するステップ
とを含んでもよい。ここで、もう一つのマッチする選択的結合物質（第２物質）は、例えば、前記選択的結合物質（第１物質）に特異的に結合するものである。このため、前記ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを前記支持体に接触させることによって、前記ハイブリッドに結合した前記選択的結合物質（第１物質）と、前記支持体に固定された前記マッチする選択的結合物質（第２物質）とが結合し、結果的に、前記支持体に前記ハイブリッドが固定される。
前記選択的結合物質（第１物質）と前記マッチする選択的結合物質（第２物質）との組合せは、特に制限されない。前記組合せは、例えば、前記選択的結合物質（第１物質）が、ビオチンであり、前記マッチする選択的結合物質（第２物質）が、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンに特異的に結合するそれらの誘導体からなる群から選択される物質である。また、例えば、前記選択的結合物質（第１物質）が、ジゴキシゲニンであり、前記マッチする選択的結合物質（第２物質）が、ジゴキシゲニンに対する抗体である。前記支持体は、例えば、前述と同様である。
前記ステップ（１ｂ）は、例えば、
前記鋳型ＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ核酸の末端領域に、前記リンカーを結合するステップと、
鋳型として前記リンカーを結合したＤＮＡ核酸（以下、「第１のｃＤＮＡ鎖」ともいう）を使用して、第２のｃＤＮＡ鎖を合成するステップと、
得られた前記リンカーが結合した前記第１のｃＤＮＡ鎖と前記第２のｃＤＮＡ鎖との二本鎖ｃＤＮＡ（以下、「リンカー結合二本鎖ｃＤＮＡ」ともいう）を、制限酵素により処理するステップと、
前記制限酵素による分解物から、前記リンカーと、前記鋳型ＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列に対応するｃＤＮＡの一部とを含むフラグメントを回収するステップ、とを含む。ここで、前記リンカーは、例えば、前記制限酵素の認識部位を少なくとも１つ有し、前記制限酵素は、例えば、前記認識部位とは異なる部位を切断する酵素であることが好ましい。前記フラグメントにおいて、前記リンカーは、例えば、前記リンカーの一部を含んでもよいし、前記リンカーの全配列を含んでもよい。
前記ステップ（１ｂ）において、前記リンカーは、例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド領域を含んでもよく、この場合、例えば、前記リンカーを使用して前記第２のｃＤＮＡ鎖を合成してもよい。
前記ステップ（１ｂ）において、前記第２のｃＤＮＡ鎖は、例えば、前記リンカーと部分的または全てが相補的な他のオリゴヌクレオチドを使用して合成してもよい。
前記ステップ（１ｂ）において、前記リンカーは、例えば、選択的結合物質（第１物質）が結合してもよいし、その内部に前記選択的結合物質（第１物質）を含んでもよい。この場合、前記ステップ（１ｂ）における前記回収ステップは、例えば、前記制限酵素による分解物を、もう一つのマッチする選択的結合物質（第２物質）を固定した支持体に接触させることにより、前記選択的結合物質（第１物質）を前記マッチする選択的結合物質（第２物質）に結合させ、前記支持体を回収するステップを含む。前記ステップ（１ｂ）において回収する前記フラグメントは、前述のように前記リンカーを含む。このため、前記リンカーにおける前記選択的結合物質と、前記支持体に固定化された前記マッチする選択的結合物質（第２物質）とが結合することで、前記支持体に、前記フラグメントが結合され、前記支持体の回収により、前記フラグメントを回収できる。前記選択的結合物質（第１物質）、前記マッチする選択的結合物質（第２物質）および前記支持体は、例えば、前述の例示と同様である。
前記ステップ（１ｂ）において、前記制限酵素は、特に制限されず、例えば、クラスII制限酵素、クラスIII制限酵素があげられる。クラスII制限酵素としては、例えば、クラスIIＧ制限酵素、クラスIIＳ制限酵素があげられる。前記制限酵素の具体例としては、例えば、ＧｓｕＩ、ＭｍｅＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓｇＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、およびＸｍａｊＩからなる群から選択される酵素があげられる。
前記（２）の調製ステップは、例えば、下記ステップ（２ａ）、ステップ（２ｂ）およびステップ（２ｃ）を含む。
（２ａ）前記鋳型ＲＮＡの５’キャップ構造をオリゴヌクレオチドに置換するステップ
（２ｂ）鋳型として前記鋳型ＲＮＡを使用して、第１のｃＤＮＡ鎖を合成するステップ
（２ｃ）鋳型として前記第１のｃＤＮＡ鎖を使用して、第２のｃＤＮＡ鎖を合成するステップ
前記（２）の調製ステップでは、前記ステップ（２ｂ）と（２ｃ）とにより、前記第１のｃＤＮＡ鎖と前記第２のｃＤＮＡ鎖とからなる二本鎖ｃＤＮＡが、前記リンカー付加ＤＮＡ核酸として得られる。前記切断ステップでは、この二本鎖ｃＤＮＡに対して、制限酵素処理が施される。
前記（２）の調製ステップでは、前記オリゴヌクレオチドは、前記リンカーともいえる。前記オリゴヌクレオチドは、その内部に、前記切断ステップで使用する制限酵素の認識部位を有する配列である。前記ステップ（２ｂ）で合成される第１のｃＤＮＡ鎖は、その３’側に前記オリゴヌクレオチドに対応する配列（リンカー）を有し、また、前記ステップ（２ｃ）で合成される第２のｃＤＮＡ鎖は、前記オリゴヌクレオチドと同じ配列（リンカー）を有し、両者は、それぞれ、鋳型ＲＮＡの５’末端領域に対応するＤＮＡ核酸内に、それぞれ、前記制限酵素の切断部位が存在する。このため、前記切断ステップにおいて、前記二本鎖ｃＤＮＡ（前記リンカー付加ＤＮＡ核酸）は、前記制限酵素により切断され、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域に対応するＤＮＡフラグメントが切り出される。
本発明の解読方法において、前記調製方法に続く前記切断ステップは、前述のように、前記リンカー内に認識部位を有し且つ前記核酸内に切断部位を有する制限酵素を用いて、前記リンカー付加ＤＮＡ核酸を切断する切断ステップである。
前記切断ステップにおける前記制限酵素は、特に制限されず、前記リンカーに応じて適宜決定できる。前記制限酵素としては、例えば、前述の例示が援用できる。
本発明の解読方法において、前記切断ステップに続く前記ステップは、前述のように、前記切断ステップにおいて得られた切断物から、前記ＲＮＡの５’末端領域に対応するＤＮＡフラグメントを回収する回収ステップである。前記ＤＮＡフラグメントの回収方法は、特に制限されない。
前記回収するＤＮＡフラグメントの長さは、特に制限されないが、例えば、５〜１００ｂｐ、１５〜３０ｂｐ、１０〜３０ｂｐである。
本発明の解読方法において、例えば、前記回収したＤＮＡフラグメントを、ベクター等に連結してもよい。そして、前記ＤＮＡフラグメントを連結したベクターを用いて、例えば、前記ＤＮＡフラグメントの配列決定を行ってよい。
本発明の解読方法において、例えば、回収した２個以上の前記ＤＮＡフラグメントを連結して、コンカテマーを調製してもよく、また、例えば、前記コンカテマーを、ベクター等に連結してもよい。
［ＤＮＡエレメントの分析方法］
本発明の分析方法は、前述のように、ＤＮＡエレメントの分析方法であり、
