KR20170020704A - 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법 - Google Patents

개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170020704A
KR20170020704A KR1020167036348A KR20167036348A KR20170020704A KR 20170020704 A KR20170020704 A KR 20170020704A KR 1020167036348 A KR1020167036348 A KR 1020167036348A KR 20167036348 A KR20167036348 A KR 20167036348A KR 20170020704 A KR20170020704 A KR 20170020704A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
oligonucleotide
sequences
cell
Prior art date
Application number
KR1020167036348A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102531677B1 (ko
Inventor
벤자민 제이 힌슨
크리스토퍼 마틴 힌슨
레빈 마이클 슈낼
케빈 딘 네스
미르나 자로스
서지 사소노브
폴 하던볼
라지브 바라와지
그레이스 엑스와이 정
필립 벌그레이더
Original Assignee
10엑스 제노믹스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 10엑스 제노믹스, 인크. filed Critical 10엑스 제노믹스, 인크.
Priority to KR1020237015588A priority Critical patent/KR20230070325A/ko
Publication of KR20170020704A publication Critical patent/KR20170020704A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102531677B1 publication Critical patent/KR102531677B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B20/00—Methods specially adapted for identifying library members
    • C40B20/04—Identifying library members by means of a tag, label, or other readable or detectable entity associated with the library members, e.g. decoding processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • C40B50/16—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support involving encoding steps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/191—Modifications characterised by incorporating an adaptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/149—Sequential reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Abstract

개별 세포 또는 세포 개체군의 내용물의 분할된 분석을 통해 개별 세포 또는 세포 개체군을 분석하기 위한 방법, 조성물 및 시스템. 개별 세포 또는 세포 개체군은 세포 내용물에 접근하기 위해, 그리고 소정의 세포 또는 세포 개체군의 내용물을 독특하게 확인하고, 그리고 차후에, 염기서열결정을 통한 세포의 핵산의 분석 및 특징화를 비롯하여, 세포의 내용물을 분석하고 이를 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 유래된 것으로 특징짓기 위해 처리 시약으로 공분할된다.