前記本発明の解読方法により、ＲＮＡの５’末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する解読ステップと、
前記解読した配列情報に基づき、前記ＲＮＡの合成をコードするＤＮＡエレメントをゲノム配列にマッピングするマッピングステップとを含むことを特徴とする。
本発明の分析方法において、「分析」とは、例えば、ゲノムにおけるＤＮＡエレメントの位置の同定、ＤＮＡエレメントの活性量の定性または定量等の意味も含む。本発明の分析方法において、「前記核酸の重複数（もしくは発現量）」は、例えば、ＤＮＡエレメントの「活性化度」ということもできる。ＤＮＡエレメントが活性化されることでＲＮＡが発現する場合、例えば、前記ＲＮＡの発現量は、間接的に、ＤＮＡエレメントの活性量に対応し、前記ＲＮＡを鋳型として調製される前記核酸（例えば、ＤＮＡフラグメント等のフラグメント）の発現量も、間接的に、ＤＮＡエレメントの活性量に対応することになる。
本発明において、分析対象である「ＤＮＡエレメント」は、例えば、既知でもよいし、未知でもよい。本発明によれば、未知のＤＮＡエレメントについても、例えば、ゲノム上における位置を決定する同定および活性量の定量が可能である。
本発明における「ＤＮＡエレメント」は、前述のように、「前記ＲＮＡの合成をコードするＤＮＡエレメント」であり、具体的には、「活性化によるＲＮＡの合成」をコードするＤＮＡエレメントである。例えば、エンハンサー等は、前述のように、活性化によって、エンハンサーそのものからＲＮＡが生じるのではなく、エンハンサーの両端から両方向にＲＮＡを生じるものであり、活性化による前記ＲＮＡの合成をコードする機能ＤＮＡエレメントである。このため、本発明において、前記ＲＮＡの合成をコードするＤＮＡエレメントとは、例えば、活性化により、「ゲノム上においてＤＮＡエレメントそのものとは異なる領域に対応するＲＮＡの合成」をコードするＤＮＡエレメントともいえる。なお、本発明は、これには制限されず、前記ＤＮＡエレメントは、例えば、「ＤＮＡエレメントそのものに対応するＲＮＡの合成」をコードするものでもよい。
本発明の分析方法によれば、例えば、前記マッピングステップより、前記ＤＮＡエレメントを同定できる。また、本発明の分析方法によれば、例えば、マッピングした前記ＤＮＡフラグメントの重複数から、前記ＤＮＡエレメントの活性量を定量することができる。
以下に、本発明の解読方法および分析方法を例示するが、本発明は、これには制限されない。
＜ステップ１＞
ステップ１は、サンプル中のＲＮＡの５’末端に対応する部位を含むｃＤＮＡを選択的に回収することである。ｃＤＮＡを、例えば、テンプレートとしてＲＮＡの使用によって合成することができる。
所望の細胞、組織、または生物から採取したＲＮＡを出発物質として使用することができる。ＲＮＡの調製方法は、例えば、前述の通りである。
また、全長ｃＤＮＡライブラリーを使用して、遺伝子の転写部分の５’末端に対応する５’末端核酸を単離することができる。
ステップ１自体を、公知の方法によって実施することができる。言い換えれば、全長ｃＤＮＡの構築方法および少なくともＲＮＡの５’末端に対応する部位を含むｃＤＮＡフラグメントの合成方法が既に公知であり、任意のこれらの方法を適用することができる。好ましい方法の１つは、キャップトラッパー法である（例えば、Piero Carninci et al., Methods in Enzymology, Vol.303, pp.19-44, 1999）。このキャップトラッパー法を以下に説明する。しかし、本発明は、キャップトラッパー法の使用に制限されず、ｃＤＮＡの他の富化または選択アプローチを同様に適用することができる。
キャップトラッパー法は、最初に、テンプレートとしてＲＮＡを使用し、逆転写酵素を使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成する。公知の方法によってこれを行うことができる。ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマーを使用して開始することができ、テンプレートＲＮＡがｍＲＮＡである場合、ランダムプライマーを使用してこれを開始することができる。逆転写酵素の安定化によって逆転写反応効率を高めるので、反応溶液にトレハロースを添加することが望ましい（米国特許第６，０１３，４８８号）。いくつかの制限酵素での内部ｃＤＮＡ切断を回避し、且つ、制限酵素での意図しない広範な切断を回避するので、標準的なｄＣＴＰの代わりに、５−メチル−ｄＣＴＰを使用することが好ましい。さらに、第１のｃＤＮＡ鎖の合成後、タンパク質および消化ペプチドを、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）処理または他のより一般的なｃＤＮＡ精製方法によって除去することができる。
次に、選択的結合物質を、ＲＮＡのキャップ構造に結合する。本明細書中の「選択的結合物質」は、特定の物質に選択的に結合する物質を意味する。このような選択的結合物質には、好ましくはビオチンが含まれるが、ビオチンに限定されない。キャップ構造は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端の構造であるが、例えば、エンハンサーからの転写物であるエンハンサーＲＮＡにもみられる、このため、エンハンサーＲＮＡを特異的に選択可能である。したがって、ＲＮＡを出発物質として使用する場合、選択的結合物質のみがＲＮＡのキャップ構造に結合する。さらに、５’末端のキャップ構造が喪失した場合、選択的結合物質は、ＲＮＡに結合しない。公知の方法によって、ビオチンをキャップ構造に結合させることができる。例えば、ＮａＩＯ4等の酸化剤でのＲＮＡの処理、およびビオチンヒドラジドとの反応によるキャップ構造内のジオール基の最初の酸化によって、キャップ構造をビオチン化することができる。
一本鎖ＲＮＡを、ＲＮアーゼＩ処理等の手段によって切断する。一本鎖ＲＮＡを切断することができるがｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを切断できない任意の他のＲＮアーゼ、または種々の特異性を有する種々の一本鎖ＲＮＡ配列を切断することができるＲＮアーゼのカクテルを、代わりに使用することができる。第１のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡの５’末端に対応する部位に伸張されたｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでは、ＲＮＡの５’末端周辺は、ｃＤＮＡとハイブリッド形成できないために一本鎖である。したがって、一本鎖部分でハイブリッドを切断して、このステップにより、そのキャップ構造が喪失する。したがって、このステップにより、キャップ構造を維持するためにＲＮＡの５’末端を完全に伸長するｃＤＮＡを有する、これらのＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのみが遊離される。
上記選択的結合物質と選択的に結合する支持体に固定した、マッチする選択的結合物質を調製する。本明細書では、「マッチする選択的結合物質」は、上記選択的結合物質に選択的に結合する物質を意味し、選択的結合物質がビオチンの場合、例えば、ビオチンまたはその誘導体に特異的に結合するアビジン、ストレプトアビジン、またはその誘導体である。前記支持体は、磁性ビーズ、特に磁性多孔質ガラスビーズであることが好ましいが、これらに限定されない。ストレプトアビジンが固定された磁性多孔質ガラスビーズは、市販されているので、このような市販のストレプトアビジンコーティング磁性多孔質ガラスビーズを使用することができる。同様に、多孔質ガラスビーズの代わりに、ラテックスビーズ、ラテックス磁性ビーズ、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはセファロースビーズ等の他の材料を使用することができる。さらに、本発明は、ビオチン−アビジン系の使用に限定されないが、キャップ構造に結合するジゴキシゲニンタグおよび固体マトリクスに結合した抗体を認識するジゴキシゲニン等の他の結合物質を使用することができる。
これにしたがって、キャップ構造上の選択的結合物質を支持体上のマッチする選択的結合物質に結合させ、それにより、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを支持体上のキャップ構造に固定するために、キャップ構造を有する上記ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを、支持体に固定された上記のマッチする選択的結合物質と反応させる。支持体として磁性ビーズを使用する場合、磁力の印加によって、磁性ビーズを迅速に回収することができる。一方、支持体への非特異的結合を防止すべく、この反応前のこのような結合を遮断するために、支持体を、大過剰のＤＮＡを含まないｔＲＮＡで処理することが好ましい。表面の遮断に適切な他の物質は、例えば、核酸または誘導体（例えば、全ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド）；タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）；多糖（例えば、グリコーゲン、硫酸デキストラン、ヘパリン、または他の多糖）である。上記の一部を含むハイブリッド分子を使用して、非特異的結合部位をマスクすることができる。
上記は、キャップトラッパー法によってステップ１を行う場合について注目しているが、例えば、ＲＮＡの５’末端に相補的な部位を含むｃＤＮＡを選択的に回収することができる限り、他の方法も使用することができる。
キャップ選択の代わりに、ＲＮＡの５’末端をＢＡＰ（細菌アルカリホスファターゼ）等のホスファターゼで脱リン酸化し、その後、脱キャップ酵素ＴＡＰ（タバコ酸性ピロホスファターゼ）で処理することができる。その後、ＲＮＡリガーゼを用いて、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを、元のキャップ構造の代わりに、ＲＮＡの５’末端に結合することができる（Maruyama K, Sugano S Gene 138, 171-4 (1994)）。この方法では、例えば、クラスII認識部位またはクラスIII認識部位を、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端に存在するライゲーションステップ時に使用したオリゴヌクレオチド配列またはリボヌクレオチド配列中に、位置付けることができる。次いで、このクラスII認識部位またはクラスＩＩＩ認識酵素を使用して、ｃＤＮＡを切断し、５’末端タグを産生することができる。
ビオチンの代わりに、キャップ結合タンパク質（Pelletier et al. Mol Cell Biol 1995 15: 3363-71; Edery I. et al., Mol Cell Biol 1995 Jun; 15(6): 3363-71）またはキャップ構造に特異的に結合する抗体（Theissen H et al. EMBO J. 1986 Dec 1; 5(12): 3209-17）を、上記の選択的結合物質として使用することができる。
あるいは、Ｇｅｎｓｅｔに記載のように、オリゴヌクレオチドを、キャップ構造に化学的に結合する方法を使用することができる。この方法は、キャップ構造の酸化に基づく（米国特許第６，０２２，７１５号）。これにより、（１）クラスIIＳ認識酵素の認識部位またはクラスIII認識酵素の認識部位を含み得るオリゴヌクレオチドに、キャップを付加し、（２）第１のｃＤＮＡ鎖を調製し、その後、第２のｃＤＮＡ鎖合成に変換することが可能である。
あるいは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈに記載のように、キャップスイッチ法を使用することができる（米国特許第５，９６２，２７２号）。クラスIIＳ認識酵素またはクラスIII認識酵素を使用することができるように、核酸を認識して認識配列からはなれて切断することができる物質の認識部位を保有するキャップスイッチオリゴヌクレオチドの存在下で、第１のｃＤＮＡ鎖を調製することができる。キャップスイッチ機構は、第１の鎖の合成を、キャップスイッチオリゴヌクレオチド上で継続させる。第２のｃＤＮＡ鎖によって、これを継続し、その後、例えば、ＳＭＡＲＴ（商標）Ｃｌｏｎｔｅｃｈクローニングシステムに記載のＰＣＲステップを行うことができる。
別の実施形態では、ＲＮＡの質に依存して、ランダムプライミングおよびキャップ構造までのｃＤＮＡの伸長により、５’末端を使用することができる。特定の酵素および反応条件により、高い効率でキャップ部位に達する場合がある（Carninci et al, Biotechniques, 2002）。キャップ選択を用いない場合でさえも、キャップ構造の代わりに、その後、コンカテマーの産生に使用されるクラスIIＳ認識酵素部位またはクラスIII認識酵素部位を保有するオリゴヌクレオチドに結合することが可能である。
最後に、ｃＤＮＡをクラスII（クラスIIＳまたはクラスIIＧ）制限酵素またはクラスIII制限酵素で切断して、５’末端タグを産生することができる。その後のコンカテマーの形成で、５’末端タグを使用する。機械的切断を含む任意の他の方法を、おそらく使用することができる。
図１は、本発明の作業の流れの例をまとめている。図１によれば、本発明の方法を行うために、転写領域の５’末端を、複数のＲＮＡ分子もしくはエンハンサーからのＲＮＡ画分を富化した複数のＲＮＡ分子、または全長ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。
複数のＲＮＡ分子に本方法を適用する場合、相補ｃＤＮＡ鎖を合成するためのテンプレートとして、ＲＮＡ分子を使用することができる。転写領域の５’末端を含むＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを富化するために、ｃＤＮＡ鎖を選択ステップに供する。アルカリでの加水分解によるｍＲＮＡ部分の除去または破壊後、転写領域の５’末端を含む第１のｃＤＮＡ鎖プールを調製する。
本発明の異なる実施形態では、全長ｃＤＮＡライブラリーを使用して、ｃＤＮＡクローンの５’末端を含むＲＮＡプールを調製することができる。次いで、テンプレートとして上記ＲＮＡプールを使用して一本鎖ｃＤＮＡプールを合成する。アルカリでの加水分解によるＲＮＡ分子の除去または破壊後に第１のｃＤＮＡ鎖の一部が得られ、得られた第１のｃＤＮＡ鎖プールは、転写領域の５’末端を含む。転写領域は、本発明のさらなる処理に利用可能である。全長ｃＤＮＡライブラリーから出発する場合、５’末端の選択は必要ないことに留意のこと。
＜ステップ２＞
ステップ１に続いて、少なくともＲＮＡの５’末端に相補的な部位を含むｃＤＮＡを含むフラグメントを、選択的に回収するためにステップ２を行う。