Description

개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법{METHODS OF ANALYZING NUCLEIC ACIDS FROM INDIVIDUAL CELLS OR CELL POPULATIONS}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/017,558 및 2014년 10월 8일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 62/061,567에 우선권을 주장하고, 이들 출원은 각각, 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
배경
생물학적 및 생화학적 물질 및 시스템을 분석하고 특징짓는데 있어서 유의미한 진전은 수명, 건강, 질환 및 치료의 기전을 이해하는데 있어서 전례 없는 진전을 야기하였다. 이들 진전 중에서, 생물학적 시스템의 유전체 구성을 표적으로 하고 특징짓는 기술은 유전자 증폭 기술 및 핵산 염기서열결정 기술의 이용 및 활용에서 진전을 비롯하여, 가장 획기적인 결과 중에서 일부를 산출하였다.
핵산 염기서열결정은 진단학, 예측학, 생명공학, 그리고 법의생물학을 비롯한 매우 다양한 생물의학 배경에서 정보를 획득하는데 이용될 수 있다. 염기서열결정은 Maxam-Gilbert 염기서열결정 및 사슬-종결 방법을 비롯한 기본적인 방법, 또는 샷건 염기서열결정 및 가교 PCR을 비롯한 데노보 염기서열결정 방법, 또는 폴로니 염기서열결정, 454 파이로시퀀싱, Illumina 염기서열결정, SOLiD 염기서열결정, Ion Torrent 반도체 염기서열결정, HeliScope 단일 분자 염기서열결정, SMRT® 염기서열결정 등을 비롯한 차세대 방법을 수반할 수 있다.
생물학적 특징화에서 이들 진전에도 불구하고, 많은 과제가 여전히 다뤄지지 않은 채로 남아있거나, 또는 현재 제공되는 해법에 의해 상대적으로 불량하게 다뤄진다. 본 발명은 현재 기술의 단점 중에서 많은 것을 해소하는 신규한 해법 및 접근법을 제공한다.
짧은 요약
핵산의 분석, 그리고 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 및 이들로 핵산의 귀인을 비롯하여, 개별 세포 또는 작은 세포 개체군을 분석하기 위한 방법, 조성물 및 시스템이 본원에서 제공된다.
본 발명의 한 양상은 세포로부터 핵산을 분석하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 개별 세포로부터 유래된 핵산을 구별된 파티션 내로 제공하고; 구별된 파티션 내에 핵산으로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하고, 상기 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열은 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 거기에 부착하였고; 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열, 또는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 특징화를 산출하고, 상기 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열은 공통 바코드 서열을 포함하고; 그리고 최소한 부분적으로, 산출된 특징화에서 공통 핵산 바코드 서열의 존재에 근거하여, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 개별 세포로부터 유래되는 것으로 확인하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 구별된 파티션은 구별된 비말이다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 중에서 최소한 10,000, 최소한 100,000 또는 최소한 500,000개가 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 비드에 부착되게 제공되는데, 여기서 비드 상에 각 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하고, 그리고 상기 비드는 개별 세포로, 구별된 파티션 내로 공분할된다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 비드에 방출가능하게 부착된다. 일부 구체예에서, 비드는 분해성 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하기에 앞서 또는 산출하는 동안, 상기 방법은 비드의 분해를 통해 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 방출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 구별된 파티션으로부터 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 방출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 특징화를 산출하는 것은 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 염기서열결정하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 서열로부터, 개별 세포의 유전체의 최소한 일부에 대한 인접한 핵산 서열을 조립하는 것을 포함할 수 있다. 게다가, 상기 방법은 또한, 개별 세포의 유전체의 최소한 일부에 대한 핵산 서열에 근거하여 개별 세포를 특징짓는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 핵산은 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 방출된다. 일부 구체예에서, 핵산은 리보핵산 (RNA), 예를 들면, 예로서, 전령 RNA (mRNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 조건 하에, 핵산을 역전사에 종속시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 역전사는 구별된 파티션에서 발생한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 구별된 파티션에서 제공되고 폴리-T 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 역전사는 폴리-T 서열을 각 핵산의 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 폴리-T 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 폴리-T 서열의 혼성화를 용이하게 하는 정착 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 예로서, 무작위 헥사머일 수 있는 무작위 기폭 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 역전사는 무작위 기폭 서열을 각 핵산의 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 무작위 기폭 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 중에서 소정의 하나는 이들 핵산 중에서 소정의 하나의 최소한 일부에 서열 상보성을 갖는다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션은 기껏해야, 복수의 세포 중에서 개별 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 독특한 분자 서열 분절을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 최소한 부분적으로, 독특한 분자 서열 분절의 존재에 근거하여, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 개별 핵산 서열을 이들 핵산 중에서 소정의 핵산으로부터 유래된 것으로 확인하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 독특한 분자 서열 분절의 존재에 근거하여 소정의 핵산의 양을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 특징화를 산출하기에 앞서, 하나 또는 그 이상의 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부가하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 스위치 올리고뉴클레오티드의 도움으로, 첫 번째 추가 핵산 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부가하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 스위치 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 중에서 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 주형 지향된 방식으로 연장되어 첫 번째 추가 핵산 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 연계한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 증폭은 구별된 파티션에서 발생한다. 일부 구체예에서, 증폭은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 구별된 파티션으로부터 방출한 후 발생한다.
일부 구체예에서, 증폭 후, 상기 방법은 첫 번째 추가 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 핵산 서열을 부가하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 서열을 부가하는 것은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 거기에 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 핵산 서열을 연계하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제거는 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 (가령, 결찰된) 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열의 전단을 통해 완결된다.
일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 RNA 단편을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 전사는 구별된 파티션으로부터 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 방출한 후 발생한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 T7 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 RNA 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 RNA 서열에 연계하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 추가 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 RNA 서열을 역전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 RNA 서열을 역전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 DNA 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 DNA 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 DNA 서열에 연계하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 특징화를 산출하기에 앞서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산은 개별 세포로부터 RNA의 역전사로부터 산출된 상보성 (cDNA)를 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 기폭 서열을 포함하고 구별된 파티션에서 제공된다. 일부 구체예에서, 기폭 서열은 무작위 N-mer을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 기폭 서열을 cDNA에 혼성화하고, 그리고 기폭 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 구별된 파티션은 올리고뉴클레오티드의 보체 서열을 포함하는 스위치 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 스위치 올리고뉴클레오티드를 핵산으로부터 유래된 핵산 단편 중에서 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 스위치 올리고뉴클레오티드를 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 올리고뉴클레오티드를 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부착하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열은 핵산으로부터 유래된 핵산 단편이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 것은 올리고뉴클레오티드를 핵산에 연계하는 (가령, 결찰하는) 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 파티션은 구별된 파티션을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 평균적으로, 파티션 마다 1개보다 적은 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션 중에서 25%보다 적은 파티션은 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 각각 최소한 하나의 분할된 세포를 갖는 구별된 파티션을 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션 중에서 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하가 하나 이상의 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션의 최소한 부분집합은 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션 중에서 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 최소한 99%가 최소한 하나의 세포 및 최소한 하나의 비드를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 구별된 파티션은 분할된 핵산 바코드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 구별된 파티션은 최소한 1,000개, 최소한 10,000개, 또는 최소한 100,000개의 상이한 분할된 핵산 바코드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 최소한 1,000, 최소한 10,000 또는 최소한 100,000개의 파티션을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 복수의 상이한 세포 유형의 개체군에서 세포를 특징짓는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 개체군에서 개별 세포로부터 핵산을 구별된 파티션 내로 제공하고; 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편에 부착하고, 여기서 복수의 상이한 파티션은 상이한 공통 핵산 바코드 서열을 포함하고; 그리고 최소한 부분적으로, 공통 바코드 서열의 존재에 근거하여, 복수의 구별된 파티션으로부터 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편을 특징짓고, 그리고 하나 또는 그 이상의 단편을 개별 세포에 기인시키고; 그리고 복수의 구별된 파티션 내에 하나 또는 그 이상의 단편의 특징화에 근거하여 개체군에서 복수의 개별 세포를 특징짓는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 핵산을 단편화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 구별된 파티션은 비말이다. 일부 구체예에서, 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편을 특징짓는 것은 개별 세포로부터 리보솜 데옥시리보핵산을 염기서열결정하는 것을 포함하고, 그리고 세포를 특징짓는 것은 세포 속, 종, 계통 또는 변이체를 확인하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 마이크로바이옴 표본으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 인간 조직 표본으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 포유동물에서 순환성 세포로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 법의학 표본으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 핵산은 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 방출된다.
본 발명의 추가 양상은 개별 세포 또는 세포 개체군을 특징짓는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 세포를 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기 유형과 함께 배양하고, 여기서 각 상이한 세포 표면 결합 기 유형은 상이한 세포 표면 특질에 결합할 수 있고, 그리고 여기서 각 상이한 세포 표면 결합 기 유형은 존재하면, 하나 또는 그 이상의 세포 표면 특질 결합 기 및 이의 개별 세포 표면 특질 사이에 결합을 허용하는 조건 하에, 그것과 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함하고; 상기 세포를 바코드 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 파티션 내로 분할하고; 바코드 서열을 파티션 내에 존재하는 올리고뉴클레오티드 리포터 기에 부착하고; 올리고뉴클레오티드 리포터 기 및 부착된 바코드를 염기서열결정하고; 그리고 염기서열결정되는 리포터 올리고뉴클레오티드에 근거하여, 세포 상에 존재하는 세포 표면 특질을 특징짓는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 복수의 파티션을 포함하는 조성물을 제공하고, 복수의 파티션 각각은 개별 세포 및 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 개체군을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션은 유제에서 비말을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 파티션 각각 내에 올리고뉴클레오티드의 개체군은 복수의 파티션 각각 내에 배치된 비드에 연계된다. 일부 구체예에서, 개별 세포는 그들의 개별 세포 표면 특질과 연관된 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기를 그것과 연관시키고, 그리고 각 상이한 유형의 세포 표면 특질 결합 기는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 리포터 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기는 복수의 상이한 세포 표면 특질에 대한 결합 친화성을 갖는 복수의 상이한 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
본 발명의 추가 양상 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명확해질 것인데, 여기서 본 발명의 단지 예시적인 구체예가 도시되고 설명된다. 실현되는 바와 같이, 본 발명은 다른 구체예 및 상이한 구체예가 가능할 수 있고, 그리고 이의 여러 상세는 본 발명으로부터 전혀 벗어나지 않으면서, 다양한 명백한 관점에서 변형될 수 있다. 따라서, 이들 도면 및 상세한 설명은 성격에서 예시적이고, 그리고 제한적이지 않은 것으로 간주된다.
참조로서 편입
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 그리고 특허 출원은 마치 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로서 편입된다. 참조로서 편입된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 내포된 발명과 상충되면, 본 명세서는 임의의 이런 모순되는 자료를 대체하고 및/또는 이에 선행하는 것으로 의도된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규한 특질은 첨부된 청구항에서 구체적으로 진술된다. 본 발명의 특질과 이점의 더욱 충분한 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구체예를 진술하는 아래의 상세한 설명, 그리고 첨부 도면 (본원에서 또한, "도면 (Figure)" 및 "도면 (FIG.)")을 참조함으로써 획득될 것이다:
도면 1은 개별 세포 세포의 소집단을 분할하기 위한 미소유체 통로 구조를 개략적으로 도해한다.
도면 2는 세포 및 추가 시약을 포함하는 비드 또는 마이크로캡슐을 공분할하기 위한 미소유체 통로 구조를 개략적으로 도해한다.
도면 3은 세포의 핵산의 증폭 및 바코드화를 위한 실례 과정을 개략적으로 도해한다.
도면 4는 특징화에서 이용을 위해 서열 데이터를 개별 세포 또는 세포의 군에 기인시키는데 있어서 세포의 핵산의 바코드화의 이용의 개략적 도해를 제공한다.
도면 5는 표지화된 세포 결합 리간드와 연관된 세포의 개략적 도해를 제공한다.
도면 6은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업 흐름의 개략적 도해를 제공한다.
도면 7은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 리보핵산 (RNA)의 분석에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 8은 개별 바코드 보유 비드와 함께 공분할된 개별 세포의 이미지를 제공한다.
도면 9A-E는 RNA의 분석 및 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 10은 RNA의 실례 분석에서 이용 및 시험관내 전사에서 서열의 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 11은 RNA의 분석 및 RNA 분석을 수행하기 위한 실례 작업에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 12A-B는 RNA의 분석에서 이용을 위한 실례 바코드화된 올리고뉴클레오티드 구조의 개략적 도해를 제공한다.
도면 13A-C는 파티션에서 주형 스위치 역전사 및 PCR로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 14A-B는 다양한 세포 수를 갖는 파티션에서 역전사 및 cDNA 증폭으로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 15는 다양한 입력 세포 농도에서 cDNA 합성 및 실시간 정량적 PCR로부터 실례 수율, 그리고 또한, 고정된 세포 입력 농도에서 수율에 대한 변하는 프라이머 농도의 효과의 도해를 제공한다.
도면 16은 시험관내 전사로부터 실례 수율의 도해를 제공한다.
도면 17은 본원에서 제공된 방법을 실행하도록 프로그램되거나 또는 달리 설정된 실례 컴퓨터 제어 시스템을 보여준다.
상세한 설명
본 발명의 다양한 구체예가 본원에서 도시되고 설명되긴 했지만, 이런 구체예가 단지 실례로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 변이, 변화와 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 발생할 수 있다. 본원에서 설명된 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
값이 범위로서 설명되는 경우에, 이런 개시는 이런 범위 내에 모든 가능한 부분범위뿐만 아니라 특정한 수치 값 또는 특정한 부분범위가 명시적으로 언급된 지와 상관없이 이런 범위 내에 들어가는 특정한 수치 값의 개시를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
I. 단일 세포 분석
진전된 핵산 염기서열결정 기술은 개별 생물체 및 상대적으로 순수한 생물학적 표본에 관한 실제적인 서열 정보를 제공하는 것을 비롯하여, 생물학적 물질을 염기서열결정함에 있어서 기념비적인 결과를 산출하였다. 하지만, 이들 시스템은 표본의 전체 구성 중에서 더욱 작은 소수를 나타낼 수도 있지만, 개별화된 서열 정보가 훨씬 귀중한 것으로 입증될 수 있는 생물학적 표본에서 세포의 아개체군을 확인하고 특징짓는데 효과적인 것으로 입증되지 않았다.
대부분의 핵산 염기서열결정 기술은 그들이 조직 또는 다른 표본으로부터 유래된 세포의 수집으로부터 염기서열결정하는 핵산을 도출한다. 세포는 세포 개체군의 평균을 나타내는 유전 물질을 추출하기 위해 일제히 처리될 수 있고, 이것은 이후, 소정의 염기서열결정 기술을 위해 설정되는 염기서열결정 준비 DNA 라이브러리로 처리될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 종종 DNA 또는 핵산에 관하여 논의된 바와 같이, 세포로부터 유래된 핵산은 예로서, 다양한 RNA-seq 방법 중에서 한 가지를 이용하여 DNA, 또는 염기서열결정을 위한 cDNA를 생산하도록 처리될 수 있는 RNA, 예를 들면, mRNA, 전체 RNA, 또는 기타 유사한 것을 포함할 수 있다. 이러한 과정에 따르면, 세포 특이적 마커가 부재하면, 표본 내에 세포의 부분집합 또는 모든 세포에 의해 기여되는 유전 물질의 귀인은 이런 앙상블 접근법에서 사실상 불가능하다.
특징을 세포 개체군의 특정 부분집합에 기인시키는 능력 없음에 더하여, 이런 앙상블 표본 제조 방법은 또한 시작부터, 세포의 표본 내에 다수 성분을 일차적으로 확인하고 특징짓는 성향이 있고, 그리고 표본 내에 소수 성분, 예를 들면, 한 세포, 소수의 세포, 또는 전체 세포 중에서 작은 백분율에 의해 기여된 유전 물질을 선발할 수 있도록 설계되지 않는다. 유사하게, 예로서 mRNA의 발현 수준을 분석하는 경우에, 앙상블 접근법은 발현 수준의 면에서 비-균질한 세포 개체군으로부터 잠재적으로 대단히 부정확한 데이터를 나타내는 성향이 있을 것이다. 일부 경우에, 발현이 분석된 개체군 내에 세포 중에서 작은 소수에서 높고, 그리고 개체군의 세포 중에서 다수에서 부재하는 경우에, 앙상블 방법은 전체 개체군에 대한 낮은 수준 발현을 지시할 것이다.
이들 표본으로부터 염기서열결정 라이브러리를 구축하는데 이용된 처리 작업 전반에서 이러한 본래 다수 선입견은 더욱 확대되고, 그리고 심지어 압도적이다. 특히, 대부분의 차세대 염기서열결정 기술은 염기서열결정 라이브러리에 대한 충분한 DNA를 생산하기 위해, 핵산 단편의 기하학적 증폭, 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응에 의존한다. 하지만, 이런 기하학적 증폭은 표본 내에 다수 성분의 증폭을 향한 선입견이 있고, 그리고 이런 소수 및 다수 성분의 시작 비율을 보존할 수 없다. 실례로서, 표본이 표본 내에 특정 세포 유형, 예를 들면, 숙주 조직 세포로부터 95 % DNA, 그리고 다른 세포 유형, 예를 들면, 암 세포로부터 5% DNA를 포함하면, PCR 기초된 증폭은 비교 지수 증폭의 함수 (더욱 높은 농도의 반복된 배가가 더욱 작은 분획물의 반복된 배가를 빠르게 앞지른다) 및 증폭 시약 및 자원의 격리의 함수 (더욱 큰 분획물이 증폭됨에 따라서, 프라이머 및 다른 증폭 시약을 우선적으로 활용한다) 둘 모두로서, 소수 DNA 대신에 다수 DNA를 우선적으로 증폭할 수 있다.
이들 어려움 중에서 일부가 상이한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, 증폭을 필요로 하지 않는 단일 분자 시스템을 활용함으로써 다뤄질 수 있긴 하지만, 이들 단일 분자 시스템뿐만 아니라 다른 차세대 염기서열결정 시스템의 앙상블 염기서열결정 방법은 또한, 충분히 큰 입력 DNA 요건을 요구할 수 있다. 특히, 단일 분자 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Pacific Biosciences SMRT 염기서열결정 시스템은 500 나노그램 (ng)으로부터 10 마이크로그램 (μg) 이상까지 표본 입력 DNA 요건을 가질 수 있는데, 이것은 개별 세포 또는 심지어 세포의 작은 아개체군으로부터 유래될 수 있는 것보다 훨씬 크다. 유사하게, 다른 NGS 시스템은 표본 내에 대략 50 ng 내지 약 1 μg의 표본 DNA의 시작 양에 대해 최적화될 수 있다.
II. 세포의 구획화 및 특징화
하지만, 작은 세포 개체군으로부터 핵산을 특징짓기 위한, 그리고 일부 경우에, 특히 더욱 큰 세포 개체군의 배경에서 개별 세포로부터 핵산을 특징짓기 위한 방법 및 시스템이 본원에서 개시된다. 이들 방법 및 시스템은 다른 차세대 시스템의 고처리량에 비-증폭된 단일 분자 방법의 귀인 이점을 제공할 수 있는 이점, 그리고 개별 세포 또는 세포의 작은 수집으로부터 도출가능한 극히 적은 양의 입력 핵산을 처리하고 염기서열결정할 수 있는 추가 이점을 제공한다.
특히, 본원에서 설명된 방법은 예로서, 개별 세포 또는 세포의 소집단으로부터 핵산을 비롯하여, 개별 세포 또는 작은 세포 개체군의 분석을 구획화하고, 그리고 이후, 상기 분석이 이들 핵산이 유래되었던 개별 세포 또는 세포의 소집단에 역으로 기인되도록 허용한다. 이것은 세포 개체군이 세포 유형의 50/50 혼합, 세포 유형의 90/10 혼합, 또는 사실상 임의의 비율의 세포 유형뿐만 아니라 상이한 세포 유형의 완전한 이질성 혼합, 또는 이들 사이에 임의의 혼합물을 나타내는 지에 상관없이 달성될 수 있다. 다른 세포 유형은 개체의 상이한 조직 유형으로부터, 상이한 개체로부터, 다른 속, 종, 계통, 변이체, 또는 전술한 것들 중에서 임의의 또는 모두의 임의의 조합으로부터 세포 또는 생물학적 생물체를 포함할 수 있다. 가령, 다른 세포 유형은 개체로부터 정상 조직 및 종양 조직, 환경적, 법의학적, 마이크로바이옴 또는 다른 표본으로부터 복수의 상이한 세균 종, 균주 및/또는 변이체, 또는 세포 유형의 다양한 다른 혼합물 중에서 한 가지를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 세포를 내포하는 표본 물질로부터 개별 세포의 핵산 내용물의 구별된 구획 또는 파티션 (본원에서 파티션으로서 교체 가능하게 지칭됨)으로의 구획화, 침적 또는 분할을 제공하는데, 여기서 각 파티션은 다른 파티션의 내용물로부터 자체 내용물의 분리를 유지한다. 독특한 식별자, 예를 들면, 바코드가 개별 세포의 특징의 특정 구획으로의 추후 귀인을 허용하기 위해, 구획화된 또는 분할된 세포를 유지하는 파티션에 미리, 차후에 또는 동시에 전달될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 일부 양상에서, 파티션은 컨테이너 또는 용기 (가령, 웰, 마이크로웰, 튜브, 나노어레이 기질에서 직선 포트, 예를 들면, BioTrove 나노어레이, 또는 다른 용기)를 지칭한다. 하지만, 많은 일부 양상에서, 구획 또는 파티션은 유체 흐름 내에서 가류성인 파티션을 포함한다. 이들 파티션은 예로서, 내부 유체 중심 또는 코어를 둘러싸는 외부 장벽을 갖는 마이크로캡슐 또는 마이크로소포로 구성될 수 있거나, 또는 이들은 자신의 매트릭스 내에 물질을 연행하고 및/또는 유지할 수 있는 다공성 매트릭스일 수 있다. 하지만, 일부 양상에서, 이들 파티션은 비수성 연속 상, 예를 들면, 오일 상 내에 방수의 비말을 포함한다. 다양한 상이한 용기는 예로서, 2013년 8월 13일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 13/966,150에서 설명되고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 유사하게, 비수성 또는 오일 연속 상에서 안정된 비말을 창출하기 위한 유제 시스템은 예로서, U.S. 특허 공개 번호 2010/0105112에서 상세하게 설명되고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
유제에서 비말의 경우에, 개별 세포를 구별된 파티션에 할당하는 것은 일반적으로, 비말이 두 흐름의 접합부에서 산출되도록, 방수 내에 세포의 유동 흐름을 비수성 유체의 유동 흐름 내로 도입함으로써 달성된다. 수성 세포-내포 흐름을 세포의 일정한 농도 수준에서 제공함으로써, 세포 숫자의 면에서 결과의 파티션의 점유의 수준을 제어할 수 있다. 일부 경우에, 단일 세포 파티션이 요망되는 경우에, 점유되는 파티션이 일차적으로 단독 점유되는 것을 담보하기 위해, 이들 파티션이 평균적으로, 파티션 마다 1개보다 적은 세포를 내포하도록, 유체의 상대적 유속을 제어하는 것이 바람직할 수 있다. 유사하게, 더욱 높은 백분율의 파티션이 점유되는 것을 제공하기 위해, 예를 들면, 극히 작은 백분율의 비점유된 파티션을 허용하기 위해, 유속을 제어하는 것이 요망될 수 있다. 일부 양상에서, 흐름 및 통로 구조는 원하는 숫자의 단독 점유된 파티션, 일정한 수준보다 적은 비점유된 파티션 및 일정한 수준보다 적은 복수 점유된 파티션을 담보하기 위해 제어된다.
많은 경우에, 이들 시스템 및 방법은 실제적인 다수의 점유된 파티션 (하나 또는 그 이상의 마이크로캡슐을 내포하는 파티션)이 점유된 파티션 마다 1개 이내의 세포를 포함하도록 담보하는데 이용된다. 일부 경우에, 분할 과정은 점유된 파티션 중에서 25% 이하가 하나 이상의 세포를 내포하고, 그리고 많은 경우에, 점유된 파티션 중에서 20% 이하가 하나 이상의 세포를 갖고, 반면 일부 경우에, 점유된 파티션 중에서 10% 이하 또는 심지어 5% 이하가 파티션 마다 하나 이상의 세포를 포함하도록 제어된다.
추가적으로 또는 대안으로, 많은 경우에, 과도한 숫자의 비어 있는 파티션의 발생을 방지하는 것이 바람직하다. 이것이 충분한 숫자의 세포를 분할 구역 내로 제공함으로써 달성될 수 있긴 하지만, 포와송 분포는 복수의 세포를 포함하는 파티션의 숫자를 예상된 바와 같이 증가시킬 것이다. 따라서, 본원에서 설명된 양상에 따라서, 분할 구역 내로 지향된 세포, 또는 다른 유체 중에서 하나 또는 그 이상의 흐름은 많은 경우에, 산출된 파티션 중에서 50% 이내, 산출된 파티션 중에서 25% 이내, 산출된 파티션 중에서 10% 이내가 비점유되도록, 다시 말하면, 1개 보다 적은 세포를 포함하도록 제어된다. 게다가, 일부 양상에서, 이들 흐름은 더욱 낮은 수준의 비점유된 파티션을 제공하면서 단일 점유된 파티션의 비-포와송 분포를 제공하도록 제어된다. 다시 말하면, 일부 양상에서, 비점유된 파티션의 상기 언급된 범위는 앞서 설명된 단일 점유 비율 중에서 한 가지를 여전히 제공하면서 달성될 수 있다. 가령, 많은 경우에, 본원에서 설명된 시스템 및 방법의 이용은 50%보다 적은, 40%보다 적은, 30%보다 적은, 20%보다 적은, 10%보다 적은, 그리고 일부 경우에, 5%보다 적은 비점유된 파티션을 가지면서, 25%보다 적은, 20%보다 적은, 15%보다 적은, 10%보다 적은, 그리고 많은 경우에, 5%보다 적은 복수 점유 비율을 갖는 결과의 파티션을 창출한다.
인지되는 바와 같이, 상기-설명된 점유 비율은 또한, 세포 및 바코드 올리고뉴클레오티드를 운반하는 비드 둘 모두를 포함하는 파티션에 적용가능하다. 특히, 일부 양상에서, 실제적인 백분율의 전체 점유된 파티션이 비드 및 세포 둘 모두를 포함할 것이다. 특히, 파티션 중에서 최소한 50%가 최소한 하나의 세포 및 최소한 하나의 비드에 의해 점유되거나, 또는 파티션 중에서 최소한 75%가 이렇게 점유되거나, 또는 심지어 파티션 중에서 최소한 80% 또는 최소한 90%가 이렇게 점유되는 것을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 파티션 내에 단일 세포 및 단일 비드를 제공하는 것이 요망되는 사례에서, 파티션 중에서 최소한 50%가 이렇게 점유될 수 있고, 파티션 중에서 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80% 또는 심지어 최소한 90%가 이렇게 점유될 수 있다.
비록 실제적으로 단독 점유된 파티션을 제공하는 면에서 상기에 설명되긴 했지만, 일정한 경우에, 중복 점유된, 예를 들면, 단일 파티션 내에 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 세포 및/또는 비드를 내포하는 파티션을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 전술한 바와 같이, 세포 및/또는 비드 내포 유체 및 분할 유체의 흐름 특징은 이런 중복 점유된 파티션을 제공하도록 제어될 수 있다. 특히, 흐름 파라미터는 파티션 중에서 50% 이상, 75% 이상, 그리고 일부 경우에 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 그 이상에서 원하는 점유 비율을 제공하도록 제어될 수 있다.
추가적으로, 많은 경우에, 단일 파티션 내에 복수의 비드는 그것과 연관된 상이한 시약을 포함할 수 있다. 이런 경우에, 공통 통로 또는 비말 산출 접합부 내로 상이한 통로 입구를 통해, 상이한 비드 공급원으로부터, 다시 말하면, 상이한 연관된 시약을 내포하는 비드 공급원으로부터 이런 공통 통로 또는 비말 산출 접합부 내로 상이한 비드를 도입하는 것이 유리할 수 있다. 이런 경우에, 통로 또는 접합부 내로 상이한 비드의 흐름 및 빈도는 원하는 숫자의 세포를 갖는 파티션 내로 이런 비드의 원하는 짝짓기 또는 조합을 담보하면서, 각 공급원으로부터 원하는 비율의 마이크로캡슐을 제공하도록 제어될 수 있다.
본원에서 설명된 파티션은 종종, 극히 적은 용적, 예를 들면, 10 μL보다 적은, 5μL보다 적은, 1μL보다 적은, 900 피코리터 (pL)보다 적은, 800 pL보다 적은, 700 pL보다 적은, 600 pL보다 적은, 500 pL보다 적은, 400pL보다 적은, 300 pL보다 적은, 200 pL보다 적은, 100pL보다 적은, 50 pL보다 적은, 20 pL보다 적은, 10 pL보다 적은, 1 pL보다 적은, 500 나노리터 (nL)보다 적은, 또는 심지어 100 nL보다 적은, 50 nL보다 적은, 또는 훨씬 적은 용적을 갖는 것으로 특징화된다.
가령, 비말 기초된 파티션의 경우에, 이들 비말은 1000 pL보다 적은, 900 pL보다 적은, 800 pL보다 적은, 700 pL보다 적은, 600 pL보다 적은, 500 pL보다 적은, 400pL보다 적은, 300 pL보다 적은, 200 pL보다 적은, 100pL보다 적은, 50 pL보다 적은, 20 pL보다 적은, 10 pL보다 적은, 또는 심지어 1 pL보다 적은 전체 용적을 가질 수 있다. 비드로 공분할되는 경우에, 파티션 내에서 예로서, 공분할된 세포를 포함하는 표본 유체 용적은 상기 설명된 용적의 90%보다 적거나, 80%보다 적거나, 70%보다 적거나, 60%보다 적거나, 50%보다 적거나, 40%보다 적거나, 30%보다 적거나, 20%보다 적거나, 또는 심지어 상기 설명된 용적의 10%보다 적은 것으로 인지될 것이다.
본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 분할 종류는 파티션의 개체군을 산출할 수 있다. 이런 경우에, 임의의 적절한 숫자의 파티션이 파티션의 개체군을 산출하기 위해 산출될 수 있다. 가령, 본원에서 설명된 방법에서, 최소한 약 1,000개 파티션, 최소한 약 5,000개 파티션, 최소한 약 10,000개 파티션, 최소한 약 50,000개 파티션, 최소한 약 100,000개 파티션, 최소한 약 500,000개 파티션, 최소한 약 1,000,000개 파티션, 최소한 약 5,000,000개 파티션, 최소한 약 10,000,000개 파티션, 최소한 약 50,000,000개 파티션, 최소한 약 100,000,000개 파티션, 최소한 약 500,000,000개 파티션 또는 최소한 약 1,000,000,000개 파티션을 포함하는 파티션의 개체군이 산출될 수 있다. 게다가, 파티션의 개체군은 비점유된 파티션 (가령, 비어 있는 파티션) 및 점유된 파티션 둘 모두를 포함할 수 있다.
일정한 경우에, 미소유체 통로 네트워크가 본원에서 설명된 바와 같은 파티션을 산출하는데 특히 적합하다. 이런 미소유체 장치의 실례는 2014년 4월 4일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/977,804에서 상세하게 설명된 것들을 포함하고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 세포의 수성 혼합물이 비수성 유체로 압출되는 다공성 막을 비롯한 대안적 기전 역시 개별 세포의 분할에 이용될 수 있다. 이런 시스템은 일반적으로, 예로서 Nanomi, Inc.로부터 가용하다.
개별 세포를 분할하기 위한 단순화된 미소유체 통로 구조의 실례는 도면 1에서 도해된다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 일부 경우에, 다수의 점유된 파티션은 점유된 파티션 마다 단지 하나의 세포만 포함하고, 그리고 일부 경우에, 산출된 파티션 중에서 일부는 비점유된다. 하지만, 일부 경우에, 점유된 파티션 중에서 일부는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 분할 과정은 점유된 파티션 중에서 25% 이하가 하나 이상의 세포를 내포하고, 그리고 많은 경우에, 점유된 파티션 중에서 20% 이하가 하나 이상의 세포를 갖고, 반면 일부 경우에, 점유된 파티션 중에서 10% 이하 또는 심지어 5% 이하가 파티션 마다 하나 이상의 세포를 포함하도록 제어될 수 있다. 보여지는 바와 같이, 통로 구조는 통로 접합부 110에서 연통하는 통로 세그먼트 102, 104, 106 및 108을 포함할 수 있다. 작업 동안, 현탁된 세포 114를 포함하는 첫 번째 방수 112는 통로 세그먼트 102를 따라서 접합부 110 내로 수송될 수 있고, 반면 방수 112와 비혼성인 두 번째 유체 116은 통로 세그먼트 104 및 106으로부터 접합부 110으로 전달되어, 통로 세그먼트 108로 흘러가는, 개별 세포 114를 포함하는 방수의 구별된 비말 118을 창출한다.
일부 양상에서, 이러한 두 번째 유체 116은 오일, 예를 들면, 플루오르화된 오일을 포함하는데, 이것은 결과의 비말을 안정시키기 위한, 예를 들면, 결과의 비말의 차후 합체를 저해하기 위한 불소계면활성제를 포함한다. 특히 유용한 분할 유체 및 불소계면활성제의 실례는 예로서, U.S. 특허 공개 번호 2010/0105112에서 설명되고, 이의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
다른 양상에서, 비말 기초된 분할에 더하여 또는 대안으로서, 세포는 하나 또는 그 이상의 개별 세포 또는 세포의 소집단이 연행되고 다른 시약을 포함할 수 있는 외부 껍질 또는 층 또는 다공성 매트릭스를 포함하는 마이크로캡슐 내에 피포될 수 있다. 세포의 피포는 다양한 과정에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 이런 과정은 분석되는 세포를 내포하는 방수를, 중합체 전구체에 특정 자극의 적용 시에 겔 또는 다른 고체 또는 반고체 매트릭스로 형성될 수도 있는 중합성 전구체 물질과 합동한다. 이런 자극은 예로서, 열 자극 (가열 또는 냉각), 광-자극 (가령, 광-경화를 통해), 화학적 자극 (가령, 교차연결을 통해), 전구체의 중합화 개시 (가령, 첨가된 개시자를 통해), 또는 기타 유사한 것을 포함한다.
세포를 포함하는 마이크로캡슐의 제조는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 가령, 공기 분사기 비말 또는 에어로졸 발생기가 개별 세포 또는 세포의 소집단을 포함하는 마이크로캡슐을 형성하기 위해, 전구체 유체의 비말을 겔화 용액 내로 분여하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 막 기초된 피포 시스템, 예를 들면, 예로서, Nanomi, Inc.로부터 가용한 것들이 본원에서 설명된 바와 같은 마이크로캡슐을 산출하는데 이용될 수 있다. 일부 양상에서, 미소유체 시스템, 예를 들면, 도면 1에서 도시된 것이 본원에서 설명된 바와 같이 세포를 피포하는데 쉽게 이용될 수 있다. 특히, 그리고 도면 1에 관하여, 세포 및 중합체 전구체 물질을 포함하는 방수는 통로 접합부 110 내로 흘러지는데, 여기서 이것은 비수성 유체 116의 흐름을 통해, 개별 세포 114를 포함하는 비말 118로 분할된다. 피포 방법의 경우에, 비수성 유체 116은 또한, 중합체 전구체의 중합화 및/또는 교차연결을 유발하여, 연행된 세포를 포함하는 마이크로캡슐을 형성하는 개시자를 포함할 수 있다. 특히 유용한 중합체 전구체/개시자 쌍의 실례는 예로서, 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383에서 설명된 것들을 포함하고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
가령, 중합체 전구체 물질이 선형 중합체 물질, 예를 들면, 선형 폴리아크릴아미드, PEG, 또는 다른 선형 중합성 물질을 포함하는 경우에, 활성화 작용제는 교차연결 작용제, 또는 형성된 비말 내에서 교차연결 작용제를 활성화시키는 화학물질을 포함할 수 있다. 유사하게, 중합가능한 단위체를 포함하는 중합체 전구체의 경우에, 활성화 작용제는 중합화 개시자를 포함할 수 있다. 가령, 중합체 전구체가 아크릴아미드 단위체 및 N,N'-비스-(아크릴로일) 시스타민 (BAC) 공단위체의 혼합물을 포함하는 일정한 경우에, 작용제, 예를 들면, 테트라에틸메틸렌디아민 (TEMED)이 통로 세그먼트 104 및 106에서 두 번째 유체 흐름 내에 제공될 수 있는데, 이것은 아크릴아미드 및 BAC의 교차연결된 중합체 네트워크 또는, 하이드로겔로의 공중합화를 개시한다.
비말의 형성 동안 접합부 110에서 두 번째 유체 흐름 116 및 첫 번째 유체 흐름 112의 접촉 시에, TEMED는 두 번째 유체 116로부터, 선형 폴리아크릴아미드를 포함하는 수성 첫 번째 유체 112로 확산할 수 있는데, 이것은 비말 내에 폴리아크릴아미드의 교차연결을 활성화시켜, 세포 114를 연행하는 고체 또는 반고체 비드 또는 입자로서 겔, 예를 들면, 하이드로겔, 마이크로캡슐 118의 형성을 유발할 것이다. 비록 폴리아크릴아미드 피포의 면에서 설명되긴 했지만, 다른 '활성화가능' 피포 조성물 역시 본원에서 설명된 방법과 조성물의 배경에서 이용될 수 있다. 가령, 알긴산염 비말의 형성, 그 이후에 이가 금속 이온, 예를 들면, Ca2+에 노출은 설명된 과정을 이용한 피포 과정으로서 이용될 수 있다. 유사하게, 아가로오스 비말은 또한, 예로서 냉각 시에 온도 기초된 겔화, 또는 기타 유사한 것을 통해 캡슐로 변환될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 일부 경우에, 피포된 세포는 예로서, 세포, 또는 이의 내용물이 마이크로캡슐로부터 예로서, 추가 파티션, 예를 들면, 비말 내로 방출되는 것을 허용할 만큼 충분히 마이크로캡슐을 분해하는 시간의 경과를 통해, 또는 특정 자극의 적용 시에, 마이크로캡슐로부터 선별적으로 방출가능할 수 있다. 가령, 앞서 설명된 폴리아크릴아미드 중합체의 경우에, 마이크로캡슐의 분해는 중합체 매트릭스를 교차연결하는 이황화 결합을 개열하는 적절한 환원제, 예를 들면, DTT 또는 기타 유사한 것의 도입을 통해 달성될 수 있다 (가령, 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383을 참조하고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
인지되는 바와 같이, 피포된 세포 또는 세포 개체군은 저장가능하고, 그리고 비말 기초된 분할된 세포보다 휴대가 더욱 용이하다는 일정한 잠재적 이점을 제공한다. 게다가, 일부 경우에, 상이한 자극의 존재 또는 부재에서 시간의 추이에서 분석되는 세포의 변화를 특징짓기 위해, 이런 세포가 선택된 기간 동안 배양되도록 허용하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 경우에, 개별 세포의 피포는 비록 일부 경우에, 비말 분할된 세포 역시 상이한 기간, 예를 들면, 최소한 10 초, 최소한 30 초, 최소한 1 분, 최소한 5 분, 최소한 10 분, 최소한 30 분, 최소한 1 시간, 최소한 2 시간, 최소한 5 시간, 또는 최소한 10 시간 또는 그 이상 동안 배양될 수 있긴 하지만, 유제 비말에서 단순한 분할보다 더욱 긴 배양을 허용할 수 있다. 상기에서 암시된 바와 같이, 세포의 피포는 다른 시약이 공분할되는 세포의 분할을 구성할 수 있다. 대안으로, 피포된 세포는 앞서 설명된 바와 같이, 다른 파티션, 예를 들면, 비말 내로 쉽게 침적될 수 있다.
일정한 양상에 따라서, 세포는 파티션 내에 세포의 내용물을 방출하기 위해, 용해 시약과 함께 분할될 수 있다. 이런 경우에, 용해 작용제는 예로서, 통로 접합부 110의 상류에 추가 통로 또는 통로들을 통해 분할 접합부/비말 산출 구역 내로 세포의 도입과 동시에, 또는 도입 직전에 세포 현탁액과 접촉될 수 있다. 용해 작용제의 실례는 생리활성 시약, 예를 들면, 상이한 세포 유형, 예를 들면, 그람 양성 또는 음성 세균, 식물, 효모, 포유류 등의 용해에 이용되는 용해 효소, 예를 들면, 라이소자임, 아크로모펩티다아제, 리소스타핀, 라비아제, 키탈라아제, 리티카아제, 그리고 예로서, Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO)로부터 가용한 다양한 다른 용해 효소뿐만 아니라 다른 상업적으로 가용한 용해 효소를 포함한다. 다른 용해 작용제는 부가적으로 또는 대안으로, 세포 내용물의 파티션으로의 방출을 유발하기 위해 세포로 공분할될 수 있다. 가령, 일부 경우에, 계면활성제 기초된 용해 용액은 비록 계면활성제가 안정된 유제를 간섭할 수 있는 유제 기초된 시스템에 대해 덜 바람직할 수도 있긴 하지만, 세포를 용해하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 용해 용액은 비이온성 계면활성제 예를 들면, 예로서, TritonX-100 및 Tween 20을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 용해 용액은 이온성 계면활성제, 예를 들면, 예로서, 사코실 및 황산도데실나트륨 (SDS)을 포함할 수 있다. 유사하게, 다른 방법을 이용하는 용해 방법이 이용될 수 있다, 예를 들면, 전기천공, 가열, 음향 또는 기계적 세포 붕괴 역시 일정한 경우에, 예를 들면, 비-유제 기초된 분할, 예를 들면, 비말 분할에 더하여 또는 대신에 세포의 피포에서 이용될 수 있는데, 여기서 피포물의 임의의 구멍 크기는 세포 붕괴 이후에, 원하는 크기의 핵산 단편을 유지할 만큼 충분히 작다.
앞서 설명된 세포로 공분할되는 용해 작용제에 더하여, 예로서 DNA분해효소 및 RNA분해효소 비활성화 작용제 또는 저해제, 예를 들면, 단백질분해효소 K, 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA, 그리고 핵산의 차후 처리에 대한 상이한 세포 용해물 성분의 부정적인 활성 또는 충격을 제거하거나 또는 달리 감소시키는데 이용되는 다른 시약을 비롯한 다른 시약 역시 이들 세포로 공분할될 수 있다. 이에 더하여, 피포된 세포의 경우에, 이들 세포는 공분할된 마이크로캡슐로부터 세포 또는 이들의 내용물을 방출하기 위해 적절한 자극에 노출될 수 있다. 가령, 일부 경우에, 화학적 자극이 마이크로캡슐의 분해 및 세포 또는 이의 내용물의 더욱 큰 파티션으로의 방출을 허용하기 위해, 피포된 세포와 함께 공분할될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 자극은 개별 비드 또는 파티션으로부터 올리고뉴클레오티드의 방출에 대해 본원의 다른 곳에서 설명된 자극과 동일할 수 있다. 대안적 양상에서, 이것은 피포된 세포가 올리고뉴클레오티드의 동일한 파티션 내로의 방출과 상이한 시점에서 파티션 내로 방출되도록 허용하기 위해, 상이한 비중복 자극일 수 있다.
추가 시약, 예를 들면, 세포의 DNA를 단편화시키는 엔도뉴클레아제, 세포의 핵산 단편을 증폭하고 바코드 올리고뉴클레오티드를 증폭된 단편에 부착하는데 이용되는 DNA 중합효소 효소 및 dNTP 역시 세포로 공분할될 수 있다. 추가 시약은 또한, 말단 전달효소 활성을 갖는 효소를 비롯한 역전사효소 효소, 프라이머 및 올리고뉴클레오티드, 그리고 주형 전환에 이용될 수 있는 스위치 올리고뉴클레오티드 (본원에서 "스위치 올리고"로서 또한 지칭됨)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 주형 전환은 cDNA의 길이를 증가시키는데 이용될 수 있다. 주형 전환의 한 가지 실례에서, cDNA는 주형, 예를 들면, 세포 mRNA의 역전사로부터 산출될 수 있는데, 여기서 말단 전달효소 활성을 갖는 역전사효소는 추가 뉴클레오티드, 예를 들면, 폴리(poly)C를 주형에 의해 인코딩되지 않은 cDNA에, 예를 들면, 상기 cDNA의 단부에서 부가할 수 있다. 스위치 올리고는 추가 뉴클레오티드에 상보적인 서열, 예를 들면, 폴리(poly)G를 포함할 수 있다. cDNA 상에서 추가 뉴클레오티드 (가령, 폴리C)는 스위치 올리고 상에서 이들 추가 뉴클레오티드에 상보적인 서열 (가령, 폴리G)에 혼성화할 수 있는데, 여기서 스위치 올리고는 cDNA를 더욱 연장하기 위한 주형으로서 역전사효소에 의해 이용될 수 있다. 스위치 올리고는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 잠금된 핵산 (LNA)을 비롯한 변형된 핵산, 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 스위치 올리고의 길이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 , 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.
일부 경우에, 스위치 올리고의 길이는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 , 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249 또는 250개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.
일부 경우에, 스위치 올리고의 길이는 기껏해야 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197 , 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249 또는 250개 뉴클레오티드일 수 있다.
일단 세포의 내용물이 그들의 개별 파티션 내로 방출되면, 그 안에 내포된 핵산이 파티션 내에서 더욱 처리될 수 있다. 본원에서 설명된 방법 및 시스템에 따라서, 개별 세포의 핵산 내용물은 일반적으로, 이들 핵산의 특징화 시에, 그들이 동일한 세포 또는 세포들로부터 유래된 것으로 기인될 수 있도록 독특한 식별자가 제공된다. 특징을 개별 세포 또는 세포의 군에 기인시키는 능력은 개별 세포 또는 세포의 군에 특이적으로 독특한 식별자의 배정에 의해 제공되는데, 이것은 본원에서 설명된 방법 및 시스템의 다른 유리한 양상이다. 특히, 예로서 핵산 바코드의 형태에서 독특한 식별자는 세포의 성분 (및 결과적으로, 이의 특징)을 독특한 식별자로 태깅하거나 또는 표지화하기 위해, 개별 세포 또는 세포 개체군에 배정되거나 또는 이들과 연관된다. 이들 독특한 식별자는 이후, 세포의 성분 및 특징을 개별 세포 또는 세포의 군에 기인시키는데 이용된다. 일부 양상에서, 이것은 개별 세포 또는 세포의 군을 독특한 식별자로 공분할함으로써 수행된다. 일부 양상에서, 독특한 식별자는 개별 세포의 핵산 내용물에, 또는 이들 세포의 다른 성분에, 그리고 특히, 이들 핵산의 단편에 부착되거나 또는 만약 그렇지 않으면, 이들과 연관될 수 있는 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 형태에서 제공된다. 올리고뉴클레오티드는 소정의 파티션 내에 올리고뉴클레오티드 사이의 경우에, 그 안에 내포된 핵산 바코드 서열은 동일한 반면, 상이한 파티션 사이의 경우에, 올리고뉴클레오티드는 다른 바코드 서열을 가질 수 있고, 그리고 실제로 갖거나, 또는 소정의 분석에서 모든 파티션을 교차하여 다수의 상이한 바코드 서열을 최소한 나타내도록 분할된다. 일부 양상에서, 단지 하나의 핵산 바코드 서열만 소정의 파티션과 연관될 수 있지만, 일부 경우에는 2개 또는 그 이상 상이한 바코드 서열이 존재할 수도 있다.
핵산 바코드 서열은 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 6 내지 약 20개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열의 길이는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열의 길이는 최소한 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열의 길이는 기껏해야 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 뉴클레오티드 또는 그 이하일 수 있다. 이들 뉴클레오티드는 완전하게 인접하거나, 다시 말하면, 인접한 뉴클레오티드의 단일 스트레치 내에 있거나, 또는 이들은 1개 또는 그 이상 뉴클레오티드에 의해 분리되는 2개 또는 그 이상 별개의 하위서열로 분리될 수 있다. 일부 경우에, 분리된 바코드 하위서열은 길이에서 약 4 내지 약 16개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 하위서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 하위서열은 최소한 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 하위서열은 기껏해야 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 뉴클레오티드 또는 그 이하일 수 있다.
공분할된 올리고뉴클레오티드는 또한, 공분할된 세포로부터 핵산의 처리에서 유용한 다른 기능적 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 예로서, 연관된 바코드 서열을 부착하면서 파티션 내에 개별 세포로부터 유전체 DNA를 증폭하기 위한 표적화된 또는 무작위/보편적인 증폭 프라이머 서열, 염기서열결정 프라이머 또는 프라이머 인식 부위, 예로서 이들 서열의 존재를 확인하기 위한 또는 바코드화된 핵산을 허물기 위한 혼성화 또는 탐침 서열, 또는 다수의 다른 잠재적 기능적 서열 중에서 한 가지를 포함한다. 다시 한 번, 표본 물질과 함께, 올리고뉴클레오티드 및 연관된 바코드 및 다른 기능적 서열의 공분할은 예로서, 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383뿐만 아니라 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/175,935에서 설명되고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 인지되는 바와 같이, 예로서 2개 또는 그 이상 비말의 합체 (여기서 1개의 비말이 올리고뉴클레오티드를 내포한다), 또는 미소유체 시스템 내에 파티션, 예를 들면, 비말 내로 올리고뉴클레오티드의 마이크로디스펜싱을 비롯하여, 올리고뉴클레오티드를 공분할하는 다른 기전 역시 이용될 수 있다.