上記キャップトラッパー法を使用する場合、支持体上に固定した第１のｃＤＮＡ鎖を、遊離する。水酸化ナトリウム等のアルカリでの支持体の処理によって、これを行うことができる。アルカリの代わりに、ＲＮアーゼＨ（ＤＮＡとハイブリッド形成したＲＮＡのみを切断する）での酵素反応を、使用することができる。アルカリ処理により、ＲＮＡ上にキャップを介して支持体に結合したＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドから、ｃＤＮＡが放出され、ＲＮＡからｃＤＮＡが分離されて、第１のｃＤＮＡ鎖自体のみが遊離する。
次いで、認識配列の外側の認識されたＤＮＡを切断する酵素活性を有する物質によって、リンカーを、配列特異的様式で認識される配列を保持するｃＤＮＡに付加する。このような物質は、一定のクラスII制限酵素およびクラスIII制限酵素が含まれるが、これらに限定されない。
この実施形態では、少なくともクラスIIＳ制限酵素部位またはクラスIII制限酵素部位、および３’末端にランダムオリゴマー部分を保有するリンカーを、上記ＲＮＡの５’末端に対応する、この第１のｃＤＮＡ鎖の末端（すなわち、ｃＤＮＡの３’末端）にライゲーションする。その後の５’末端配列タグのコンカテマーへのクローニングのために、第２の認識部位を、リンカーに導入することが好ましいが、必須ではない。第２の認識部位は、例えば、クラスIIＳ認識酵素またはクラスIII認識酵素に使用する上記認識部位と異なることが好ましい。
好ましくは、クラスIIＳ認識酵素部位またはクラスIII認識酵素部位、およびランダムオリゴマー部分を保有するリンカーを使用して、これを行うことができる（ＳＳＬＬＭ（一本鎖リンカーライゲーション法）、Y. Shibata et al., BioTechniques, Vol.30, No.6, pp.1250-1254, 2001）。クラスIIＳ制限酵素およびクラスIII制限酵素は、認識部位以外の部分を切断する制限酵素群である。クラスIIＳ制限酵素の例には、ＧｓｕＩの使用が含まれるが、これらに限定されない。ＧｓｕＩ処理により、認識部位から１６ｂｐ下流の鎖および認識部位から１４ｂｐ下流の他の鎖の１つが切断される。別の適切な例は、その認識配列からそれぞれ２０塩基および１８塩基離れて切断するＭｍｅＩである。クラスIII制限酵素の例には、その認識部位から、それぞれ２５ｂｐおよび２７ｂｐ離れて切断するＥｃｏＰ１５１が含まれるが、これらに限定されない。ランダムオリゴマー部分は、リンカーの３’末端に存在し、塩基数は特に制限されないが、推奨数は５〜９個、より好ましくは５〜６個である。クラスIIＳ制限酵素部位またはクラスIII制限酵素部位は、切断点がｃＤＮＡ内となるように、上記ランダムオリゴマー部分付近に存在することが好ましい。好ましくは、リンカーは、上記ランダムオリゴマー部分が３’末端に突き出して結合末端が得られる二本鎖ＤＮＡのリンカーである。さらに、その後の回収を促進する前に、リンカーに、ビオチン等の選択的結合物質を結合させることが望ましい。
上記の第１のｃＤＮＡ鎖を、このようなリンカーと反応させる場合、リンカーのランダムオリゴマー部分は、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端（すなわち、テンプレートＲＮＡの５’末端）とハイブリッド形成する。次に、プライマーとしてこのリンカーを使用し、且つテンプレートとして第１のｃＤＮＡ鎖を使用することによって、第２のｃＤＮＡ鎖を合成する。標準的な方法によって、このステップを行うことができる。本発明の異なる実施形態では、複数の核酸に対するハイブリッド形成およびその後の一本鎖および二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたは二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの物理的分離によって、第１のｃＤＮＡ鎖を除去することができる。米国特許出願第２００２０１０６６６６号に開示の方法（この方法に限定するものではない）によって、このような除去ステップを行うことができる。除去ステップを省略した上記アプローチに類似した標準的な手順による、第２の鎖の合成用テンプレートとして除去ステップから回収した一本鎖ｃＤＮＡを使用する。
次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡを、上記クラスIIＳ制限酵素またはクラスIII制限酵素で処理する。このステップでは、リンカー由来の部分およびｃＤＮＡの５’末端由来の部分（第２のｃＤＮＡ鎖の５’末端）を含む二本鎖ｃＤＮＡフラグメントを調製する。例として、ＧｓｕＩをクラスIIＳ制限酵素として使用する場合、および上記ランダムオリゴマー部位からすぐ上流に制限部位を位置付けるようにリンカーをデザインする場合、得られたＤＮＡフラグメントは、長さが１６ｂｐ（相補鎖は１４ｂｐ）の第２のＤＮＡ鎖の５’末端上の部位（すなわち、ＲＮＡの５’末端上の部位）由来の部位を含む。ＭｍｅＩを使用する場合、第２のＤＮＡ鎖フラグメントの長さは、それぞれ２０ｂｐおよび１８ｂｐに増加し、ＥｃｏＰ１５Ｉの場合、それぞれ２５ｂｐおよび２７ｂｐに増加する。
次に、このようなＤＮＡフラグメントを選択的に回収する。選択的結合物質（例えば、ビオチン）が上記のリンカーに結合している場合、マッチする選択的結合物質（例えば、ストレプトアビジン）を固定した支持体の使用によって、ステップ１と同様に回収することができる。この手順によりステップ２を終了し、少なくとも上記ＲＮＡの５’末端に相補的な部位を含む第１のｃＤＮＡ鎖に属するｃＤＮＡ部位を含むフラグメントを、選択的に回収する。
上記は、ステップ２のためにＳＳＬＬＭを使用する場合について説明しているが、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端（テンプレートｍＲＮＡの５’末端）を含むフラグメントを選択的に回収することができる限り、任意の他の方法によってもステップ２を実施することができる。例えば、制御された速度にて、５’→３’方向でヌクレオチドを切断するエキソヌクレアーゼを使用することが可能である。所定の時間の第１のｃＤＮＡ鎖のエキソヌクレアーゼ処理により、第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端（テンプレートＲＮＡの５’末端）を含む一本鎖フラグメントが遊離する。二本鎖フラグメントのみを分割するヌクレアーゼでの処理により、ターゲティングした一本鎖フラグメントのみを得ることが可能である。これらのフラグメントを回収し、アダプターと連結し、クローン化することができる。
５’末端に対応する上記の選択されたフラグメントを、リンカーにさらにライゲーションし、その後、質がクローニング等の以後の適用に不十分である場合、ＰＣＲ増幅のために使用することができる。
１つの実施形態では、ＲＮＡの５’部分に対応するフラグメントを、３’末端で、第１のリンカーで使用した制限部位と異なり得る別の制限酵素部位のみを含むリンカーに、ライゲーションする。その後、ｍＲＮＡの５’末端に対応するフラグメントは、両側に制限酵素の制限部位を保有するリンカーを含む。このようなフラグメントを、ＰＣＲによって増幅し、その後、１つまたは２つの制限酵素で切断して、以下により詳細に記載したコンカテマーのクローニングに適切なＤＮＡフラグメントを産生することができる。
論文（Velculescu et al, 1995）に類似した別の実施形態では、上記ＤＮＡフラグメントまたはＰＣＲ産物を、最初に、互いに、反対方向にライゲーションされた２つの５’末端特異的フラグメントから構成される二量体分子の形成に使用する。次いで、これらの二量体を、直接または別のＰＣＲ増幅の直後に使用して、以下により詳細に特定したコンカテマーを産生することができる。