간단히 말하면, 한 가지 실례에서, 비드에 방출가능하게 부착된 다수의 전술한 올리고뉴클레오티드를 각각 포함하는 비드, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐이 제공되는데, 여기서 특정 비드에 부착된 모든 올리고뉴클레오티드는 동일한 핵산 바코드 서열을 포함할 것이고, 하지만 여기서 다수의 다양한 바코드 서열은 이용된 비드의 개체군을 교차하여 대표된다. 특히 유용한 실례에서, 예로서 폴리아크릴아미드 중합체 매트릭스를 포함하는 하이드로겔 비드가 올리고뉴클레오티드에 대한 고체 지지체 및 파티션 내로 이들 올리고뉴클레오티드에 대한 전달 운반제로서 이용되는데, 그 이유는 이들이 다수의 올리고뉴클레오티드 분자를 운반할 수 있고, 그리고 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 특정 자극에 노출 시에 이들 올리고뉴클레오티드를 방출하도록 설정될 수 있기 때문이다. 일부 경우에, 비드의 개체군은 최소한 1,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 10,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 최소한 50,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 100,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 1,000,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000,000개의 상이한 바코드 서열, 또는 최소한 10,000,000개의 상이한 바코드 서열을 포함하는 다양한 바코드 서열 라이브러리를 제공할 것이다. 추가적으로, 각 비드는 부착된 다수의 올리고뉴클레오티드 분자가 제공될 수 있다. 특히, 개별 비드 상에서 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 분자의 숫자는 최소한 1,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 500,000개 올리고뉴클레오티드, 최소한 1,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 그리고 일부 경우에 최소한 십억 개 올리고뉴클레오티드 분자일 수 있다.
게다가, 비드의 개체군이 분할될 때, 파티션의 결과의 개체군은 또한, 최소한 1,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 10,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 최소한 50,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 100,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 1,000,000개의 상이한 바코드 서열, 최소한 5,000,000개의 상이한 바코드 서열, 또는 최소한 10,000,000개의 상이한 바코드 서열을 포함하는 다양한 바코드 라이브러리를 포함할 수 있다. 추가적으로, 개체군의 각 파티션은 최소한 1,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 500,000개 올리고뉴클레오티드, 최소한 1,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 5,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 10,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 50,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 최소한 100,000,000개 올리고뉴클레오티드 분자, 그리고 일부 경우에 최소한 십억 개 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 파티션 내에 단일 또는 복수의 비드에 부착된, 소정의 파티션 내에 복수의 상이한 바코드를 통합하는 것이 바람직할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 혼합된, 하지만 공지된 바코드 서열 세트가 예로써, 소정의 파티션으로부터 출력의 중복된 또는 독립된 확증으로서, 소정의 파티션에 바코드의 더욱 강한 주소 또는 귀인을 제공함으로써, 차후 처리에서 확인의 더욱 큰 확증을 제공할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 비드에 특정 자극의 적용 시에, 이들 비드로부터 방출가능하다. 일부 경우에, 자극은 예로서, 올리고뉴클레오티드를 방출하는 광-불안정 연쇄의 개열을 통한 광-자극일 수 있다. 다른 경우에, 열 자극이 이용될 수 있는데, 여기서 비드 환경의 온도의 상승은 이들 비드로부터 올리고뉴클레오티드의 연쇄의 개열 또는 다른 방출을 유발할 것이다. 또 다른 사례에서, 비드에 대한 올리고뉴클레오티드의 연쇄를 개열하거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 비드로부터 올리고뉴클레오티드의 방출을 유발하는 화학적 자극이 이용된다. 이러한 유형의 시스템의 실례는 2013년 8월 13일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 13/966,150뿐만 아니라 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 그리고 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383에서 설명되고, 이들의 전체 개시는 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 한 가지 경우에, 이런 조성물은 세포의 피포에 대해 앞서 설명된 폴리아크릴아미드 매트릭스를 포함하고, 그리고 환원제, 예를 들면 DTT에 노출을 통한 부착된 올리고뉴클레오티드의 방출을 위해 분해될 수 있다.
본원에서 설명된 방법 및 시스템에 따라서, 부착된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비드는 단일 비드 및 단일 세포가 개별 파티션 내에 내포되도록, 개별 세포로 공분할된다. 전술한 바와 같이, 단일 세포/단일 비드 점유가 가장 바람직한 상태이긴 하지만, 복수 점유된 파티션 (세포, 비드 또는 둘 모두의 면에서), 또는 비점유된 파티션 (세포, 비드 또는 둘 모두의 면에서)이 종종 존재할 것으로 인지될 것이다. 세포 및 바코드 올리고뉴클레오티드를 포함하는 비드를 공분할하기 위한 미소유체 통로 구조의 실례는 도면 2에서 개략적으로 도해된다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 일부 양상에서, 전체 점유된 파티션 중에서 실제적인 백분율이 비드 및 세포 둘 모두를 포함할 것이고, 그리고 일부 경우에, 산출되는 파티션 중에서 일부는 비점유될 것으로 인지될 것이다. 일부 경우에, 파티션 중에서 일부는 1:1 분할되지 않는 비드 및 세포를 가질 수 있다. 일부 경우에, 중복 점유된, 예를 들면, 단일 파티션 내에 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 세포 및/또는 비드를 내포하는 파티션을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 보여지는 바와 같이, 통로 세그먼트 202, 204, 206, 208 및 210이 통로 접합부 212에서 유체 연통으로 제공된다. 개별 세포 214를 포함하는 수성 흐름은 통로 세그먼트 202를 통해 통로 접합부 212를 향하여 흘러진다. 앞서 설명된 바와 같이, 이들 세포는 방수 내에서 현탁될 수 있거나, 또는 분할 과정에 앞서 피포되었을 수 있다.
동시에, 바코드 보유 비드 216을 포함하는 수성 흐름은 통로 세그먼트 204를 통해 통로 접합부 212를 향하여 흘러진다. 비수성 분할 유체 216은 측면 통로 206 및 208 각각으로부터 통로 접합부 212 내로 도입되고, 그리고 합동된 흐름은 출구 통로 210으로 흘러진다. 통로 접합부 212 내에, 통로 세그먼트 202 및 204로부터 2개의 합동된 수성 흐름은 합동되고, 그리고 공분할된 세포 214 및 비드 216을 포함하는 비말 218로 분할된다. 전술한 바와 같이, 통로 접합부 212에서 합동하는 유체 각각의 흐름 특징을 제어할 뿐만 아니라 통로 접합부의 기하학을 제어함으로써, 조합 및 분할을 최적화하여, 산출되는 파티션 218 내에 비드, 세포 또는 둘 모두의 원하는 점유 수준을 달성할 수 있다.
일부 경우에, 용해 작용제, 예를 들면, 세포 용해 효소가 세포의 용해가 단지 분할의 시점에서 또는 시점 후에 시작되도록, 예로서 통로 세그먼트 204를 관류하는 비드 흐름으로 파티션 내로 도입될 수 있다. 추가 시약, 예를 들면, 세포의 DNA를 단편화시키는 엔도뉴클레아제, 세포의 핵산 단편을 증폭하고 바코드 올리고뉴클레오티드를 증폭된 단편에 부착하는데 이용되는 DNA 중합효소 효소 및 dNTP 역시 이러한 설정에서 파티션에 첨가될 수 있다. 전술한 바와 같이, 많은 경우에, 화학적 자극, 예를 들면 DTT가 개별 비드로부터 바코드를 파티션 내로 방출하는데 이용될 수 있다. 이런 경우에, 바코드의 방출이 예로서, 파티션 218 내에서 2개의 흐름이 합동된 이후에만 발생하도록, 통로 세그먼트 202 내에 세포-내포 흐름과 함께 화학적 자극을 제공하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 하지만, 세포가 피포되는 경우에, 예로서, 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 방출시킬 뿐만 아니라 마이크로캡슐로부터 세포를 방출시키는 통상적인 화학적 자극의 도입은 일반적으로, 통로 접합부 212의 상류에 또는 여기에 연결된 별개의 추가 측면 통로 (도시되지 않음)로부터 제공될 수 있다.
인지되는 바와 같이, 예로서 보호 시약, 예를 들면, 단백질분해효소 K, 킬레이터, 핵산 연장, 복제, 전사 또는 증폭 시약, 예를 들면, 중합효소, 역전사효소, 트랜스포손 기초된 방법 (가령, Nextera)에 이용될 수 있는 유전자전위효소, 뉴클레오시드 삼인산염 또는 NTP 유사체, 프라이머 서열 및 추가 보조인자, 예를 들면, 이런 반응에서 이용된 이가 금속 이온, 결찰 반응 시약, 예를 들면, 리가아제 효소 및 결찰 서열, 염료, 라벨, 또는 다른 태깅 시약을 비롯한 다수의 다른 시약이 세포, 비드, 용해 작용제 및 화학적 자극과 함께 공분할될 수 있다.
예로서 본원에서 설명된 바와 같은 통로 네트워크는 적절한 유체 성분에 유동적으로 연계될 수 있다. 가령, 입구 통로 세그먼트, 예를 들면, 통로 세그먼트 202, 204, 206 및 208은 이들이 통로 접합부 212에 전달하고자 하는 물질의 적절한 공급원에 유동적으로 연계된다. 가령, 통로 세그먼트 202는 분석되는 세포 214의 수성 현탁액의 공급원에 유동적으로 연계될 것이고, 반면 통로 세그먼트 204는 비드 216의 수성 현탁액의 공급원에 유동적으로 연계될 것이다. 통로 세그먼트 206 및 208은 이후, 비수성 유체의 하나 또는 그 이상의 공급원에 유동적으로 연결될 것이다. 이들 공급원은 미소유체 장치의 몸체 구조에서 규정된 또는 여기에 연결된 단순한 저장소로부터 오프-장치 공급원, 다양체, 또는 기타 유사한 것으로부터 유체를 전달하는 유체 도관까지, 다양한 상이한 유체 성분 중에서 한 가지를 포함할 수 있다. 유사하게, 출구 통로 세그먼트 210은 분할된 세포에 대한 수용 용기 또는 도관에 유동적으로 연계될 수 있다. 이번에도, 이것은 미소유체 장치의 몸체 내에 규정된 저장소일 수 있거나, 또는 이것은 분할된 세포를 차후 과정 작업, 기기 또는 성분에 전달하기 위한 유체 도관일 수 있다.
도면 8은 유중수 유제 내에 수성 비말에서 비드를 내포하는 바코드 올리고뉴클레오티드와 함께 공분할된 개별 Jurkat 세포의 이미지를 보여준다. 예시된 바와 같이, 개별 세포는 개별 비드와 함께 쉽게 공분할될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 개별 세포 적하의 최적화는 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 파티션 마다 원하는 세포 적하를 달성하기 위해, 미소유체 시스템 내로 세포 개체군의 희석액을 제공하는 것을 비롯한 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다.
작업 동안, 일단 용해되면, 개별 세포의 핵산 내용물은 이후, 파티션 내에서 예로서, 단편화, 증폭 및 바코드화뿐만 아니라 다른 기능적 서열의 부착을 비롯한 추가 처리에 가용하다. 전술한 바와 같이, 단편화는 핵산을 더욱 작은 단편으로 단편화하기 위해, 전단 효소, 예를 들면, 엔도뉴클레아제의 공분할을 통해 달성될 수 있다. 이들 엔도뉴클레아제는 유형 II 및 유형 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 비롯한 제한 엔도뉴클레아제뿐만 아니라 다른 핵산 개열 효소, 예를 들면, 틈내기 엔도뉴클레아제 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단편화가 요망되지 않을 수 있고, 그리고 전장 핵산이 파티션 내에 유지될 수 있거나, 또는 피포된 세포 또는 세포 내용물의 경우에, 단편화가 분할하기에 앞서, 예로서 효소적 방법, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들을 통해, 또는 기계적 방법, 예를 들면, 기계적, 음향 또는 다른 전단을 통해 수행될 수 있다.
일단 공분할되고, 그리고 세포가 용해되어 그들의 핵산이 방출되면, 비드 상에 배치된 올리고뉴클레오티드는 이들 핵산의 단편을 바코드화하고 증폭하는데 이용될 수 있다. 표본 핵산의 단편을 증폭하고 바코드화함에 있어서 이들 바코드 올리고뉴클레오티드의 이용을 위한 특히 우아한 과정은 2014년 2월 7일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/940,318, 2014년 5월 9일자 제출된 61/991,018, 2014년 6월 26일자 제출된 U.S. 특허 출원 번호 14/316,383에서 상세하게 설명되고, 그리고 이미 참조로서 편입된다. 간단히 말하면, 한 양상에서, 세포로 공분할되는 비드 상에 존재하는 올리고뉴클레오티드는 세포의 핵산과 함께 그들의 비드로부터 파티션 내로 방출된다. 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열과 함께, 이의 5' 단부에서 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 이러한 프라이머 서열은 세포의 핵산 상에서 다양한 상이한 영역을 무작위로 기폭하도록 의도된 무작위 올리고뉴클레오티드 서열일 수 있거나, 또는 이것은 세포의 유전체의 특정한 표적화된 영역의 상류를 기폭하도록 표적화된 특정한 프라이머 서열일 수 있다.
일단 방출되면, 올리고뉴클레오티드의 프라이머 부분은 세포의 핵산의 상보성 영역에 어닐링할 수 있다. 세포 및 비드와 함께 또한 공분할되는 연장 반응 시약, 예를 들면, DNA 중합효소, 뉴클레오시드 삼인산염, 보조인자 (가령, Mg2+ 또는 Mn2+)는 이후, 세포의 핵산을 주형으로서 이용하여 프라이머 서열을 연장하여, 상기 프라이머가 어닐링되는 세포의 핵산의 가닥에 대한 상보성 단편을 생산하고, 상기 상보성 단편은 올리고뉴클레오티드 및 이의 연관된 바코드 서열을 포함한다. 세포의 핵산의 상이한 부분에 복수의 프라이머의 어닐링 및 연장은 핵산의 중복 상보성 단편의 대규모 풀을 유발할 것인데, 이들 단편 각각은 자신이 창출되었던 파티션을 지시하는 자체 바코드 서열을 소유한다. 일부 경우에, 이들 상보성 단편은 그들 자체로, 파티션 내에 존재하는 올리고뉴클레오티드에 의해 기폭된 주형으로서 이용되어, 바코드 서열을 이번에도 포함하는 보체의 보체를 생산할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 복제 과정은 첫 번째 보체가 복제될 때, 이것이 이의 말단에서 또는 이와 가깝게 2개의 상보성 서열을 생산하여, 추가 반복적인 사본을 생산하기 위한 기초가 되는 분자의 능력을 감소시키는 헤어핀 구조 또는 부분적인 헤어핀 구조의 형성을 허용하도록 설정된다. 본원에서 설명된 바와 같이, 세포의 핵산은 예로서, 세포의 DNA, 예를 들면, 유전체 DNA, RNA, 예를 들면, 전령 RNA, 기타 등등을 비롯하여, 세포 내에 임의의 원하는 핵산을 포함할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 발현된 mRNA (가령, 이런 mRNA의 존재 및 정량 포함)를 특징짓는데 이용되고, 그리고 특징화 과정으로서 RNA 염기서열결정 과정을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 세포와 함께 분할된 시약은 DNA 염기서열결정이 이용되는 염기서열결정 과정을 용이하게 하기 위해, mRNA의 cDNA로의 전환을 위한 시약, 예를 들면, 역전사효소 효소 및 시약을 포함할 수 있다. 특징화되는 핵산이 RNA, 예를 들면, mRNA를 포함하는 일부 경우에, 이것의 한 가지 실례의 개략적 도해는 도면 3에서 도시된다.
보여지는 바와 같이, 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 표본 핵산 304와 함께, 예로서 유제 내에 비말 302에서 공분할된다. 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 308은 표본 핵산 304로 공분할되는 비드 306 상에 제공될 수 있고, 상기 올리고뉴클레오티드는 패널 A에서 보여지는 바와 같이, 비드 306으로부터 방출가능하다. 올리고뉴클레오티드 308은 하나 또는 그 이상의 기능적 서열, 예를 들면, 서열 310, 314 및 316에 더하여, 바코드 서열 312를 포함한다. 가령, 올리고뉴클레오티드 308은 바코드 서열 312뿐만 아니라 소정의 염기서열결정 시스템에 대한 부착 또는 고정 서열, 예를 들면, Illumina Hiseq® 또는 Miseq® 시스템의 흐름 셀에서 부착에 이용된 P5 서열로서 기능할 수 있는 서열 310을 포함하는 것으로 도시된다. 보여지는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 또한, 프라이머 서열 316을 포함하는데, 이것은 표본 핵산 304의 부분의 복제를 기폭하기 위한 무작위 또는 표적화된 N-mer을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 308 내에 서열 314가 또한 포함되는데, 이것은 염기서열결정 시스템에서 합성 반응에 의한 중합효소 매개된, 주형 지향된 염기서열결정을 기폭하는데 이용되는 염기서열결정 기폭 영역, 예를 들면, "판독1" 또는 R1 기폭 영역을 제공할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 기능적 서열은 다양한 상이한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, 454 염기서열결정, Ion Torrent Proton 또는 PGM, Illumina X10 등, 그리고 이들의 요구사항과 양립하도록 선별될 수 있다. 많은 경우에, 바코드 서열 312, 고정 서열 310 및 R1 서열 314는 소정의 비드에 부착된 모든 올리고뉴클레오티드에 공통적일 수 있다. 프라이머 서열 316은 무작위 N-mer 프라이머를 위해 변할 수 있거나, 또는 일정한 표적화된 적용을 위해 소정의 비드 상에서 올리고뉴클레오티드에 공통적일 수 있다.
인지되는 바와 같이, 일부 경우에, 기능적 서열은 RNA-seq 적용에 유용한 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 가령, 일부 경우에, 올리고뉴클레오티드는 RNA-seq의 경우에 RNA의 역전사를 기폭하기 위한 폴리-T 프라이머를 포함할 수 있다. 또 다른 사례에서, 소정의 파티션 내에, 예로서 개별 비드 상에 포함된 올리고뉴클레오티드는 공통 바코드 서열에 더하여 복수 유형의 프라이머 서열, 예를 들면, DNA-염기서열결정 및 RNA 염기서열결정 프라이머 둘 모두, 예를 들면, 비드에 연계된 올리고뉴클레오티드 내에 포함된 폴리-T 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 이런 경우에, 단일 분할된 세포는 DNA 및 RNA 염기서열결정 과정 둘 모두에 종속될 수 있다.
프라이머 서열 316의 존재에 근거하여, 올리고뉴클레오티드는 패널 B에서 보여지는 바와 같이 표본 핵산을 기폭할 수 있는데, 이것은 비드 306 및 표본 핵산 304과 함께 또한 공분할되는 중합효소 효소 및 다른 연장 시약을 이용하여 올리고뉴클레오티드 308 및 308a의 연장을 허용한다. 패널 C에서 보여지는 바와 같이, 무작위 N-mer 프라이머의 경우에, 표본 핵산 304의 복수의 상이한 영역에 어닐링할 올리고뉴클레오티드의 연장 이후에; 핵산의 복수의 중복 보체 또는 단편, 예를 들면, 단편 318 및 320이 창출된다. 비록 표본 핵산의 부분에 상보적인 서열 부분, 예를 들면, 서열 322 및 324를 포함하긴 하지만, 이들 구조체는 일반적으로 본원에서, 부착된 바코드 서열을 갖는, 표본 핵산 304의 단편을 포함하는 것으로 지칭된다.
바코드화된 핵산 단편은 이후, 예로서 서열 분석을 통한 특징화에 종속될 수 있거나, 또는 이들은 패널 D에서 보여지는 바와 같이, 과정 동안 더욱 증폭될 수 있다. 가령, 비드 306으로부터 또한, 방출된 추가 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 308b는 단편 318 및 320을 기폭할 수 있다. 이것은 단편 318에 대해 도시된다. 특히, 다시 한 번, 올리고뉴클레오티드 308b 내에 무작위 N-mer 프라이머 316b (이것은 많은 경우에, 소정의 파티션 내에 다른 무작위 N-mer, 예를 들면, 프라이머 서열 316과 상이할 수 있다)의 존재에 근거하여, 올리고뉴클레오티드는 단편 318과 어닐링하고, 그리고 연장되어 서열 328을 포함하는 단편 318의 최소한 일부에 대한 보체 326을 창출하는데, 이것은 표본 핵산 서열의 일부의 복제물을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 308b의 연장은 이것이 단편 318의 올리고뉴클레오티드 부분 308을 통해 복제될 때까지 계속된다. 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 그리고 패널 D에서 예시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 예로서, 단편 318 내에 포함되는 올리고뉴클레오티드 308의 서열 316 및 314을 통해 복제된 후, 원하는 시점에서 중합효소에 의한 복제의 중단을 촉발하도록 설정될 수 있다. 본원에서 설명된 바와 같이, 이것은 예로서, 이용된 중합효소 효소에 의해 처리될 수 없는 상이한 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 통합을 비롯한 상이한 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 이것은 상기 영역의 복제를 중단시키는 비-우라실 내성 중합효소를 예방하기 위해, 서열 영역 312 내에 우라실 내포 뉴클레오티드의 포함을 포함할 수 있다. 결과적으로, 바코드 서열 312, 부착 서열 310, R1 프라이머 영역 314, 그리고 무작위 N-mer 서열 316b를 포함하는 전장 올리고뉴클레오티드 308b를 한쪽 단부에서 포함하는 단편 326이 창출된다. 상기 서열의 다른 단부에는 첫 번째 올리고뉴클레오티드 308의 무작위 N-mer에 대한 보체 316'뿐만 아니라 서열 314'로서 도시된, R1 서열의 전부 또는 일부에 대한 보체가 포함될 수 있다. R1 서열 314 및 이의 보체 314'는 이후, 함께 혼성화하여 부분적인 헤어핀 구조 328을 형성할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 이들 무작위 N-mer이 상이한 올리고뉴클레오티드 사이에서 다르기 때문에, 이들 서열 및 이들의 보체는 헤어핀 형성에 참여할 것으로 예상되지 않을 것이다, 예를 들면, 무작위 N-mer 316에 대한 보체인 서열 316'은 무작위 N-mer 서열 316b에 상보적일 것으로 예상되지 않을 것이다. 이것은 N-mer이 소정의 파티션 내에 올리고뉴클레오티드 사이에서 공통적일 다른 적용, 예를 들면, 표적화된 프라이머의 경우에는 그렇지 않을 것이다.
이들 부분적인 헤어핀 구조를 형성함으로써, 이것은 추가 복제로부터 표본 서열의 첫 번째 수준 복제물의 제거를 허용한다, 예를 들면, 사본의 반복적인 복사를 예방한다. 부분적인 헤어핀 구조는 또한, 창출된 단편, 예를 들면, 단편 326의 차후 처리를 위한 유용한 구조를 제공한다.
일반적으로, 세포의 핵산의 증폭은 파티션 내에 바코드화된 중복 단편이 세포의 유전체의 특정 부분 또는 전부의 최소한 1X 적용범위, 관심되는 유전체 또는 이의 유관한 부분의 최소한 2X, 최소한 3X, 최소한 4X, 최소한 5X, 최소한 10X, 최소한 20X, 최소한 40X 또는 그 이상 적용범위를 구성할 때까지 수행된다. 일단 바코드화된 단편이 생산되면, 이들은 적절한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Illumina Hiseq®, Miseq® 또는 X10 시스템에서 직접적으로 염기서열결정될 수 있거나, 또는 이들은 추가 처리, 예를 들면, 추가 증폭, 역판독을 위한 다른 기능적 서열, 예를 들면, 두 번째 염기서열결정 프라이머, 표본 색인 서열 등의 부착에 종속될 수 있다.
복수의 상이한 파티션으로부터 모든 단편은 이후, 본원에서 설명된 바와 같은 고처리량 서열분석기에서 염기서열결정을 위해 모아질 수 있는데, 여기서 모아진 단편은 상이한 세포 또는 작은 세포 개체군의 핵산으로부터 유래된 다수의 단편을 포함하지만, 여기서 소정의 세포의 핵산으로부터 단편은 동일한 바코드 서열을 공유할 것이다. 특히, 각 단편이 기원된 파티션, 그리고 결과적으로, 이의 단일 세포 또는 작은 세포 개체군에 대해 코딩되기 때문에, 단편의 서열은 바코드의 존재에 근거하여 상기 세포 또는 이들 세포에 역으로 기인될 수 있고, 이것은 또한, 복수의 파티션으로부터 상이한 세포에 대한 개별 유전체의 어셈블리까지 다양한 서열 단편을 적용하는데 보조할 것이다. 이것은 도면 4에서 개략적으로 도해된다. 한 가지 실례에서 보여지는 바와 같이, 첫 번째 세포 400으로부터 첫 번째 핵산 404, 그리고 두 번째 세포 402로부터 두 번째 핵산 406은 각각, 앞서 설명된 바와 같이 바코드 올리고뉴클레오티드의 그들의 자체 세트와 함께 분할된다. 핵산은 세포로부터 염색체, 전체 유전체 또는 다른 큰 핵산을 포함할 수 있다.
각 파티션 내에, 각 세포의 핵산 404 및 406은 이후, 첫 번째 단편(들)의 두 번째 단편의 중복 세트, 예를 들면, 두 번째 단편 세트 408 및 410을 별개로 제공하기 위해 처리된다. 이러한 과정은 또한, 특정 첫 번째 단편으로부터 유래된 두 번째 단편 각각에서와 동일한 바코드 서열을 갖는 두 번째 단편을 제공한다. 보여지는 바와 같이, 두 번째 단편 세트 408의 바코드 서열은 "1"에 의해 표시되고, 반면 단편 세트 410에 대한 바코드 서열은 "2"에 의해 표시된다. 바코드의 다양한 라이브러리가 다수의 상이한 단편 세트를 차별적으로 바코드화하는데 이용될 수 있다. 하지만, 상이한 첫 번째 단편으로부터 모든 두 번째 단편 세트가 상이한 바코드 서열로 바코드화될 필요는 없다. 실제로, 많은 경우에, 복수의 상이한 첫 번째 단편이 동일한 바코드 서열을 포함하도록 동시에 처리될 수 있다. 다양한 바코드 라이브러리는 본원의 다른 곳에서 상세하게 설명된다.
예로서, 단편 세트 408 및 410으로부터 바코드화된 단편은 이후, 예로서 Thermo-Fisher, Inc.의 Illumina 또는 Ion Torrent 부문으로부터 가용한 합성 기술에 의한 서열을 이용한 염기서열결정을 위해 모아질 수 있다. 일단 염기서열결정되면, 서열 리드 412는 포함된 바코드에 최소한 부분적으로 근거하여, 그리고 일부 경우에, 단편 그 자체의 서열에 부분적으로 근거하여 예로서, 응집된 리드 414 및 416에서 보여지는 바와 같이, 그들의 개별 단편 세트에 기인될 수 있다. 각 단편 세트에 대한 기인된 서열 리드는 이후, 각 세포의 핵산에 대한 조립된 서열, 예를 들면, 서열 418 및 420을 제공하기 위해 조립되고, 이들은 차례로, 개별 세포, 예를 들면, 세포 400 및 402에 기인될 수 있다.
세포 내에 존재하는 유전 물질을 분석하는 면에서 설명되긴 했지만, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 개별 세포에 시약의 할당을 허용하고, 그리고 이들 시약에 대한 응답으로 이들 세포의 귀인 분석 또는 특징화를 제공함으로써, 개별 세포 또는 세포 개체군의 다른 양상을 특징짓는 능력을 비롯한 훨씬 넓은 적용가능성을 가질 수 있다. 이들 방법 및 시스템은 예로서, 연구, 진단, 병원체 확인, 그리고 많은 다른 목적을 위해 세포를 특징지을 수 있다는 점에서 특히 귀중하다. 실례로서, 넓은 범위의 상이한 세포 표면 특질, 예를 들면, 세포 표면 단백질, 예를 들면, 분화 또는 CD 단백질의 클러스터는 암과 같은 질환의 특징화에서 유의미한 진단적 관련성을 갖는다.
한 가지 특히 유용한 적용에서, 본원에서 설명된 방법 및 시스템은 세포 특질, 예를 들면, 세포 표면 특질, 예를 들면, 단백질, 수용체 등을 특징짓는데 이용될 수 있다. 특히, 본원에서 설명된 방법은 리포터 분자를 이들 세포 특질에 부착하는데 이용될 수 있는데, 이들 특질은 앞서 설명된 바와 같이 분할될 때, 개별 세포 또는 세포 개체군 내에 이런 세포 특질의 존재, 그리고 일부 경우에, 상대적 존재비 또는 양을 확인하기 위해, 예로서 DNA 염기서열결정 기술을 이용하여 바코드화되고 분석될 수 있다.
특정 실례에서, 잠재적 세포 결합 리간드, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 세포 표면 수용체 결합 분자, 또는 기타 유사한 것의 라이브러리는 예로서, 핵산 리포터 분자의 첫 번째 세트와 연관되어 제공될 수 있는데, 여기서 상이한 리포터 올리고뉴클레오티드 서열은 특정한 리간드와 연관되고, 그리고 이런 이유로, 특정한 세포 표면 특질에 결합할 수 있다. 일부 양상에서, 라이브러리의 상이한 구성원은 상이한 올리고뉴클레오티드 서열 라벨의 존재에 의해 특징화될 수 있다, 예를 들면, 첫 번째 유형의 세포 표면 단백질 또는 수용체에 대한 항체는 이것과 연관된 첫 번째 공지된 리포터 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 것이고, 반면 두 번째 수용체 단백질에 대한 항체는 이것과 연관된 상이한 공지된 리포터 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 것이다. 공분할하기에 앞서, 세포는 상이한 세포 표면 특질의 광범위한 패널, 예를 들면, 수용체, 단백질 등에 대한 항체를 나타낼 수 있고, 그리고 그들의 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리간드의 라이브러리와 함께 배양될 것이다. 결합되지 않은 리간드는 세포로부터 세척되고, 그리고 이들 세포는 이후, 앞서 설명된 바코드 올리고뉴클레오티드와 함께 공분할된다. 결과적으로, 파티션은 세포 또는 세포들뿐만 아니라 결합된 리간드 및 이들의 공지된, 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이다.
파티션 내에서 세포를 용해할 필요 없이, 이후 리포터 올리고뉴클레오티드를 세포 핵산에 대해 앞서 설명된 바코드화 작업에 종속시켜, 바코드화된, 리포터 올리고뉴클레오티드를 생산할 수 있었는데, 여기서 리포터 올리고뉴클레오티드의 존재는 특정 세포 표면 특질의 존재를 지시할 수 있고, 그리고 바코드 서열은 소정의 세포 또는 세포 개체군으로 공분할된 바코드 서열에 근거하여, 상이한 세포 표면 특질의 범위의 상기 개별 세포 또는 세포 개체군으로의 귀인을 허용할 것이다. 결과적으로, 더욱 넓은 세포 개체군 내에서 세포 표면 특질의 세포별 프로필을 산출할 수 있다. 본원에서 설명된 방법 및 시스템의 이러한 양상은 아래에 더욱 상세하게 설명된다.
이러한 실례는 도면 5에서 개략적으로 도해된다. 보여지는 바와 같이, 세포 502 및 504에 의해 대표되는 세포 개체군은 세포 표면 연관된 시약의 라이브러리, 예를 들면, 항체, 세포 표면 결합 단백질, 리간드 또는 기타 유사한 것과 함께 배양되는데, 여기서 각 상이한 유형의 결합 기는 자신과 연관되는 연관된 핵산 리포터 분자를 포함하고, 리간드 및 연관된 리포터 분자 506, 508, 510 및 512 (리포터 분자는 상이하게 음영된 원에 의해 지시됨)로서 도시된다. 세포가 라이브러리에 의해 결합되는 표면 특질을 발현하는 경우에, 리간드 및 이들의 연관된 리포터 분자는 세포 표면과 연관되거나 또는 연계될 수 있다. 개별 세포는 이후, 이들의 연관된 리간드/리포터 분자뿐만 아니라 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 개별 바코드 올리고뉴클레오티드 비드, 예를 들면, 비드 522 및 524 각각과 함께, 별개의 파티션, 예를 들면, 비말 514 및 516 내로 분할된다. 본원에서 설명된 다른 실례에서처럼, 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 비드로부터 방출되고, 그리고 소정의 파티션에 공통적이지만, 상이한 파티션 사이에서 폭넓게 변하는 바코드로, 각 파티션 내에 존재하는 리포터 분자에 바코드 서열을 부착하는데 이용된다. 가령, 도면 5에서 보여지는 바와 같이, 파티션 514 내에 세포 502와 연관되는 리포터 분자는 바코드 서열 518로 바코드화되고, 반면 파티션 516 내에 세포 504와 연관된 리포터 분자는 바코드 520으로 바코드화된다. 결과적으로, 리포터 분자에 의해 반영된 바와 같이, 세포의 표면 리간드를 반영하지만, 세포의 표면 특성의 단일 세포 수준 프로파일링을 허용하는 공통 바코드 서열에 의해서 개별 세포에 실제적으로 기인되는 올리고뉴클레오티드의 라이브러리가 제공된다. 인지되는 바와 같이, 이러한 과정은 세포 표면 수용체에 한정되지 않으며, 매우 다양한 특정한 세포 구조, 화학적 성질 또는 다른 특징의 존재를 확인하는데 이용될 수 있다.
III. 단일 세포 분석의 적용
특정한 개별 세포의 분석, 다른 세포 유형의 개체군 내에 상이한 세포 유형의 분석, 환경, 인간 건강, 역학적 법의학에 대한 대규모 세포 개체군의 분석 및 특징화, 또는 매우 다양한 상이한 적용 중에서 한 가지를 비롯하여, 본원에서 설명된 단일 세포 공정 및 분석 방법 및 시스템의 매우 다양한 상이한 적용이 있다.
본원에서 설명된 단일 세포 분석 과정의 특히 귀중한 적용은 암 세포의 염기서열결정 및 특징화에 있다. 특히, 상기에 암시된 앙상블 염기서열결정 과정을 비롯한 전통적인 분석 기법은 암 세포의 유전체 구성에서 작은 변이를 선발하는데 별로 뛰어나지 않은데, 이들이 정상적인 조직 세포의 바다에서 존재할 경우에 특히 그러하다. 게다가, 심지어 종양 세포 사이에도, 넓은 변이가 존재할 수 있고, 그리고 염기서열결정에 대한 이들 앙상블 접근법에 의해 차폐될 수 있다 (가령, Patel, et al., Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma, Science DOI: 10.1126/science.1254257 (2014년 6월 12일자에 온라인 공개됨)을 참조한다. 암 세포는 고형 종양, 혈액학적 악성, 세포주로부터 유래되거나, 또는 순환성 종양 세포로서 획득되고, 그리고 앞서 설명된 분할 과정에 종속될 수 있다. 분석 시에, 개별 세포 서열을 단일 세포 또는 세포의 소집단으로부터 유래하는 것으로 확인하고, 그리고 이들을 정상적인 조직 세포 서열과 식별할 수 있다. 게다가, 전체 개시가 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는, 2014년 6월 26일자 제출된 공동 계류 중인 U.S. 특허가출원 번호 62/017,808에서 설명된 바와 같이, 각 세포로부터 단계적인 서열 정보를 또한 획득하여, 암 세포 내에 일배체형 변이체의 더욱 명확한 특징화를 허용할 수 있다. 단일 세포 분석 접근법은 전체 개시가 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는, 2014년 6월 26일자 제출된 공동 계류 중인 U.S. 특허가출원 번호 62/017,580에서 설명된 바와 같이, 적은 양의 입력 핵산을 수반하는 시스템 및 방법에 특히 유용하다.
암 세포 분석에서처럼, 태아 세포의 분석을 통한 태아 건강 또는 이상의 분석 및 진단은 전통적인 기술을 이용하면 어려운 과제이다. 특히, 상대적으로 침습성 시술, 예를 들면, 양수천자의 부재에서 태아 세포 표본을 획득하는 것은 모체 순환으로부터 이들 세포를 수확하는 것을 이용할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 이런 순환성 태아 세포는 순환의 전체 세포 개체군 중에서 극히 작은 분율을 구성한다. 결과적으로, 획득된 데이터 중에서 어느 것이 모체 세포와는 대조적으로 태아 세포로부터 아마도 유래되는 지를 특징짓기 위해 복잡한 분석이 수행된다. 하지만, 본원에서 설명된 단일 세포 특징화 방법 및 시스템을 이용함으로써, 유전자 구성을 개별 세포에 기인시키고, 그리고 이들 세포를 그들의 개별 유전자 구성에 근거하여 모체 또는 태아로 분류할 수 있다. 게다가, 태아 세포의 유전자 서열은 예로서, 이수성, 예를 들면, 다운 증후군, 에드워드 증후군 및 파타우 증후군을 비롯한 다수의 유전 질환 중에서 한 가지를 확인하는데 이용될 수 있다.
더욱 크고 다양한 세포 개체군으로부터 개별 세포를 특징짓는 능력은 또한, 환경적 시험뿐만 아니라 법의학 분석 둘 모두에서 유의미한 가치를 갖는데, 여기서 표본은 그들의 본성에 의해, 표본이 시험되는 세포에 비하여 표본을 "오염"시키는 다양한 세포 개체군 및 다른 물질, 예를 들면, 예로서, 환경 및 식품 안전성 시험을 위한 환경적 지표 생물체, 독성 생물체 등, 성폭행 및 다른 강력 범죄에 대한 법의학 분석에서 피해자 및/또는 가해자 세포, 기타 등등으로 구성될 수 있다.
상기 설명된 단일 세포 염기서열결정 및 특징화 과정의 추가 유용한 적용은 신경과학 연구 및 진단의 분야이다. 특히, 신경 세포는 유전체 주변으로 이동할 수 있는 긴 산재된 핵 요소 (LINEs), 또는 '점핑' 유전자를 포함할 수 있는데, 이들은 각 뉴런이 이웃 세포와 상이하도록 유발한다. 연구를 통해, 인간 뇌 내에 LINE의 숫자는 80 내지 300개의 독특한 삽입으로, 다른 조직, 예를 들면, 심장 및 간 조직의 것을 초과하는 것으로 밝혀졌다 (가령, Coufal, N. G. et al. Nature 460, 1127-1131 (2009)을 참조한다). 이들 차이는 신경 질환에 대한 개인의 감수성에 관련되거나 (가령, Muotri, A. R. et al. Nature 468, 443-446 (2010)을 참조한다), 또는 과제에 대응하는 다양성을 뇌에 제공하는 것으로 상정되었다. 따라서, 본원에서 설명된 방법은 개별 신경 세포의 염기서열결정 및 특징화에서 이용될 수 있다.
또한, 본원에서 설명된 단일 세포 분석 방법은 전술한 바와 같이, RNA 전사체의 확인 및 이들의 정량 둘 모두의 면에서 유전자 발현의 분석에서 유용하다. 특히, 본원에서 설명된 단일 세포 수준 분석 방법을 이용하여, 개별 세포, 세포 개체군, 또는 세포 개체군의 부분집합 내에 존재하는 RNA 전사체를 단리하고 분석할 수 있다. 특히, 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 개별 세포로부터 RNA의 바코드화된 단편을 기폭하고, 복제하고, 그리고 결과적으로 산출하도록 설정될 수 있다. 가령, 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 mRNA 특정한 기폭 서열, 예를 들면, 역전사 반응에서 mRNA의 기폭 및 복제를 허용하는 폴리-T 프라이머 분절 또는 다른 표적화된 기폭 서열을 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 무작위 RNA 기폭은 바코드 올리고뉴클레오티드의 무작위 N-mer 프라이머 분절을 이용하여 수행될 수 있다.
도면 6은 본원에서 설명된 방법을 이용하여 개별 세포에서 RNA 발현 분석을 위한 한 가지 실례 방법의 계통도를 제공한다. 보여지는 바와 같이, 작업 602에서 세포 내포 표본은 생존가능 세포에 대해 분류되고, 이들은 차후 분할을 위해 정량되고 희석된다. 작업 604에서, 개별 세포는 본원에서 설명된 바와 같은 바코드화 올리고뉴클레오티드를 보유하는 겔 비드로 별개로 공분할된다. 세포는 용해되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 작업 606에서 파티션 내로 방출되는데, 여기서 이들은 예로서, mRNA의 폴리-A 꼬리에 상보적인 폴리-T 프라이머 서열에 의해서, 작업 608에서 mRNA와 상호작용하고 여기에 혼성화한다. 폴리-T 바코드 올리고뉴클레오티드를 기폭 서열로서 이용하여, 역전사 반응이 바코드 서열을 포함하는 mRNA의 cDNA 전사체를 합성하기 위해 작업 610에서 수행된다. 바코드화된 cDNA 전사체는 이후, 이들이 cDNA 서열 및 이의 연관된 바코드 서열(들)의 결정을 위해 핵산 염기서열결정 시스템 위에 배치되기 전에, 작업 612에서 예로서, PCR 과정을 이용한 추가 증폭, 작업 614에서 정제에 종속된다. 일부 경우에, 보여지는 바와 같이, 작업 602 내지 608은 시약이 그들의 본래 비말 또는 파티션 내에 남아있는 동안 일어날 수 있고, 반면 작업 612 내지 616은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 612 내지 616을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 유제가 파괴된 후 엑소뉴클레아제로 소화될 수 있다. 엑소뉴클레아제 활성은 프라이머 소화 이후에 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)에 의해 저해될 수 있다. 일부 경우에, 작업 610은 역전사 혼합물, 예를 들면, 역전사효소 및 연관된 시약의 공분할에 근거하여 파티션 내에서 수행될 수 있거나, 또는 이것은 대량으로 수행될 수 있다.
본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 바코드 올리고뉴클레오티드의 구조는 올리고뉴클레오티드 바코드 서열에 더하여 다수의 서열 요소를 포함할 수 있다. 앞서 설명된 바와 같은 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 한 가지 실례는 도면 7에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 702는 방출가능한 연쇄 706, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 704에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 기능적 서열 708을 포함할 수 있는데, 이들은 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열 중에서 하나 또는 그 이상, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 P5 서열뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 R1 프라이머를 포함할 수 있다. 바코드 서열 710은 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. mRNA 특정한 기폭 서열, 예를 들면, 폴리-T 서열 712 역시 올리고뉴클레오티드 구조 내에 포함된다. 정착 서열 분절 714는 폴리-T 서열이 mRNA의 서열 단부에서 혼성화하도록 담보하기 위해 포함될 수 있다. 이러한 정착 서열은 뉴클레오티드의 무작위 짧은 서열, 예를 들면, 1-mer, 2-mer, 3-mer 또는 더욱 긴 서열을 포함할 수 있는데, 이것은 폴리-T 분절이 mRNA의 폴리-A 꼬리의 서열 단부에서 혼성화할 개연성이 더욱 높도록 담보할 것이다. 추가 서열 분절 716이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 독특한 분자 서열 분절을 예로서, 무작위 서열 (가령, 예를 들면, 무작위 N-mer 서열)로서 제공하는데, 이것은 단일 비드에 연계된 개별 올리고뉴클레오티드에 걸쳐 변하고, 반면 바코드 서열 710은 개별 비드에 묶인 올리고뉴클레오티드 사이에서 일정할 수 있다. 이러한 독특한 서열은 본래 발현된 RNA의 숫자의 정량을 허용하기 위해, 포획되었던 시작 mRNA 분자의 독특한 식별자를 제공하는데 역할을 한다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다. 이러한 독특한 분자 서열 분절은 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 5 내지 약 8개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 독특한 분자 서열 분절은 길이에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 독특한 분자 서열 분절은 길이에서 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 독특한 분자 서열 분절은 길이에서 기껏해야 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드 또는 그 이하일 수 있다.
작업 동안, 그리고 도면 6 및 7에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드와 함께 공분할되고 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출된다. 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 부분은 이후, mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 이후, mRNA의 역전사를 기폭하여 mRNA의 cDNA 전사체를 생산하지만, 이것은 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 708-716 각각을 포함한다. 다시 한 번, 올리고뉴클레오티드 702가 정착 서열 714를 포함하기 때문에, 이것은 mRNA의 폴리-A 꼬리의 서열 단부에 혼성화하고 역전사를 기폭할 개연성이 더욱 높을 것이다. 임의의 소정의 파티션 내에서, 개별 mRNA 분자의 모든 cDNA 전사체는 공통 바코드 서열 분절 710을 포함할 것이다. 하지만, 독특한 무작위 N-mer 서열을 포함함으로써, 소정의 파티션 내에 상이한 mRNA 분자로부터 만들어진 전사체는 이러한 독특한 서열에서 변할 것이다. 이것은 심지어, 소정의 파티션의 내용물의 임의의 차후 증폭 이후에도 인지가능할 수 있는 정량 특질을 제공한다, 예를 들면, 공통 바코드와 연관된 독특한 분절의 숫자는 단일 파티션 및 따라서, 단일 세포로부터 유래하는 mRNA의 양을 지시할 수 있다. 전술한 바와 같이, 전사체는 이후, mRNA의 cDNA 전사체의 서열을 확인할 뿐만 아니라 바코드 분절 및 독특한 서열 분절을 염기서열결정하기 위해 증폭되고, 청소되고, 염기서열결정된다.
본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 폴리-T 프라이머 서열이 설명되긴 하지만, 다른 표적화된 또는 무작위 기폭 서열 역시 역전사 반응을 기폭하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 비록 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 용해된 세포의 내용물과 함께 파티션 내로 방출하는 것으로 설명되긴 하지만, 일부 경우에, 겔 비드 결합된 올리고뉴클레오티드가 다른 세포 내용물로부터 RNA의 분리를 용이하게 하기 위해, 겔 비드의 고체상 상에서 mRNA를 혼성화하고 포획하는데 이용될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
전령 RNA (mRNA, 세포로부터 획득된 mRNA 포함) 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 9A에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 902는 방출가능한 연쇄 906, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 904에 연계될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 908뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 910을 포함할 수 있다. 바코드 서열 912는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. RNA 특정한 (가령, mRNA 특정한) 기폭 서열, 예를 들면, 폴리-T 서열 914 역시 올리고뉴클레오티드 구조 내에 포함된다. 정착 서열 분절 (도시되지 않음)은 폴리-T 서열이 mRNA의 서열 단부에서 혼성화하도록 담보하기 위해 포함될 수 있다. 추가 서열 분절 916이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 이러한 추가 서열은 독특한 분자 서열 분절을 예로서, 무작위 N-mer 서열로서 제공할 수 있는데, 이것은 단일 비드에 연계된 개별 올리고뉴클레오티드에 걸쳐 변하고, 반면 바코드 서열 912는 개별 비드에 묶인 올리고뉴클레오티드 사이에서 일정할 수 있다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이러한 독특한 서열은 본래 발현된 RNA의 숫자의 정량, 예를 들면, mRNA 계수를 허용하기 위해, 포획되었던 시작 mRNA 분자의 독특한 식별자를 제공하는데 역할을 할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다.
세포 RNA (가령, mRNA) 분석의 한 가지 실례 방법에서 및 도면 9A에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드, 스위치 올리고 924, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 950에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 이후, 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 952에서 폴리-T 분절 914는 mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체에 부가된 추가 염기와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 임의의 소정의 파티션 내에서, 개별 mRNA 분자의 모든 cDNA 전사체는 공통 바코드 서열 분절 912를 포함할 것이다. 하지만, 독특한 무작위 N-mer 서열 916을 포함함으로써, 소정의 파티션 내에 상이한 mRNA 분자로부터 만들어진 전사체는 이러한 독특한 서열에서 변할 것이다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이것은 심지어, 소정의 파티션의 내용물의 임의의 차후 증폭 이후에도 인지가능할 수 있는 정량 특질을 제공한다, 예를 들면, 공통 바코드와 연관된 독특한 분절의 숫자는 단일 파티션 및 따라서, 단일 세포로부터 유래하는 mRNA의 양을 지시할 수 있다. 작업 952 이후에, cDNA 전사체 922는 이후, 작업 954에서 프라이머 926 (가령, PCR 프라이머)으로 증폭된다. 그 다음, 증폭된 산물은 이후, 작업 956에서 정제된다 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해). 작업 958에서, 증폭된 산물은 이후, 전단되고, 추가 기능적 서열에 결찰되고, 그리고 더욱 증폭된다 (가령, PCR을 통해). 기능적 서열은 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열 930, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 P7 서열뿐만 아니라 예로서, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 R2 프라이머에 대한 염기서열결정 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 928뿐만 아니라 표본 색인, 예를 들면, Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 i7 표본 색인 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 932를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 작업 950 및 952는 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 954, 956 및 958은 벌크 용액에서 (가령, 파티션 외부에서 모아진 혼합물에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 954, 956 및 958을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 일부 경우에, 작업 954는 파티션에서 완결될 수 있다. 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오티드는 유제가 파괴된 후 엑소뉴클레아제로 소화될 수 있다. 엑소뉴클레아제 활성은 프라이머 소화 이후에 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)에 의해 저해될 수 있다. 비록 일정한 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Illumina 시스템에 대해 이용된 특정한 서열 참조의 면에서 설명되긴 하지만, 이들 서열에 대한 참조는 단지 예시를 목적으로 하고, 그리고 본원에서 설명된 방법은 이들 시스템에서 이용되는 특정한 기폭, 부착, 색인 및 다른 작업 순서를 통합하는 다른 염기서열결정 시스템, 예를 들면, Ion Torrent, Oxford Nanopore, Genia, Pacific Biosciences, Complete Genomics 등으로부터 가용한 시스템용으로 설정될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
도면 9A에서 보여지는 바와 같이 RNA (가령, 세포 RNA) 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 대안적 실례에서, 기능적 서열 908은 P7 서열일 수 있고 기능적 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위일 수 있다. 게다가, 기능적 서열 930은 P5 서열일 수 있고, 기능적 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위일 수 있고, 그리고 기능적 서열 932는 Illumina 염기서열결정 시스템의 경우에 i5 표본 색인 서열일 수 있다. 이런 바코드 올리고뉴클레오티드에 의해 산출된 구조체의 형상은 염기서열결정 동안 폴리-T 서열의 염기서열결정을 최소화하는데 (또는 방지하는데) 도움을 줄 수 있다.
도면 9B에는 세포 mRNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 스위치 올리고 924는 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께, 개별 세포 및 바코드화된 비드로 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 스위치 올리고 924는 추가 태그 934, 예를 들면, 비오틴으로 표지화될 수 있다. 작업 951에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 작업 953에서 폴리-T 분절 914는 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 그 다음, 단리 작업 960이 파티션 내에 시약 및 올리고뉴클레오티드로부터 cDNA 전사체 922를 단리하는데 이용될 수 있다. 추가 태그 934, 예를 들면, 비오틴은 자성 비드 938에 부착될 수 있는 상호작용 태그 936, 예를 들면, 스트렙타비딘과 접촉될 수 있다. 작업 960에서 cDNA는 작업 955에서 증폭 (가령, PCR을 통해) 전에 풀다운 작업 (가령, 자성 분리, 원심분리를 통해)으로 단리되고, 그 이후에 작업 957에서 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고 작업 959에서 추가 처리 (전단, 서열 928, 932 및 930의 결찰, 그리고 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))될 수 있다. 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, 보여지는 바와 같이, 작업 951 및 953은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 960, 955, 957 및 959은 벌크 용액에서 (가령, 파티션 외부에서 모아진 혼합물에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 960을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 이후, 작업 955, 957 및 959는 전사체가 처리를 위해 모아진 후, 작업 960 이후에 수행될 수 있다.
도면 9C에는 세포 mRNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 스위치 올리고 924는 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께, 개별 세포 및 바코드화된 비드로 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내에서 공분할된다. 작업 961에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 이후, 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 963에서 폴리-T 분절 914는 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 작업 961 및 작업 963 이후에, mRNA 920 및 cDNA 전사체 922는 작업 962에서 변성된다. 작업 964에서, 두 번째 가닥은 추가 태그 942, 예를 들면, 비오틴을 갖는 프라이머 940로부터 연장되고, 그리고 cDNA 전사체 922에 혼성화된다. 또한 작업 964에서, 비오틴 표지화된 두 번째 가닥은 자성 비드 938에 부착될 수 있는 상호작용 태그 936, 예를 들면, 스트렙타비딘과 접촉될 수 있다. cDNA는 작업 965에서 증폭 (가령, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해) 전에 풀다운 작업 (가령, 자성 분리, 원심분리를 통해)으로 단리되고, 그 이후에 작업 967에서 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고 작업 969에서 추가 처리 (전단, 서열 928, 932 및 930의 결찰, 그리고 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))될 수 있다. 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, 작업 961 및 963은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 962, 964, 965, 967 및 969는 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 962, 964, 965, 967 및 969을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