本発明のまさに別の実施形態では、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの代わりに、ＲＮＡポリメラーゼは、両末端に適切なリンカーを有する５’末端に対応するフラグメントを、一次的に増幅することができる。次いで、逆転写酵素ステップによって、ＤＮＡフラグメントを再構築し、第２の鎖を形成してコンカテマーを形成する。
＜ステップ３＞
その後のステップ３は、回収したフラグメントの相互ライゲーションによってコンカテマーを形成する。複数のＲＮＡが存在し、且つリンカーが上記のランダムオリゴマー部分で第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリッド形成するので、上記の方法により、サンプル内の複数のＲＮＡ由来の複数のｃＤＮＡを含むフラグメントを得ることができる。ステップ３は、これらの複数のフラグメントをライゲーションしてコンカテマーを形成する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（これに限定するものではない）に基づいた市販のライゲーションキットを使用した標準的な方法によって、ｃＤＮＡフラグメントのライゲーションを行うことができる。最初に、第２のリンカーを移入して、より以前の段階で使用した他の認識部位と異なる制限酵素の認識部位を獲得し、その後、２つのフラグメントをライゲーションして、反対方向に２つの５’タグを含む二量体（ジタグ）とし、これらのライゲーションしたジタグフラグメントを、さらにライゲーションして、コンカテマーにする方法によってライゲーションを安全に行うことができるが、この方法に限定されない。しかし、本発明の性能は、中間ジタグのクローニングに依存しない。単量体タグを直接自己ライゲーションして、本発明を実施するための長さを満たすコンカテマーを形成することができる。したがって、本発明は、ジタグの使用を制限も依存しない。ライゲーションフラグメント数は、制限されず、実際、２つ以上の任意の数、好ましくは少なくとも２０〜３０個が、本発明の実施に適切である。得られたコンカテマーを、標準的な方法によって増幅またはクローン化することが好ましいが、これらに限定されない。
この方法で得られたコンカテマーは、それぞれサンプル内の複数のＲＮＡの５’末端と同一の塩基配列（しかし、ＲＮＡ中のウラシルはＤＮＡ中のチミンである）を有する部位を含む。リンカー由来の部分も含むにもかかわらず、リンカーの塩基配列は、実験デザインから公知であるので、リンカー由来の部分およびＲＮＡ由来の部分をコンカテマーの塩基配列の調査によって、明白に区別することができる。したがって、得られたコンカテマーの塩基配列の決定により、サンプル内の複数のＲＮＡの５’末端に塩基配列を見出すことが可能である。ＧｓｕＩ、ＭｍｅＩ、またはＥｃｏＰ１５Ｉの好ましい使用様式により、各ＲＮＡの５’末端に、最大１６、２０、または２５塩基の塩基配列を確認することができる。１６、２０、または２５塩基に関する情報は、ＲＮＡのほぼ確実且つ満足な同定および新規のＲＮＡであるかどうかの判断に十分である。さらに、コンカテマーの塩基配列の決定により、コンカテマー中に含まれる上記フラグメント数（好ましくは２０〜３０）について、ＲＮＡの５’末端の塩基配列を確認することが可能であり、それにより複数のＲＮＡの５’末端に関する情報を効率よく決定することができる。コンカテマー分析を、５’末端由来の配列とリンカー由来の配列とを区別するためのコンピュータソフトウェアの使用によって、自動化することができる。
上記形態中のコンカテマーから得られた特異的５’末端タグ由来の配列を、NCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)またはAccelrys Inc.(http://www.accelrys.com/)からGenetics Computer Group(GCG)パッケージとして利用可能なＦＡＳＴＡ等の配列アラインメントを実施するための標準的なソフトウェアソリューションによって、その同一性を分析することができる。このようなソフトウェアソリューションにより、５’末端特異的配列タグを、互いにアラインメントして、データベース検索におけるクラスター化およびさらなる使用のための固有または非重複タグを同定する。次いで、このような全ての非重複配列タグを、それぞれ計数し、各非重複タグの同一サンプルから得られた全タグ数への寄与について、さらに分析することができる。各タグの全タグ数への寄与により、複数のＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー内の転写物を定量することが可能である。各サンプルでこのような方法で得られた結果を、互いの発現パターンを比較するために、他のサンプルから得た類似のデータとさらに比較することができる。したがって、本発明により、１つまたは複数のサンプル内の各転写物の発現をプロファイリングし、基準データベースを確立することが可能である。
上記のように得た特異的５’末端配列タグをさらに使用して、部分配列または全配列が得られるゲノム内の転写領域を同定することができる。ゲノム配列に５’末端特異的配列を整列させるためのNCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等の標準的なソフトウェアソリューションを使用して、このような検索を行うことができる。ゲノム配列に２０ｂｐのタグを特異的にマッピングされることが見出されたが、いくつかの場合、例えば、下記のアプローチの１つによってコンカテマーから得られた最初の配列情報を、拡大する必要があり得る。伸長配列の使用により、ゲノム中の活発に転写された領域を、より正確に同定可能である。同様に、同一のアプローチおよびソフトウェアソリューションを使用して、他のデータベース（例えば、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html）、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（http://www.ebi.ac.uk/Databases/index.html）、またはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）等）中の関連配列を検索することができる。
ゲノム配列にマッピングすることができる特異的５’末端配列タグにより、調節配列を同定することが可能である（Suzuki Y et al. EMBO Rep. 2001 May; 2(5): 388-93 and Suzuki Y et al. Genome Res. 2001 May; 11(5): 677-84）。遺伝子では、転写領域の５’末端の上流ＤＮＡは、通常、遺伝子発現の調節で使用されるほとんどの調節エレメントを含む。これらの調節配列を、転写因子の結合部位に関する情報を保持するデータベースの検索によって、その機能性についてさらに分析することができる。転写因子結合部位およびTranscription RegulatoryRegion Database(TRRD)(http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases/trrd4/)、TRANSFAC(http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/)、TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)、およびGenomatix Software(http://www.genomatix.de/)から提供されたPromoterInspectorを含むプロモーター分析のための公的に利用可能なデータベースにより、プロモーターおよびエンハンサー領域のコンピュータ分析リソースが得られる。