도면 9D에는 세포 mRNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 스위치 올리고 924는 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께, 개별 세포 및 바코드화된 비드로 공분할된다. 작업 971에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 902 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 914는 이후 세포로부터 방출되는 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 973에서 폴리-T 분절 914는 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 924는 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적인 서열은 이후, 스위치 올리고 924를 주형으로서 이용한 cDNA 전사체 922의 연장을 통해 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 작업 966에서, mRNA 920, cDNA 전사체 922 및 스위치 올리고 924는 변성될 수 있고, 그리고 cDNA 전사체 922는 추가 태그 946, 예를 들면, 비오틴으로 표지화된 포획 올리고뉴클레오티드 944로 혼성화될 수 있다. 이러한 작업에서, cDNA 전사체에 혼성화되는 비오틴-표지화된 포획 올리고뉴클레오티드 944는 자성 비드 938에 부착될 수 있는 상호작용 태그 936, 예를 들면, 스트렙타비딘과 접촉될 수 있다. 풀다운 작업 (가령, 자성 분리, 원심분리를 통해)을 이용한 다른 종류 (가령, 과잉 바코드화된 올리고뉴클레오티드)로부터 분리 이후에, cDNA 전사체는 작업 975에서 프라이머 926으로 증폭되고 (가령, PCR을 통해), 그 이후에 작업 977에서 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고 작업 979에서 추가 처리 (전단, 서열 928, 932 및 930의 결찰, 그리고 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))될 수 있다. 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 다른 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, 작업 971 및 973은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 966, 975, 977 (정제) 및 979는 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 966, 975, 977 및 979을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
도면 9E에는 세포 RNA 분석을 비롯한 RNA 분석을 위한 다른 실례 방법이 도시된다. 이러한 방법에서, 개별 세포는 바코드 보유 비드, 스위치 올리고 990, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 981에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 (가령, 도면 9A에서 보여지는 바와 같이 902)가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 908은 P7 서열이고, 그리고 서열 910은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 908은 P5 서열이고, 그리고 서열 910은 R1 프라이머 결합 부위이다. 그 다음, 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 이후, 세포로부터 방출된 mRNA 920의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 983에서 폴리-T 분절 914는 이후, 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 922를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 908, 912, 910, 916 및 914 각각을 포함한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. 스위치 올리고 990은 이후, cDNA 전사체와 혼성화하고 주형 전환을 용이하게 할 수 있다. 스위치 올리고 서열에 상보적이고 T7 프로모터 서열을 포함하는 서열은 cDNA 전사체 922 내로 통합될 수 있다. 작업 968에서, 두 번째 가닥이 합성되고, 그리고 작업 970에서 T7 프로모터 서열이 T7 중합효소에 의해 이용되어 시험관내 전사에서 RNA 전사체가 생산될 수 있다. 작업 985에서 RNA 전사체가 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해)되고, 역전사되어 DNA 전사체를 형성할 수 있고, 그리고 두 번째 가닥이 각각의 DNA 전사체에 대해 합성될 수 있다. 일부 경우에, 정제에 앞서, RNA 전사체는 잔여 DNA를 분해하기 위해 DNA분해효소 (가령, DNAase I)와 접촉될 수 있다. 작업 987에서 DNA 전사체는 이후, 단편화되고, 추가 기능적 서열, 예를 들면, 서열 928, 932 및 930에 결찰되고, 그리고 일부 경우에, 더욱 증폭된다 (가령, PCR을 통해). 서열 908이 P7 서열이고 서열 910이 R2 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P5 서열이고, 서열 928은 R1 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i5 표본 색인 서열이다. 서열 908이 P5 서열이고 서열 910이 R1 프라이머 결합 부위인 일부 경우에, 서열 930은 P7 서열이고, 서열 928은 R2 프라이머 결합 부위이고, 그리고 서열 932는 i7 표본 색인 서열이다. 일부 경우에, DNA 전사체의 일부를 제거하기에 앞서, 이들 DNA 전사체는 잔여 RNA를 분해하기 위해 RNA분해효소와 접촉될 수 있다. 일부 경우에, 작업 981 및 983은 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 968, 970, 985 및 987은 대량으로 (가령, 파티션의 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 968, 970, 985 및 987을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
전령 RNA (mRNA, 세포로부터 획득된 mRNA 포함) 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 다른 실례는 도면 10에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1002는 방출가능한 연쇄 1006, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1004에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P7 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1008뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R2 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1010을 포함할 수 있다. 바코드 서열 1012는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. RNA 특정한 (가령, mRNA 특정한) 기폭 서열, 예를 들면, 폴리-T 서열 1014가 올리고뉴클레오티드 구조 내에 포함될 수 있다. 정착 서열 분절 (도시되지 않음)은 폴리-T 서열이 mRNA의 서열 단부에서 혼성화하도록 담보하기 위해 포함될 수 있다. 추가 서열 분절 1016이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공할 수 있다. 추가 기능적 서열 1020, 예를 들면, T7 RNA 중합효소 프로모터 서열이 시험관내 전사를 위해 포함될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다.
세포 RNA 분석의 한 가지 실례 방법에서 및 도면 10에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 1050에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드 1002가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절 1014는 이후, mRNA 1020의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 1052에서 폴리-T 분절은 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA의 cDNA 전사체 1022를 생산하고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 1020, 1008, 1012, 1010, 1016 및 1014 각각을 포함한다. 임의의 소정의 파티션 내에서, 개별 mRNA 분자의 모든 cDNA 전사체는 공통 바코드 서열 분절 1012를 포함할 것이다. 하지만, 독특한 무작위 N-mer 서열을 포함함으로써, 소정의 파티션 내에 상이한 mRNA 분자로부터 만들어진 전사체는 이러한 독특한 서열에서 변할 것이다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 이것은 심지어, 소정의 파티션의 내용물의 임의의 차후 증폭 이후에도 인지가능할 수 있는 정량 특질을 제공한다, 예를 들면, 공통 바코드와 연관된 독특한 분절의 숫자는 단일 파티션 및 따라서, 단일 세포로부터 유래하는 mRNA의 양을 지시할 수 있다. 작업 1054에서, 두 번째 가닥이 합성되고, 그리고 작업 1056에서 T7 프로모터 서열이 T7 중합효소에 의해 이용되어 시험관내 전사에서 RNA 전사체가 생산될 수 있다. 작업 1058에서 전사체는 단편화되고 (가령, 전단되고), 추가 기능적 서열에 결찰되고, 그리고 역전사된다. 기능적 서열은 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열 1030, 예를 들면, P5 서열뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머, 예를 들면, R1 프라이머 결합 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1028뿐만 아니라 표본 색인, 예를 들면, i5 표본 색인 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1032를 포함할 수 있다. 작업 1060에서, RNA 전사체는 DNA로 역전사될 수 있고, 상기 DNA는 mRNA의 cDNA 전사체의 서열을 확인할 뿐만 아니라 바코드 분절 및 독특한 서열 분절을 염기서열결정하기 위해 증폭 (가령, PCR을 통해)되고 염기서열결정된다. 일부 경우에, 작업 1050 및 1052는 파티션에서 일어날 수 있고, 반면 작업 1054, 1056, 1058 및 1060은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 작업 1054, 1056, 1058 및 1060을 완결하기 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
도면 10에서 보여지는 바와 같이 RNA (가령, 세포 RNA) 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 대안적 실례에서, 기능적 서열 1008은 P5 서열일 수 있고 기능적 서열 1010은 R1 프라이머 결합 부위일 수 있다. 게다가, 기능적 서열 1030은 P7 서열일 수 있고, 기능적 서열 1028은 R2 프라이머 결합 부위일 수 있고, 그리고 기능적 서열 1032는 i7 표본 색인 서열일 수 있다.
전령 RNA (mRNA, 세포로부터 획득된 mRNA 포함) 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 11에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1102는 방출가능한 연쇄 1106, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1104에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1108뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1110을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열 1108은 P7 서열이고, 그리고 서열 1110은 R2 프라이머 결합 부위이다. 바코드 서열 1112는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. 추가 서열 분절 1116이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공할 수 있다. 추가 서열 1114, 예를 들면, 폴리G가 주형 전환을 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다.
세포 mRNA 분석의 한 가지 실례 방법에서 및 도면 11에 관하여, 세포는 바코드 보유 비드, 폴리-T 서열, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 작업 1150에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 폴리-T 서열은 세포로부터 방출된 mRNA 1120의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 그 다음, 작업 1152에서 폴리-T 서열은 이후, mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체 1122를 생산한다. 역전사효소의 말단 전달효소 활성은 추가 염기 (가령, 폴리C)를 cDNA 전사체에 부가할 수 있다. cDNA 전사체에 부가된 추가 염기, 예를 들면, 폴리C는 이후, 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 1114와 혼성화할 수 있다. 이것은 주형 전환을 용이하게 할 수 있고, 그리고 바코드 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열은 cDNA 전사체 내로 통합될 수 있다. 전사체는 더욱 처리되고 (가령, 증폭되거나, 부분 제거되거나, 추가 서열 부가되거나, 기타 등등), 그리고 예로서, 염기서열결정함으로써 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 특징화될 수 있다. 이런 방법에 의해 산출된 구조체의 형상은 염기서열결정 동안 폴리-T 서열의 염기서열결정을 최소화하는데 (또는 방지하는데) 도움을 줄 수 있다.
세포 RNA 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 12A에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1202는 방출가능한 연쇄 1206, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1204에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1208뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1210을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열 1208은 P7 서열이고, 그리고 서열 1210은 R2 프라이머 결합 부위이다. 바코드 서열 1212는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. 추가 서열 분절 1216이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공할 수 있다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다. 이러한 바코드를 이용한 세포 RNA 분석의 한 가지 실례 방법에서, 세포는 바코드 보유 비드, 그리고 다른 시약, 예를 들면, RNA 리가아제 및 환원제와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 이후, 파티션 내에 있는 동안 RNA 리가아제에 의해 mRNA 전사체의 5' 단부에 결찰될 수 있다. 차후 작업은 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해) 및 추가 처리 (전단, 기능적 서열의 결찰 및 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))를 포함할 수 있고, 그리고 이들 작업은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 추가 작업을 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다.
세포 RNA 분석을 비롯한 RNA 분석에서 이용을 위한 바코드 올리고뉴클레오티드의 추가 실례는 도면 12B에서 도시된다. 보여지는 바와 같이, 전체 올리고뉴클레오티드 1222는 방출가능한 연쇄 1226, 예를 들면, 이황화 링커에 의해 비드 1224에 연계된다. 올리고뉴클레오티드는 차후 처리에서 이용되는 기능적 서열, 예를 들면, 서열분석기 특정한 흐름 셀 부착 서열, 예를 들면, P5 서열을 포함할 수 있는 기능적 서열 1228뿐만 아니라 염기서열결정 프라이머 서열, 예를 들면, R1 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있는 기능적 서열 1230을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 서열 1228은 P7 서열이고, 그리고 서열 1230은 R2 프라이머 결합 부위이다. 바코드 서열 1232는 표본 RNA를 바코드화하는데 이용하기 위해 구조 내에 포함된다. 기폭 서열 1234 (가령, 무작위 기폭 서열) 역시 올리고뉴클레오티드 구조, 예를 들면, 무작위 헥사머 내에 포함될 수 있다. 추가 서열 분절 1236이 올리고뉴클레오티드 서열 내에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 추가 서열은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 독특한 분자 서열 분절을 제공한다. 인지되는 바와 같이, 비록 비드의 표면에 묶인 단일 올리고뉴클레오티드로서 도시되긴 하지만, 개별 비드는 수만 개 내지 수십 만 개 또는 심지어 수백 만 개의 개별 올리고뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있는데, 여기서 언급된 바와 같이, 바코드 분절은 소정의 비드에 대해 일정하거나 또는 상대적으로 일정할 수 있지만, 여기서 가변적 또는 독특한 서열 분절은 개별 비드에 걸쳐 변할 것이다. 도면 12B의 바코드 올리고뉴클레오티드를 이용한 세포 mRNA 분석의 한 가지 실례 방법에서, 세포는 바코드 보유 비드 및 추가 시약, 예를 들면, 역전사효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출된다 (가령, 환원제의 작용을 통해). 일부 경우에, 서열 1228은 P7 서열이고, 그리고 서열 1230은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 1228은 P5 서열이고, 그리고 서열 1230은 R1 프라이머 결합 부위이다. 무작위 헥사머의 기폭 서열 1234는 세포 mRNA에 무작위로 혼성화할 수 있다. 무작위 헥사머 서열은 이후, 세포로부터 mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서 연장되어 상기 mRNA에 상보적인 cDNA 전사체를 생산할 수 있고, 그리고 또한, 바코드 올리고뉴클레오티드의 서열 분절 1228, 1232, 1230, 1236 및 1234 각각을 포함한다. 차후 작업은 정제 (가령, 고체상 가역성 고정 (SPRI)을 통해) 및 추가 처리 (전단, 기능적 서열의 결찰 및 차후 증폭 (가령, PCR을 통해))를 포함할 수 있고, 그리고 이들 작업은 대량으로 (가령, 파티션 외부에서) 일어날 수 있다. 파티션이 유제에서 비말인 경우에, 추가 작업을 위해, 유제는 파괴될 수 있고 비말의 내용물은 모아질 수 있다. 바코드 보유 비드와 함께 공분할될 수 있는 추가 시약은 리보솜 RNA (rRNA)를 차단하기 위한 올리고뉴클레오티드 및 세포로부터 유전체 DNA와 cDNA를 소화하기 위한 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 대안으로, rRNA 제거 작용제는 추가 처리 작업 동안 적용될 수 있다. 이런 방법에 의해 산출된 구조체의 형상은 염기서열결정 동안 폴리-T 서열의 염기서열결정을 최소화하는데 (또는 방지하는데) 도움을 줄 수 있다.
본원에서 설명된 단일 세포 분석 방법은 또한, 전체 전사체의 분석에서 유용할 수 있다. 도면 12B의 바코드를 다시 참조하면, 기폭 서열 1234는 무작위 N-mer일 수 있다. 일부 경우에, 서열 1228은 P7 서열이고, 그리고 서열 1230은 R2 프라이머 결합 부위이다. 다른 경우에, 서열 1228은 P5 서열이고, 그리고 서열 1230은 R1 프라이머 결합 부위이다. 이러한 바코드를 이용한 전체 전사체 분석의 한 가지 실례 방법에서, 개별 세포는 바코드 보유 비드, 폴리-T 서열, 그리고 다른 시약, 예를 들면, 역전사효소, 중합효소, 환원제 및 dNTP와 함께 파티션 (가령, 유제에서 비말) 내로 공분할된다. 이러한 방법의 작업에서, 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고 (가령, 환원제의 작용을 통해), 그리고 폴리-T 서열은 세포 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. mRNA를 주형으로서 이용한 역전사 반응에서, 세포 mRNA의 cDNA 전사체가 생산될 수 있다. RNA는 이후, RNA분해효소로 분해될 수 있다. 바코드화된 올리고뉴클레오티드 내에 기폭 서열 1234는 이후, cDNA 전사체에 무작위로 혼성화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 도면 3 (패널 F)에서 도시된 실례 증폭 산물과 유사한 증폭 산물 (가령, 바코드화된 단편)을 산출하기 위해, 도면 3에서 보여지는 바와 유사하게 비드 및 세포로 공분할된 중합효소 효소 및 다른 연장 시약을 이용하여 확장될 수 있다. 바코드화된 핵산 단편은 일부 경우에, 추가 처리 (가령, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 증폭, 추가 서열의 부가, 청소 과정 등)에 종속되고 예로서, 서열 분석을 통해 특징화될 수 있다. 이러한 작업에서, 염기서열결정 신호는 전장 RNA에서 비롯될 수 있다.
비록 다양한 바코드 설계로 작업이 개별적으로 논의되긴 했지만, 개별 비드는 동시적 이용을 위해 다양한 설계의 바코드 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
더욱 큰 개체군으로부터 개별 세포 또는 세포 아개체군을 특징짓는 것에 더하여, 본원에서 설명된 과정 및 시스템은 또한, 세포, 또는 다른 생물체 개체군의 전체 프로필을 제공하기 위한 방식으로서 개별 세포를 특징짓는데 이용될 수 있다. 다양한 적용은 예로서, 마이크로바이옴 분석 및 특징화, 환경적 시험, 식품 안전성 시험, 예로서 오염을 추적하는 역학적 분석, 또는 기타 유사한 것을 비롯하여, 세포 개체군 내에 상이한 세포 또는 생물체 유형의 존재의 평가 및 정량을 필요로 한다. 특히, 앞서 설명된 분석 과정은 개체군 내에 다수의 개별 세포를 개별적으로 특징짓고, 염기서열결정하고 및/또는 확인하는데 이용될 수 있다. 이러한 특징화는 이후, 기원하는 개체군의 전체 프로필을 집합시키는데 이용될 수 있는데, 이것은 중요한 예후 및 진단 정보를 제공할 수 있다.
가령, 예로서 소화관, 협측, 표피 마이크로바이옴 등을 비롯한 인간 마이크로바이옴에서 변동은 상이한 질환 또는 전반적인 건강 상태를 진단할 뿐만 아니라 예측하는 것으로 확인되었다. 본원에서 설명된 단일 세포 분석 방법 및 시스템을 이용하여, 다시 한 번, 전체 개체군에서 개별 세포를 특징짓고, 염기서열결정하고, 확인할 수 있고, 그리고 진단적으로 유관한 인자를 지시할 수 있는 상기 개체군 내에 변동을 확인할 수 있다. 실례로서, 세균 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기서열결정은 세균의 분류학적 분류를 위한 고도로 정확한 방법으로서 이용되었다. 앞서 설명된 표적화된 증폭 및 염기서열결정 과정을 이용하는 것은 세포 개체군 내에 개별 세포의 확인을 제공할 수 있다. 현재 상태 또는 시간의 추이에서 상태의 변동을 확인하기 위해 개체군 내에 상이한 세포의 숫자를 더욱 정량할 수 있다. 가령, Morgan et al, PLoS Comput. Biol., Ch. 12, December 2012, 8(12):e1002808, 그리고 Ram et al., Syst. Biol. Reprod. Med., June 2011, 57(3):162-170을 참조하고, 이들은 각각 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 유사하게, 감염 또는 잠재적 감염의 확인 및 진단 역시 예로서, 앞서 설명된 환경뿐만 아니라 임의의 다른 진단적으로 유관한 환경, 예를 들면, 뇌척수액, 혈액, 대변 또는 장관 표본, 또는 기타 유사한 것을 비롯하여, 다른 세포 또는 다른 생물학적 물질, 세포 및/또는 핵산의 큰 혼합물 내에 존재하는 미생물 종류를 확인하기 위한 본원에서 설명된 단일 세포 분석으로부터 이익을 얻을 수 있다.
전술한 분석은 또한, 소정의 표본 내에 세포 개체군을 교차하여 상이한 내성 마커/돌연변이의 분포 및 프로파일링의 분석을 통해, 상이한 세포, 예를 들면, 암 세포, 세균 병원체 등의 잠재적 약제 내성의 특징화에 특히 유용할 수 있다. 추가적으로, 시간의 추이에서 세포 개체군을 교차하여 이들 마커/돌연변이에서 변동의 특징화는 이런 약제 내성 문제에 의해 특징화되는 다양한 질환의 진행, 변경, 예방, 그리고 치료에 관한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다.
비록 세포의 면에서 설명되지만, 예로서 세포, 바이러스, 소기관, 세포 봉입체, 소포, 또는 기타 유사한 것을 비롯한 임의의 다양한 개별 생물학적 생물체, 또는 생물체의 성분은 이러한 설명 내에 포괄되는 것으로 인지될 것이다. 추가적으로, 세포를 참조하는 경우에, 이런 참조는 단일 세포 또는 다세포 생물체로부터 유래되는 지에 상관없이, 원핵 세포, 진핵 세포, 세균, 진균, 식물, 포유류, 또는 다른 동물 세포 유형, 미코플라스마, 정상적인 조직 세포, 종양 세포, 또는 임의의 다른 세포 유형을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 유형의 세포를 포함하는 것으로 인지될 것이다.
유사하게, 이런 표본 내에 존재하는 미생물 생물체, 바이러스, 또는 다른 생물학적 오염체를 프로파일링하기 위한 상이한 환경적 표본의 분석은 질환 역학에 관한 중요한 정보를 제공하고, 그리고 질환 발생, 전염병 및 유행병을 잠재적으로 예측하는데 보조할 수 있다.
앞서 설명된 바와 같이, 본원에서 설명된 방법, 시스템 및 조성물은 또한, 개별 세포 또는 세포 개체군의 다른 양상의 분석 및 특징화에 이용될 수 있다. 한 가지 실례 과정에서, 세포 표면 단백질에 대해 분석되고 특징화되는 세포를 내포하는 표본이 제공된다. 항체의 라이브러리, 항체 단편, 또는 세포가 특징화되는 세포 표면 단백질 또는 항원 (또는 다른 세포 특질)에 대한 결합 친화성을 갖는 다른 분자 (본원에서 세포 표면 특질 결합 기로서 또한 지칭됨) 역시 제공된다. 논의의 용이함을 위해, 이들 친화성 기는 본원에서 결합 기로서 지칭된다. 결합 기는 이러한 결합 기가 결합하는 세포 표면 특질을 지시하는 리포터 분자를 포함할 수 있다. 특히, 한 가지 유형의 세포 표면 특질에 특이적인 결합 기 유형은 첫 번째 리포터 분자를 포함할 것이고, 반면 상이한 세포 표면 특질에 특이적인 결합 기 유형은 이것과 연관된 상이한 리포터 분자를 가질 것이다. 일부 양상에서, 이들 리포터 분자는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 올리고뉴클레오티드 기초된 리포터 분자는 서열의 면에서 유의미한 다양성을 산출할 수 있고, 그리고 또한, 대부분의 생체분자, 예를 들면, 항체 등에 쉽게 부착가능할 뿐만 아니라 예로서, 염기서열결정 또는 어레이 기술을 이용하여 쉽게 검출될 수 있는 이점을 제공한다. 실례 과정에서, 결합 기는 그들에 부착된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 첫 번째 결합 기 유형, 예를 들면, 첫 번째 유형의 세포 표면 특질에 대한 항체는 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 갖는 리포터 올리고뉴클레오티드를 이것과 연관시킬 것이다. 상이한 결합 기 유형, 예를 들면, 다른, 상이한 세포 표면 특질에 대한 결합 친화성을 갖는 항체는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 예를 들면, 부분적으로 또는 완전하게 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 리포터 올리고뉴클레오티드를 그것과 연관시킬 것이다. 일부 경우에, 각 유형의 세포 표면 특질 결합 기, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편에서, 리포터 올리고뉴클레오티드 서열은 공지되고, 그리고 공지된 세포 표면 특질 결합 기와 연관되는 것으로 쉽게 인지가능하다. 이들 올리고뉴클레오티드는 결합 기에 직접적으로 연계될 수 있거나, 또는 이들은 비드, 분자 격자, 예를 들면, 선형, 구형, 교차연결된, 또는 다른 중합체, 또는 결합 기에 부착되거나 또는 달리 연관되는 다른 프레임워크에 부착될 수 있는데, 이것은 단일 결합 기에 복수 리포터 올리고뉴클레오티드의 부착을 허용한다.
단일 결합 기에 연계된 복수의 리포터 분자의 경우에, 이런 리포터 분자는 동일한 서열을 포함할 수 있거나, 또는 특정 결합 기는 리포터 올리고뉴클레오티드 서열의 공지된 세트를 포함할 것이다. 예로서, 상이한 세포 표면 특질에 특정한 상이한 결합 기 사이에서, 리포터 분자는 상이하고 특정 결합 기에 기인할 수 있다.
결합 기에 리포터 기의 부착은 다양한 직접적인 또는 간접적인, 공유 또는 비공유 연관 또는 부착 중에서 한 가지를 통해 달성될 수 있다. 가령, 항체 기초된 결합 기와 연관된 올리고뉴클레오티드 리포터 기의 경우에, 이런 올리고뉴클레오티드는 화학적 접합 기술 (가령, Innova Biosciences로부터 가용한 Lightning-Link® 항체 표지화 키트)뿐만 아니라 예로서, 아비딘 또는 스트렙타비딘 링커와 함께 비오틴화된 항체 및 올리고뉴클레오티드 (또는 올리고뉴클레오티드에 연계된, 하나 또는 그 이상의 비오틴화된 링커를 포함하는 비드)를 이용한 다른 비공유 부착 기전을 이용하여 항체 또는 항체 단편의 부분에 공유 부착될 수 있다. 항체 및 올리고뉴클레오티드 비오티닐화 기술은 가용하다 (가령, 전체 개시가 전체적으로 모든 점에서 본원에 참조로서 편입되는 Fang, et al., Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labeling and Affinity Purification of Synthetic Oligonucleotides, Nucleic Acids Res. Jan 15, 2003; 31(2):708-715를 참조, DNA 3' 단부 비오티닐화 키트, Thermo Scientific로부터 가용). 유사하게, 단백질 및 펩티드 비오티닐화 기술이 개발되었고 쉽게 가용하다 (가령, U.S. 특허 번호 6,265,552를 참조하고, 이의 전체 개시는 전체적으로 모든 점에서 본원에 참조로서 편입된다).
원하는 리포터 분자 또는 소정의 분석의 다양성, 이용된 서열 검출 계획, 기타 등등에 따라, 임의의 범위의 상이한 길이를 갖는 리포터 올리고뉴클레오티드가 제공될 수 있다. 일부 경우에, 이들 리포터 서열은 길이에서 약 5개 뉴클레오티드보다 크거나, 길이에서 약 10개 뉴클레오티드보다 크거나, 길이에서 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 또는 심지어 200개 뉴클레오티드보다 클 수 있다. 일부 경우에, 이들 리포터 뉴클레오티드는 길이에서 약 250개 뉴클레오티드보다 작거나, 길이에서 약 200, 180, 150, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 또는 심지어 30개 뉴클레오티드보다 작을 수 있다. 많은 경우에, 리포터 올리고뉴클레오티드는 미리 크기산정되고, 그리고 만약 그렇지 않으면, 염기서열결정 시스템에서 분석되도록 설정되는 바코드화된 산물을 제공하도록 선별될 수 있다. 가령, 이들 서열은 특정 염기서열결정 시스템에 대한 원하는 길이의 염기서열결정가능 산물을 이상적으로 창출하는 길이에서 제공될 수 있다. 유사하게, 이들 리포터 올리고뉴클레오티드는 리포터 서열에 더하여, 추가 서열 요소, 예를 들면, 서열분석기 부착 서열, 염기서열결정 프라이머 서열, 증폭 프라이머 서열, 또는 이들 중에서 한 가지에 대한 보체를 포함할 수 있다.
작업 동안, 세포-내포 표본은 분석이 요망되는 임의의 세포 표면 특질을 위해, 결합 분자 및 그들의 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드와 함께 배양된다. 배양 이후에, 세포는 결합되지 않은 결합 기를 제거하기 위해 세척된다. 세척 이후에, 세포는 앞서 설명된 바코드 운반 비드와 함께, 별개의 파티션, 예를 들면, 비말 내로 분할되는데, 여기서 각 파티션은 제한된 숫자의 세포, 예를 들면, 일부 경우에, 단일 세포를 포함한다. 비드로부터 바코드를 방출 시에, 이들은 리포터 올리고뉴클레오티드의 증폭 및 바코드화를 기폭할 것이다. 전술한 바와 같이, 리포터 분자의 바코드화된 복제물은 기능적 서열, 예를 들면, 프라이머 서열, 부착 서열 또는 기타 유사한 것을 부가적으로 포함할 수 있다.
바코드화된 리포터 올리고뉴클레오티드는 이후, 어떤 리포터 올리고뉴클레오티드가 파티션 내에서 세포에 결합되는 지를 확인하기 위한 서열 분석에 종속된다. 게다가, 연관된 바코드 서열을 또한 염기서열결정함으로써, 소정의 세포 표면 특질이 리포터 서열이 동일한 바코드 서열을 포함하는 다른 상이한 세포 표면 특질에서와 동일한 세포로부터 아마도 비롯되었다는 것을 확인할 수 있다, 다시 말하면, 이들은 동일한 파티션으로부터 유래되었다.
바코드 서열의 존재에 근거하여 개별 파티션에서 나오는 리포터 분자에 기초하여, 세포 개체군으로부터 개별 세포의 세포 표면 프로필을 창출할 수 있다. 개별 세포 또는 세포 개체군의 프로필은 세포 표면 특질에서 변이를 확인하기 위해 다른 세포, 예를 들면, '정상적인' 세포로부터 프로필과 비교될 수 있는데, 이것은 진단적으로 유관한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 이들 프로필은 세포 표면 수용체에서 변이에 의해 특징화되는 다양한 장애, 예를 들면, 암 및 다른 장애의 진단에서 특히 유용할 수 있다.
IV. 장치 및 시스템
세포를 앞서 설명된 바와 같이 분할하는데 이용되는 미소유체 장치 역시 본원에서 제공된다. 이런 미소유체 장치는 분할 과정, 예를 들면, 도면 1 및 2에서 진술된 것들을 수행하기 위한 통로 네트워크를 포함할 수 있다. 특히 유용한 미소유체 장치의 실례는 2014년 4월 4일자에 제출되고, 그리고 모든 점에서 전체적으로 본원에 참조로서 편입되는 U.S. 특허가출원 번호 61/977,804에서 설명된다. 간단히 말하면, 이들 미소유체 장치는 세포를 별개의 파티션 내로 분할하고, 그리고 이런 세포를 예로서, 비드 상에 배치된 올리고뉴클레오티드 바코드 라이브러리 구성원으로 공분할하기 위한 통로 네트워크, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들을 포함할 수 있다. 이들 통로 네트워크는 이들 통로가 규정되는 고형 몸체, 예를 들면, 유리, 반도체 또는 중합체 몸체 구조 내에 배치될 수 있는데, 여기서 이들 통로는 그들의 말단에서, 통로 네트워크의 출력으로부터 다양한 입력 유체를 제공받기 위해, 그리고 분할된 세포의 궁극적 침적을 위해, 기타 등등을 위해 저장소와 연통한다. 실례로서, 그리고 도면 2에 관하여, 통로 202에 유동적으로 연계된 저장소는 세포의 수성 현탁액 214가 제공될 수 있고, 반면 통로 204에 연계된 저장소는 올리고뉴클레오티드를 운반하는 비드 216의 수성 현탁액이 제공될 수 있다. 통로 세그먼트 206 및 208은 방수가 통로 접합부 212에서 비말로서 분할되는 비수성 용액, 예를 들면, 오일이 제공될 수 있다. 최종적으로, 출구 저장소는 분할된 세포 및 비드가 전달될 수 있고, 그리고 이들이 수확될 수 있는 통로 210에 유동적으로 연계될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 저장소로서 설명되긴 하지만, 통로 세그먼트는 다른 시스템의 배관, 다양체, 또는 유체 성분을 비롯하여, 임의의 다양한 상이한 유체 공급원 또는 수용 성분에 연계될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
통로 네트워크를 통해, 예를 들면, 적용된 차압, 원심력, 동전기적 펌핑, 모세관 또는 중력 흐름, 또는 기타 유사한 것을 통해 이들 유체의 흐름을 제어하는 시스템 역시 제공된다.
V. 키트
개별 세포 또는 작은 세포 개체군을 분석하기 위한 키트 역시 본원에서 제공된다. 이들 키트는 수성 완충액 및 비수성 분할 유체 또는 오일 둘 모두, 본원에서 설명된 바와 같이 비드와 방출가능하게 연관되는 핵산 바코드 라이브러리, 미소유체 장치, 세포를 파괴하고 핵산을 증폭하기 위한 시약을 포함하고, 그리고 세포 핵산 또는 이들의 복제물의 단편에 추가 기능적 서열을 제공하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상, 최대 모든 분할 유체뿐만 아니라 본원에서 설명된 방법에서 전술한 것들 중에서 한 가지를 이용하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
VI. 컴퓨터 제어 시스템
본 발명은 본 발명의 방법을 실행하도록 프로그램된 컴퓨터 제어 시스템을 제공한다. 도면 17은 핵산 염기서열결정 방법을 비롯한 본 발명의 방법, 핵산 염기서열결정 데이터의 해석 및 세포 핵산, 예를 들면, RNA (가령, mRNA)의 분석, 그리고 염기서열결정 데이터로부터 세포의 특징화를 실행하도록 프로그램되거나 또는 달리 설정된 컴퓨터 시스템 1701을 보여준다. 컴퓨터 시스템 1701은 전자 장치에 대하여 원격으로 위치된 사용자의 전자 장치 또는 컴퓨터 시스템일 수 있다. 전자 장치는 이동식 전자 장치일 수 있다.
컴퓨터 시스템 1701은 중앙 처리 장치 (CPU, 본원에서 또한 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서") 1705를 포함하고, 이것은 단일 코어 또는 멀티 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위한 복수의 프로세서일 수 있다. 컴퓨터 시스템 1701은 또한, 메모리 또는 메모리 위치 1710 (가령, 무작위 접근 메모리, 판독 전용 메모리, 플래시 메모리), 전자 기억 장치 1715 (가령, 하드 디스크), 하나 또는 그 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스 1720 (가령, 네트워크 어댑터), 그리고 주변 장치 1725, 예를 들면, 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함한다. 메모리 1710, 기억 장치 1715, 인터페이스 1720 및 주변 장치 1725는 통신 버스 (연속선), 예를 들면, 마더보드를 통해 CPU 1705와 통신한다. 기억 장치 1715는 데이터를 저장하기 위한 데이터 기억 장치 (또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템 1701은 통신 인터페이스 1720의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크") 1730에 작동가능하게 연계될 수 있다. 네트워크 1730은 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 네트워크 1730은 일부 경우에, 전기통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크 1730은 하나 또는 그 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있는데, 이들은 분산 컴퓨팅, 예를 들면, 클라우드 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있다. 네트워크 1730은 일부 경우에, 컴퓨터 시스템 1701의 도움으로, 개인간 네트워크를 실행할 수 있는데, 이것은 컴퓨터 시스템 1701에 연계된 장치가 고객 또는 서버로서 행동할 수 있게 할 수 있다.
CPU 1705는 일련의 기계-판독가능한 명령을 실행할 수 있는데, 이들은 프로그램 또는 소프트웨어에서 구현될 수 있다. 명령은 메모리 위치, 예를 들면, 메모리 1710 내에 저장될 수 있다. 명령은 CPU 1705에 지향될 수 있고, 이것은 차후에, CPU 1705가 본 발명의 방법을 실행하도록 프로그램하거나 또는 달리 설정할 수 있다. CPU 1705에 의해 수행된 작업의 실례는 페치, 명령어 해석, 명령어 실행, 그리고 라이트백을 포함할 수 있다.
CPU 1705는 회로, 예를 들면, 집적 회로의 부분일 수 있다. 시스템 1701의 하나 또는 그 이상의 다른 성분이 회로 내에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 회로는 주문형 집적 회로 (ASIC)이다.
기억 장치 1715는 파일, 예를 들면, 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램을 저장할 수 있다. 기억 장치 1715는 사용자 데이터, 예를 들면, 사용자 선호 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템 1701은 일부 경우에, 컴퓨터 시스템 1701의 외부에 있는, 예를 들면, 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템 1701과 통신하는 원격 서버 상에 위치하는 하나 또는 그 이상의 추가 데이터 기억 장치를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템 1701은 네트워크 1730을 통해 하나 또는 그 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 가령, 컴퓨터 시스템 1701은 사용자의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 실례는 개인용 컴퓨터 (가령, 휴대용 PC), 슬레이트 또는 테블릿 PC (가령, Apple® iPad, Samsung® Galaxy Tab), 전화기, 스마트폰 (가령, Apple® iPhone, 안드로이드에서 이용가능한 장치, Blackberry®), 또는 개인 휴대용 단말기를 포함한다. 사용자는 네트워크 1730을 통해 컴퓨터 시스템 1701에 접근할 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같은 방법은 컴퓨터 시스템 1701의 전자 저장 위치 상에, 예를 들면, 예로서, 메모리 1710 또는 전자 기억 장치 1715 상에 저장된 기계 (가령, 컴퓨터 프로세서) 실행가능한 코드에 의하여 실행될 수 있다. 기계 실행가능한 또는 기계 판독가능한 코드는 소프트웨어의 형태에서 제공될 수 있다. 이용 동안, 코드는 프로세서 1705에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 기억 장치 1715로부터 회수되고, 그리고 프로세서 1705에 의한 용이한 접근을 위해 메모리 1710 상에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 기억 장치 1715는 배제될 수 있고, 그리고 기계-실행가능 명령은 메모리 1710 상에 보관된다.
코드는 이러한 코드를 실행하도록 개조된 프로세서를 갖는 기계용으로 미리 편집되고 설정될 수 있거나, 또는 실행 시간 동안 편집될 수 있다. 코드는 이러한 코드가 미리 편집된 또는 편집된 그대로 방식으로 실행할 수 있게 하도록 선별될 수 있는 프로그래밍 언어에서 공급될 수 있다.
본원에서 제공된 시스템 및 방법, 예를 들면, 컴퓨터 시스템 1701의 양상은 프로그래밍에서 구현될 수 있다. 이러한 기술의 다양한 양상은 전형적으로, 한 유형의 기계 판독가능 매체에서 운반되거나 또는 구현되는 기계 (또는 프로세서) 실행가능한 코드 및/또는 연관된 데이터의 형태에서 "산물" 또는 "제조 물품"으로서 생각될 수 있다. 기계-실행가능 코드는 전자 기억 장치, 예를 들면, 메모리 (가령, 판독 전용 메모리, 무작위 접근 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장" 유형 매체는 컴퓨터, 프로세서 또는 기타 유사한 것의 임의의 또는 모든 실재적인 메모리, 또는 이의 연관된 모듈, 예를 들면, 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 기타 등등을 포함할 수 있는데, 이들은 임의의 시점에서 소프트웨어 프로그래밍을 위한 비-일시적인 저장을 제공할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로, 인터넷 또는 다양한 다른 전기통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 이런 통신은 예로서, 한 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 것으로, 예를 들면, 관리 서버 또는 주컴퓨터로부터 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 소프트웨어 요소를 보유할 수 있는 다른 유형의 매체는 예로서, 국부 장치 사이에, 유선 및 광학적 지상통신선 네트워크를 통해, 그리고 다양한 에어-링크 위에서 물리적 인터페이스를 교차하여 이용된 광학파, 전기파 및 전자기파를 포함한다. 이런 파를 운반하는 물리적 요소, 예를 들면, 유선 또는 무선 링크, 광회선 또는 기타 유사한 것 역시 소프트웨어를 보유하는 매체로서 고려될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 비-일시적인, 실재적인 "저장" 매체에 한정되지 않으면, 용어, 예를 들면, 컴퓨터 또는 기계 "판독가능 매체"는 명령을 실행을 위한 프로세서에 제공하는데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
따라서, 기계 판독가능 매체, 예를 들면, 컴퓨터-실행가능 코드는 실재적인 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전파 매체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 많은 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 저장 매체는 예로서, 광학 디스크 또는 자기 디스크, 예를 들면, 도면에 도시된 바와 같이 데이터베이스 등을 실행하는데 이용될 수 있는 임의의 컴퓨터(들) 또는 기타 유사한 것에서 임의의 저장 장치를 포함한다. 휘발성 저장 매체는 동적 메모리, 예를 들면, 이런 컴퓨터 플랫폼의 주기억장치를 포함한다. 실재적인 전송 매체는 동축 케이블; 구리선 및 컴퓨터 시스템 내에 버스를 포함하는 와이어를 비롯한 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 음향 또는 광파, 예를 들면, 고주파 (RF) 및 적외선 (IR) 데이터 통신 동안 산출된 것들의 형태를 취할 수 있다. 컴퓨터-판독가능 매체의 통상적인 형태는 이런 이유로, 예로서 다음을 포함한다: 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자성 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 종이 테이프, 구멍의 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령을 수송하는 반송파, 이런 반송파를 수송하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매체. 이들 형태의 컴퓨터 판독가능 매체 중에서 다수는 하나 또는 그 이상의 명령의 하나 또는 그 이상의 연속을 실행을 위한 프로세서로 운반하는데 관련될 수 있다.
컴퓨터 시스템 1701은 예로서, 핵산 염기서열결정의 결과, 핵산 염기서열결정 데이터의 분석, 핵산 염기서열결정 표본의 특징화, 세포 특징화 등을 제공하기 위한 사용자 인터페이스 (UI) 1740을 포함하는 전자 디스플레이 1735를 포함하거나 또는 이것과 통신할 수 있다. UI의 실례는 제한 없이, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 및 웹-기초된 사용자 인터페이스를 포함한다.
본 발명의 방법 및 시스템은 하나 또는 그 이상의 알고리즘에 의하여 실행될 수 있다. 알고리즘은 중앙 처리 장치 1705에 의한 실행 시에 소프트웨어에 의하여 실행될 수 있다. 알고리즘은 예로서, 핵산 염기서열결정을 개시하고, 핵산 염기서열결정 데이터를 처리하고, 핵산 염기서열결정 결과를 해석하고, 핵산 표본을 특징짓고, 세포를 특징짓고, 기타 등등일 수 있다.
VII. 실시예
실시예 I 유제를 이용한 세포 RNA 분석
한 가지 실례에서, 주형 전환 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 이용한 역전사가 도면 9A에서 보여지는 바와 같은 작업으로 유제 비말에서 수행된다. 역전사 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 위해 분할되는 반응 혼합물은 1,000개 세포 또는 10,000개 세포 또는 10 ng의 RNA, 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드/0.2% Tx-100/5x Kapa 완충액, 2x Kapa HS HiFi Ready Mix, 4 μM 스위치 올리고, 그리고 Smartscribe를 포함한다. 세포가 존재하는 경우에, 혼합물은 비말 중에서 대부분 또는 전부가 단일 세포 및 단일 비드를 포함하도록 분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 950에서처럼 세포로부터 방출되는 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 952에서처럼 역전사 반응에서 연장되고, 그리고 cDNA 전사체는 작업 954에서 증폭된다. 열 주기 조건은 130 분 동안 42 ℃; 2 분 동안 98 ℃; 그리고 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 6 분 동안 72 ℃의 35 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 전사체는 작업 956에서처럼 Dynabeads 및 0.6x SPRI로 정제된다.
유제에서 주형 스위치 역전사 및 PCR로부터 수율은 도면 13A에서 1,000개 세포, 도면 13C에서 10,000개 세포, 그리고 도면 13B (Smartscribe 라인)에서 10 ng의 RNA에 대해 도시된다. 10 ng RNA에 대한 유제에서 수행된 RT 및 PCR로부터 cDNA 전사체는 전단되고, 기능적 서열에 결찰되고, 0.8x SPRI로 청소되고, 그리고 작업 958에서처럼 PCR에 의해 더욱 증폭된다. 증폭 산물은 0.8x SPRI로 청소된다. 이러한 처리로부터 수율은 도면 13B (SSII 라인)에서 도시된다.
실시예 II 유제를 이용한 세포 RNA 분석
다른 실례에서, 주형 전환 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 이용한 역전사가 도면 9A에서 보여지는 바와 같은 작업으로 유제 비말에서 수행된다. 역전사 및 cDNA 증폭 (PCR을 통해)을 위해 분할되는 반응 혼합물은Jurkat 세포, 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드/0.2% TritonX-100/5x Kapa 완충액, 2x Kapa HS HiFi Ready Mix, 4 μM 스위치 올리고, 그리고 Smartscribe를 포함한다. 혼합물은 비말 중에서 대부분 또는 전부가 단일 세포 및 단일 비드를 포함하도록 분할된다. 세포는 용해되고, 이때 바코드화된 올리고뉴클레오티드가 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 950에서처럼 세포로부터 방출되는 mRNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 952에서처럼 역전사 반응에서 연장되고, 그리고 cDNA 전사체는 작업 954에서 증폭된다. 열 주기 조건은 130 분 동안 42 ℃; 2 분 동안 98 ℃; 그리고 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 6 분 동안 72 ℃의 35 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 전사체는 작업 956에서처럼 Dynabeads 및 0.6x SPRI로 청소된다. 다양한 세포 수 (625개 세포, 1,250개 세포, 2,500개 세포, 5,000개 세포, 그리고 10,000개 세포)와의 반응으로부터 수율은 도면 14A에서 도시된다. 이들 수율은 도면 14B에서 도시된 GADPH qPCR 검정 결과로 확증된다.
실시예 III 유제를 이용한 RNA 분석
다른 실례에서, 역전사가 유제 비말에서 수행되고, 그리고 cDNA 증폭이 도면 9C에서 보여지는 것과 유사한 방식으로 대량으로 수행된다. 역전사를 위해 분할되는 반응 혼합물은 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드, 10 ng Jurkat RNA (가령, Jurkat mRNA), 5x 일차-가닥 완충액 및 Smartscribe를 포함한다. 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 961에서처럼 RNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 963에서처럼 역전사 반응에서 연장된다. 역전사를 위한 열 주기 조건은 2 시간 동안 42 ℃에서 1 주기 및 10 분 동안 70 ℃에서 1 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 RNA와 cDNA 전사체는 작업 962에서 변성된다. 두 번째 가닥은 이후, 작업 964에서처럼 비오틴 태그를 갖는 프라이머를 이용한 프라이머 연장에 의해 합성된다. 이러한 프라이머 연장을 위한 반응 조건은 일차 가닥으로서 cDNA 전사체 및 0.5 - 3.0 μM의 농도 범위에서 변하는 비오틴화된 연장 프라이머를 포함한다. 열 주기 조건은 3 분 동안 98 ℃에서 1 주기 및 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 30 분 동안 72 ℃의 1 주기이다. 프라이머 연장 이후에, 두 번째 가닥은 Dynabeads MyOne 스트렙타비딘 C1과 T1로 철거되고, 그리고 Agilent SureSelect XT 완충액으로 청소된다. 두 번째 가닥은 다음의 주기 조건 - 3 분 동안 98 ℃에서 1 주기 및 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 30 분 동안 72 ℃의 1 주기로, 작업 965에서처럼 PCR을 통해 미리 증폭된다. 다양한 농도의 비오틴화된 프라이머 (0.5 μM, 1.0 μM, 2.0 μM, 그리고 3.0 μM)에 대한 수율은 도면 15에서 도시된다.
실시예 IV 유제를 이용한 RNA 분석
다른 실례에서, T7 중합효소에 의한 시험관내 전사가 도면 10에서 보여지는 바와 같이 RNA 전사체를 생산하는데 이용된다. 역전사를 위해 분할되는 혼합물은 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열, 10 ng 인간 RNA (가령, 인간 mRNA), 5x 일차-가닥 완충액 및 Smartscribe를 또한 포함하는, 바코드화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드를 포함한다. 혼합물은 비말 중에서 대부분 또는 전부가 단일 비드를 포함하도록 분할된다. 바코드화된 올리고뉴클레오티드는 비드로부터 방출되고, 그리고 바코드화된 올리고뉴클레오티드의 폴리-T 분절은 작업 1050에서처럼 RNA의 폴리-A 꼬리에 혼성화한다. 폴리-T 분절은 작업 1052에서처럼 역전사 반응에서 연장된다. 열 주기 조건은 2 시간 동안 42 ℃에서 1 주기 및 10 분 동안 70 ℃에서 1 주기이다. 열 주기 이후에, 유제는 파괴되고, 그리고 나머지 작업은 대량으로 수행된다. 두 번째 가닥은 이후, 작업 1054에서처럼 프라이머 연장에 의해 합성된다. 이러한 프라이머 연장을 위한 반응 조건은 주형으로서 cDNA 전사체 및 연장 프라이머를 포함한다. 열 주기 조건은 3 분 동안 98 ℃에서 1 주기 및 15 초 동안 98 ℃, 20 초 동안 60 ℃ 및 30 분 동안 72 ℃의 1 주기이다. 이러한 프라이머 연장 이후에, 두 번째 가닥은 0.6x SPRI로 정제된다. 작업 1056에서처럼, 시험관내 전사가 이후, RNA 전사체를 생산하기 위해 수행된다. 시험관내 전사는 하룻밤 동안 수행되고, 그리고 전사체는 0.6x SPRI로 정제된다. 시험관내 전사로부터 RNA 수율은 도면 16에서 도시된다.
본 발명의 일부 구체예가 본원에서 도시되고 설명되긴 했지만, 이런 구체예가 단지 실례로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 특정한 실례에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 전술한 명세서에 관하여 설명되긴 했지만, 본원에서 구체예의 설명 및 예시는 제한하는 의미로 해석되는 것으로 의미되지 않는다. 다양한 변이, 변화와 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 발생할 것이다. 게다가, 본 발명의 모든 양상은 다양한 조건과 변수에 의존하는, 본원에서 진술된 특정한 묘사, 설정 또는 상대적 비율에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 설명된 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이런 이유로, 본 발명은 임의의 이런 대안, 변형, 변이 또는 등가물 역시 커버할 것으로 예기된다. 다음 청구항은 발명의 범위를 규정하고, 그리고 이들 청구항의 범위 내에 방법과 구조 및 이들의 등가물이 그것에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