５’末端特異的配列タグまたはゲノムへの５’末端配列のマッピングによって得られた配列情報を、さらに使用して、所与の標的遺伝子の調節を操作することができる。このような実験では、プロモーター関連情報を使用して、その活性を変化させるか、人工プロモーターと置き換える。あるいは、５’末端特異的タグにより、遺伝子相互作用のためのアンチセンスまたはＲＮＡｉプローブをデザインするための配列情報を得ることができる。
本発明の異なる実施形態では、コンカテマー由来の配列情報を使用して、全長ｃＤＮＡのクローニング用の特異的プライマーを合成することができる。このようなアプローチでは、所与の５’末端特異的タグ由来の配列を使用して、正方向プライマーをデザインする一方で、逆方向プライマーの選択は、増幅反応で使用するテンプレートＤＮＡに依存する。生体サンプルから得た複数のＲＮＡ由来のテンプレートおよびオリゴｄＴプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行うことができる。第１のステップでは、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡプールを合成する。第２のステップでは、５’末端特異的タグ由来の正方向プライマーおよびオリゴｄＴプライマーを使用して、ｃＤＮＡプールから全長ｃＤＮＡを増幅する。同様に、５’末端タグ由来の正方向プライマーおよびベクターネスト化逆方向プライマーを使用して、既存のｃＤＮＡライブラリーから特異的全長ｃＤＮＡを増幅することができる。
上記方法は出発物質としてサンプル内のＲＮＡを使用する一方で、既存の全長ｃＤＮＡライブラリーを使用することによりステップ１を省略することができる。この方法では、全長ｃＤＮＡライブラリー中に含まれる複数のｃＤＮＡの５’末端（すなわち、ｃＤＮＡのテンプレートとして使用されるＲＮＡの５’末端）の塩基配列に関する情報を、上記手順と同様に効率よく得ることができる。
本発明を実施するために使用した出発材料から独立して、発現の異なる遺伝子の５’末端の富化または低濃度の転写物の濃縮のためのサブトラクティブハイブリダイゼーションおよび物理的分離によって、第１の一本鎖ｃＤＮＡ材料を分画することができる。
いくつかの実施形態では、転写領域の５’末端から伸長配列情報を得ることが望ましい。特定の場合、このような伸長配列により、タンパク質合成の開始部位を同定するか、ゲノム配列により良好にマッピングすることができる。上記のように、本発明は、ステップ２に、ｃＤＮＡの５’末端へのリンカーのライゲーションを含んでいた。リンカーのような特異的核酸フラグメントに結合またはライゲーションするためのコンカテマーから得た配列を含む一本鎖突出末端の移入を、標的特異的様式で使用することができる。ライゲーション後、リンカーを使用して、支持体へのリンカーの結合によって、ＤＮＡフラグメントを富化することができ、これを、富化後に放出することができる。プライマーとしてリンカーをさらに使用して、富化前に使用した液相中または固相上に５’末端に関する伸長配列情報を得ることができる。
本発明によって得られたコンカテマーの塩基配列または伸長５’配列の調査により、上記の新規遺伝子をクローニングすることが可能なだけでなく、サンプル内の遺伝子の発現プロフィールを調査することが可能である。さらに、ゲノム中の転写開始部位のマッピング、プロモーターやエンハンサー使用パターンのマッピング、プロモーターやエンハンサー領域中のＳＮＰ分析、発現分析とプロモーターやエンハンサー情報との組み合わせによる遺伝子ネットワークの作成、別のプロモーターやエンハンサー使用および転写因子の利用可能性、および断片化ゲノムＤＮＡ内のプロモーターやエンハンサー部位の選択的回収等の種々の目的のために、このテクノロジーを使用することができる。プロモーター部位を含むゲノムフラグメントを選択するために、例えば、上記ビオチン系の使用によって、ｍＲＮＡの５’末端と同一の塩基配列を含むフラグメントを支持体に結合し、断片化ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成することができる。次いで、ハイブリッド形成ゲノムＤＮＡフラグメントを、例えば、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズの使用によって、ゲノムフラグメントの混合物から分離し、標準的な条件下でクローニングすることができる。
あるいは、全長ｃＤＮＡの混合物にライゲーションし、均一なオリゴヌクレオチド配列を保有する磁性ビーズに結合させた選択された５’末端タグの作製および使用ならびにその後のＳＳＬＬＭ、二本鎖ｃＤＮＡ調製、およびクラスIIＳまたはクラスIII制限酵素での切断等におけるライゲーションによって、コンカテマークローニングを回避することができる。５’末端特異的タグをビーズに特異的に固定し、Lynx Therapeuticsに類似の特異的配列決定のために使用する（米国特許第６，３５２，８２８号；同第６，３０６，５９７号；同第６，２８０，９３５号；同第６，２６５，１６３号；および同第５，６９５，９３４号）。
例えば、オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの５’末端と結合する「ランダム部分Ｉ」およびライゲーション産物を「タグ化する」ことができるオリゴヌクレオチドのコード部分を有する。ｃＤＮＡとハイブリッド形成しない場合、エキソヌクレアーゼVIIによってオリゴヌクレオチドを破壊することができる。「デコーダー」オリゴヌクレオチドを使用して、配列を拾い出す。次いで、ビーズ上のｃＤＮＡの特異的アレイを、１箇所あたり１つ固体表面上に整列させ、平行配列決定を行う。上記アプローチにより液体アレイ形式をデザイン可能であり、各ビーズを独立した標識によって標識し、配列分析等のために個別に処理することができる。
本発明の異なる実施形態では、公知の５’末端特異的タグを、コンカテマーのクローニングおよび配列決定を省略した５’末端特異的配列の別の分析のために、使用することができる。このような場合、約２５ｂｐの５’末端特異的オリゴヌクレオチドを合成し、固体支持体に固定して、５’末端特異的マイクロアレイを形成する。次いで、サンプルから得た５’タグのハイブリッド形成により、サンプル中に存在する転写物を同定および定量することが可能である。マイクロアレイの標準的な調製方法および使用は、分子生物学分野の当業者に公知である（Jordan B., DNA Microarrays: Gene Expression Applications, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, 2001: Schena A, DNA Microarrays, A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford 1999）。
５’末端の直接配列決定または５’末端特異的マイクロアレイへのハイブリッド形成による読出しのための上記アプローチの修正形態によって、本発明は、コンカテマー形態での５’末端の一般的分析または５’末端特異的選択によって富化された各５’末端分析の異なる手段を提供する。
図２は、上記ステップ２および３による作業の流れの例をまとめる。図２では、例示として、３３ｂｐのＤＮＡフラグメントのクローニングのために、制限酵素ＸｍａＪＩ、ＭｍｅＩ、およびＸｂａＩを使用する。原則的に、５’末端特異的タグのクローニングは以下のステップを含む。
図１に概説した本発明の最初のステップでは、一本鎖ｃＤＮＡのプールが得られる。プールは、ＲＮＡから転写された５’末端領域を含む。ＲＮＡから転写した５’末端領域を含む一本鎖ｃＤＮＡの一部に隣接して、特異的リンカー（本明細書中で「第１のリンカー」と命名する）をライゲーションして、その結合部位または５’末端転写領域内の第１のリンカーの外側を切断する制限酵素の認識部位を得る。図中に記載された例の目的のため、認識部位の２１ｂｐ下流を切断し、それによりＲＮＡの転写領域の５’末端を含むタグを末端化する制限酵素ＭｍｅＩを使用する。また、「第１のリンカー」のための第２の制限酵素を得る。この例の目的のために、５’末端特異的タグのその後のクローニングのためにＸｍａＪＩを使用する。
その後、「第１のリンカー」を使用して、第２の相補ｃＤＮＡ鎖の合成を開始し、それによりＲＮＡの転写領域の５’末端を含み、５’末端領域転写ＲＮＡを含む領域に隣接する結合部位に関して、第１のリンカーの外側に存在する部位で切断する制限酵素の認識部位を有する二本鎖ｃＤＮＡ分子が得られる。
この例の目的のための切断部位の外側を切断する上記制限酵素は、ＭｍｅＩである。ＭｍｅＩでの切断により、ＲＮＡの転写領域の５’末端および「第１のリンカー」を含み、且つ、ＭｍｅＩの切断部位に一本鎖ＤＮＡ突出末端を有するタグの二本鎖ｃＤＮＡフラグメントが得られる。
ＭｍｅＩの切断部位の上記一本鎖ＤＮＡ突出末端に、「第２のリンカー」をライゲーションして、ｃＤＮＡフラグメントのクローニングに適切な制限酵素の制限部位またはＰＣＲによる増幅のテンプレートとして機能するタグが得られる。
「第１のリンカー」、ＲＮＡから転写された領域の５’末端を含むｃＤＮＡフラグメント、および「第２のリンカー」を含むｃＤＮＡフラグメントを、第１のリンカーに結合した選択的結合物質による支持体への選択的結合によって精製する。
転写領域の５’末端またはタグを含むｃＤＮＡフラグメントのクローニングの目的のために、「第１のリンカー」、ＲＮＡから転写された５’末端領域を含むｃＤＮＡフラグメントまたはタグ、および「第２のリンカー」を含む上記ｃＤＮＡ画分を、ＰＣＲによって増幅し、リンカー部分を制限酵素で切り出してタグをコンカテマーにライゲーションする。この例の目的のために、上記ｃＤＮＡフラグメントから３３ｂｐのフラグメントを切り出す制限酵素ＸｍａＪＩおよびＸｂａＩを使用する。適切な精製ステップ後、例えば、ＲＮＡの転写領域の５’末端を含む３０個までのタグを含むコンカテマーの形成のために、３３ｂｐのフラグメントを互いにライゲーションするかそれぞれクローニングする。
ＲＮＡから転写した５’末端領域を含むライブラリーを調製するために、配列決定ベクターにコンカテマーをクローン化することができる。
図３は、５’末端タグの直接配列決定のための別のアプローチを例示するための本発明の作業原理の流れを示す。本発明のこの実施形態の目的のために、ＲＮＡから転写された５’末端領域を含み、且つ図１にまとめたように得た一本鎖ｃＤＮＡを、この例の目的のために、固体支持体上にライゲーション産物を固定するための特異的標識を有する「第１のリンカー」と命名されたリンカーに、ライゲーションする。このリンカーを、第１の鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖の合成のためのプライマーとして、使用することができる。ＲＮＡから転写された５’末端領域を含む領域に隣接する二本鎖リンカーを有する一本鎖ＤＮＡまたは５’末端転写領域を含む二本鎖ＤＮＡを、この例の目的のために、ＲＮＡの５’末端の高処理連続配列決定アプローチによる個別または並行配列決定に進めることができる。
［実施例１］
まず、ＭＣＦ７細胞から、定法に従って核を回収した。回収した核に、ウレア含有変性緩衝液を添加し、所定濃度（０．５、１、２、４ｍｏｌ／Ｌ）のウレアで変性処理を行い、核内成分を、可溶分画（ｎｕｃｌｅａｒ）とクロマチン分画（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）とに分離した。そして、前記可溶分画と前記クロマチン分画とについて、ウェタンブロッティングにより、ＧＡＰＤＨ、Ｕ１ｓｎＲＮＰ７０、ポリメラーゼIIを検出した。ＧＡＰＤＨは、細胞質のマーカーであり、Ｕ１ｓｎＲＮＰ７０は、核内可溶分画のマーカーである。これらのウェスタンブロッティングの結果を、図４に示す。図４に示すように、Ｕ１ｓｎＲＮＰ７０は、相対的に、前記可溶分画において検出され、前記クロマチン分画には検出されなかったことから、効率良く分画できていることがわかった。そして、前記クロマチン分画には、リン酸化された活性ＲＮＡポリメラーゼ（ａｃｔｉｖｅ ＰｏｌII）が濃縮しており、前記クロマチン分画に、合成中のＲＮＡポリメラーゼが存在することが示された。
［実施例２］
従来のＣＡＧＥ法は、鋳型ＲＮＡとして、トータルＲＮＡを使用する方法である。この方法を、以下、通常のＣＡＧＥ法という。他方、ＣＡＧＥ法に本発明を適用する場合、鋳型ＲＮＡとして、新生ＲＮＡを使用する。そこで、鋳型ＲＮＡとして新生ＲＮＡを使用する本発明を適用したＣＡＧＥ法を、以下、本発明におけるＮＥＴ−ＣＡＧＥ（Native Elongating Transcript-Cap Analysis of Gene Expression）法と呼ぶ。本実施例では、前記実地例１で得られたクロマチン分画からＲＮＡを回収することで、新生ＲＮＡを得て、この新生ＲＮＡを鋳型としてＮＥＴ−ＣＡＧＥ法を行った。そして、ＭＣＦ７細胞から回収したトータルＲＮＡを使用する前記通常のＣＡＧＥ法との比較を行った。特に示さない限り、以下の実施例も同様とした。
論文（Andersson et al. Nature 2014）ですでに発表されている、ＦＡＮＴＯＭ５計画において同定された既知のエンハンサー領域について、ＭＣＦ７細胞における通常のＣＡＧＥによるリード数と、本発明のＮＥＴ−ＣＡＧＥによるリード数とを、図５のグラフに示す。図５において、Ｘ軸は、通常のＣＡＧＥのリード数であり、Ｙ軸は、ＮＥＴ−ＣＡＧＥのリード数であり、それぞれの点は、一つのエンハンサー領域を意味する。図５に示すように、ほとんどのエンハンサー領域において、通常のＣＡＧＥと比較して、本発明のＮＥＴ−ＣＡＧＥでは、数倍から十倍以上のシグナル（リード数）が認められた。また、通常のＣＡＧＥでは全く検出できなかったエンハンサーも、ＮＥＴ−ＣＡＧＥによれば、十分なリード数で検出されているものが多く存在した。これらの結果から、本発明のＮＥＴ−ＣＡＧＥによれば、通常のＣＡＧＥより飛躍的に高い感度でエンハンサーを検出できるといえる。
［実施例３］
論文（Andersson et al. Nature 2014）ですでに発表されている、ＦＡＮＴＯＭ５計画において同定された既知のエンハンサー領域について、ＭＣＦ７細胞における通常のＣＡＧＥによるリード数と、ＭＣＦ７細胞における前記ＮＥＴ−ＣＡＧＥによるリード数とに基づいて、再現性を確認した。これらの結果を、図６のグラフに示す。図６において、Ｘ軸およびＹ軸は、前記論文で同定された既知のエンハンサー領域にマップされたリード数を示す。図６に示すように、通常のＣＡＧＥでは、前記論文のリード数に対して、相関係数が０．６９であり、本発明におけるＮＥＴ−ＣＡＧＥは、前記論文のリード数に対して、相関係数が、０．６５であった。この結果から、本発明におけるＮＥＴ−ＣＡＧＥによっても、通常のＣＡＧＥと同様に、再現性良く、高い信頼度で定量的にエンハンサーを同定できることがわかった。