Claims (88)

  1. 세포로부터 핵산을 분석하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    (a) 개별 세포로부터 유래된 핵산을 구별된 파티션 내로 제공하고;
    (b) 구별된 파티션 내에 핵산으로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하고, 상기 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열은 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 거기에 부착하였고;
    (c) 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열, 또는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 특징화를 산출하고, 상기 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열은 공통 바코드 서열을 포함하고; 그리고
    (d) 최소한 부분적으로, (c)에서 산출된 특징화에서 공통 핵산 바코드 서열의 존재에 근거하여, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 개별 세포로부터 유래되는 것으로 확인하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 구별된 파티션은 구별된 비말인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, (a)에서 올리고뉴클레오티드는 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, (a)에서 최소한 10,000개의 올리고뉴클레오티드가 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, (a)에서 최소한 100,000개의 올리고뉴클레오티드가 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, (a)에서 최소한 500,000개의 올리고뉴클레오티드가 개별 세포로부터 유래된 핵산으로, 구별된 파티션 내로 공분할되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, (a)에서 올리고뉴클레오티드는 비드에 부착되게 제공되고, 여기서 비드 상에 각 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하고, 그리고 상기 비드는 개별 세포로, 구별된 파티션 내로 공분할되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 비드에 방출가능하게 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 비드는 분해성 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, (b)에 앞서 또는 동안, 비드의 분해를 통해 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 방출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, (c)에 앞서, 구별된 파티션으로부터 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 방출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, (c)는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 염기서열결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 서열로부터, 개별 세포의 유전체의 최소한 일부에 대한 인접한 핵산 서열을 조립하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 개별 세포는 개별 세포의 유전체의 최소한 일부에 대한 핵산 서열에 근거하여 특징화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 핵산은 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 핵산은 리보핵산 (RNA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, RNA는 전령 RNA (mRNA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, (b)는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 산출하는 조건 하에, 핵산을 역전사에 종속시키는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 역전사는 구별된 파티션에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 구별된 파티션에서 제공되고 폴리-T 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 역전사는 폴리-T 서열을 각 핵산의 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 폴리-T 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 폴리-T 서열의 혼성화를 용이하게 하는 정착 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 무작위 기폭 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 무작위 기폭 서열은 무작위 헥사머인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 역전사는 무작위 기폭 서열을 각 핵산의 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 무작위 기폭 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 1에 있어서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 중에서 소정의 하나는 이들 핵산 중에서 소정의 하나의 최소한 일부에 서열 상보성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 1에 있어서, 구별된 파티션은 기껏해야, 복수의 세포 중에서 개별 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 1에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 독특한 분자 서열 분절을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 최소한 부분적으로, 독특한 분자 서열 분절의 존재에 근거하여, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 또는 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열의 개별 핵산 서열을 이들 핵산 중에서 소정의 핵산으로부터 유래된 것으로 확인하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 독특한 분자 서열 분절의 존재에 근거하여 소정의 핵산의 양을 결정하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 1에 있어서, (c)에 앞서, 하나 또는 그 이상의 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부가하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 스위치 올리고뉴클레오티드의 도움으로, 첫 번째 추가 핵산 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부가하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 스위치 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 중에서 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 주형 지향된 방식으로 연장되어 첫 번째 추가 핵산 서열을 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 연계하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 증폭은 구별된 파티션에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 34에 있어서, 증폭은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 구별된 파티션으로부터 방출한 후 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 34에 있어서, 증폭 후, 첫 번째 추가 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 핵산 서열을 부가하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 서열을 부가하는 것은 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 거기에 하나 또는 그 이상의 두 번째 추가 핵산 서열을 연계하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 제거는 첫 번째 추가 핵산 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열의 전단을 통해 완결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 연계는 결찰을 통해 완결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 청구항 18에 있어서, (c)에 앞서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 RNA 단편을 산출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 전사는 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열을 구별된 파티션으로부터 방출한 후 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 41에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 T7 프로모터 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, (c)에 앞서, 하나 또는 그 이상의 RNA 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 RNA 서열에 연계하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, (c)에 앞서, 추가 서열에 연계된 하나 또는 그 이상의 RNA 서열을 역전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, (c)에 앞서, 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 41에 있어서, (c)에 앞서, 하나 또는 그 이상의 RNA 서열을 역전사에 종속시켜 하나 또는 그 이상의 DNA 서열을 산출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, (c)에 앞서, 하나 또는 그 이상의 DNA 서열 각각의 일부를 제거하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 추가 서열을 하나 또는 그 이상의 DNA 서열에 연계하여 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 산출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, (c)에 앞서, 하나 또는 그 이상의 두 번째 핵산 서열을 증폭하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 청구항 1에 있어서, 핵산은 개별 세포로부터 RNA의 역전사로부터 산출된 상보성 (cDNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 기폭 서열을 더욱 포함하고 구별된 파티션에서 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 기폭 서열은 무작위 N-mer을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 청구항 51에 있어서, (b)는 기폭 서열을 cDNA에 혼성화하고, 그리고 기폭 서열을 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 청구항 1에 있어서, 구별된 파티션은 올리고뉴클레오티드의 보체 서열을 포함하는 스위치 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, (b)는 스위치 올리고뉴클레오티드를 핵산으로부터 유래된 핵산 단편 중에서 최소한 일부에 혼성화하고, 그리고 스위치 올리고뉴클레오티드를 주형 지향된 방식으로 연장하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 청구항 1에 있어서, (b)는 올리고뉴클레오티드를 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열에 부착하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 청구항 1에 있어서, 하나 또는 그 이상의 첫 번째 핵산 서열은 핵산으로부터 유래된 핵산 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 청구항 1에 있어서, (b)는 올리고뉴클레오티드를 핵산에 연계하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 연계는 결찰을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 청구항 1에 있어서, 복수의 파티션은 구별된 파티션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 복수의 파티션은 평균적으로, 파티션 마다 1개보다 적은 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 청구항 60에 있어서, 복수의 파티션 중에서 25%보다 적은 파티션은 세포를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 청구항 60에 있어서, 복수의 파티션은 각각 최소한 하나의 분할된 세포를 갖는 구별된 파티션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 구별된 파티션 중에서 25% 이하가 하나 이상의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 구별된 파티션의 최소한 부분집합은 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 구별된 파티션 중에서 최소한 75%가 최소한 하나의 세포 및 최소한 하나의 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 청구항 63에 있어서, 구별된 파티션은 분할된 핵산 바코드 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 구별된 파티션은 최소한 1,000개의 상이한 분할된 핵산 바코드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 구별된 파티션은 최소한 10,000개의 상이한 분할된 핵산 바코드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 구별된 파티션은 최소한 100,000개의 상이한 분할된 핵산 바코드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 청구항 60에 있어서, 복수의 파티션은 최소한 1,000개의 파티션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 복수의 파티션은 최소한 10,000개의 파티션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 복수의 파티션은 최소한 100,000개의 파티션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 복수의 상이한 세포 유형의 개체군에서 세포를 특징짓는 방법에 있어서, 상기 방법은
    (a) 개체군에서 개별 세포로부터 핵산을 구별된 파티션 내로 제공하고;
    (b) 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편에 부착하고, 여기서 복수의 상이한 파티션은 상이한 공통 핵산 바코드 서열을 포함하고;
    (c) 최소한 부분적으로, 공통 바코드 서열의 존재에 근거하여, 복수의 구별된 파티션으로부터 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편을 특징짓고, 그리고 하나 또는 그 이상의 단편을 개별 세포에 기인시키고; 그리고
    (d) 복수의 구별된 파티션 내에 하나 또는 그 이상의 단편의 특징화에 근거하여 개체군에서 복수의 개별 세포를 특징짓는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 청구항 74에 있어서, 핵산을 단편화하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 청구항 74에 있어서, 구별된 파티션은 비말인 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 청구항 74에 있어서, 핵산의 하나 또는 그 이상의 단편을 특징짓는 것은 개별 세포로부터 리보솜 데옥시리보핵산을 염기서열결정하는 것을 포함하고, 그리고 세포를 특징짓는 것은 세포 속, 종, 계통 또는 변이체를 확인하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 개별 세포는 마이크로바이옴 표본으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 청구항 74에 있어서, 개별 세포는 인간 조직 표본으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 청구항 74에 있어서, 개별 세포는 포유동물에서 순환성 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 청구항 74에 있어서, 개별 세포는 법의학 표본으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 청구항 74에 있어서, 핵산은 구별된 파티션 내에 개별 세포로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 개별 세포 또는 세포 개체군을 특징짓는 방법에 있어서, 상기 방법은
    (a) 세포를 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기 유형과 함께 배양하고, 여기서 각 상이한 세포 표면 결합 기 유형은 상이한 세포 표면 특질에 결합할 수 있고, 그리고 여기서 각 상이한 세포 표면 결합 기 유형은 존재하면, 하나 또는 그 이상의 세포 표면 특질 결합 기 및 이의 개별 세포 표면 특질 사이에 결합을 허용하는 조건 하에, 그것과 연관된 리포터 올리고뉴클레오티드를 포함하고;
    (b) 상기 세포를 바코드 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 파티션 내로 분할하고;
    (c) 바코드 서열을 파티션 내에 존재하는 올리고뉴클레오티드 리포터 기에 부착하고;
    (d) 올리고뉴클레오티드 리포터 기 및 부착된 바코드를 염기서열결정하고; 그리고
    (e) 염기서열결정되는 리포터 올리고뉴클레오티드에 근거하여, 세포 상에 존재하는 세포 표면 특질을 특징짓는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 복수의 파티션을 포함하는 조성물에 있어서, 복수의 파티션 각각은 (i) 개별 세포, 그리고 (ii) 공통 핵산 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 개체군을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  85. 청구항 84에 있어서, 복수의 파티션은 유제에서 비말을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  86. 청구항 84에 있어서, 복수의 파티션 각각 내에 올리고뉴클레오티드의 개체군은 복수의 파티션 각각 내에 배치된 비드에 연계되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  87. 청구항 84에 있어서, 개별 세포는 그들의 개별 세포 표면 특질과 연관된 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기를 그것과 연관시키고, 각 상이한 유형의 세포 표면 특질 결합 기는 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 리포터 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  88. 청구항 87에 있어서, 복수의 상이한 세포 표면 특질 결합 기는 복수의 상이한 세포 표면 특질에 대한 결합 친화성을 갖는 복수의 상이한 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020167036348A 2014-06-26 2015-06-26 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법 KR102531677B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237015588A KR20230070325A (ko) 2014-06-26 2015-06-26 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462017558P 2014-06-26 2014-06-26
US62/017,558 2014-06-26
US201462061567P 2014-10-08 2014-10-08
US62/061,567 2014-10-08
PCT/US2015/038178 WO2015200893A2 (en) 2014-06-26 2015-06-26 Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237015588A Division KR20230070325A (ko) 2014-06-26 2015-06-26 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170020704A true KR20170020704A (ko) 2017-02-23
KR102531677B1 KR102531677B1 (ko) 2023-05-10

Family

ID=54929862

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167036348A KR102531677B1 (ko) 2014-06-26 2015-06-26 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
KR1020237015588A KR20230070325A (ko) 2014-06-26 2015-06-26 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237015588A KR20230070325A (ko) 2014-06-26 2015-06-26 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법

Country Status (10)

Country Link
US (5) US20150376609A1 (ko)
EP (3) EP4053292A1 (ko)
JP (3) JP6838969B2 (ko)
KR (2) KR102531677B1 (ko)
CN (2) CN113249435A (ko)
AU (1) AU2015279548B2 (ko)
CA (1) CA2953374A1 (ko)
IL (1) IL249617A0 (ko)
MX (1) MX2016016902A (ko)
WO (1) WO2015200893A2 (ko)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200026218A (ko) * 2017-08-01 2020-03-10 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레오타이드 서열분석용 하이드로겔 비드
KR20200039623A (ko) * 2017-05-26 2020-04-16 에이비비트로 엘엘씨 고-처리량 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 시퀀싱 및 전사체 분석
US11085036B2 (en) 2018-10-26 2021-08-10 Illumina, Inc. Modulating polymer beads for DNA processing
US11180752B2 (en) 2018-02-13 2021-11-23 Illumina, Inc. DNA sequencing using hydrogel beads
US11359226B2 (en) 2018-04-20 2022-06-14 Illumina, Inc. Contiguity particle formation and methods of use