［実施例４］
ＭＣＦ７細胞を用いて、通常のＣＡＧＥと前記ＮＥＴ−ＣＡＧＥとを施行した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の上流領域について、通常のＣＡＧＥおよび前記ＮＥＴ−ＣＡＧＥによって得られたＣＡＧＥタグの分布を、それぞれ図７に示す。図７は、Integrative Genomics Viewer（ＩＧＶ）のゲノムブラウザーのブラウザービューであり、図に示されているゲノム座標位置に、マップしているＣＡＧＥタグが示されており、横軸は、ゲノムの位置座標である。本実施例は、本発明におけるＮＥＴ−ＣＡＧＥにより、通常のＣＡＧＥでは同定できない新規のエンハンサー候補の同定を示すことを目的とするため、図７は、プラウザービューの一部を抜粋して示す。具体的には、図７の上部に示すプロモーターのピークのすそ野におけるタグを示す。図７において、枠線で囲まれていない矢印は、センス方向にマッピングしたＣＡＧＥタグであり、枠で囲まれた矢印は、アンチセンス方向にマッピングしたＣＡＧＥタグである。矢印で示した領域には、対称性の逆方向のＣＡＧＥタグが分布する領域であり、この領域は通常のＣＡＧＥではＣＡＧＥタグを実質検出できないが、前記ＮＥＴ−ＣＡＧＥによってのみ十分数のＣＡＧＥタグが検出された。このように、対称性に逆方向にＣＡＧＥタグが存在する領域は、エンハンサーに特徴的な所見であり、この領域がエンハンサーであることを強く示唆している。なお、この領域は、ＦＡＮＴＯＭ５計画ではエンハンサーと同定できていないことから、本発明におけるＮＥＴ−ＣＡＧＥにより同定された新規のエンハンサー候補と考えられる。つまり、本発明を適用した前記ＮＥＴ−ＣＡＧＥによれば、通常のＣＡＧＥでは検出不可能な新規のエンハンサーを同定できるといえる。
その例によって、本発明をここに記載する。本発明は、実施例に制限されないことに留意すべきである。分子生物学分野の標準的技術を有する当業者は、実施例に記載の実験を実施することができる。文中で別記していない限り、実施例中で使用した技術用語、略語、およびソリューションは、本発明の分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。このような用語、略語、および溶液の一般的な説明を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Sambrook and Russel,2001）中の一般的試薬で見出すことができる。本明細書中に記載の全ての刊行物は、参照することにより、本明細書中で開示ならびに方法および／または材料を記載するために組み込まれる。
この出願は、２０１６年１月２７日に出願された日本出願特願２０１６−０１３５７５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
以上のように、本発明によれば、例えば、エンハンサー等の機能性ＤＮＡエレメントについて、より高感度な同定と、転写量の定量が可能である。

Claims (13)

  1. 鋳型ＲＮＡを用いて、
    前記ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸もしくは前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸、または、２つ以上の配列が連結された配列を有する核酸を調製し、前記核酸をＣＡＧＥ法により配列解読する調製解読工程を含み、
    前記調製解読工程において、使用する前記鋳型ＲＮＡが、非標識新生ＲＮＡ（Ｎａｓｃｅｎｔ ＲＮＡ）であることを特徴とする、ＲＮＡの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する方法。
  2. 前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
    前記調製解読工程において、ｎＡｎＴ−ｉＣＡＧＥ法に基づく手法を用いる、請求項１記載の解読方法。
  3. 前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
    前記調製解読工程が、
    前記核酸にリンカーが結合したリンカー付加核酸を調製する調製ステップと、
    前記リンカー内に認識部位を有し且つ前記核酸内に切断部位を有する制限酵素を用いて、前記リンカー付加核酸を切断する切断ステップと、
    得られた切断物から、前記ＲＮＡの５’末端領域に対応するフラグメントを回収する回収ステップとを含む、請求項１記載の解読方法。
  4. 前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
    前記調製解読工程において、テンプレートスイッチ法に基づく手法を用いる、請求項１記載の解読方法。
  5. 前記調製解読工程において、前記調製する核酸が、前記鋳型ＲＮＡの５’末端領域のＲＮＡ核酸および前記ＲＮＡの５’末端領域に対応する相補ＤＮＡ核酸の少なくとも一方の核酸を含み、
    前記調製解読工程において、HeliScopeCAGE法に基づく手法を用いる、請求項１記載の解読方法。
  6. 前記非標識新生ＲＮＡが、単一の細胞種由来のＲＮＡまたは単一の組織由来のＲＮＡである、請求項１から５のいずれか一項に記載の解読方法。
  7. 前記非標識新生ＲＮＡが、転写過程における鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼIIと合成中のＲＮＡとの複合体から単離されたＲＮＡである、請求項１から６のいずれか一項に記載の解読方法。
  8. さらに、生体試料から前記非標識新生ＲＮＡを単離する単離ステップを含み、
    単離した前記非標識新生ＲＮＡを、前記鋳型ＲＮＡとして使用する、請求項１から７のいずれか一項に記載の解読方法。
  9. 前記単離ステップにおいて、
    前記生体試料から、転写過程における鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼIIと合成中のＲＮＡとの複合体を含むクロマチンを分離し、
    前記クロマチンから、前記複合体に含まれる前記合成中のＲＮＡを、非標識新生ＲＮＡとして分離する、請求項８記載の解読方法。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の解読方法により、ＲＮＡの末端領域に対応する核酸の塩基配列を解読する解読ステップと、
    前記解読した配列情報に基づき、前記ＲＮＡの合成をコードするＤＮＡエレメントをゲノム配列にマッピングするマッピングステップとを含むことを特徴とする、ＤＮＡエレメントの分析方法。
  11. 前記マッピングステップにおいて、前記マッピングにより前記ＤＮＡエレメントを同定する、請求項１０記載の分析方法。
  12. さらに、マッピングした前記核酸の重複数から、前記ＤＮＡエレメントの活性量を定量するステップを含む、請求項１０または１１記載の分析方法。
  13. 前記定量した前記ＤＮＡエレメントの活性量と、
    ゲノム上のＤＮＡ変異および遺伝子多型の少なくとも一方とを関連させる、請求項１２記載の分析方法。
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