Families Citing this family (283)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
EP2047910B1 (en) 2006-05-11 2012-01-11 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic device and method
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
WO2010009365A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
WO2012045012A2 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2673614B1 (en) 2011-02-11 2018-08-01 Raindance Technologies, Inc. Method for forming mixed droplets
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9404864B2 (en) 2013-03-13 2016-08-02 Denovo Sciences, Inc. System for imaging captured cells
US10466160B2 (en) 2011-08-01 2019-11-05 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for retrieving and analyzing particles
WO2013019491A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Denovo Sciences Cell capture system and method of use
SG11201405274WA (en) 2012-02-27 2014-10-30 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting
EP4001426A1 (en) 2012-08-13 2022-05-25 The Regents of The University of California Methods and systems for detecting biological components
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150376609A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods of Analyzing Nucleic Acids from Individual Cells or Cell Populations
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
MX364957B (es) 2012-08-14 2019-05-15 10X Genomics Inc Composiciones y metodos para microcapsulas.
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9752181B2 (en) 2013-01-26 2017-09-05 Denovo Sciences, Inc. System and method for capturing and analyzing cells
CA2900481A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
US9707562B2 (en) 2013-03-13 2017-07-18 Denovo Sciences, Inc. System for capturing and analyzing cells
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
US9856535B2 (en) 2013-05-31 2018-01-02 Denovo Sciences, Inc. System for isolating cells
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
AU2015243445B2 (en) 2014-04-10 2020-05-28 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
CN114214314A (zh) 2014-06-24 2022-03-22 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
JP2017526046A (ja) 2014-06-26 2017-09-07 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 核酸配列アセンブルのプロセス及びシステム
US20160122817A1 (en) 2014-10-29 2016-05-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
SG11201705615UA (en) 2015-01-12 2017-08-30 10X Genomics Inc Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
KR20170106979A (ko) 2015-01-13 2017-09-22 10엑스 제노믹스, 인크. 구조 변이 및 위상 조정 정보를 시각화하기 위한 시스템 및 방법
CN115011670A (zh) * 2015-02-04 2022-09-06 加利福尼亚大学董事会 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序
US10854315B2 (en) 2015-02-09 2020-12-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data
ES2824700T3 (es) 2015-02-19 2021-05-13 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
EP3262407B1 (en) 2015-02-24 2023-08-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
EP3262188B1 (en) 2015-02-24 2021-05-05 10X Genomics, Inc. Methods for targeted nucleic acid sequence coverage
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
EP3277843A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
CN107580632B (zh) 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
US10851399B2 (en) 2015-06-25 2020-12-01 Native Microbials, Inc. Methods, apparatuses, and systems for microorganism strain analysis of complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
JP6839666B2 (ja) 2015-06-25 2021-03-10 ネイティブ マイクロビアルズ， インコーポレイテッド 複雑な異種群集由来微生物株の解析、機能的な関係及びそれらの相互作用の予測及び同定、ならびにそれに基づく微生物アンサンブルの選択及び合成のための方法、装置、及びシステム
US9938558B2 (en) 2015-06-25 2018-04-10 Ascus Biosciences, Inc. Methods, apparatuses, and systems for analyzing microorganism strains from complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
WO2017044574A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
KR20180097536A (ko) * 2015-11-04 2018-08-31 아트레카, 인크. 단일 세포와 연관된 핵산의 분석을 위한 핵산 바코드의 조합 세트
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
EP3263715B1 (en) 2016-06-28 2020-01-08 Hifibio Method for transcriptome analysis of single cells
US11965891B2 (en) * 2015-12-30 2024-04-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital protein quantification
US10293006B2 (en) 2016-01-07 2019-05-21 Ascus Biosciences, Inc. Microbial compositions for improving milk production in ruminants
JP7179329B2 (ja) * 2016-01-14 2022-11-29 ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリー リガンド誘発型の細胞発現のマイクロ流体分析
US20170260584A1 (en) * 2016-02-11 2017-09-14 10X Genomics, Inc. Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes
SG11201806757XA (en) 2016-02-11 2018-09-27 10X Genomics Inc Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
JP2019515674A (ja) * 2016-04-19 2019-06-13 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝的解析および他の適用のための固定化ベースのシステムおよび方法
DK3452591T3 (da) 2016-05-02 2023-09-18 Encodia Inc Makromolekyleanalyse under anvendelse af nukleinsyrekodning
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
WO2017205344A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital proximity assay
CN109074430B (zh) 2016-05-26 2022-03-29 贝克顿迪金森公司 分子标记计数调整方法
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
WO2017218486A1 (en) * 2016-06-14 2017-12-21 Mission Bio, Inc. Methods and compositions for emulsification of solid supports in deformable beads
US10809266B2 (en) 2016-07-22 2020-10-20 Verily Life Sciences Llc Quantitative massively parallel proteomics
WO2018058073A2 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP4026905B1 (en) * 2016-10-19 2024-04-17 10X Genomics, Inc. Methods for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations
EP3539035B1 (en) 2016-11-08 2024-04-17 Becton, Dickinson and Company Methods for expression profile classification
KR20190077061A (ko) 2016-11-08 2019-07-02 셀룰러 리서치, 인크. 세포 표지 분류 방법
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) * 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
US10011872B1 (en) * 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
JP2020504620A (ja) 2016-12-28 2020-02-13 アスカス バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 複雑な不均一コミュニティの完全微生物株の解析、その機能的関連性及び相互作用の決定、ならびにそれに基づく生物反応性の改変剤の同定及び合成、のための方法、装置、及びシステム
JP7104048B2 (ja) 2017-01-13 2022-07-20 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 流体チャネルの親水性コーティング
WO2018134907A1 (ja) * 2017-01-18 2018-07-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ 同一細胞複数生体分子抽出装置および方法
CN110291207A (zh) 2017-01-27 2019-09-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于长程测序的条形码化dna
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
EP4324931A2 (en) * 2017-02-02 2024-02-21 New York Genome Center, Inc. Methods and compositions for identifying or quantifying targets in a biological sample
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
US11954614B2 (en) 2017-02-08 2024-04-09 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing a pattern in a dataset
US10347365B2 (en) 2017-02-08 2019-07-09 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing a pattern in a dataset
WO2018200867A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 10X Genomics, Inc. Mmlv reverse transcriptase variants
US11044924B2 (en) 2017-04-28 2021-06-29 Native Microbials, Inc. Methods for supporting grain intensive and or energy intensive diets in ruminants by administration of a synthetic bioensemble of microbes or purified strains therefor
US20180320173A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Scipio Bioscience Methods for trapping and barcoding discrete biological units in hydrogel
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
CN117143960A (zh) 2017-05-18 2023-12-01 10X基因组学有限公司 用于分选液滴和珠的方法和系统
EP3625715A4 (en) 2017-05-19 2021-03-17 10X Genomics, Inc. DATA SET ANALYSIS SYSTEMS AND METHODS
WO2018218226A1 (en) * 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN116064732A (zh) 2017-05-26 2023-05-05 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
JP2020521486A (ja) * 2017-05-29 2020-07-27 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シングルセルトランスクリプトームの増幅法
CA3059559A1 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
EP3642397A4 (en) 2017-06-20 2021-03-31 10X Genomics, Inc. IMPROVED DROPLET STABILIZATION METHODS AND SYSTEMS
CN107222286B (zh) * 2017-08-09 2018-03-13 罗普特（厦门）科技集团有限公司 一种网络定向屏蔽的方法
US10357771B2 (en) 2017-08-22 2019-07-23 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
EP3651903A4 (en) 2017-08-29 2021-06-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. SYSTEM AND METHOD FOR ISOLATING AND ANALYZING CELLS
US11738344B2 (en) * 2017-09-19 2023-08-29 Hifibio Sas Particle sorting in a microfluidic system
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
WO2019071039A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 10X Genomics, Inc. COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS FOR PEARL FORMATION USING ENHANCED POLYMERS
US10590244B2 (en) 2017-10-04 2020-03-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US10501739B2 (en) * 2017-10-18 2019-12-10 Mission Bio, Inc. Method, systems and apparatus for single cell analysis
WO2019083852A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. MICROFLUIDIC CHANNEL NETWORKS FOR PARTITIONING
WO2019084328A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS FOR PREPARING NUCLEIC ACID MOLECULES
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
EP3700672B1 (en) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
SG11202003924YA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Encodia Inc Kits for analysis using nucleic acid encoding and/or label
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
CN110770352B (zh) 2017-11-17 2023-12-15 10X基因组学有限公司 用于关联生物颗粒的物理和遗传特性的方法和系统
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
WO2019113235A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing nucleic acid molecules
SG11201907566TA (en) 2017-12-08 2019-09-27 10X Genomics Inc Methods and compositions for labeling cells
WO2019118355A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
EP3728636A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Becton, Dickinson and Company Particles associated with oligonucleotides
CN111712579A (zh) * 2017-12-22 2020-09-25 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
WO2019148042A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
EP3749740B1 (en) 2018-02-05 2023-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods for multiplexed measurements in single and ensemble cells
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
SG11202008080RA (en) 2018-02-22 2020-09-29 10X Genomics Inc Ligation mediated analysis of nucleic acids
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US20240044877A1 (en) * 2018-02-22 2024-02-08 10X Genomics, Inc. Systems and methods for sample analysis
WO2019169028A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Transcriptome sequencing through random ligation
WO2019191321A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 10X Genomics, Inc. Nucleic acid enrichment within partitions
SG11202009889VA (en) 2018-04-06 2020-11-27 10X Genomics Inc Systems and methods for quality control in single cell processing
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
US11773441B2 (en) 2018-05-03 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
GB201810571D0 (en) * 2018-06-27 2018-08-15 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for the analysis of circulating microparticles
EP3821035A4 (en) * 2018-07-13 2022-04-20 Coral Genomics, Inc. CELL ANALYSIS METHODS
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US20200263232A1 (en) 2018-08-03 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Methods and systems to minimize barcode exchange
WO2020041148A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for detection of protein-dna interactions using proximity ligation
WO2020047005A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
WO2020047010A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 10X Genomics, Inc. Increasing spatial array resolution
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
US11608524B1 (en) * 2018-10-25 2023-03-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of analyzing cells
AU2019364418A1 (en) * 2018-10-25 2021-04-22 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US11636921B2 (en) 2018-11-27 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Systems and methods for inferring cell status
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
WO2020123319A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
EP3894552A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 Becton, Dickinson and Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
CN111378557B (zh) 2018-12-26 2023-06-06 财团法人工业技术研究院 用于产生液珠的管状结构及液珠产生方法
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
CN113874521A (zh) 2019-01-06 2021-12-31 10X基因组学有限公司 用于富集条形码的方法和系统
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
EP3924505A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
WO2020167862A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transfer of reagents between droplets
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
WO2020167866A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transposon loading
GB2582850A (en) * 2019-02-13 2020-10-07 Biosearch Tech Inc Molecular barcodes for single cell sequencing, compositions and methods thereof
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
SG11202111242PA (en) 2019-03-11 2021-11-29 10X Genomics Inc Systems and methods for processing optically tagged beads
WO2020190509A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
WO2020198071A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2020198532A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing rna from cells
EP3947530A1 (en) 2019-04-03 2022-02-09 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CA3138367A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Encodia, Inc. Methods for preparing analytes and related kits
KR20220016477A (ko) 2019-05-07 2022-02-09 바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드 자동화된 단일 세포 처리를 위한 시스템 및 방법
US11273439B2 (en) 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
CA3138806A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Dalia Dhingra Method and apparatus for simultaneous targeted sequencing of dna, rna and protein
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
SG11202112898WA (en) 2019-06-14 2021-12-30 Bio Rad Laboratories System and method for automated single cell processing and analyses
WO2021003255A1 (en) 2019-07-01 2021-01-07 Mission Bio Method and apparatus to normalize quantitative readouts in single-cell experiments
JPWO2021006353A1 (ko) * 2019-07-11 2021-01-14
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
EP4025709A1 (en) * 2019-09-06 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Systems and methods for barcoding cells and cell beads
BR112021026562A2 (pt) * 2019-09-20 2022-11-29 Illumina Inc Métodos e composições para identificar ligantes em arranjos com o uso de índices e códigos de barras
CN114761992B (zh) 2019-10-01 2023-08-08 10X基因组学有限公司 用于识别组织样品中的形态学模式的系统和方法
JP2022552194A (ja) 2019-10-10 2022-12-15 １８５９，インク． マイクロ流体スクリーニングのための方法およびシステム
EP4022309B1 (en) 2019-10-11 2023-01-04 10X Genomics, Inc. Methods for analyte detection and analysis
CN114729350A (zh) 2019-11-08 2022-07-08 贝克顿迪金森公司 使用随机引发获得用于免疫组库测序的全长v(d)j信息
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US20230002812A1 (en) 2019-11-13 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP4073241A2 (en) 2019-12-11 2022-10-19 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants
CN115135984A (zh) 2019-12-23 2022-09-30 10X基因组学有限公司 可逆固定试剂及其使用方法
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
CN115768558A (zh) * 2020-01-13 2023-03-07 福路伦特生物科学公司 用于单细胞基因谱分析的方法和系统
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
CN115698282A (zh) 2020-01-13 2023-02-03 福路伦特生物科学公司 单细胞测序
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
WO2021163611A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 10X Genomics, Inc. Methods for characterizing cells using gene expression and chromatin accessibility
EP4104179A1 (en) 2020-02-13 2022-12-21 10X Genomics, Inc. Systems and methods for joint interactive visualization of gene expression and dna chromatin accessibility
JP2023514749A (ja) 2020-02-21 2023-04-07 １０エックス ジェノミクス インコーポレイテッド 統合型インサイチュ空間的アッセイのための方法および組成物
EP4110941A1 (en) 2020-02-28 2023-01-04 10X Genomics, Inc. Method for isolating nuclei and cells from tissues
US11504719B2 (en) 2020-03-12 2022-11-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for receiving and delivering a fluid for sample processing
EP4121016A1 (en) 2020-03-16 2023-01-25 Fluent Biosciences Inc. Multi-omic analysis in monodisperse droplets
WO2021194699A1 (en) * 2020-03-24 2021-09-30 Cellecta, Inc. Single cell genetic analysis
WO2021207610A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Cold protease treatment method for preparing biological samples
EP4136227A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for use with fixed samples
WO2021222301A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis and identification of barcode multiplets
WO2021222302A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for increasing cell recovery efficiency
WO2021226290A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 10X Genomics, Inc. Methods for identification of antigen-binding molecules
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
EP4158058A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Enrichment of nucleic acid sequences
WO2022006455A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for detection of low-abundance molecular barcodes from a sequencing library
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022035729A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Dimensiongen Devices and methods for multi-dimensional genome analysis
WO2022066760A1 (en) 2020-09-23 2022-03-31 10X Genomics, Inc. Selective enzymatic gelation
WO2022076912A1 (en) 2020-10-09 2022-04-14 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing antigen binding molecules
WO2022076914A1 (en) 2020-10-09 2022-04-14 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for profiling immune repertoire
WO2022081643A2 (en) 2020-10-13 2022-04-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating recombinant antigen binding molecules from single cells
EP4244379A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 10X Genomics, Inc. Nano-partitions (encapsulated nucleic acid processing enzymes) for cell-lysis and multiple reactions in partition-based assays
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析
US20240076723A1 (en) 2020-12-30 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Cleavage of capture probes for spatial analysis
EP4275051A1 (en) 2021-01-08 2023-11-15 10X Genomics, Inc. Methods for generating antigen-binding molecules from single cells
WO2022178304A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 10X Genomics, Inc. High-throughput methods for analyzing and affinity-maturing an antigen-binding molecule
WO2022182662A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for mapping antigen-binding molecule affinity to antigen regions of interest
WO2022182664A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. A method for epitope binning of novel monoclonal antibodies
EP4298239A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 10X Genomics, Inc. Drug screening methods
WO2022182682A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
CN117178061A (zh) 2021-02-23 2023-12-05 10X基因组学有限公司 单细胞聚糖谱分析
WO2022221428A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for single cell analyte detection and analysis
CN113106150B (zh) * 2021-05-12 2022-05-24 浙江大学 一种超高通量单细胞测序方法
WO2022256313A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Validation of a unique molecular identifier associated with a nucleic acid sequence of interest
WO2022256345A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods and systems for engineering antibodies, and antigen-binding fragments thereof, to have altered characteristics
WO2022265965A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
EP4359755A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 10X Genomics, Inc. Chop-fix method and chopping device for preparing biological samples
CA3226327A1 (en) * 2021-07-15 2023-01-19 Fluent Biosciences Inc. Decentralized workflows for single cell analysis
WO2023009988A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 10X Genomics, Inc. Nucleic acid processing via circularization
WO2023022925A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 10X Genomics, Inc. Compositions, systems and methods for enzyme optimization
WO2023060110A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 10X Genomics, Inc. Methods of immune cell analysis
WO2023059646A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 10X Genomics, Inc. Systems and methods for evaluating biological samples
WO2023086824A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods for identification of antigen-binding molecules
WO2023114203A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Cornell University Genotyping of targeted loci with single-cell chromatin accessibility
WO2023114310A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Methods for improving sensitivity of immune profiling using oligo-tagged antigens
WO2023114473A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Recombinant reverse transcriptase variants for improved performance
WO2023201235A2 (en) 2022-04-12 2023-10-19 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for generating and characterizing recombinant antigen binding molecules
WO2023212532A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 10X Genomics, Inc. Systems and methods for evaluating biological samples
EP4272764A1 (en) 2022-05-03 2023-11-08 Scipio Bioscience Method of complexing biological units with particles
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023215861A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 10X Genomics, Inc. Reagents for characterizing antigen-binding molecules from immune cells
WO2023225259A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for characterizing antigen binding molecules from single cells
WO2023225201A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for characterizing t cell, or t cell-like, receptors from single cells
WO2023225294A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 10X Genomics, Inc. Improved major histocompatibility complex molecules
WO2023235570A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for the identification of antigen binding molecules using lipoparticle-based antigen mapping
WO2023235596A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining antigen binding specificity of antigen binding molecules
WO2023250422A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for characterizing multispecific antigen binding molecules from single cells
WO2024006734A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Methods for preparing and using mhc multimer reagents compositions
WO2024006392A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
WO2024015856A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for characterizing binding characteristics of antigen binding molecules from single cells
WO2024015862A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods for characterization of antigen-binding molecules from biological samples
WO2024015733A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Improved methods and systems for identification and characterization of antigen-binding molecules from single cells
WO2024015378A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing antigen-binding molecules expressed by immune cells
WO2024044703A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for antigenic epitope mapping in biological samples
WO2024050299A1 (en) 2022-08-29 2024-03-07 10X Genomics, Inc. Improved methods and compositions for characterization of antigen-binding molecules from single cells
WO2024076908A1 (en) 2022-10-03 2024-04-11 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for analyzing genomic insertion sites of exogenous nucleic acids
WO2024081212A1 (en) * 2022-10-10 2024-04-18 10X Genomics, Inc. In vitro transcription of spatially captured nucleic acids

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004526940A (ja) * 2000-10-18 2004-09-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 内在化機能を有する抗体の高処理スクリーニングの方法
US20120316074A1 (en) * 2011-04-25 2012-12-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2014028537A1 (en) * 2012-08-14 2014-02-20 10X Technologies, Inc. Microcapsule compositions and methods

Family Cites Families (813)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2797149A (en) 1953-01-08 1957-06-25 Technicon International Ltd Methods of and apparatus for analyzing liquids containing crystalloid and non-crystalloid constituents
US3047367A (en) 1959-12-01 1962-07-31 Technicon Instr Automatic analysis with fluid segmentation
US3479141A (en) 1967-05-17 1969-11-18 Technicon Corp Method and apparatus for analysis
US4124638A (en) 1977-09-12 1978-11-07 Hansen John N Solubilizable polyacrylamide gels containing disulfide cross-linkages
US4253846A (en) 1979-11-21 1981-03-03 Technicon Instruments Corporation Method and apparatus for automated analysis of fluid samples
GB2097692B (en) 1981-01-10 1985-05-22 Shaw Stewart P D Combining chemical reagents
DE3230289A1 (de) 1982-08-14 1984-02-16 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Herstellung von pharmazeutischen oder kosmetischen dispersionen
US4582802A (en) 1983-09-30 1986-04-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Stimulation of enzymatic ligation of DNA by high concentrations of nonspecific polymers
JPS60227826A (ja) 1984-04-27 1985-11-13 Sogo Yatsukou Kk ｐＨに応答するグラフトカプセル
KR890003947B1 (ko) 1985-12-11 1989-10-13 가부시기가이샤 시마즈세이사구쇼 세포융합장치
US4916070A (en) 1986-04-14 1990-04-10 The General Hospital Corporation Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies
US5618711A (en) 1986-08-22 1997-04-08 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant expression vectors and purification methods for Thermus thermophilus DNA polymerase
US4872895A (en) 1986-12-11 1989-10-10 American Telephone And Telegraph Company, At&T Bell Laboratories Method for fabricating articles which include high silica glass bodies
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US5137829A (en) 1987-10-05 1992-08-11 Washington University DNA transposon TN5SEQ1
US5185099A (en) 1988-04-20 1993-02-09 Institut National De Recherche Chimique Appliquee Visco-elastic, isotropic materials based on water, fluorinate sufactants and fluorinated oils, process for their preparation, and their use in various fields, such as optics, pharmacology and electrodynamics
US5237016A (en) 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US6176962B1 (en) 1990-02-28 2001-01-23 Aclara Biosciences, Inc. Methods for fabricating enclosed microchannel structures
US5756334A (en) 1990-04-26 1998-05-26 New England Biolabs, Inc. Thermostable DNA polymerase from 9°N-7 and methods for producing the same
ATE176002T1 (de) 1990-07-24 1999-02-15 Hoffmann La Roche Verringerung von nicht spezifischer amplifikation während einer (in vitro) nukleinsäure amplifikation unter verwendung von modifizierten nukleinsäure basen
US5489523A (en) 1990-12-03 1996-02-06 Stratagene Exonuclease-deficient thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase I
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5270183A (en) 1991-02-08 1993-12-14 Beckman Research Institute Of The City Of Hope Device and method for the automated cycling of solutions between two or more temperatures
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
DE69213240T2 (de) 1991-07-04 1997-04-24 Immunodex K S Wasserlösliche reagenzien und konjugate auf polymerbasis, die vom divinylsulfon abgeleitete reste enthalten
CA2114950A1 (en) 1991-08-10 1993-02-11 Michael J. Embleton Treatment of cell populations
US5770358A (en) 1991-09-18 1998-06-23 Affymax Technologies N.V. Tagged synthetic oligomer libraries
US5413924A (en) 1992-02-13 1995-05-09 Kosak; Kenneth M. Preparation of wax beads containing a reagent for release by heating
WO1993019205A1 (en) 1992-03-19 1993-09-30 The Regents Of The University Of California Multiple tag labeling method for dna sequencing
US5587128A (en) 1992-05-01 1996-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification devices
WO1993022058A1 (en) 1992-05-01 1993-11-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania Polynucleotide amplification analysis using a microfabricated device
US5840865A (en) 1992-09-14 1998-11-24 Institute Of Molecular Biology And Biotechnology/Forth Eukaryotic transposable element
US5897783A (en) 1992-09-24 1999-04-27 Amersham International Plc Magnetic separation method
US5569364A (en) 1992-11-05 1996-10-29 Soane Biosciences, Inc. Separation media for electrophoresis
IL108497A0 (en) 1993-02-01 1994-05-30 Seq Ltd Methods and apparatus for dna sequencing
WO1994019101A1 (en) 1993-02-16 1994-09-01 Alliance Pharmaceutical Corp. Method of microemulsifying fluorinated oils
NZ265555A (en) 1993-04-19 1997-09-22 Medisorb Technologies Internat Biodegradable microparticle compositions of antisense oligodeoxyribonucleotides
US5456986A (en) 1993-06-30 1995-10-10 Carnegie Mellon University Magnetic metal or metal carbide nanoparticles and a process for forming same
DE69429038T2 (de) 1993-07-28 2002-03-21 Pe Corp Ny Norwalk Vorrichtung und Verfahren zur Nukleinsäurevervielfältigung
WO1995004069A1 (en) 1993-07-30 1995-02-09 Affymax Technologies N.V. Biotinylation of proteins
WO1995006652A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
US5512131A (en) 1993-10-04 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles
US20030044777A1 (en) 1993-10-28 2003-03-06 Kenneth L. Beattie Flowthrough devices for multiple discrete binding reactions
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5558071A (en) 1994-03-07 1996-09-24 Combustion Electromagnetics, Inc. Ignition system power converter and controller
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
DE69515675T2 (de) 1994-05-11 2000-07-20 Genera Technologies Ltd Verfahren zum Einfangen von einem Ligand aus einer Flüssigkeit und Vorrichtung zur dessen Ausführung
US5705628A (en) 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5585069A (en) 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
EP0812434B1 (en) 1995-03-01 2013-09-18 President and Fellows of Harvard College Microcontact printing on surfaces and derivative articles
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
DE69637285T2 (de) 1995-06-07 2008-07-10 Solexa, Inc., Hayward Oligonukleotid-tags zur sortierung und identifizierung
EP0832287B1 (en) 1995-06-07 2007-10-10 Solexa, Inc Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US6866760B2 (en) 1998-08-27 2005-03-15 E Ink Corporation Electrophoretic medium and process for the production thereof
US5872010A (en) 1995-07-21 1999-02-16 Northeastern University Microscale fluid handling system
US6057149A (en) 1995-09-15 2000-05-02 The University Of Michigan Microscale devices and reactions in microscale devices
US5851769A (en) 1995-09-27 1998-12-22 The Regents Of The University Of California Quantitative DNA fiber mapping
US5736330A (en) 1995-10-11 1998-04-07 Luminex Corporation Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences
US5736332A (en) 1995-11-30 1998-04-07 Mandecki; Wlodek Method of determining the sequence of nucleic acids employing solid-phase particles carrying transponders
US6051377A (en) 1995-11-30 2000-04-18 Pharmaseq, Inc. Multiplex assay for nucleic acids employing transponders
US6001571A (en) 1995-11-30 1999-12-14 Mandecki; Wlodek Multiplex assay for nucleic acids employing transponders
US6355198B1 (en) 1996-03-15 2002-03-12 President And Fellows Of Harvard College Method of forming articles including waveguides via capillary micromolding and microtransfer molding
EP0832436A1 (en) 1996-04-15 1998-04-01 Dade Behring Inc. Apparatus and method for analysis
WO1997045559A1 (en) 1996-05-29 1997-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US5846727A (en) 1996-06-06 1998-12-08 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural & Mechanical College Microsystem for rapid DNA sequencing
DE69707288T2 (de) 1996-07-15 2002-07-18 Calcitech Ltd Herstellung von pulvern
US5965443A (en) 1996-09-09 1999-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US6133436A (en) 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
US5900481A (en) 1996-11-06 1999-05-04 Sequenom, Inc. Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports
AU746549B2 (en) 1996-11-20 2002-05-02 Becton Dickinson & Company Microfabricated isothermal nucleic acid amplification devices and methods
US5958703A (en) 1996-12-03 1999-09-28 Glaxo Group Limited Use of modified tethers in screening compound libraries
US20020172965A1 (en) 1996-12-13 2002-11-21 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US20050042625A1 (en) 1997-01-15 2005-02-24 Xzillion Gmbh & Co. Mass label linked hybridisation probes
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US20020034737A1 (en) 1997-03-04 2002-03-21 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
WO1998035012A2 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Chan Eugene Y Methods and products for analyzing polymers
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US20030027203A1 (en) 1997-03-24 2003-02-06 Fields Robert E. Biomolecular processor
US6391622B1 (en) 1997-04-04 2002-05-21 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
ATE340868T1 (de) 1997-05-02 2006-10-15 Gen Probe Inc Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid
DE69823347T2 (de) 1997-05-16 2005-05-12 Alberta Research Council, Edmonton Mikrofluidisches system und verfahren zu dessen betrieb
EP0985142A4 (en) 1997-05-23 2006-09-13 Lynx Therapeutics Inc SYSTEM AND APPARATUS FOR THE SEQUENTIAL TREATMENT OF ANALYTES
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US20040241759A1 (en) 1997-06-16 2004-12-02 Eileen Tozer High throughput screening of libraries
EP1019496B1 (en) 1997-07-07 2004-09-29 Medical Research Council In vitro sorting method
GB9714716D0 (en) 1997-07-11 1997-09-17 Brax Genomics Ltd Characterising nucleic acids
FI103809B (fi) 1997-07-14 1999-09-30 Finnzymes Oy In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten
US20050037397A1 (en) 2001-03-28 2005-02-17 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6368871B1 (en) 1997-08-13 2002-04-09 Cepheid Non-planar microstructures for manipulation of fluid samples
CA2300940A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6207031B1 (en) 1997-09-15 2001-03-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and apparatus for processing a sample of biomolecular analyte using a microfabricated device
US20020092767A1 (en) 1997-09-19 2002-07-18 Aclara Biosciences, Inc. Multiple array microfluidic device units
US7214298B2 (en) 1997-09-23 2007-05-08 California Institute Of Technology Microfabricated cell sorter
WO1999018438A1 (en) 1997-10-02 1999-04-15 Aclara Biosciences, Inc. Capillary assays involving separation of free and bound species
US5842787A (en) 1997-10-09 1998-12-01 Caliper Technologies Corporation Microfluidic systems incorporating varied channel dimensions
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
JP2001519538A (ja) 1997-10-10 2001-10-23 プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ 核酸アレイのレプリカ増幅
AU1080999A (en) 1997-10-14 1999-05-03 Luminex Corporation Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same
CA2306791C (en) 1997-10-24 2007-05-15 Northeastern University A multichannel microscale system for high throughput preparative separation with comprehensive collection and analysis
JP4318859B2 (ja) 1997-12-04 2009-08-26 ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド 複合アッセイ方法
WO1999033963A1 (en) 1997-12-31 1999-07-08 Chiron Corporation Metastatic cancer regulated gene
BR9908082A (pt) 1998-02-19 2000-10-31 Harvard College Proteìna de fusão do complexo de histocompatibilidade principal classe ii, conjugado dos domìnios de ligação do complexo de histocompatibilidade principal multimérico, processos para detectar células t tendo uma especificidade do complexo definido de mhc / peptìdeo, para conferir a um indivìduo imunidade adotiva a um complexo definido de mhc / peptìdeo, para estimular ou ativar as células t reativas a um complexo definido de mhc / peptìdeo, para seletivamente matar células t reativas a um complexo definido de mhc / peptìdeo, para tolerizar um indivìduo humano a um complexo definido de mhc / peptìdeo, e, ácido nucleico isolado
AU3196099A (en) 1998-03-27 1999-10-18 President And Fellows Of Harvard College Systematic identification of essential genes by (in vitro) transposon mutagenesis
US6022716A (en) 1998-04-10 2000-02-08 Genset Sa High throughput DNA sequencing vector
EP1079967A4 (en) 1998-04-13 2003-07-23 Luminex Corp LIQUID MARKING USING FLUORESCENT MICROPARTICLES
US5997636A (en) 1998-05-01 1999-12-07 Instrumentation Technology Associates, Inc. Method and apparatus for growing crystals
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6123798A (en) 1998-05-06 2000-09-26 Caliper Technologies Corp. Methods of fabricating polymeric structures incorporating microscale fluidic elements
US6534262B1 (en) 1998-05-14 2003-03-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
US6306590B1 (en) 1998-06-08 2001-10-23 Caliper Technologies Corp. Microfluidic matrix localization apparatus and methods
EP2360271A1 (en) 1998-06-24 2011-08-24 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
US6586176B1 (en) 1998-08-07 2003-07-01 Cellay, Llc Gel microdrops in genetic analysis
US6159736A (en) 1998-09-23 2000-12-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for making insertional mutations using a Tn5 synaptic complex
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
KR20010089295A (ko) 1998-10-13 2001-09-29 마이클 알. 맥닐리 수동 유체 동역학에 의한 유체회로 및 유체회로내에서의방법
US6489096B1 (en) 1998-10-15 2002-12-03 Princeton University Quantitative analysis of hybridization patterns and intensities in oligonucleotide arrays
SE9803614L (sv) 1998-10-19 2000-04-20 Muhammed Mamoun Förfarande och anordning för framställning av nanopartiklar
WO2000026412A1 (en) 1998-11-02 2000-05-11 Kenneth Loren Beattie Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization
US5942609A (en) 1998-11-12 1999-08-24 The Porkin-Elmer Corporation Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support
US6569631B1 (en) 1998-11-12 2003-05-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Microplate thermal shift assay for ligand development using 5-(4″dimethylaminophenyl)-2-(4′-phenyl)oxazole derivative fluorescent dyes
US6465193B2 (en) 1998-12-11 2002-10-15 The Regents Of The University Of California Targeted molecular bar codes and methods for using the same
NO986133D0 (no) 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
GB9900298D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
US6416642B1 (en) 1999-01-21 2002-07-09 Caliper Technologies Corp. Method and apparatus for continuous liquid flow in microscale channels using pressure injection, wicking, and electrokinetic injection
US6635419B1 (en) 1999-02-16 2003-10-21 Applera Corporation Polynucleotide sequencing method
US20030027214A1 (en) 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
ATE469699T1 (de) 1999-02-23 2010-06-15 Caliper Life Sciences Inc Manipulation von mikroteilchen in mikrofluiden systemen
US7615373B2 (en) 1999-02-25 2009-11-10 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Electroprocessed collagen and tissue engineering
US6171850B1 (en) 1999-03-08 2001-01-09 Caliper Technologies Corp. Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses
US6303343B1 (en) 1999-04-06 2001-10-16 Caliper Technologies Corp. Inefficient fast PCR
US6908737B2 (en) 1999-04-15 2005-06-21 Vitra Bioscience, Inc. Systems and methods of conducting multiplexed experiments
AU4476900A (en) 1999-04-20 2000-11-02 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
AU4806100A (en) 1999-04-28 2000-11-10 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University P element derived vector and methods for its use
CA2373537A1 (en) 1999-05-12 2000-11-16 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed fluorescent detection in microfluidic devices
WO2000070095A2 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Dade Behring Inc. Homogeneous isothermal amplification and detection of nucleic acids using a template switch oligonucleotide
US20020051971A1 (en) 1999-05-21 2002-05-02 John R. Stuelpnagel Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US6846622B1 (en) 1999-05-26 2005-01-25 Oregon Health & Science University Tagged epitope protein transposable element
US20030124509A1 (en) 1999-06-03 2003-07-03 Kenis Paul J.A. Laminar flow patterning and articles made thereby
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
AU6068300A (en) 1999-07-06 2001-01-22 Caliper Technologies Corporation Microfluidic systems and methods for determining modulator kinetics
US6977145B2 (en) 1999-07-28 2005-12-20 Serono Genetics Institute S.A. Method for carrying out a biochemical protocol in continuous flow in a microreactor
US6524456B1 (en) 1999-08-12 2003-02-25 Ut-Battelle, Llc Microfluidic devices for the controlled manipulation of small volumes
WO2001013086A2 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Brandeis University Detection of nucleic acids
WO2001014589A2 (en) 1999-08-20 2001-03-01 Luminex Corporation Liquid array technology
WO2001016372A1 (en) 1999-08-27 2001-03-08 Matrix Technologies Corporation Methods of immobilizing ligands on solid supports and apparatus and methods of use therefor
US6982146B1 (en) 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
AU8023500A (en) 1999-10-13 2001-04-23 Mds Sciex System and method for detecting and identifying molecular events in a test sample
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
AU1100201A (en) 1999-10-28 2001-05-08 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of in vivo gene transfer using a sleeping beauty transposon system
JP4721603B2 (ja) 1999-11-08 2011-07-13 栄研化学株式会社 変異および／または多型の検出方法
US6432290B1 (en) 1999-11-26 2002-08-13 The Governors Of The University Of Alberta Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems
US20010051348A1 (en) 2000-01-28 2001-12-13 Lee Chee Wee Novel ligands and methods for preparing same
CA2399199A1 (en) 2000-02-23 2001-08-30 Ring-Ling Chien Multi-reservoir pressure control system
WO2001062887A1 (en) 2000-02-23 2001-08-30 Zyomyx, Inc. Chips having elevated sample surfaces
IL134830A0 (en) 2000-03-01 2001-05-20 Chay 13 Medical Res Group N V Peptides and immunostimulatory and anti-bacterial pharmaceutical compositions containing them
KR20030009389A (ko) 2000-03-14 2003-01-29 브루카드 괴케 유문동-유문-십이지장 운동성에 대한 글루카곤 유사펩티드-1 (7-36)의 효과
US6376191B1 (en) 2000-03-22 2002-04-23 Mergen, Ltd. Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations
US6409832B2 (en) 2000-03-31 2002-06-25 Micronics, Inc. Protein crystallization in microfluidic structures
AU2001250058A1 (en) 2000-04-06 2001-10-23 Caliper Technologies Corp. Methods and devices for achieving long incubation times in high-throughput systems
DK2206791T3 (en) 2000-04-10 2016-10-24 Taxon Biosciences Inc Methods of study and genetic analysis of populations
US6481453B1 (en) 2000-04-14 2002-11-19 Nanostream, Inc. Microfluidic branch metering systems and methods
US6800298B1 (en) 2000-05-11 2004-10-05 Clemson University Biological lubricant composition and method of applying lubricant composition
US20060008799A1 (en) 2000-05-22 2006-01-12 Hong Cai Rapid haplotyping by single molecule detection
EP1286913A2 (en) 2000-05-24 2003-03-05 Micronics, Inc. Microfluidic concentration gradient loop
US6645432B1 (en) 2000-05-25 2003-11-11 President & Fellows Of Harvard College Microfluidic systems including three-dimensionally arrayed channel networks
US20060263888A1 (en) 2000-06-02 2006-11-23 Honeywell International Inc. Differential white blood count on a disposable card
US6632606B1 (en) 2000-06-12 2003-10-14 Aclara Biosciences, Inc. Methods for single nucleotide polymorphism detection
ES2259666T3 (es) 2000-06-21 2006-10-16 Bioarray Solutions Ltd Analisis molecular de multiples analitos usando series de particulas aleatorias con especificidad de aplicacion.
EP1309404A2 (en) 2000-08-07 2003-05-14 Nanostream, Inc. Fluidic mixer in microfluidic system
US6610499B1 (en) 2000-08-31 2003-08-26 The Regents Of The University Of California Capillary array and related methods
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
WO2002022878A1 (en) 2000-09-14 2002-03-21 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and methods for performing temperature mediated reactions
WO2002023163A1 (en) 2000-09-15 2002-03-21 California Institute Of Technology Microfabricated crossflow devices and methods
US7258774B2 (en) 2000-10-03 2007-08-21 California Institute Of Technology Microfluidic devices and methods of use
EP1364052A2 (en) 2000-10-10 2003-11-26 Diversa Corporation High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
JP2002155305A (ja) 2000-11-14 2002-05-31 Akira Kawasaki 単分散粒子の製造装置及び単分散粒子の製造方法及びその製造方法で製造された単分散粒子
US6492154B2 (en) 2001-01-31 2002-12-10 Applera Corporation Isolated human kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human kinase proteins, and uses thereof
CA2332186A1 (en) 2001-02-08 2002-08-08 Her Majesty In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agricul Ture And Agri-Food Canada Replicative in vivo gene targeting
US7670559B2 (en) 2001-02-15 2010-03-02 Caliper Life Sciences, Inc. Microfluidic systems with enhanced detection systems
WO2002068383A2 (en) 2001-02-22 2002-09-06 Anika Therapeutics, Inc. Thiol-modified hyaluronan
WO2002068104A1 (en) 2001-02-23 2002-09-06 Japan Science And Technology Corporation Process for producing emulsion and microcapsules and apparatus therefor
US7211654B2 (en) 2001-03-14 2007-05-01 Regents Of The University Of Michigan Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid supports
US20150329617A1 (en) 2001-03-14 2015-11-19 Dynal Biotech Asa Novel MHC molecule constructs, and methods of employing these constructs for diagnosis and therapy, and uses of MHC molecules
US20060040286A1 (en) 2001-03-28 2006-02-23 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
EP1377811B1 (en) 2001-04-03 2008-07-16 Micronics, Inc. Split focusing cytometer
US7138267B1 (en) 2001-04-04 2006-11-21 Epicentre Technologies Corporation Methods and compositions for amplifying DNA clone copy number
US20030027221A1 (en) 2001-04-06 2003-02-06 Scott Melissa E. High-throughput screening assays by encapsulation
US7572642B2 (en) 2001-04-18 2009-08-11 Ambrigen, Llc Assay based on particles, which specifically bind with targets in spatially distributed characteristic patterns
EP1399580B1 (en) 2001-05-26 2008-10-08 One Cell Systems, Inc. Secretion of proteins by encapsulated cells
US6880576B2 (en) 2001-06-07 2005-04-19 Nanostream, Inc. Microfluidic devices for methods development
US7179423B2 (en) 2001-06-20 2007-02-20 Cytonome, Inc. Microfluidic system including a virtual wall fluid interface port for interfacing fluids with the microfluidic system
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
US6613523B2 (en) 2001-06-29 2003-09-02 Agilent Technologies, Inc. Method of DNA sequencing using cleavable tags
US7077152B2 (en) 2001-07-07 2006-07-18 Nanostream, Inc. Microfluidic metering systems and methods
CA2454573A1 (en) 2001-07-20 2003-01-30 California Institute Of Technology Protein and nucleic acid expression systems
US6767731B2 (en) 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
WO2003031591A2 (en) * 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US7297485B2 (en) 2001-10-15 2007-11-20 Qiagen Gmbh Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias
US20030089605A1 (en) 2001-10-19 2003-05-15 West Virginia University Research Corporation Microfluidic system for proteome analysis
US6783647B2 (en) 2001-10-19 2004-08-31 Ut-Battelle, Llc Microfluidic systems and methods of transport and lysis of cells and analysis of cell lysate
US20030149307A1 (en) 2001-10-24 2003-08-07 Baxter International Inc. Process for the preparation of polyethylene glycol bis amine
AU2002365140A1 (en) 2001-10-26 2003-07-15 Aclara Biosciences Inc. System and method for injection molded micro-replication of micro-fluidic substrates
US20030182068A1 (en) 2001-10-30 2003-09-25 Battersby Bronwyn J. Device and methods for directed synthesis of chemical libraries
US7262056B2 (en) 2001-11-08 2007-08-28 Mirus Bio Corporation Enhancing intermolecular integration of nucleic acids using integrator complexes
GB0127564D0 (en) 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
EP1456409B1 (en) 2001-11-28 2010-02-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
US7335153B2 (en) 2001-12-28 2008-02-26 Bio Array Solutions Ltd. Arrays of microparticles and methods of preparation thereof
WO2003057010A2 (en) 2002-01-04 2003-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Droplet-based microfluidic oligonucleotide synthesis engine
AU2003202026A1 (en) 2002-01-16 2003-09-02 Dynal Biotech Asa Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample
KR100459870B1 (ko) 2002-02-22 2004-12-04 한국과학기술원 트랜스포존과 Cre/loxP 부위 특이적 재조합 방법을 이용하는 염색체의 특정부위가 제거된 미생물 변이주 제조방법
AU2003226679A1 (en) 2002-03-20 2003-09-29 Innovativebio.Biz Microcapsules with controlable permeability encapsulating a nucleic acid amplification reaction mixture and their use as reaction compartments for parallels reactions
EP2278338B1 (en) 2002-05-09 2020-08-26 The University of Chicago Device and method for pressure-driven plug transport and reaction
US7901939B2 (en) 2002-05-09 2011-03-08 University Of Chicago Method for performing crystallization and reactions in pressure-driven fluid plugs
US7527966B2 (en) 2002-06-26 2009-05-05 Transgenrx, Inc. Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector
JP2006507921A (ja) 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
EP1543157A4 (en) 2002-07-24 2006-11-15 Ptc Therapeutics Inc METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLECULES MODULATING PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND DEGRADATION OF INDUCED MRNA BY NON-SENSE MUTATION
IL151660A0 (en) 2002-09-09 2003-04-10 Univ Ben Gurion Method for isolating and culturing unculturable microorganisms
JP4201203B2 (ja) 2002-09-30 2008-12-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー チミジル酸シンターゼ遺伝子の遺伝子型判別のためのオリゴヌクレオチド
US20040081962A1 (en) 2002-10-23 2004-04-29 Caifu Chen Methods for synthesizing complementary DNA
US6979713B2 (en) 2002-11-25 2005-12-27 3M Innovative Properties Company Curable compositions and abrasive articles therefrom
US20050266582A1 (en) 2002-12-16 2005-12-01 Modlin Douglas N Microfluidic system with integrated permeable membrane
US20040248299A1 (en) 2002-12-27 2004-12-09 Sumedha Jayasena RNA interference
EP1587946B1 (en) 2003-01-17 2009-07-08 The Trustees Of Boston University Haplotype analysis
ES2396245T3 (es) 2003-01-29 2013-02-20 454 Life Sciences Corporation Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos
US8420386B2 (en) 2003-02-10 2013-04-16 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin (Mdc) Transposon-based targeting system
US7041481B2 (en) 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
US7316903B2 (en) 2003-03-28 2008-01-08 United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Detection of nucleic acid sequence variations using phase Mu transposase
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
RU2541809C2 (ru) 2003-04-04 2015-02-20 Зоетис Пи ЛЛК Микрофлюидизированные эмульсии "масло в воде" и композиции вакцины
US20100035254A1 (en) 2003-04-08 2010-02-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
EP2266687A3 (en) 2003-04-10 2011-06-29 The President and Fellows of Harvard College Formation and control of fluidic species
US20060275915A1 (en) 2003-05-16 2006-12-07 Global Technologies (Nz) Ltd. Method and apparatus for mixing sample and reagent in a suspension fluid
DE112004001376D2 (de) 2003-05-19 2006-04-13 Knoell Hans Forschung Ev Vorrichtung und Verfahren zur Strukturierung von Flüssigkeiten und zum zudosieren von Reaktionsflüssigkeiten zu in Separationsmedium eingebetteten Flüssigkeitskompartimenten
WO2004105734A1 (en) 2003-05-28 2004-12-09 Valorisation Recherche, Societe En Commandite Method of preparing microcapsules
GB0313170D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Qinetiq Ltd Method and apparatus for spore disruption and/or detection
WO2004113877A1 (en) 2003-06-13 2004-12-29 The General Hospital Corporation Microfluidic systems for size based removal of red blood cells and platelets from blood
CN101001960A (zh) 2003-06-27 2007-07-18 西北大学 基于生物条形码检测靶分析物
GB2403475B (en) 2003-07-01 2008-02-06 Oxitec Ltd Stable integrands
GB0315438D0 (en) 2003-07-02 2003-08-06 Univ Manchester Analysis of mixed cell populations
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
CN104069784B (zh) 2003-08-27 2017-01-11 哈佛大学 流体物种的电子控制
JP4988345B2 (ja) 2003-09-04 2012-08-01 ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ・アズ・リプレゼンティッド・バイ・ザ・デパートメント・オブ・ヴェテランズ・アフェアーズ 眼用ハイドロゲルナノコンポジット
EP1663497B2 (en) 2003-09-05 2020-03-25 Stokes Bio Limited A microfluidic analysis system
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
US20090004739A1 (en) 2003-09-22 2009-01-01 Taku Demura Efficient Method of Preparing Dna Inverted Repeat
DK1691196T3 (da) 2003-09-25 2013-04-15 Vivalis Chip med mikrobrøndsarray og fremgangsmåde til fremstilling heraf
JP2007512811A (ja) 2003-11-10 2007-05-24 インベスチゲン， インコーポレイテッド 検出のための核酸を調製する方法
WO2005049787A2 (en) 2003-11-24 2005-06-02 Yeda Research And Development Co.Ltd. Compositions and methods for in vitro sorting of molecular and cellular libraries
US20050136417A1 (en) 2003-12-19 2005-06-23 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US8071364B2 (en) 2003-12-24 2011-12-06 Transgenrx, Inc. Gene therapy using transposon-based vectors
ES2432040T3 (es) 2004-01-28 2013-11-29 454 Life Sciences Corporation Amplificación de ácido nucleico con emulsión de flujo continuo
US20050181379A1 (en) 2004-02-18 2005-08-18 Intel Corporation Method and device for isolating and positioning single nucleic acid molecules
CN1950519A (zh) 2004-02-27 2007-04-18 哈佛大学的校长及成员们 聚合酶群落荧光原位测序珠子
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
KR100552706B1 (ko) 2004-03-12 2006-02-20 삼성전자주식회사 핵산 증폭 방법 및 장치
EP1757357B1 (en) 2004-03-23 2013-04-24 Japan Science and Technology Agency Method and device for producing micro-droplets
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
EP1735668A2 (en) 2004-04-13 2006-12-27 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for manipulation and/or detection of biological samples and other objects
US20050250147A1 (en) 2004-05-10 2005-11-10 Macevicz Stephen C Digital profiling of polynucleotide populations
US20080268507A1 (en) 2004-05-25 2008-10-30 Airbus Deutschland Gmbh Recombinant Dna Nicking Endonuclease and Uses Thereof
US7799553B2 (en) 2004-06-01 2010-09-21 The Regents Of The University Of California Microfabricated integrated DNA analysis system
US7700281B2 (en) 2004-06-30 2010-04-20 Usb Corporation Hot start nucleic acid amplification
US7968085B2 (en) 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
CN1648671B (zh) 2005-02-06 2012-09-26 成都夸常医学工业有限公司 多反应器分析芯片检测方法和分析芯片及检测装置
US7608434B2 (en) 2004-08-04 2009-10-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof
WO2006030993A1 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Jin-Ho Choy Information code system using dna sequences
US7892731B2 (en) 2004-10-01 2011-02-22 Radix Biosolutions, Ltd. System and method for inhibiting the decryption of a nucleic acid probe sequence used for the detection of a specific nucleic acid
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
WO2007001448A2 (en) 2004-11-04 2007-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
WO2006051552A2 (en) 2004-11-15 2006-05-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Directed evolution and selection using in vitro compartmentalization
US7329493B2 (en) 2004-12-22 2008-02-12 Asiagen Corporation One-tube nested PCR for detecting Mycobacterium tuberculosis
US8883487B2 (en) 2004-12-23 2014-11-11 Abbott Point Of Care Inc. Molecular diagnostics system and methods
WO2006078841A1 (en) 2005-01-21 2006-07-27 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for forming fluidic droplets encapsulated in particles such as colloidal particles
US7579153B2 (en) 2005-01-25 2009-08-25 Population Genetics Technologies, Ltd. Isothermal DNA amplification
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US7604938B2 (en) 2005-02-18 2009-10-20 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Devices and methods for monitoring genomic DNA of organisms
US8062391B2 (en) 2005-02-21 2011-11-22 Kagoshima University Method for purifying biodiesel fuel
US9040237B2 (en) 2005-03-04 2015-05-26 Intel Corporation Sensor arrays and nucleic acid sequencing applications
US20070054119A1 (en) 2005-03-04 2007-03-08 Piotr Garstecki Systems and methods of forming particles
EP1861194A2 (en) 2005-03-04 2007-12-05 The President and Fellows of Harvard College Method and apparatus for forming multiple emulsions
JP2006289250A (ja) 2005-04-08 2006-10-26 Kao Corp マイクロミキサー及びそれを用いた流体混合方法
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
US20090264299A1 (en) 2006-02-24 2009-10-22 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
CA2611671C (en) 2005-06-15 2013-10-08 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
JP2006349060A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Ntn Corp ボールねじ
US8828209B2 (en) 2005-06-22 2014-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Massively parallel 2-dimensional capillary electrophoresis
WO2007002567A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Nanosphere, Inc. Selective isolation and concentration of nucleic acids from complex samples
JP4927730B2 (ja) 2005-07-05 2012-05-09 一般財団法人化学及血清療法研究所 改変トランスポゾンベクター及びその利用方法
JP5051490B2 (ja) 2005-07-08 2012-10-17 独立行政法人産業技術総合研究所 マクロ生体材料を内包する無機マイクロカプセルおよびその製造方法
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
FR2888912B1 (fr) 2005-07-25 2007-08-24 Commissariat Energie Atomique Procede de commande d'une communication entre deux zones par electromouillage, dispositif comportant des zones isolables les unes des autres et procede de realisation d'un tel dispositif
EP1924704B1 (en) 2005-08-02 2011-05-25 Rubicon Genomics, Inc. Compositions and methods for processing and amplification of dna, including using multiple enzymes in a single reaction
DE102005037401B4 (de) 2005-08-08 2007-09-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Bildung einer Emulsion in einem fluidischen Mikrosystem
WO2007024840A2 (en) 2005-08-22 2007-03-01 Critical Therapeutics, Inc. Method of quantitating nucleic acids by flow cytometry microparticle-based array
US7556776B2 (en) 2005-09-08 2009-07-07 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic manipulation of fluids and reactions
JP2007074967A (ja) 2005-09-13 2007-03-29 Canon Inc 識別子プローブ及びそれを用いた核酸増幅方法
CA2622719A1 (en) 2005-09-16 2007-07-26 The Regents Of The University Of California A colorimetric bio-barcode amplification assay for analyte detection
US7960104B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
US20070111241A1 (en) 2005-10-14 2007-05-17 Nezih Cereb System and method for accessing, tracking, and editing sequence analysis and software to accomplish the same
US7709544B2 (en) 2005-10-25 2010-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Microstructure synthesis by flow lithography and polymerization
EP1954838B1 (en) 2005-11-14 2014-02-26 Life Technologies Corporation Coded molecules for detecting target analytes
US20070134277A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 Children's Medical Center Corporation Pharmaceutical formulation for sulfur-containing drugs in liquid dosage forms
US20070141584A1 (en) 2005-12-20 2007-06-21 Roberts Douglas N Methods for assessment of native chromatin on microarrays
US7932037B2 (en) 2007-12-05 2011-04-26 Perkinelmer Health Sciences, Inc. DNA assays using amplicon probes on encoded particles
CA2636855C (en) 2006-01-11 2016-09-27 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
WO2007087310A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
US7537897B2 (en) 2006-01-23 2009-05-26 Population Genetics Technologies, Ltd. Molecular counting
AU2007210152A1 (en) 2006-01-27 2007-08-09 President And Fellows Of Harvard College Fluidic droplet coalescence
EP3591068A1 (en) 2006-02-02 2020-01-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
WO2007092538A2 (en) 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
GB0603251D0 (en) 2006-02-17 2006-03-29 Isis Innovation DNA conformation
JP5180845B2 (ja) 2006-02-24 2013-04-10 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド Ｄｎａアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定
WO2007111937A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Applera Corporation Directed enrichment of genomic dna for high-throughput sequencing
JP4921829B2 (ja) 2006-03-30 2012-04-25 株式会社東芝 微粒子の製造装置、乳化剤保持部、微粒子の製造方法および分子膜の製造方法
US20090181864A1 (en) 2006-03-31 2009-07-16 Nam Trung Nguyen Active control for droplet-based microfluidics
AU2007237909A1 (en) 2006-04-19 2007-10-25 Applied Biosystems, Llc. Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US7811603B2 (en) 2006-05-09 2010-10-12 The Regents Of The University Of California Microfluidic device for forming monodisperse lipoplexes
EP2047910B1 (en) 2006-05-11 2012-01-11 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic device and method
ES2620398T3 (es) 2006-05-22 2017-06-28 Nanostring Technologies, Inc. Sistemas y métodos para analizar nanoindicadores
RU2321638C2 (ru) 2006-05-23 2008-04-10 Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа
EP2029781A4 (en) 2006-05-26 2010-06-30 Althea Technologies Inc BIOCHEMICAL ANALYSIS OF PARTITIONED CELLS
FR2901717A1 (fr) 2006-05-30 2007-12-07 Centre Nat Rech Scient Procede de traitement de gouttes dans un circuit microfluidique.
EP4108780A1 (en) 2006-06-14 2022-12-28 Verinata Health, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
US8715934B2 (en) 2006-06-19 2014-05-06 The Johns Hopkins University Single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions
WO2008005675A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Applera Corporation Emulsion pcr and amplicon capture
EP1878501A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 Roche Diagnostics GmbH Instrument for heating and cooling
US8394590B2 (en) 2006-08-02 2013-03-12 California Institute Of Technology Capture agents and related methods and systems for detecting and/or sorting targets
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US9278321B2 (en) 2006-09-06 2016-03-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Chip and cartridge design configuration for performing micro-fluidic assays
CN104774275A (zh) 2006-09-25 2015-07-15 阿彻-丹尼尔斯-米德兰德公司 超吸收性的经表面处理的羧烷基化多糖及其制备方法
US7935518B2 (en) 2006-09-27 2011-05-03 Alessandra Luchini Smart hydrogel particles for biomarker harvesting
US20080166720A1 (en) 2006-10-06 2008-07-10 The Regents Of The University Of California Method and apparatus for rapid nucleic acid analysis
WO2008052138A2 (en) 2006-10-25 2008-05-02 The Regents Of The University Of California Inline-injection microdevice and microfabricated integrated dna analysis system using same
US7910302B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US8709787B2 (en) 2006-11-14 2014-04-29 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge and method of using same
DK2518162T3 (en) 2006-11-15 2018-06-18 Biospherex Llc Multi-tag sequencing and ecogenomic analysis
EP2327990A1 (en) 2006-11-20 2011-06-01 Nativis, Inc Apparatus and method for transducing an in vitro or mammalian system with a low-frequency signal
US20080242560A1 (en) 2006-11-21 2008-10-02 Gunderson Kevin L Methods for generating amplified nucleic acid arrays
US7866543B2 (en) 2006-11-21 2011-01-11 International Business Machines Corporation Security and privacy enforcement for discovery services in a network of electronic product code information repositories
WO2008072540A1 (ja) 2006-12-13 2008-06-19 National University Corporation Nagoya University Ｔｏｌ１因子のトランスポザーゼ及びそれを用いたＤＮＡ導入システム
EP2677309B9 (en) 2006-12-14 2014-11-19 Life Technologies Corporation Methods for sequencing a nucleic acid using large scale FET arrays, configured to measure a limited pH range
US8338166B2 (en) 2007-01-04 2012-12-25 Lawrence Livermore National Security, Llc Sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences in a complex mixture
JP2008167722A (ja) 2007-01-15 2008-07-24 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 磁性支持体上での加熱による核酸単離方法
US7844658B2 (en) 2007-01-22 2010-11-30 Comcast Cable Holdings, Llc System and method for providing an application to a device
US20080176768A1 (en) 2007-01-23 2008-07-24 Honeywell Honeywell International Hydrogel microarray with embedded metal nanoparticles
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US8003312B2 (en) 2007-02-16 2011-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multiplex cellular assays using detectable cell barcodes
FI20075124A0 (fi) 2007-02-21 2007-02-21 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testikitti nukleotidivariaatioiden toteamiseksi
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
US20080228268A1 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Uluru, Inc. Method of Formation of Viscous, Shape Conforming Gels and Their Uses as Medical Prosthesis
US7943330B2 (en) 2007-03-23 2011-05-17 Academia Sinica Tailored glycoproteomic methods for the sequencing, mapping and identification of cellular glycoproteins
US7776927B2 (en) 2007-03-28 2010-08-17 President And Fellows Of Harvard College Emulsions and techniques for formation
WO2008134153A1 (en) 2007-04-23 2008-11-06 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead-based multiplexed analytical methods and instrumentation
CN101293191B (zh) 2007-04-25 2011-11-09 中国科学院过程工程研究所 一种琼脂糖凝胶微球的制备方法
WO2008135512A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Jerzy Paszkowski Dna amplification method
US20080295909A1 (en) 2007-05-24 2008-12-04 Locascio Laurie E Microfluidic Device for Passive Sorting and Storage of Liquid Plugs Using Capillary Force
CN101720359A (zh) 2007-06-01 2010-06-02 454生命科学公司 从多重混合物中识别个别样本的系统和方法
EP2162205A1 (en) 2007-06-05 2010-03-17 Eugenia Kumacheva Multiple continuous microfluidic reactors for the scaled up synthesis of gel or polymer particles
WO2009005680A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for manipulation of fluidic species
WO2009011808A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 President And Fellows Of Harvard College Droplet-based selection
WO2009015296A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 The Regents Of The University Of California Microfabricated dropley generator
US20130084243A1 (en) 2010-01-27 2013-04-04 Liliane Goetsch Igf-1r specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
EP2179285A4 (en) 2007-08-15 2010-08-18 Opgen Inc METHOD, SYSTEM AND SOFTWARE ARRANGEMENT FOR COMPARATIVE ANALYSIS AND PHYLOGENIA WITH OPTICAL TOTAL GENERIC CARD
US8563527B2 (en) 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
US8268564B2 (en) 2007-09-26 2012-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and applications for stitched DNA barcodes
WO2009048532A2 (en) 2007-10-05 2009-04-16 President And Fellows Of Harvard College Formation of particles for ultrasound application, drug release, and other uses, and microfluidic methods of preparation
US20090099040A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Sigma Aldrich Company Degenerate oligonucleotides and their uses
US20100086914A1 (en) 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
JP2011500092A (ja) * 2007-10-26 2011-01-06 ロゼッタ、インファーマティクス、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー 非ランダムプライマーを用いたｃＤＮＡ合成の方法
WO2009061372A1 (en) 2007-11-02 2009-05-14 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for creating multi-phase entities, including particles and/or fluids
US8334013B2 (en) 2007-11-02 2012-12-18 Stc.Unm Mesoporous metal oxide microspheres and method for forming same
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
CN101918590B (zh) 2007-12-10 2013-03-27 高晓莲 核酸测序
US7771944B2 (en) 2007-12-14 2010-08-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Methods for determining genetic haplotypes and DNA mapping
EP2235210B1 (en) 2007-12-21 2015-03-25 President and Fellows of Harvard College Methods for nucleic acid sequencing
EP3699291A1 (en) 2008-01-17 2020-08-26 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
KR20090081260A (ko) 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 마이크로 어레이 혼성화 검출 방법
EP2252625B1 (en) 2008-02-07 2017-12-20 Pacific Biosciences of California, Inc. Cis reactive oxygen quenchers integrated into linkers
JP5468271B2 (ja) 2008-02-08 2014-04-09 花王株式会社 微粒子分散液の製造方法
US20090203531A1 (en) 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
US9012370B2 (en) 2008-03-11 2015-04-21 National Cancer Center Method for measuring chromosome, gene or specific nucleotide sequence copy numbers using SNP array
CN101241126A (zh) 2008-03-14 2008-08-13 东华大学 一种生物条形码探针的制备方法
US9011777B2 (en) 2008-03-21 2015-04-21 Lawrence Livermore National Security, Llc Monodisperse microdroplet generation and stopping without coalescence
US8961902B2 (en) 2008-04-23 2015-02-24 Bioscale, Inc. Method and apparatus for analyte processing
US9068181B2 (en) 2008-05-23 2015-06-30 The General Hospital Corporation Microfluidic droplet encapsulation
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
GB0810051D0 (en) 2008-06-02 2008-07-09 Oxford Biodynamics Ltd Method of diagnosis
WO2009148598A1 (en) 2008-06-05 2009-12-10 President And Fellows Of Harvard College Polymersomes, colloidosomes, liposomes, and other species associated with fluidic droplets
US8198028B2 (en) 2008-07-02 2012-06-12 Illumina Cambridge Limited Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
US8388945B2 (en) 2008-07-11 2013-03-05 Eth Zurich Degradable microcapsules
WO2010009365A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
US10722562B2 (en) 2008-07-23 2020-07-28 Immudex Aps Combinatorial analysis and repair
US20100062494A1 (en) 2008-08-08 2010-03-11 President And Fellows Of Harvard College Enzymatic oligonucleotide pre-adenylation
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
US20120252015A1 (en) 2011-02-18 2012-10-04 Bio-Rad Laboratories Methods and compositions for detecting genetic material
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
CA2735899A1 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Cephalon, Inc. Liquid formulations of bendamustine
US8361299B2 (en) 2008-10-08 2013-01-29 Sage Science, Inc. Multichannel preparative electrophoresis system
DK2376517T3 (da) 2008-10-24 2013-02-11 Epict Technologies Corp Transposon-ende-sammensætninger og fremgangsmåder til at modificere nukleinsyrer
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20100113296A1 (en) 2008-11-05 2010-05-06 Joel Myerson Methods And Kits For Nucleic Acid Analysis
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
CN104195227B (zh) * 2008-11-07 2017-04-12 适应生物技术公司 通过序列分析监测状况的方法
US20100203647A1 (en) 2008-11-21 2010-08-12 The Rockefeller University Chemical Reporters of Protein Acylation
SG171916A1 (en) 2008-12-02 2011-07-28 Bio Rad Laboratories Chromatin structure detection
EP3290531B1 (en) 2008-12-19 2019-07-24 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
US10839940B2 (en) 2008-12-24 2020-11-17 New York University Method, computer-accessible medium and systems for score-driven whole-genome shotgun sequence assemble
KR101065807B1 (ko) 2009-01-23 2011-09-19 충남대학교산학협력단 액적 기반의 미세유체 칩을 이용한 마이크로 캡슐 제조방법
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
BRPI1008965B1 (pt) 2009-03-13 2018-12-18 Harvard College método para aumento de escala de dispositivos microfluídicos e sistema para a formação de gotículas em canais microfluídicos em paralelo
WO2010104604A1 (en) 2009-03-13 2010-09-16 President And Fellows Of Harvard College Method for the controlled creation of emulsions, including multiple emulsions
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
WO2010111231A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
US20120010091A1 (en) 2009-03-30 2012-01-12 Illumina, Inc. Gene expression analysis in single cells
AU2010232439C1 (en) 2009-04-02 2017-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
WO2010127304A2 (en) 2009-05-01 2010-11-04 Illumina, Inc. Sequencing methods
US9334531B2 (en) 2010-12-17 2016-05-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
FR2945819B1 (fr) 2009-05-19 2011-06-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
CA2765427A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
EP4019977A1 (en) 2009-06-26 2022-06-29 President and Fellows of Harvard College Fluid injection
US20110028412A1 (en) 2009-08-03 2011-02-03 Cappellos, Inc. Herbal enhanced analgesic formulations
US20110033548A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Degradable crosslinked aminated dextran microspheres and methods of use
WO2011021102A2 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Population Genetics Technologies Ltd Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement
BR112012004382A2 (pt) 2009-09-01 2016-03-22 Koninkl Philips Electronics Nv dispositivo para a seleção específica de moléculas-alvo, método para selecionar especificamente moléculas-alvo e uso de um dispositivo
EP2940153B1 (en) 2009-09-02 2020-05-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions
JP5869482B2 (ja) 2009-09-02 2016-02-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ジェッティングおよび他の技術を使用して生成された多重エマルジョン
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
GB0918564D0 (en) 2009-10-22 2009-12-09 Plasticell Ltd Nested cell encapsulation
EP3461558B1 (en) 2009-10-27 2021-03-17 President and Fellows of Harvard College Droplet creation techniques
WO2011056872A2 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
RU2573409C2 (ru) 2009-11-04 2016-01-20 Дзе Юниверсити Оф Бритиш Коламбиа Содержащие нуклеиновые кислоты липидные частицы и относящиеся к ним способы
CA2767028A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Quantalife, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
EP2504448B1 (en) 2009-11-25 2016-10-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
US9023769B2 (en) 2009-11-30 2015-05-05 Complete Genomics, Inc. cDNA library for nucleic acid sequencing
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
WO2011074960A1 (en) 2009-12-17 2011-06-23 Keygene N.V. Restriction enzyme based whole genome sequencing
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
EP2534267B1 (en) 2010-02-12 2018-04-11 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
US20110257889A1 (en) 2010-02-24 2011-10-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Sequence assembly and consensus sequence determination
ES2565563T3 (es) 2010-02-25 2016-04-05 Advanced Liquid Logic, Inc. Método para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos
US8236574B2 (en) 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
JP2013523651A (ja) 2010-03-24 2013-06-17 ノースイースタン ユニヴァーシティ 多重コンパートメントのマクロファージ送達
CA2767182C (en) 2010-03-25 2020-03-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
FR2958186A1 (fr) 2010-03-30 2011-10-07 Ecole Polytech Dispositif de formation de gouttes dans un circuit microfluide.
PT2556171E (pt) 2010-04-05 2015-12-21 Prognosys Biosciences Inc Ensaios biológicos codificados espacialmente
US9255291B2 (en) 2010-05-06 2016-02-09 Bioo Scientific Corporation Oligonucleotide ligation methods for improving data quality and throughput using massively parallel sequencing
US20110287947A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 University Of Southern California Tethered Conformation Capture
CA2798323A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Selecta Biosciences, Inc. Dose selection of adjuvanted synthetic nanocarriers
US20120000777A1 (en) 2010-06-04 2012-01-05 The Regents Of The University Of California Devices and methods for forming double emulsion droplet compositions and polymer particles
EP2580378A4 (en) 2010-06-08 2014-01-01 Nugen Technologies Inc MULTIPLEX SEQUENCING METHODS AND COMPOSITION
US8703493B2 (en) 2010-06-15 2014-04-22 Src, Inc. Location analysis using fire retardant-protected nucleic acid-labeled tags
US20120003657A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Samuel Myllykangas Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization
WO2012012037A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 New England Biolabs, Inc. Oligonucleotide adaptors: compositions and methods of use
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
CN103202812B (zh) 2010-08-09 2015-10-28 南京大学 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法
WO2012019765A1 (en) 2010-08-10 2012-02-16 European Molecular Biology Laboratory (Embl) Methods and systems for tracking samples and sample combinations
CN103328007B (zh) 2010-09-16 2016-09-21 北卡罗来纳州大学查珀尔希尔分校 作为药物试剂、化学试剂和生物试剂的递送载剂和前药的不对称双官能甲硅烷基单体及其颗粒
CN102409048B (zh) 2010-09-21 2013-10-23 深圳华大基因科技服务有限公司 一种基于高通量测序的dna标签文库构建方法
ES2595433T3 (es) 2010-09-21 2016-12-30 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
US9187783B2 (en) 2010-10-04 2015-11-17 Genapsys, Inc. Systems and methods for automated reusable parallel biological reactions
US9999886B2 (en) 2010-10-07 2018-06-19 The Regents Of The University Of California Methods and systems for on demand droplet generation and impedance based detection
CA2814049C (en) * 2010-10-08 2021-07-13 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US10392726B2 (en) 2010-10-08 2019-08-27 President And Fellows Of Harvard College High-throughput immune sequencing
CN102050953B (zh) 2010-10-18 2012-11-07 武汉理工大学 一种可还原降解超分子水凝胶的制备方法
WO2012055929A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Illumina, Inc. Sequencing methods
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
EP2635840B1 (en) 2010-11-01 2017-01-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for forming emulsions
EP2635679B1 (en) 2010-11-05 2017-04-19 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US8829171B2 (en) 2011-02-10 2014-09-09 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2652155B1 (en) 2010-12-16 2016-11-16 Gigagen, Inc. Methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
CN103384725A (zh) 2010-12-23 2013-11-06 塞昆纳姆股份有限公司 胎儿遗传变异的检测
US20120191366A1 (en) 2011-01-20 2012-07-26 Nathaniel Pearson Methods and Apparatus for Assigning a Meaningful Numeric Value to Genomic Variants, and Searching and Assessing Same
GB201101429D0 (en) 2011-01-27 2011-03-16 Biocompatibles Uk Ltd Drug delivery system
US8765455B2 (en) 2011-01-27 2014-07-01 Lawrence Livermore National Security, Llc Chip-based droplet sorting
AU2012211081B2 (en) 2011-01-28 2016-02-04 Illumina, Inc. Oligonucleotide replacement for di-tagged and directional libraries
WO2016100976A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Apprise Bio, Inc. Methods for identifying multiple epitopes in selected sub-populations of cells
US10144950B2 (en) 2011-01-31 2018-12-04 Roche Sequencing Solutions, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
WO2012106546A2 (en) 2011-02-02 2012-08-09 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel continguity mapping
AU2012214312A1 (en) 2011-02-09 2013-08-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
EP2673614B1 (en) 2011-02-11 2018-08-01 Raindance Technologies, Inc. Method for forming mixed droplets
EP2673382B1 (en) 2011-02-11 2020-05-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Thermocycling device for nucleic acid amplification and methods of use
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
US9388276B2 (en) 2011-02-25 2016-07-12 University Of Massachusetts Monomers and polymers for functional polycarbonates and poly(ester-carbonates) and PEG-co-polycarbonate hydrogels
JP2014507164A (ja) 2011-02-25 2014-03-27 イルミナ，インコーポレイテッド ハプロタイプ決定のための方法およびシステム
CN103502218B (zh) 2011-03-04 2016-08-17 生命科技公司 用于缀合生物分子的化合物和方法
WO2012122549A2 (en) 2011-03-09 2012-09-13 Lawrence Ganeshalingam Biological data networks and methods therefor
CA2830443C (en) 2011-03-18 2021-11-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
US20140141442A1 (en) 2011-04-05 2014-05-22 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Linear dna amplification
GB2489714B (en) * 2011-04-05 2013-11-06 Tracesa Ltd Fluid Identification Method
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
CN107368705B (zh) 2011-04-14 2021-07-13 完整基因有限公司 分析生物体的基因组dna的方法和计算机系统
SI2702146T1 (sl) 2011-04-28 2019-06-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identifikacija polinukleotidov, povezanih z vzorcem
CN106912197B (zh) 2011-04-28 2022-01-25 生命技术公司 用于多重pcr的方法和组合物
WO2012157684A1 (ja) 2011-05-16 2012-11-22 地方独立行政法人 大阪府立病院機構 血中ｄｎａの定量的検出による悪性新生物の病勢の進行を評価する方法
AU2012257418B2 (en) 2011-05-16 2017-08-03 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Bio-orthogonal drug activation
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
KR20140034242A (ko) 2011-05-23 2014-03-19 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 다중 에멀젼을 포함하는 에멀젼의 제어
EP2714938B1 (en) 2011-05-27 2017-11-15 President and Fellows of Harvard College Methods of amplifying whole genome of a single cell
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9150916B2 (en) 2011-06-24 2015-10-06 Beat Christen Compositions and methods for identifying the essential genome of an organism
US8927218B2 (en) 2011-06-27 2015-01-06 Flir Systems, Inc. Methods and compositions for segregating target nucleic acid from mixed nucleic acid samples
US8975302B2 (en) 2011-07-07 2015-03-10 Life Technologies Corporation Polymer particles, nucleic acid polymer particles and methods of making and using the same
US20130017978A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Finnzymes Oy Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9605304B2 (en) 2011-07-20 2017-03-28 The Hong Kong Polytechnic University Ultra-stable oligonucleotide-gold and-silver nanoparticle conjugates and method of their preparation
US20130189700A1 (en) 2011-07-25 2013-07-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Breakage of an emulsion containing nucleic acid
EP2737089B1 (en) 2011-07-29 2017-09-06 Bio-rad Laboratories, Inc. Library characterization by digital assay
EP2739394A2 (en) 2011-08-04 2014-06-11 Sage Science, Inc. Microfluidic systems and methods for processing fluids
WO2013022961A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 3The Broad Institute Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
US8846883B2 (en) 2011-08-16 2014-09-30 University Of Southhampton Oligonucleotide ligation
WO2013035114A1 (en) 2011-09-08 2013-03-14 Decode Genetics Ehf Tp53 genetic variants predictive of cancer
US9725765B2 (en) * 2011-09-09 2017-08-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for obtaining a sequence
LT2768607T (lt) 2011-09-26 2021-12-27 Thermo Fisher Scientific Geneart Gmbh Daugiašulininė plokštelė didelio efektyvumo, mažo tūrio nukleorūgščių sintezei atlikti
CN106423314B (zh) 2011-09-28 2021-03-02 哈佛学院院长等 用于液滴产生和/或流体操纵的系统和方法
US9514272B2 (en) 2011-10-12 2016-12-06 Complete Genomics, Inc. Identification of DNA fragments and structural variations
US9469874B2 (en) 2011-10-18 2016-10-18 The Regents Of The University Of California Long-range barcode labeling-sequencing
US20130109576A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 Anthony P. Shuber Methods for detecting mutations
US9385791B2 (en) 2011-11-04 2016-07-05 Intel Corporation Signaling for configuration of downlink coordinated multipoint communications
EP2786019B1 (en) 2011-11-16 2018-07-25 International Business Machines Corporation Microfluidic device with deformable valve
US9938524B2 (en) 2011-11-22 2018-04-10 Active Motif, Inc. Multiplex isolation of protein-associated nucleic acids
US10689643B2 (en) 2011-11-22 2020-06-23 Active Motif, Inc. Targeted transposition for use in epigenetic studies
EP2785825B1 (en) 2011-12-03 2021-04-21 EMD Millipore Corporation Microfluidic cell culture system
EP4108782B1 (en) 2011-12-22 2023-06-07 President and Fellows of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US20150125865A1 (en) 2011-12-23 2015-05-07 Gigagen, Inc. Methods And Apparatuses For Droplet Mixing
CN106883334B (zh) 2012-02-09 2019-06-18 生命技术公司 亲水性聚合物颗粒及其制备方法
WO2013122996A1 (en) 2012-02-14 2013-08-22 The Johns Hopkins University Mirna analysis methods
EP2814472A4 (en) 2012-02-15 2015-11-04 Wisconsin Alumni Res Found DITHIOAMINE REDUCING AGENTS
PL2814959T3 (pl) 2012-02-17 2018-07-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Kompozycje i sposoby do dokładnej identyfikacji mutacji
US10202628B2 (en) 2012-02-17 2019-02-12 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
EP2817418B1 (en) 2012-02-24 2017-10-11 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
EP3305918B1 (en) 2012-03-05 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods for epigenetic sequencing
NO2694769T3 (ko) 2012-03-06 2018-03-03
US9552458B2 (en) 2012-03-16 2017-01-24 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Comprehensive analysis pipeline for discovery of human genetic variation
US20150125904A1 (en) 2012-03-30 2015-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Probe incorporation mediated by enzymes
CN102622634B (zh) 2012-03-31 2014-04-23 中国农业科学院果树研究所 一种苹果种质资源条形码标识的制备方法
EP2647426A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
CA2870160C (en) 2012-04-16 2021-08-24 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US20130296173A1 (en) 2012-04-23 2013-11-07 Complete Genomics, Inc. Pre-anchor wash
WO2013177046A1 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Solulink, Inc. Methods and/or use of oligonucleotide conjugates for suppressing background due to cross-hybridization
EP3514243B1 (en) 2012-05-21 2022-08-17 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
EP2861761A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
JP6558830B2 (ja) 2012-06-15 2019-08-14 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 複数転写産物のハイスループットシークエンシング
JP2015523087A (ja) 2012-07-24 2015-08-13 シーケンタ インコーポレイテッド 配列タグを用いる単一細胞分析
WO2014026032A2 (en) 2012-08-08 2014-02-13 Apprise Bio, Inc. Increasing dynamic range for identifying multiple epitopes in cells
EP4001426A1 (en) 2012-08-13 2022-05-25 The Regents of The University of California Methods and systems for detecting biological components
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150376609A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods of Analyzing Nucleic Acids from Individual Cells or Cell Populations
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20150005200A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378349A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378322A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005199A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20220098659A1 (en) 2012-08-14 2022-03-31 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2898096B1 (en) 2012-09-21 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Methods for labeling of rnas
US9644199B2 (en) 2012-10-01 2017-05-09 Agilent Technologies, Inc. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging
GB201217772D0 (en) 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
FR2996545B1 (fr) 2012-10-08 2016-03-25 Ecole Polytech Procede microfluidique de traitement et d'analyse d'une solution contenant un materiel biologique, et circuit microfluidique correspondant.
FR2996544B1 (fr) 2012-10-08 2015-03-13 Ecole Polytech Circuit microfluidique permettant la mise en contact de gouttes de plusieurs fluides, et procede microfluidique correspondant.
CN107541546B (zh) 2012-10-15 2021-06-15 生命技术公司 用于标靶核酸富集的组合物、方法、系统和试剂盒
CA2886974C (en) 2012-10-17 2021-06-29 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
CA2889862C (en) 2012-11-05 2021-02-16 Rubicon Genomics, Inc. Barcoding nucleic acids
WO2014072703A1 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Oxford Nanopore Technologies Limited Quadruplex method
WO2014074611A1 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for identifying contamination in samples
CN105026576A (zh) 2012-12-03 2015-11-04 以琳生物药物有限公司 单链多核苷酸扩增方法
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US20140242664A1 (en) 2012-12-12 2014-08-28 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
CA2894694C (en) 2012-12-14 2023-04-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2749653A1 (en) 2012-12-28 2014-07-02 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Molecular coding for analysis of composition of macromolecules and molecular complexes
EP2752664A1 (en) 2013-01-07 2014-07-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Label-free method for the detection of analytes
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
US9483610B2 (en) 2013-01-17 2016-11-01 Edico Genome, Corp. Bioinformatics systems, apparatuses, and methods executed on an integrated circuit processing platform
KR101984699B1 (ko) 2013-01-24 2019-05-31 삼성전자주식회사 핵산 분석용 미세 유체 시스템
EP3473905B1 (en) 2013-01-25 2020-07-29 Bio-rad Laboratories, Inc. System and method for performing droplet inflation
US10381106B2 (en) 2013-01-28 2019-08-13 Hasso-Plattner-Institut Fuer Softwaresystemtechnik Gmbh Efficient genomic read alignment in an in-memory database
US11110458B2 (en) 2013-02-01 2021-09-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
CA2900481A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
CN105050718B (zh) 2013-03-06 2018-04-24 哈佛学院院长及董事 形成相对单分散液滴的装置和方法
WO2014138711A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions, methods and systems for polymerase chain reaction assays
DK3553175T3 (da) 2013-03-13 2021-08-23 Illumina Inc Fremgangsmåde til fremstilling af et nukleinsyresekvenseringsbibliotek
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
WO2014152155A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Massively multiplexed rna sequencing
US20140272996A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generator with collection tube
US20140274729A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Nugen Technologies, Inc. Methods, compositions and kits for generation of stranded rna or dna libraries
AU2014233373B2 (en) 2013-03-15 2019-10-24 Verinata Health, Inc. Generating cell-free DNA libraries directly from blood
CA2907050C (en) 2013-03-15 2023-09-26 Prognosys Biosciences, Inc. Methods for detecting peptide/mhc/tcr binding
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
GB2525568B (en) 2013-03-15 2020-10-14 Abvitro Llc Single cell barcoding for antibody discovery
EP2971080B1 (en) 2013-03-15 2018-01-03 Expedeon, S.L. Methods for amplification and sequencing using thermostable tthprimpol
EP2981349A4 (en) 2013-04-02 2016-11-16 Raindance Technologies Inc SYSTEMS AND METHODS FOR HANDLING MICROFLUIDIC DROPLETS
CN105431575B (zh) 2013-05-09 2017-08-29 生物辐射实验室股份有限公司 磁性免疫数字pcr试验
AU2014268710B2 (en) 2013-05-23 2018-10-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transposition into native chromatin for personal epigenomics
WO2014201273A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The Broad Institute, Inc. High-throughput rna-seq
CA2915033C (en) 2013-06-12 2023-08-29 The General Hospital Corporation Methods, kits, and systems for multiplexed detection of target molecules and uses thereof
BR112015031608A2 (pt) 2013-06-17 2017-08-22 Massachusetts Inst Technology Aplicação e uso dos sistemas crispr-cas, vetores e composições para direcionamento e terapia hepáticos
US20160208323A1 (en) 2013-06-21 2016-07-21 The Broad Institute, Inc. Methods for Shearing and Tagging DNA for Chromatin Immunoprecipitation and Sequencing
WO2014210223A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
KR102436171B1 (ko) 2013-06-27 2022-08-24 10엑스 제노믹스, 인크. 샘플 처리를 위한 조성물 및 방법
US9840718B2 (en) 2013-07-12 2017-12-12 University Of South Alabama Minimal piggyBac vectors for genome integration
CN103394410B (zh) 2013-07-25 2016-04-20 博奥生物集团有限公司 一种位置可调节的智能磁力架
GB2516684A (en) 2013-07-30 2015-02-04 Sphere Fluidics Ltd Microfluidic devices and systems
SG10201806890VA (en) 2013-08-28 2018-09-27 Cellular Res Inc Massively parallel single cell analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US9381217B2 (en) * 2013-09-09 2016-07-05 Georgia Tech Research Corporation Microgels for encapsulation of cells and other biologic agents
CN105764490B (zh) 2013-09-24 2020-10-09 加利福尼亚大学董事会 用于生物测定和诊断的胶囊封装的传感器和感测系统及其制造和使用方法
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
US10266904B2 (en) 2013-10-09 2019-04-23 Stc.Unm Synthetic long read DNA sequencing
WO2015065924A2 (en) 2013-10-28 2015-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Hydrogel microstructures with immiscible fluid isolation for small reaction volumes
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US20140315755A1 (en) 2013-12-26 2014-10-23 Tao Chen Genome-wide Antisense Oligonucleotide and RNAi
ES2912183T3 (es) * 2013-12-30 2022-05-24 Atreca Inc Análisis de ácidos nucleicos asociados a células individuales utilizando códigos de barras de ácidos nucleicos
KR101464100B1 (ko) 2014-01-29 2014-11-21 성균관대학교산학협력단 생체 적용 가능한 리포솜-핵산형광 나노 융합체, 이의 응용, 및 이의 제조방법
WO2015113725A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Method for controlled dna fragmentation
CN105531408B (zh) 2014-02-13 2019-09-10 生物辐射实验室股份有限公司 染色体构象划分产物捕获
WO2015131110A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Igenomx International Genomics Corporation Methods for analysis of somatic mobile elements, and uses thereof
AU2015243445B2 (en) 2014-04-10 2020-05-28 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
TWI682997B (zh) 2014-04-15 2020-01-21 美商伊路米納有限公司 用於改善插入序列傾向及增加ｄｎａ輸入耐受度之經修飾的轉位酶
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
CN107075543B (zh) 2014-04-21 2021-11-16 哈佛学院院长及董事 用于条形码化核酸的系统和方法
US10975371B2 (en) 2014-04-29 2021-04-13 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
WO2015179706A1 (en) 2014-05-23 2015-11-26 Fluidigm Corporation Haploidome determination by digitized transposons
AU2015271324B2 (en) 2014-06-06 2019-09-12 Herlev Hospital Determining antigen recognition through barcoding of MHC multimers
AU2015273480A1 (en) 2014-06-11 2016-12-08 Samplix S.A.R.L. Nucleotide sequence exclusion enrichment by droplet sorting (needls)
US9534215B2 (en) 2014-06-11 2017-01-03 Life Technologies Corporation Systems and methods for substrate enrichment
US11585806B2 (en) 2014-06-13 2023-02-21 Immudex Aps General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
US10480021B2 (en) 2014-06-23 2019-11-19 Yale University Methods for closed chromatin mapping and DNA methylation analysis for single cells
CN114214314A (zh) 2014-06-24 2022-03-22 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
JP2017526046A (ja) 2014-06-26 2017-09-07 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 核酸配列アセンブルのプロセス及びシステム
US20150376700A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
US20150376605A1 (en) 2014-06-26 2015-12-31 10X Genomics, Inc. Methods and Compositions for Sample Analysis
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
DK3656875T3 (da) 2014-07-18 2021-12-13 Illumina Inc Ikke-invasiv prænatal diagnostik
US20160024558A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 10X Genomics, Inc. Nucleic acid binding proteins and uses thereof
CN105335116B (zh) 2014-07-30 2018-11-09 联想(北京)有限公司 一种显示控制方法及电子设备
EP3186418A2 (en) 2014-08-26 2017-07-05 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
EP3191605B1 (en) 2014-09-09 2022-07-27 The Broad Institute, Inc. A droplet-based method and apparatus for composite single-cell nucleic acid analysis
AU2015318011B2 (en) 2014-09-15 2020-07-23 Abvitro Llc High-throughput nucleotide library sequencing
IL299976A (en) 2014-10-17 2023-03-01 Illumina Cambridge Ltd Continuity-preserving transposition
US20160122817A1 (en) 2014-10-29 2016-05-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10783984B2 (en) 2014-12-18 2020-09-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. De novo diploid genome assembly and haplotype sequence reconstruction
SG11201705615UA (en) 2015-01-12 2017-08-30 10X Genomics Inc Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same
KR20170106979A (ko) 2015-01-13 2017-09-22 10엑스 제노믹스, 인크. 구조 변이 및 위상 조정 정보를 시각화하기 위한 시스템 및 방법
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
CN115011670A (zh) 2015-02-04 2022-09-06 加利福尼亚大学董事会 通过在离散实体中条形码化对核酸进行测序
US10854315B2 (en) 2015-02-09 2020-12-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data
DK3256604T3 (da) 2015-02-10 2020-05-25 Illumina Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til analyse af cellebestanddele
EP3262407B1 (en) 2015-02-24 2023-08-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
EP3262188B1 (en) 2015-02-24 2021-05-05 10X Genomics, Inc. Methods for targeted nucleic acid sequence coverage
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
US11873483B2 (en) 2015-03-11 2024-01-16 The Broad Institute, Inc. Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
WO2016149661A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Massively parallel on-chip coalescence of microemulsions
EP3277838A1 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Verily Life Sciences LLC Methods for combining single cell profiling with combinatorial nanoparticle conjugate library screening
CN107532207B (zh) 2015-04-10 2021-05-07 空间转录公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
JP2018511341A (ja) 2015-04-17 2018-04-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子配列決定および他の適用のためのバーコード化システムおよび方法
WO2016169431A1 (zh) 2015-04-20 2016-10-27 深圳华大基因研究院 一种长片段dna文库构建方法
WO2016170126A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Stilla Technologies Contact-less priming method for loading a solution in a microfluidic device and associated system
US20160314242A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 10X Genomics, Inc. Sample indexing methods and compositions for sequencing applications
CN107532218A (zh) 2015-05-18 2018-01-02 10X基因组学有限公司 稳定化还原剂及其使用方法
CN107580627A (zh) 2015-05-18 2018-01-12 10X基因组学有限公司 用于生物化学反应和分析中的流动固相组合物
WO2016187717A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Exerkine Corporation Exosomes useful for genome editing
WO2016191618A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Jianbiao Zheng Methods of inserting molecular barcodes
EP3314015A1 (en) 2015-06-24 2018-05-02 Oxford Biodynamics Limited Detection of chromosome interactions
JP2018527947A (ja) 2015-07-17 2018-09-27 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸配列増幅方法
PT3334841T (pt) 2015-08-12 2020-01-30 Cemm Forschungszentrum Fuer Molekulare Medizin Gmbh Métodos para estudar ácidos nucleicos
US11479805B2 (en) 2015-08-21 2022-10-25 The General Hospital Corporation Combinatorial single molecule analysis of chromatin
US11156611B2 (en) 2015-09-24 2021-10-26 Abvitro Llc Single cell characterization using affinity-oligonucleotide conjugates and vessel barcoded polynucleotides
CN108289797B (zh) 2015-10-13 2022-01-28 哈佛学院院长及董事 用于制备和使用凝胶微球的系统和方法
US10900031B2 (en) 2015-10-19 2021-01-26 Zhejiang Annoroad Bio-Technology Co. Ltd. Method for constructing high-resolution single cell Hi-C library with a lot of information
WO2017070056A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for high throughput single cell genetic manipulation
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
KR20180097536A (ko) 2015-11-04 2018-08-31 아트레카, 인크. 단일 세포와 연관된 핵산의 분석을 위한 핵산 바코드의 조합 세트
WO2017087910A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 10X Genomics, Inc. Transformable tagging compositions, methods, and processes incorporating same
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
US11965891B2 (en) 2015-12-30 2024-04-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital protein quantification
SG11201806757XA (en) 2016-02-11 2018-09-27 10X Genomics Inc Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
US20170260584A1 (en) 2016-02-11 2017-09-14 10X Genomics, Inc. Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes
WO2017151828A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 Universal Sequencing Technology Corporation Methods and kits for tracking nucleic acid target origin for nucleic acid sequencing
US11680253B2 (en) 2016-03-10 2023-06-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transposase-mediated imaging of the accessible genome
WO2017180420A1 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for detecting single t cell receptor affinity and sequence
AU2017250269A1 (en) 2016-04-15 2018-11-08 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for the collection of droplets and/or other entities
JP2019515674A (ja) 2016-04-19 2019-06-13 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝的解析および他の適用のための固定化ベースのシステムおよび方法
WO2017197343A2 (en) 2016-05-12 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic on-chip filters
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
WO2018031631A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Methods of de novo assembly of barcoded genomic dna fragments
WO2018039338A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 10X Genomics, Inc. Microfluidic surface-mediated emulsion stability control
US10858699B2 (en) 2016-08-30 2020-12-08 Integrated Dna Technologies, Inc. Cleavable hairpin primers
EP3507379A4 (en) 2016-08-31 2020-05-13 President and Fellows of Harvard College METHOD FOR DIGITAL TOTAL GENOM AMPLIFICATION
CN109923216A (zh) 2016-08-31 2019-06-21 哈佛学院董事及会员团体 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法
US20180080021A1 (en) 2016-09-17 2018-03-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Simultaneous sequencing of rna and dna from the same sample
WO2018058073A2 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP4026905B1 (en) 2016-10-19 2024-04-17 10X Genomics, Inc. Methods for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations
GB201619458D0 (en) 2016-11-17 2017-01-04 Spatial Transcriptomics Ab Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
CN109996892B (zh) 2016-12-07 2023-08-29 深圳华大智造科技股份有限公司 单细胞测序文库的构建方法及其应用
CN110139932A (zh) 2016-12-19 2019-08-16 生物辐射实验室股份有限公司 液滴加标的相邻性保留的标签化dna
EP3571308A4 (en) 2016-12-21 2020-08-19 The Regents of The University of California GENOMIC SEQUENCING OF SINGLE CELLS USING HYDROGEL-BASED DROPS
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20190177800A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for labeling cells
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA3048863A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Illumina, Inc. Analysis system for orthogonal access to and tagging of biomolecules in cellular compartments
JP7229923B2 (ja) 2017-01-06 2023-02-28 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド ヌクレアーゼ切断を評価する方法
US20210087610A9 (en) 2017-01-12 2021-03-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods for analyzing t cell receptors and b cell receptors
EP4029939B1 (en) 2017-01-30 2023-06-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
EP4324931A2 (en) * 2017-02-02 2024-02-21 New York Genome Center, Inc. Methods and compositions for identifying or quantifying targets in a biological sample
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
US10347365B2 (en) 2017-02-08 2019-07-09 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing a pattern in a dataset
GB201704402D0 (en) 2017-03-20 2017-05-03 Blacktrace Holdings Ltd Single cell DNA sequencing
KR20190133711A (ko) 2017-03-24 2019-12-03 싱가포르국립대학교 분자의 다중 검출 방법
WO2018191563A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Karius, Inc. Sample preparation methods, systems and compositions
US20210139941A1 (en) 2017-04-14 2021-05-13 The Broad Institute, Inc. High-throughput screens for exploring biological functions of microscale biological systems
US20180312822A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 10X Genomics, Inc. Mmlv reverse transcriptase variants
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
CN117143960A (zh) 2017-05-18 2023-12-01 10X基因组学有限公司 用于分选液滴和珠的方法和系统
EP3625715A4 (en) 2017-05-19 2021-03-17 10X Genomics, Inc. DATA SET ANALYSIS SYSTEMS AND METHODS
US10914729B2 (en) 2017-05-22 2021-02-09 The Trustees Of Princeton University Methods for detecting protein binding sequences and tagging nucleic acids
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CA3059559A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
WO2018226546A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 10X Genomics, Inc. Gaskets for the distribution of pressures in a microfluidic system
EP3642397A4 (en) 2017-06-20 2021-03-31 10X Genomics, Inc. IMPROVED DROPLET STABILIZATION METHODS AND SYSTEMS
CA3068273A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Bluedot Llc Systems and methods for identification of nucleic acids in a sample
CN108336542B (zh) 2017-06-23 2020-02-21 番禺得意精密电子工业有限公司 电连接器
KR102307473B1 (ko) 2017-08-01 2021-10-01 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레오타이드 서열분석용 하이드로겔 비드
US9946577B1 (en) 2017-08-14 2018-04-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for distributed resource management
US10357771B2 (en) 2017-08-22 2019-07-23 10X Genomics, Inc. Method of producing emulsions
US10590244B2 (en) 2017-10-04 2020-03-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
WO2019071039A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 10X Genomics, Inc. COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS FOR PEARL FORMATION USING ENHANCED POLYMERS
WO2019084328A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS FOR PREPARING NUCLEIC ACID MOLECULES
WO2019083852A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. MICROFLUIDIC CHANNEL NETWORKS FOR PARTITIONING
US20190127731A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. Methods for preparing nucleic acid molecules
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
EP3700672B1 (en) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
WO2019113235A1 (en) 2017-12-06 2019-06-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing nucleic acid molecules
WO2019118355A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
CN111712579A (zh) 2017-12-22 2020-09-25 10X基因组学有限公司 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法
WO2019148042A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
EP3749740B1 (en) 2018-02-05 2023-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods for multiplexed measurements in single and ensemble cells
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
SG11202008080RA (en) 2018-02-22 2020-09-29 10X Genomics Inc Ligation mediated analysis of nucleic acids
WO2019169028A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Transcriptome sequencing through random ligation
WO2019169347A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Systems and apparatus for holding plates
WO2019191321A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 10X Genomics, Inc. Nucleic acid enrichment within partitions
SG11202009889VA (en) 2018-04-06 2020-11-27 10X Genomics Inc Systems and methods for quality control in single cell processing
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
US20190345636A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
US20190352717A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 10X Genomics, Inc. Targeted non-invasive prenatal testing
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11574706B2 (en) 2018-06-28 2023-02-07 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualization of single-cell resolution characteristics
US20200033366A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US20200263232A1 (en) 2018-08-03 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Methods and systems to minimize barcode exchange
WO2020041148A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for detection of protein-dna interactions using proximity ligation
US20200056223A1 (en) 2018-08-20 2020-02-20 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for cellular processing
US20200105373A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 10X Genomics, Inc. Systems and methods for cellular analysis using nucleic acid sequencing
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
CN113874521A (zh) 2019-01-06 2021-12-31 10X基因组学有限公司 用于富集条形码的方法和系统
WO2020167866A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transposon loading
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
WO2020167862A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transfer of reagents between droplets
EP3924505A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
SG11202111242PA (en) 2019-03-11 2021-11-29 10X Genomics Inc Systems and methods for processing optically tagged beads
WO2020198532A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing rna from cells
EP4025709A1 (en) 2019-09-06 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Systems and methods for barcoding cells and cell beads
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
CN115135984A (zh) 2019-12-23 2022-09-30 10X基因组学有限公司 可逆固定试剂及其使用方法
EP4110941A1 (en) 2020-02-28 2023-01-04 10X Genomics, Inc. Method for isolating nuclei and cells from tissues
WO2021207610A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 10X Genomics, Inc. Cold protease treatment method for preparing biological samples
EP4136227A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for use with fixed samples
WO2021222302A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for increasing cell recovery efficiency
WO2021222301A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis and identification of barcode multiplets
EP4244379A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 10X Genomics, Inc. Nano-partitions (encapsulated nucleic acid processing enzymes) for cell-lysis and multiple reactions in partition-based assays
EP4298239A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 10X Genomics, Inc. Drug screening methods
WO2022182682A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004526940A (ja) * 2000-10-18 2004-09-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 内在化機能を有する抗体の高処理スクリーニングの方法
US20120316074A1 (en) * 2011-04-25 2012-12-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2014028537A1 (en) * 2012-08-14 2014-02-20 10X Technologies, Inc. Microcapsule compositions and methods

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200039623A (ko) * 2017-05-26 2020-04-16 에이비비트로 엘엘씨 고-처리량 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 시퀀싱 및 전사체 분석
KR20200026218A (ko) * 2017-08-01 2020-03-10 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레오타이드 서열분석용 하이드로겔 비드
KR20210121294A (ko) * 2017-08-01 2021-10-07 일루미나, 인코포레이티드 뉴클레오티드 서열분석용 하이드로겔 비드
US11180752B2 (en) 2018-02-13 2021-11-23 Illumina, Inc. DNA sequencing using hydrogel beads
US11359226B2 (en) 2018-04-20 2022-06-14 Illumina, Inc. Contiguity particle formation and methods of use
US11085036B2 (en) 2018-10-26 2021-08-10 Illumina, Inc. Modulating polymer beads for DNA processing

Also Published As

Publication number Publication date
EP4053292A1 (en) 2022-09-07
JP6838969B2 (ja) 2021-03-03
AU2015279548A1 (en) 2017-01-12
US20230348897A1 (en) 2023-11-02
JP7329552B2 (ja) 2023-08-18
EP3161160A4 (en) 2018-01-10
US20150376609A1 (en) 2015-12-31
US20220340968A1 (en) 2022-10-27
CN106795553A (zh) 2017-05-31
MX2016016902A (es) 2017-03-27
WO2015200893A2 (en) 2015-12-30
EP3161160B1 (en) 2021-10-13
EP3161160A2 (en) 2017-05-03
JP2023099197A (ja) 2023-07-11
EP3889325A1 (en) 2021-10-06
US11629344B2 (en) 2023-04-18
US20240002837A1 (en) 2024-01-04
WO2015200893A9 (en) 2016-04-21
CN113249435A (zh) 2021-08-13
JP2017522867A (ja) 2017-08-17
US11713457B2 (en) 2023-08-01
IL249617A0 (en) 2017-02-28
KR20230070325A (ko) 2023-05-22
WO2015200893A3 (en) 2016-03-17
CN106795553B (zh) 2021-06-04
JP2021072863A (ja) 2021-05-13
KR102531677B1 (ko) 2023-05-10
AU2015279548B2 (en) 2020-02-27
US20230087127A1 (en) 2023-03-23
CA2953374A1 (en) 2015-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11359239B2 (en) Methods and systems for processing polynucleotides
US11713457B2 (en) Methods and systems for processing polynucleotides
US10253364B2 (en) Method and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) Methods and systems for processing polynucleotides
US20220098659A1 (en) Methods and systems for processing polynucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E701 Decision to grant or registration of patent right
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant