JP6839666B2 - 複雑な異種群集由来微生物株の解析、機能的な関係及びそれらの相互作用の予測及び同定、ならびにそれに基づく微生物アンサンブルの選択及び合成のための方法、装置、及びシステム - Google Patents

複雑な異種群集由来微生物株の解析、機能的な関係及びそれらの相互作用の予測及び同定、ならびにそれに基づく微生物アンサンブルの選択及び合成のための方法、装置、及びシステム Download PDF

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Description

本願は、２０１５年６月２５日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ」と題された米国仮特許出願第６２／１８４，６５０号、及び２０１６年１月７日に出願された「微生物の群集をスクリーニングするための方法」と題された米国仮出願第６２／２７６，１４２号の優先権を主張し；前述の出願の各々は、本明細書中に参照として明示的に援用する。
微生物は自然界に群集として共生し、多様な相互作用をし、個々の群集メンバー間の協調と競争の両方をもたらす。微生物生態学の進歩により、ほとんどの地域社会において高レベルの種の多様性及び複雑性が明らかになった。微生物は、環境中に広がっており、生物圏内の広範な生態系に生息している。個々の微生物及びそれらのそれぞれの群集は、海洋地点（深海及び海洋表面の両方での）、土壌、ならびにヒト組織を含む動物組織などの環境においてユニークな役割を果たす。
［概要］
本開示の一態様では、複数の試料から活性微生物を同定し、同定した微生物を少なくとも１つのメタデータを用いて解析し、解析に基づいて微生物のアンサンブルを作製する方法を開示する。本方法の実施形態は、試料中の１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を測定することを含み、そこにおいて１つ以上の活性微生物株は試料中の微生物群集に存在する。１つ以上の微生物株は、微生物型の部分分類群である。本明細書で提供する方法において使用する試料は、任意の環境起源のものであり得る。例えば、一実施形態では、試料は、動物、土壌（例えば、バルク土壌または根圏）、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、植物、または極限環境由来のものである。別の実施形態では、動物試料は、血液、組織、歯、汗、爪、皮膚、毛髪、糞便、尿、精液、粘液、唾液、胃腸管、第一胃、筋肉、脳、組織、または器官の試料である。一実施形態では、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を測定する方法を提供する。
本開示の一実施形態では、１つ以上の微生物型は、１つ以上の細菌（例えば、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ｃｏｃｃｕｓ、ｂａｃｉｌｌｕｓ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、真菌（例えば、，ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ、ｙｅａｓｔ）、線虫、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド及び／またはそれらの組合せである。一実施形態では、１つ以上の微生物株は、１つ以上の細菌（例えば、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ｃｏｃｃｕｓ、ｂａｃｉｌｌｕｓ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、真菌（例えば、ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ、ｙｅａｓｔ）、線虫、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド及び／またはその組合せである。さらなる実施形態では、１つ以上の微生物株は、１つ以上の真菌種または真菌亜種である。さらなる実施形態では、１つ以上の微生物株は、１つ以上の細菌種または細菌の亜種である。さらなる実施形態では、試料は第一胃の試料である。いくつかの実施形態では、第一胃の試料はウシ由来である。さらなる実施形態では、試料は胃腸試料である。いくつかの実施形態では、胃腸試料はブタまたはニワトリ由来である。
試料中の１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を測定する方法の１つの実施形態では、試料中の１つ以上の微生物型の存在を検出し、試料中の１つ以上の微生物型のそれぞれの絶対数を測定する。ユニークな第一のマーカーの数を、それぞれのユニークな第一のマーカーの量すなわち存在量とともに、測定する。本明細書中に記載するように、ユニークな第一のマーカーは、ユニークな微生物株のマーカーである。次いで、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することによって、タンパク質またはＲＮＡレベルで活性を評価する。ユニークな第二のマーカーは、ユニークな第一のマーカーと同じかまたは異なるものであり、生物株の活性のマーカーである。一つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルに基づいて、（もしあれば）一つ以上の微生物株が活性であると判定を下す。一実施形態では、微生物株は、閾値レベルまたは閾値レベルを上回る割合でユニークな第二のマーカーを発現する場合、活性であるとみなされる。１つ以上の活性微生物株の１つ以上の第一のマーカーの量、及び１つ以上の微生物株がその部分分類群である由来元の微生物型の絶対数に基づいて、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を測定する。
一実施形態では、試料中の１つ以上の生物型の各々の数を測定することは、試料またはその一部を、核酸配列決定、遠心分離、光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、染色、質量分析、マイクロ流体工学、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）またはフローサイトメトリーに供することを含む。
一実施形態では、試料中の第一のユニークなマーカーの数を測定することは、ユニークなゲノムＤＮＡマーカーの数を測定することを含む。別の実施形態では、試料中の第一のユニークなマーカーの数を測定することは、ユニークなＲＮＡマーカーの数を測定することを含む。別の実施形態では、試料中のユニークな第一のマーカーの数を測定することは、ユニークなタンパク質マーカーの数を測定することを含む。別の実施形態では、試料中のユニークな第一のマーカーの数を測定することは、ユニークな代謝産物マーカーの数を測定することを含む。さらなる実施形態では、試料中のユニークな代謝産物マーカーの数を測定することは、ユニークな炭水化物マーカーの数、ユニークな脂質マーカーの数またはそれらの組合せを測定することを含む。
別の実施形態では、ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することは、試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループットな配列決定反応に供することを含む。一実施形態では、ユニークな第一のマーカーの測定は、例えばユニークな第一のマーカーに特異的なプライマーを用いたマーカー特異的反応を含む。別の実施形態では、メタゲノムアプローチである。
一実施形態では、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することは、試料中のＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡ）を発現解析に供することを含む。さらなる実施形態では、遺伝子発現解析は配列決定反応を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡ発現解析は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトーム配列決定、及び／またはトランスクリプトーム配列決定を含む。
一実施形態では、試料中の第二のユニークなマーカーの数の測定は、ユニークなタンパク質マーカーの数を測定することを含む。別の実施形態では、試料中のユニークな第二のマーカーの数を測定することは、ユニークな代謝産物マーカーの数を測定することを含む。別の実施形態では、試料中のユニークな代謝産物マーカーの数を測定することは、ユニークな炭水化物マーカーの数を測定することを含む。別の実施形態では、試料中のユニークな代謝産物マーカーの数を測定することは、ユニークな脂質マーカーの数を測定することを含む。別の実施形態では、１つ以上の微生物株の絶対細胞数を、複数の試料中で測定する。さらなる実施形態では、複数の試料を、同じ環境または同様の環境から採取する。別の実施形態では、複数の試料を複数の時点で採取する。
別の実施形態では、１つ以上のユニークな第二のマーカーのレベルを測定することは、試料またはその一部を質量分析に供することを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することは、試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリングに供することを含む。
本開示の別の態様では、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数の測定方法を、複数の試料において決定し、絶対細胞数レベルを、１つ以上のメタデータ（例えば、環境的な）パラメータに関連付ける。一実施形態では、絶対細胞数レベルを１つ以上のメタデータパラメータに関連付けることは、共起測定、相互情報量測定、連鎖解析などを含む。一実施形態において、１つ以上のメタデータパラメータは、第二の活性微生物株の存在である。したがって、本方法の一実施形態において、絶対細胞数値を用いて、環境パラメータを有する微生物群集における１つ以上の活性微生物株の共起性を判定する。別の実施形態では、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数レベルを、微生物群集を採取する環境の供給条件、ｐＨ、栄養素または温度などの環境パラメータに関連付ける。
本態様では、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を、１つ以上の環境パラメータに関連付ける。環境パラメータは、試料自体のパラメータ、例えば、ｐＨ、温度、試料中のタンパク質の量、群集内の他の微生物の存在であり得る。一実施形態では、パラメータは、試料の取得元の宿主の特定のゲノム配列（例えば、特定の遺伝子変異）である。あるいは、環境パラメータは、微生物群集の同一性の変化に影響を及ぼすパラメータである（すなわち、微生物群集の「同一性」が、微生物株の型及び／または群集内の特定の微生物株の数によって特徴付けられる場合）か、または微生物群集の同一性の変化に影響を受ける。例えば、一実施形態における環境パラメータは、動物の食物摂取量または泌乳反芻動物が産生する牛乳の量（または牛乳のタンパク質または脂肪含量）である。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、環境パラメータは、メタデータパラメータと呼ばれる。
一実施形態では、試料中の１つ以上の活性微生物株の共起性を測定することは、１つ以上の環境パラメータと活性微生物株との関連性を示す連鎖で構成されたマトリックスを作成することを含む。
一実施形態では、１つ以上の活性生物株及びメタデータパラメータの共起性の測定は、ネットワーク内の株間の連結性を測定するネットワーク及び／またはクラスター解析法を含み、そこにおいてネットワークは、共通または類似の環境パラメータを共有する２つ以上の試料の集合体である。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュール性解析、ロバストネス測定、媒介性測定、連結性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せを含む。別の実施形態では、クラスター解析法は、連結性モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクマイニング及び予測、集合分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似度、またはそれらの組合せによるネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、相互情報、最大情報係数計算、または他の、連結性を確定するための変数間のノンパラメトリックな方法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデル化を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
解析に基づいて、微生物アンサンブルに含めるための１つ以上の活性関連株を同定する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
方法であって：
少なくとも１つの共通特性を共有し、少なくとも１つの異なる特性を有する少なくとも２つの試料を取得し；
各試料について１つ以上の微生物型の存在を検出し、
各試料中の前記１つ以上の微生物型のそれぞれの検出した微生物型の数を判定し；
各試料中の、微生物株のマーカーであるユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し；
前記各微生物型の数及び前記第一のマーカーの数を統合して、各試料中に存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し；
特定の閾値に基づいて各微生物株についての少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定して、各試料中のその微生物株の活性レベルを測定し；
前記測定した活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングして、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれらのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；
前記少なくとも２つの試料の各々についての活性微生物株の前記フィルタリングした絶対細胞数を、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株と比較し、前記活性微生物株を、予測される機能及び／または化学に基づいて少なくとも２つの群に分類し；
前記少なくとも２つの群から少なくとも１つの微生物株を選択し；ならびに
前記少なくとも２つの群から選択した前記少なくとも１つの微生物株を組み合わせて、前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変更するように構成された微生物のアンサンブルを形成することを含む、前記方法。
（項目２）
前記ユニークな第一のマーカーの数を測定することが、各試料中のユニークなゲノムＤＮＡマーカーの数を測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ユニークな第一のマーカーの数を測定することが、各試料中のユニークなＲＮＡマーカーの数を測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ユニークな第一のマーカーの数を測定することが、各試料中のユニークなタンパク質マーカーの数を測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ユニークな第一のマーカーの数を測定することが、各試料中のユニークな代謝産物マーカーの数を測定することを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ユニークな代謝産物マーカーの数を測定することが、各試料中のユニークな脂質マーカーの数を測定することを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ユニークな代謝産物マーカーの数を測定することが、各試料中のユニークな炭水化物マーカーの数を測定することを含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することが、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応に供することを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することが、各試料由来のゲノムＤＮＡをメタゲノム配列決定に供することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ユニークな第一のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカーの少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ユニークな第一のマーカーが、σ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素の少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定することが、各試料中の前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することを含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することが、前記試料中のｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供することを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記遺伝子発現解析が、配列決定反応を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記遺伝子発現解析が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトーム配列決定、及び／またはトランスクリプトーム配列決定を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することが、各試料またはその一部を質量分析に供することを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することが、各試料またはその一部を、メタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリングに供することを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記１つ以上の微生物型が、細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せを含む、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記１つ以上の微生物株が、１つ以上の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組合せである、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記１つ以上の微生物株が、１つ以上の真菌種または亜種であり；及び／または１つ以上の微生物株が１つ以上の細菌種または亜種である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記各試料中の１つ以上の微生物型の各々の数を判定することが、各試料またはその一部を、配列決定、遠心分離、光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供することを含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記ユニークな第一のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムＣオキシダーゼサブユニット遺伝子、βチューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組合せを含む系統発生学的マーカーを含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記ユニークなマーカーの数及びその量を測定することが、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応に供することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ユニークなマーカーの数及びその量を測定することが、ゲノムＤＮＡをゲノム配列決定に供することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記ユニークなマーカーの数及びその量を測定することが、ゲノムＤＮＡをアンプリコン配列決定に供することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記少なくとも１つの異なる特性が、前記少なくとも２つの試料のそれぞれを採取した採取時間を含み、第一の試料の前記採取時間が、第二の試料の前記採取時間と異なる、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記少なくとも１つの異なる特性が、前記少なくとも２つの試料のそれぞれを採取した採取地域を含み、第一の試料の前記採取地域が第二の試料の前記採取地域と異なる、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記少なくとも１つの共通特性が、試料供給源の型を含み、第一の試料の前記試料供給源の型が第二の試料の前記試料供給源の型と同一である、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記試料供給源の型が、動物型、器官型、土壌型、水型、堆積物型、油型、植物型、農産物型、バルク土壌型、土壌根圏型、または植物部分型のいずれか１つである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記少なくとも１つの共通特性が、前記少なくとも２つの試料のそれぞれが胃腸試料であることを含む、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記少なくとも１つの共通特性が、動物試料供給源の型を含み、各試料が組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料であるような、さらなる共通特性を各試料が有する、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
項目１〜３１のいずれか一項に記載の方法であって：
前記少なくとも１つの測定したメタデータに基づいて、標的から少なくとも１つのさらなる試料を取得し、そこにおいて前記標的由来の少なくとも１つのさらなる試料が、前記少なくとも２つの試料と少なくとも１つの共通特性を共有し；及び
前記標的由来の前記少なくとも１つのさらなる試料について、１つ以上の微生物型の存在を検出し、１つ以上の微生物型のそれぞれの検出した微生物型の数を判定し、ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、前記各微生物型の数と前記第一のマーカーの数を統合し、存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し、各微生物株の少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定して、その微生物株の活性レベルを決定し、決定した活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングし、活性微生物株及び前記標的由来の少なくとも１つのさらなる試料についてのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；
そこにおいて、前記少なくとも２つの群の各々からの少なくとも１つの微生物株の選択が、前記標的由来の前記少なくとも１つのさらなる試料についての活性微生物株及びそのそれぞれの絶対細胞数のリストに基づいており、それによって、形成するアンサンブルが前記少なくとも１つのメタデータに対応する前記標的の特性を変更するように構成される、前記方法。
（項目３３）
前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株の前記フィルタリングした絶対細胞数を、少なくとも１つの測定したメタデータまたは前記少なくとも２つの試料のそれぞれについてのさらなる活性微生物株と比較することが、前記少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株を用いて各試料中の前記１つ以上の活性微生物株の共起性を判定することを含む、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記少なくとも１つの測定したメタデータが、１つ以上のパラメータを含み、前記１つ以上のパラメータが、試料のｐＨ、試料の温度、脂肪の豊富さ、タンパク質の豊富さ、炭水化物の豊富さ、ミネラルの豊富さ、ビタミンの豊富さ、天然物の豊富さ、特定の化合物の豊富さ、試料供給源の体重、試料供給源の飼料摂取量、試料供給源の体重増加、試料供給源の飼料効率、１つ以上の病原体の存在の有無、試料供給源の物理的特性（複数可）または測定値（複数可）、試料供給源の生産特性、またはそれらの組合せのうちの少なくとも１つである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記１つ以上のパラメータが、乳清タンパク質の豊富さ、カゼインタンパク質の豊富さ、及び／または乳中脂肪の豊富さのうちの少なくとも１つである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記１つ以上の活性微生物株及び前記少なくとも１つの測定したメタデータの各試料中での前記共起性を判定することが、メタデータと微生物株との関連性を示すリンク、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数、及び異種微生物群集または複数の群集の１つ以上のネットワークを表す１つ以上のユニークな第二のマーカーの測定値を集合させたマトリックスを作成することを含む、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記少なくとも１つの測定したメタデータが、第二の微生物株の存在、活性及び／または量を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記１つ以上の活性微生物株及び前記少なくとも１つの測定したメタデータの前記共起性を判定し、前記活性微生物株を分類することは、ネットワーク内の各微生物株の連結性を測定するネットワーク解析及び／またはクラスター解析を含み、そこにおいて前記ネットワークが、共通の特性、測定したメタデータ、及び／または関連する環境パラメータを共有する前記少なくとも２つの試料の集合を表す、項目３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記少なくとも１つの測定したメタデータが、第二の微生物株の存在、活性及び／または量を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ネットワーク解析及び／またはクラスター解析が、連鎖解析、モジュール性解析、ロバストネス測定、媒介性測定、連結性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せを含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１）
前記クラスター解析が、連結性モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ネットワーク解析が、リンクマイニング及び予測、集合分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似度、またはそれらの組合せによるネットワークの予測モデリングを含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４３）
前記ネットワーク解析が、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４４）
前記ネットワーク解析が、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記クラスター解析がヒューリスティックな方法である、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４６）
前記ヒューリスティックな方法がＬｏｕｖａｉｎ法である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ネットワーク解析が、変数間の連結性を確定するノンパラメトリックな方法を含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４８）
前記ネットワーク解析が、連結性を確定するための変数間の相互情報及び／または最大情報係数計算を含む、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４９）
２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを共有する前記２つ以上の試料セットに基づいて、環境内の特徴または特性を変更するように構成された活性微生物株のアンサンブルの形成方法であって、各試料セットが、異種微生物群集を含む少なくとも１つの試料を含み、前記１つ以上の微生物株が１つ以上の生物型の部分分類群であり；前記方法が：
各試料中の複数の微生物型の存在を検出し；
各試料中の前記検出した微生物型の各々の細胞の絶対数を決定し；
各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、そこにおいてユニークな第一のマーカーは微生物株のマーカーであり；
タンパク質またはＲＮＡレベルで、１つ以上のユニークな第２のマーカーの発現レベルを測定し、そこにおいてユニークな第二のマーカーは微生物株の活性のマーカーであり；
特定の閾値を上回る前記一つ以上のユニークな第二のマーカーの前記発現レベルに基づいて、各試料についての前記検出した微生物株の活性を測定し；
前記１つ以上の第一のマーカーの量、及び前記１つ以上の微生物株をその部分分類群とする前記微生物型の細胞の絶対数に基づいて、各試料中の検出した各活性微生物株の絶対細胞数を計算し、そこにおいて前記１つ以上の活性微生物株は、前記特定の閾値を上回る前記第二のユニークなマーカーを発現し；
ネットワーク内の各微生物株の連結性を測定する最大情報係数ネットワーク解析に基づいて、少なくとも１つの環境パラメータまたは追加の活性微生物株を用いて試料中の活性微生物株の共起性を判定し、そこにおいて前記ネットワークは、前記少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを有する少なくとも２つ以上の試料セットの集合であり；前記ネットワーク解析に基づいて、前記１つ以上の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択し；及び
前記選択した複数の活性微生物株から活性微生物株のアンサンブルを形成することを含み、前記活性微生物株のアンサンブルをその環境に導入した場合に、前記活性微生物株のアンサンブルが環境の特徴または特性を選択的に変更するように構成される、前記方法。
（項目５０）
前記少なくとも１つの環境パラメータが、第二の微生物株の存在、活性及び／または量を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記第一の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の少なくとも１つの測定指標が、第二の試料セットについての前記少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定指標とは異なる、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５２）
各試料セットが複数の試料を含み、試料セット内の各試料についての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定指標が実質的に類似しており、１つの試料セットの平均測定指標が、別の試料セットからの平均測定指標と異なる、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５３）
各試料セットが複数の試料を含み、第一の試料セットを第一の集団から採取し、第二の試料セットを第二の集団から採取する、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５４）
各試料セットが複数の試料を含み、第一の試料セットを第一の時間に第一の集団から採取し、第二の試料セットを前記第一の時間とは異なる第二の時間に前記第一の集団から採取する、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５５）
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、栄養素情報を含む、項目４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、食餌情報を含む、項目４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、動物の特徴を含む、項目４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、感染情報または健康状態を含む、項目４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
少なくとも１つの測定指標が、試料のｐＨ、試料の温度、脂肪の豊富さ、タンパク質の豊富さ、炭水化物の豊富さ、ミネラルの豊富さ、ビタミンの豊富さ、天然物の豊富さ、特定の化合物の豊富さ、試料供給源の体重増加、試料供給源の飼料効率、１つ以上の病原体の存在の有無、試料供給源の物理的特性（複数可）または測定値（複数可）、試料供給源の生産特性、またはそれらの組合せである、項目５１に記載の方法。
（項目６０）
前記少なくとも１つのパラメータが、乳清タンパク質の豊富さ、カゼインタンパク質の豊富さ、及び／または乳中脂肪の豊富さのうちの少なくとも１つである、項目４９または５０に記載の方法。
（項目６１）
各試料中のユニークな第一のマーカーの数を測定することが、ユニークなゲノムＤＮＡマーカーの数を測定することを含む、項目４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記試料中のユニークな第一のマーカーの数を測定することが、ユニークなＲＮＡマーカーの数を測定することを含む、項目４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記試料中のユニークな第一のマーカーの数を測定することが、ユニークなタンパク質マーカーの数を測定することを含む、項目４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記複数の微生物型が、１つ以上の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せを含む、項目４９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
各試料中の微生物型の各々の絶対細胞数を測定することが、試料またはその一部を、配列決定、遠心分離、光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動及び／またはフローサイトメトリーに供することを含む、項目４９〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
１つ以上の活性生物株が、１つ以上の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せから選択される１つ以上の微生物型の部分分類群である、項目４９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
１つ以上の活性生物株が、１つ以上の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組合せである、項目４９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
１つ以上の活性微生物株が、１つ以上の真菌種、真菌亜種、細菌種及び／または細菌亜種である、項目４９〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
少なくとも１つのユニークな第一のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムＣオキシダーゼサブユニット遺伝子、βチューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組合せを含む系統発生学的マーカーを含む、項目４９〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することが、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応に供することを含む、項目４９または５０に記載の方法。
（項目７１）
前記ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することが、各試料由来のゲノムＤＮＡをメタゲノム配列決定に供することを含む、項目４９または５０に記載の方法。
（項目７２）
前記ユニークな第一のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、またはリボソームＲＮＡマーカーを含む、項目４９または５０に記載の方法。
（項目７３）
前記ユニークな第一のマーカーが、σ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、代謝酵素、またはそれらの組合せを含む、項目４９または５０に記載の方法。
（項目７４）
前記１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することが、前記試料中のｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供することを含む、項目４９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記遺伝子発現解析が、配列決定反応を含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記遺伝子発現解析が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトーム配列決定、及び／またはトランスクリプトーム配列決定を含む、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することが、各試料またはその一部を質量分析に供することを含む、項目４９〜６８及び７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することが、前記試料またはその一部をメタリボソームプロファイリング及び／またはリボソームプロファイリングに供することを含む、項目４９〜６８及び７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記試料供給源の型が、動物、土壌、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、バルク土壌、土壌根圏、植物部分、野菜、極限環境、またはそれらの組合せのうちの１つである、項目４９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
各試料が胃腸試料である、項目４９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
各試料が、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、組織試料、または器官試料のうちの１つである項目４９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
プロセッサで実施する方法であって：
少なくとも１つの共通特性を共有し、少なくとも１つの異なる特性を有する少なくとも２つの試料から試料データを受け取り；
各試料について、各試料中の１つ以上の微生物型の存在を判定し；
各試料中の前記１つ以上の微生物型のそれぞれの検出した各微生物型の数を測定し；
各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、それぞれのユニークな第一のマーカーは微生物株のマーカーであり；
プロセッサを介して、各微生物型の数及び第一のマーカーの数を統合して、各試料中に存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し；
特定の閾値を上回る各微生物株についての少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値に基づいて、各試料中の各微生物株の活性レベルを測定し、微生物株は、その株に対する少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値が、対応する閾値を上回る場合に、活性であると同定され；
前記測定した活性によって各微生物株の絶対細胞数をフィルタリングして、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれらのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；
少なくとも１つのプロセッサを介して、少なくとも２つの試料の各々についての少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株を有する、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについて、前記フィルタリングした活性微生物株の絶対細胞数のネットワーク解析を実施し、前記ネットワーク解析は、各活性微生物株と他のすべての活性微生物株との間の最大情報係数スコアを測定し、各活性微生物株と前記それぞれの少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株との間の最大情報係数スコアを測定し；
予測される機能及び／または化学に基づいて前記活性微生物株を分類し；
前記分類に基づいて複数の活性微生物株を同定し；ならびに
前記同定した複数の活性微生物株を出力することを含む、前記方法。
（項目８３）
項目８２に記載のプロセッサで実施する方法であって：
標的に適用した場合に、少なくとも１つの測定したメタデータに対応する特性を変更するように構成された活性微生物アンサンブルを組み立てることを含む、前記方法。
（項目８４）
前記出力した複数の活性微生物株を用いて、標的に適用した場合に、前記少なくとも１つの測定したメタデータに対応する特性を変更するように構成された活性微生物アンサンブルを組み立てる、項目８２に記載のプロセッサで実施する方法。
（項目８５）
項目８２に記載のプロセッサで実施する方法であって：前記出力した複数の同定した活性微生物株に基づいて少なくとも１つの病原体を同定することをさらに含む、前記方法。
（項目８６）
前記出力した複数の活性微生物株をさらに用いて、標的に適用した場合に少なくとも１つの同定した病原体を標的とし、少なくとも１つの同定した病原体に付随する症状を治療及び／または予防するように構成された活性微生物アンサンブルを組み立てる、項目８２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
いくつかの実施形態による、複雑な異種群集由来の微生物株のスクリーニング及び解析、機能的関係及びその相互作用の予測、ならびにそれに基づく微生物アンサンブルの選択及び合成のための例示的な高レベルプロセスフローを示す。 一実施形態による、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を測定するための一般的なプロセスフローを示す。 一実施形態による、試料、または１つ以上のメタデータ（環境）パラメータを有する試料中の１つ以上の活性微生物株の共起性を測定する一般的なプロセスフローを示す。 一実施形態による例示的な微生物相互作用解析及び選択システム３００を示す模式図である。天然微生物群集内の多次元種間相互作用及び依存性を決定し、活性微生物を同定し、複数の活性微生物を選択して、特定のパラメータ（複数可）及び／または関連する尺度を変更する微生物のアンサンブル、凝集体または他の合成グループを形成するためのシステム及びプロセスを記載する。 そのようなシステムで使用するためのプロセスフローの例である。天然微生物群集内の多次元種間相互作用及び依存性を決定し、活性微生物を同定し、複数の活性微生物を選択して、特定のパラメータ（複数可）及び／または関連する尺度を変更する微生物のアンサンブル、凝集体または他の合成グループを形成するためのシステム及びプロセスを記載する。 本開示のいくつかの態様を示す例示的なデータを提供する。 本開示のいくつかの態様を示す例示的なデータを提供する。 乳牛の乳脂肪の産生に影響を与える第一胃微生物群集の成分を決定する実験中に産生される乳脂肪のポンド量の非線形性を示す図である。 標的株Ａｓｃｕｓ＿７１３の活性フィルターを用いた絶対細胞数と、産生された乳脂肪のポンド量（ｌｂ）との相関を示す。 標的株Ａｓｃｕｓ＿７の活性フィルターを用いた絶対細胞数、及び実験中に産生された乳脂肪のポンド量（ｌｂ）を示す。 標的株Ａｓｃｕｓ＿３０３８の活性フィルターを用いない場合の相対存在量と、産生された乳脂肪のポンド量（ｌｂ）との相関を示す。 （図８Ａ）開示する方法に従って調製した微生物アンサンブルを乳牛に投与した圃場試験の結果を示す図である。経時的に産生された乳脂肪の平均ポンド量を示す。（図８Ｂ）開示する方法に従って調製した微生物アンサンブルを乳牛に投与した圃場試験の結果を示す図である。経時的に産生された乳タンパク質の平均ポンド量を示す。（図８Ｃ）開示する方法に従って調製した微生物アンサンブルを乳牛に投与した圃場試験の結果を示す図である。経時的に産生されたエネルギー調整乳（ＥＣＭ）の平均ポンド量を示す。
［詳細な説明］
微生物群集は、多くの異なるタイプの生態系における環境プロセス、ならびに、例えば、栄養素を循環させ、炭素を固定化することによる地球の生物地球化学の中心である（Ｆａｌｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，ｐｐ．２３７−２４０、その全体を参照として本明細書に援用する）。しかしながら、群集の複雑性及び所与の微生物群集のメンバーの大部分が培養不可能であるために、これらのプロセスの分子及び生態学的詳細ならびに影響因子はまだほとんど理解されていない。
微生物群集は質的及び量的組成が異なり、各微生物群集はユニークであり、その組成は、所与の生態系及び／またはそれが存在する環境に依存する。微生物群集メンバーの絶対細胞数は、群集が存在する環境の変化、ならびに微生物によって引き起こされる生理学的及び代謝的変化（例えば、細胞分裂、タンパク質発現など）に左右される。環境パラメータ及び／または群集内の１つの活性微生物の量の変化は、群集の他の微生物及び群集が見出される生態系及び／または環境に広範囲の影響を及ぼし得る。これらの微生物群集の変化を理解し、予測し、対応するためには、試料中の活性微生物及びそれぞれの群集における活性微生物の数を同定することが必要である。しかしながら、現在まで、微生物群集メンバーの大多数の研究は、絶対細胞数ではなく、特定の微生物群集における微生物の割合に焦点を当ててきた（Ｓｅｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９，ｐ．６６６、その全体を参照として本明細書に援用する）。
微生物群集組成は、例えば、ハイスループット配列決定アプローチの使用を介して容易に決定できるが、それぞれの群集がどのように成り立ち、維持されるかについてのより深い理解が必要である。
微生物群集は、必須元素の生体化学的循環、例えば、炭素、酸素、窒素、硫黄、リン及び様々な金属の循環の重要なプロセスに関与し；それぞれの群集の構造、相互作用及びダイナミクスは、生物圏が存在するうえで重要である（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）． ｍＢｉｏ ６（１）：ｅ０２２８８−１４．Ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．０２２８８−１４、すべての目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する）。そのような群集は高度に不均一であり、ほとんどの場合、細菌、ウイルス、古細菌、及び真菌のような他の微生物の複雑な混合物を含む。腸及び膣などのヒト環境における微生物の群集の不均一性のレベルは、炎症性腸疾患及び細菌性膣炎などの疾患に関連している（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）． Ｖｏ．４８６，ｐ．２０７、すべての目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する）。しかしながら、健康な個体でさえも、そのような環境において組織を占める微生物が顕著に異なっている（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）． Ｖｏ．４８６，ｐ．２０７）。
多くの微生物は、培養することができないか、そうでなければ培養が困難／高価であり得るため、核酸配列決定のような培養に依存しないアプローチは、様々な微生物群集の多様性の理解を進歩させた。小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡまたは１６ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子の増幅及び配列決定は、遺伝子の普遍的存在及び比較的均一な進化速度に部分的に基づく、群集における微生物多様性の研究に対する基礎的アプローチであった。ハイスループット法の進歩は、微生物の全ゲノムを配列決定するメタゲノミクス解析につながった。そのような方法は、群集に関する先験的な知識を必要とせず、新規微生物株の発見を可能にする。メタゲノミクス、メタトランスクリプトーム、メタプロテオミクス、及びメタボロミクスはすべて、群集を調査して構造と機能を識別することを可能にする。
群集内の微生物をカタログ化するだけでなく、どのメンバーが活性であるか、それらの生物の数、及び環境パラメータ（複数可）による微生物群集メンバー（複数可）の互いの共起性、例えば、群集の環境の特定の変化に対応した群集内での２つの微生物の共起性を解読する能力は、それぞれの環境要因（例えば、気候、存在する栄養素、環境ｐＨ）が、微生物群集内の微生物の同一性（及びそれらのそれぞれの数）に対して有している重要性、ならびに特定の群集メンバーがその群集が存在する環境において有している重要性の理解を可能にするであろう。本開示は、これら及び他の必要性に対処する。
本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指定がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「生物型」という用語は、単一の生物型または複数の生物型を意味するものとする。別の例では、用語「環境パラメータ」とは、単一の環境パラメータまたは複数の環境パラメータを意味することが可能であり、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、文脈が、明らかに環境パラメータが１つしか存在しないことを要求しない限り、環境パラメータが複数存在する可能性を排除するものではない。
本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、「一態様」、「態様」、「一実施態様」、または「実施態様」とは、実施形態に関連して記載する特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な箇所において「一実施形態では」または「実施形態では」という語句が出現するが、これらは必ずしもすべて同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
本明細書中で使用する場合、特定の実施形態において、数値の前にある場合の用語「約」または「およそ」は、±１０％の範囲の値を示す。
本明細書中で使用する場合、「単離する」、「単離した」、「単離した微生物」などの用語は、特定の環境（例えば、土壌、水、動物組織）において、１つ以上の微生物が、それが会合する少なくとも１つの物質から分離されていることを意味する。したがって、「単離した微生物」はその天然に存在する環境には存在せず；むしろ、微生物をその自然環境から除去し、自然に存在しない状態に置くことを、本明細書に記載の様々な技術を通じて行う。したがって、単離した株は、例えば、生物学的に純粋な培養物として、または許容可能な担体と会合した胞子（もしくは他の形態の株）として存在する場合がある。
本明細書中で使用する場合、「微生物アンサンブル」とは、本開示の方法、システム、及び／または装置によって同定する１つ以上の活性微生物を含む組成物であって、天然の環境には通常存在しない、及び／または天然に存在しない比率もしくは量で存在する組成物を指す。例えば、微生物アンサンブルまたは凝集体は、適切な培地または担体とともに、１つ以上の単離した微生物株から形成し得る。微生物アンサンブルは、標的、例えば、標的環境、集団、及び／または動物に塗布または投与することができる。
本開示による微生物アンサンブルは、相互に関連する個々の活性微生物種、または種の株の、セット、サブセット、及び／またはグループから選択される。本開示の方法によって同定する関係性及びネットワークは、１つ以上の共通機能の実行に基づいてグループ化及び／またはリンクされているか、または関心対象の表現型の形質（例えば、反芻動物での乳生産の増加）などの認識可能なパラメータに関与しているか、それをもたらすか、もしくはそれに関連している。微生物アンサンブルの選択元のグループ、及び／または微生物アンサンブル自体は、微生物の２つ以上の種、種の株、または異なる種の株を含み得る。いくつかの例では、微生物は、グループ及び／または微生物アンサンブル内に、共生的に共存することができる。
本開示の特定の態様において、微生物アンサンブルは、単離して生物学的に純粋な培養物として存在する１つ以上の単離した微生物であるか、またはそれに基づいたものである。当業者であれば、特定の微生物の単離した生物学的に純粋な培養物は、当該培養物が他の生物を実質的に含有せず（科学上の理由で）、課題対象の個々の微生物のみを含有することを意味することは、理解するであろう。この培養物は、上記微生物を様々な濃度で含有することができる。本開示は、単離した生物学的に純粋な微生物が、しばしば「純粋でない物質または不純な物質とは必ずしも同じではない」ことに言及する。例えば、Ｉｎ ｒｅ Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，４２７ Ｆ．２ｄ １３９４，（ＣＣＰＡ１９７０）（ｄｉｓｃｕｓｓｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ）を参照されたく、また、Ｉｎ ｒｅ Ｂｅｒｇｙ，５９６ Ｆ．２ｄ ９５２（ＣＣＰＡ１９７９）（ｄｉｓｃｕｓｓｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を参照されたく、また、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ＆Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ＆Ｃｏ．，１８９ Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（Ｌｅａｒｎｅｄ Ｈａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ），ａｆｆ’ｄ ｉｎ ｐａｒｔ，ｒｅｖ’ｄ ｉｎ ｐａｒｔ，１９６ Ｆ．４９６（２ｄ Ｃｉｒ．１９１２）を参照されたく、これらの文献は参照として本明細書に援用する。さらに、いくつかの態様では、本開示の実施態様は、開示する微生物アンサンブルにおいて使用するために、単離した生物学的に純粋な微生物培養物について達成しなければならない濃度または純度の制限の特定の定量的尺度を必要とする可能性がある。特定の実施形態において、これらの純度値の存在は、現在開示する方法によって同定した微生物を天然状態に存在する微生物と区別する更なる属性である。例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，２５３ Ｆ．２ｄ １５６（４ｔｈ Ｃｉｒ．１９５８）（微生物によって産生されたビタミンＢ１２の純度制限について論じている）を参照されたく、上記文献は参照として本明細書に援用する。
本明細書で使用する場合、「担体」、「許容可能な担体」、または「医薬担体」とは、微生物アンサンブルと共にまたは微生物アンサンブル中で使用する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような担体は、石油、動物、植物、または合成物起源のものを含む水及び油などの滅菌液体であることができ；例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油などである。水または水溶液である生理食塩水溶液ならびに水性デキストロース及びグリセロール水溶液を、担体として、いくつかの実施形態では注射用溶液として、使用することが好ましい。あるいは、担体は、結合剤（圧縮ピル用の）、滑剤、封止剤、着香料、及び着色剤の１つ以上を含むがこれらに限定されない固体剤形担体であり得る。担体の選択は、意図する投与経路及び標準的な製薬実務に関して選択することができる。Ｈａｒｄｅｅ ａｎｄ Ｂａｇｇｏ（１９９８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ． ２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．５０４ｐｇ．）；Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（１９７０．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． １７ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．）；及びＢｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＵＳ２０１１０２８０８４０Ａ１）を参照されたく、これらの文献の各々は、その全体を参照として本明細書に明示的に援用する。
用語「微生物」及び「微小生命体」は、本明細書では同じ意味で使用し、細菌、真核生物または古細菌ドメインにあたる微生物を指す。微生物型として、限定するものではないが、細菌（例えば、ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ｃｏｃｃｕｓ、ｂａｃｉｌｌｕｓ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、菌類（例えば、ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ、ｙｅａｓｔ）、線虫、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド及び／またはそれらの組合せが挙げられる。生物株は生物型の部分分類群であり、例えば、特定の微生物の、種、亜種、亜型、遺伝的変異体、病原型または血清型であり得る。
本明細書中で使用する用語「マーカー」または「ユニークなマーカー」は、ユニークな微生物型、微生物株または微生物株の活性の指標である。マーカーは、生物学的試料中で測定することができ、限定するものではないが、リボソームＲＮＡ遺伝子などの核酸ベースのマーカー、ペプチドもしくはタンパク質ベースのマーカー、及び／または代謝物または他の小分子マーカーが挙げられる。
本明細書中で使用する用語「代謝産物」とは、代謝の中間体または産物である。一実施形態における代謝産物は小分子である。代謝産物は、燃料、構造、シグナル伝達、酵素に対する刺激及び阻害効果において、酵素に対する補因子として、防御において、及び他の生物との相互作用（例えば、色素、臭気物質及びフェロモン）などの様々な機能を有する。一次代謝産物は、正常な成長、発達及び再生に直接関与する。二次代謝産物はこれらのプロセスに直接関与しないが、通常は重要な生態学的機能を有する。代謝産物の例として、抗生物質ならびに例えば樹脂及びテルペンなどの色素が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。いくつかの抗生物質は、一次代謝産物であるトリプトファンから生成されるアクチノマイシンなどの前駆物質として一次代謝産物を使用する。本明細書中で使用する場合、代謝産物には、小分子の親水性炭水化物；高分子の疎水性脂質及び複合型の天然化合物が含まれる。
本開示の一態様では、複数の微生物株と１つ以上のメタデータ及び／またはパラメータとの間の関係を同定する方法を開示する。図１Ａに示すように、少なくとも２つの試料供給源から少なくとも２つの試料に関する試料及び／または試料データを受け取り１０１、各試料について、１つ以上の微生物型の存在を判定する１０３。各試料中の１つ以上の微生物型の各々の検出した微生物の数（細胞数）を測定し１０５、各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し１０７、ここで各々のユニークな第一のマーカーは微生物株のマーカーである。各微生物型の数及び第一のマーカーの数を統合して、各試料中に存在する各微生物株の絶対細胞数を算出し１０９、各微生物株について特定の閾値を上回る少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値に基づいて各試料中の各微生物株の活性レベルを測定し１１１、微生物株は、その株の少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値が、対応する閾値を上回る場合に活性であると同定する。次いで、各微生物株の絶対細胞数を、測定した活性によってフィルタリングして、少なくとも２つの試料の各々について、活性微生物株のリスト、及びそれらのそれぞれの絶対細胞数を提供する１１３。少なくとも２つの試料のそれぞれについてフィルタリングした活性微生物株の絶対細胞数のリストのネットワーク解析を、少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株を用いて行い１１５、ネットワーク解析は、各活性微生物株と他のすべての活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定すること、及び各活性微生物株と少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定することを含む。その後、活性微生物株を、機能、予測した機能及び／または化学に基づいて分類し１１７、分類に基づいて複数の活性微生物株を同定し、出力する１１９。いくつかの実施形態では、本方法は、同定した複数の微生物株から活性微生物アンサンブルを組み立てることをさらに含み１２１、微生物アンサンブルは、標的に適用した場合に少なくとも１つの測定したメタデータに対応する特性を変更するように構成される。本方法は、出力した複数の同定した活性微生物株に基づいて少なくとも１つの病原体を同定することをさらに含み得る（さらなる詳細については実施例４参照）。いくつかの実施形態では、複数の活性微生物株を利用して、標的に適用した場合に少なくとも１つの同定した病原体に対処し、及び／または少なくとも１つの同定した病原体に関連する症状を治療するように構成される活性微生物アンサンブルを組み立てることができる。
本開示の一態様では、試料または複数の試料中の１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数の測定方法を提供し、そこにおいて１つ以上の活性微生物株は、試料中の微生物群集に存在する。１つ以上の微生物株は、１つ以上の生物型の部分分類群である（図１Ｂの方法１０００参照）。各試料について、試料中の１つ以上の微生物型の存在を検出する（１００１）。試料中の１つ以上の生物型のそれぞれの絶対数を測定する（１００２）。ユニークな第一のマーカーの数を、ユニークな第一のマーカーの各々の量とともに測定する（１００３）。本明細書に記載するように、ユニークな第一のマーカーは、ユニークな微生物株のマーカーである。次いで、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することにより、タンパク質及び／またはＲＮＡレベルで活性を評価する（１００４）。ユニークな第二のマーカーは、第一のユニークなマーカーと同じであっても異なっていてもよく、それは生物株の活性のマーカーである。一つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルに基づいて、微生物株が活性である（もしあれば）という決定を行う（１００５）。微生物株は、第二のユニークなマーカーを特定レベルで、または閾値レベル（１００５）を上回るレベルで、例えば閾値レベルを少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％または少なくとも約４０％上回るレベルで発現する場合、活性であるとみなされる（特定の用途及び／または実施態様に基づいて様々な閾値を決定し得ることが理解されるべきであり、例えば、閾値は、特定の種、試料の由来元の地域、関心対象のメタデータ、環境などの試料の供給源（複数可）によって様々に異なる場合がある）。１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数は、１つ以上の活性微生物株の１つ以上の第一のマーカーの量及び１つ以上の微生物株がその部分分類群である生物型の絶対数に基づいて決定することができる。
図２に示すように、本開示の別の態様では、１つ以上の活性微生物の絶対細胞数を複数の試料中で測定し、絶対細胞数をメタデータ（環境パラメータ）に関連付ける（２００１〜２００８）。複数の試料を、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数の解析に供し、複数の試料中の少なくとも１つにおいて、活性測定値が閾値レベル以上にある場合、１つ以上の活性微生物株は活性であるとみなされる（２００１〜２００６）。１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を、特定の実施態様及び／または用途のメタデータパラメータに関連付ける（２００８）。
一実施形態では、複数の試料は、同じ環境源から経時的に（例えば、時間経過にわたって同じ動物から）採取する。別の実施形態では、複数の試料は、複数の環境源（例えば、異なる動物）由来である。一実施形態では、環境パラメータは、第二の活性微生物株の絶対細胞数である。さらなる実施形態では、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数値を使用して、１つ以上の活性微生物株と、微生物群集の第二の活性微生物株との共起性を判定する。さらなる実施形態では、第二の環境パラメータを、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数及び／または第二の環境株の絶対細胞数に関連付ける。
これらの態様の実施形態を、全体にわたって議論する。
本明細書で提供する方法で使用するための試料は、微生物群集を含む任意のタイプのものであることが重要であり得る。例えば、本明細書で提供する方法で使用するための試料は、動物試料（例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類）、土壌、空気、水（例えば、海洋、淡水、廃水汚泥）、沈降物、油、植物、農産物、植物、土壌（例えば、根圏）及び極限下の環境試料（例えば、酸性鉱山排水、熱水系）を包含するが、必ずしもこれらに限定するものではない。海洋または淡水試料の場合、試料は、水域の表面から、または水域の任意の深さからのもの、例えば深海試料などであり得る。一実施形態では、水試料は、海、川または湖の試料である。
一実施形態では、動物試料は体液である。別の実施形態では、動物試料は組織試料である。非限定的な動物試料として、歯、汗、爪、皮膚、毛髪、糞便、尿、精液、粘液、唾液、胃腸管が挙げられる。動物試料は、例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウスもしくはラット）、またはトリの試料であり得る。一実施形態では、トリ試料は、１つ以上のニワトリ由来試料を含む。別の実施形態では、試料はヒト試料である。ヒトマイクロバイオームは、皮膚の表面及び深層、乳腺、唾液、口腔粘膜、結膜及び胃腸管に見出される微生物のコレクションを含む。マイクロバイオームに認められる微生物として、細菌、真菌、原生動物、ウイルス及び古細菌が挙げられる。体の異なる部分は、多様な微生物を呈する。微生物の量及び型は、個体の健康状態または病的状態を示す可能性がある。細菌分類群の数は数千にも及び、ウイルスは豊富に存在する可能性がある。体の所定の部位の細菌組成は、型だけでなく、豊富さ、すなわち量においても、人によって様々に異なっている。
別の実施形態では、試料は、第一胃の試料である。ウシなどの反芻動物は、多様な微生物群集を利用して飼料を消化する。これらの動物は、嫌気性微生物群集によって発酵させる間、飼料を保持する改変された上部消化管（反芻胃または第一胃）を有することにより、栄養価が低い飼料を使用するように進化した。第一胃の微生物群集は非常に稠密で、１ｍＬあたり約３×１０１０個の微生物細胞を有する。嫌気性発酵微生物は第一胃を優占する。第一胃の微生物群集は：細菌、古細菌及び真核生物の３つすべてのドメインのメンバーを含んでいる。第一胃の発酵産物は、体の維持及び成長ならびに乳生産のために、それぞれの宿主に必要とされる（ｖａｎ Ｈｏｕｔｅｒｔ（１９９３）．Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４３，ｐｐ．１８９−２２５；Ｂａｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．３１，ｐｐ．２９９−３１９；上記文献はすべての目的のためにその全体を参照として援用する）。さらに、産乳量及び組成物は、第一胃の微生物群集と関連していることが報告されている（Ｓａｎｄｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ａｎｉｍａｌ ８，ｐｐ．５７２−５７９；Ｐａｌｍｏｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．９３，ｐｐ．２７９−２８７；各文献はすべての目的のためにその全体を参照として援用する）。一実施形態において、第一胃の試料は、すべての目的のためにその全体を参照として本明細書に援用するＪｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１，ｐｐ．４６９７−４７１０に記載のプロセスによって採取した。
別の実施形態では、試料は土壌試料（例えば、バルク土壌または根圏試料）である。１グラムの土壌には数万種の細菌分類群、最大１０億個の細菌細胞ならびに約２億個の菌糸が含まれていると推定されている（Ｗａｇｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１，ｐｐ．５２６６−５２７０、上記文献はすべての目的のためにその全体を参照として援用する）。細菌、放線菌、真菌、藻類、原生動物及びウイルスはすべて土壌中に見出される。土壌微生物群集の多様性は、土壌微小環境の構造と肥沃度、植物による栄養分の獲得、植物の多様性と生長、ならびに地上と地下の群集間の資源の循環に関係している。したがって、土壌試料中の微生物含量の時系列変化及び活性微生物の共起性（ならびに活性微生物の数）を評価することにより、栄養素獲得及び／または植物多様性などの環境メタデータパラメータに関連する微生物についての洞察が得られる。
一実施形態における土壌試料は、根圏試料、すなわち根分泌物及び関連する土壌微生物に直接影響を受ける土壌の狭い領域である。根圏は、高められた微生物活性が観察され、植物根が栄養素及び成長因子の交換を介して土壌微生物と相互作用する密度の高い区域である（Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２５３−０１４−５５４５−６、上記文献はすべての目的のためにその全体を参照として援用する）。植物が根圏内に多くの化合物を分泌するため、根圏における生物型の解析は、そこで生育する植物の特徴を決定するのに有用である場合がある。
別の実施形態では、試料は、海洋または淡水試料である。海洋水には、１ｍＬあたり最大１００万の微生物と数千種類の微生物型が含まれる。これらの数値は、生産性が高く、有機物や栄養分の負荷が高い沿岸海域では、一桁高い場合がある。海洋微生物は海洋生態系の機能にとって重要であり；生成した二酸化炭素と固定した二酸化炭素のバランスを維持し；Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、珪藻類、ならびにピコ及びナノ植物プランクトンなどの海洋光合成微生物を介して地球上の酸素の５０％以上を産生し；新規生物活性化合物及び代謝経路を提供し；海洋食物網における重要な最下層の栄養段階を占有することによって、魚介類製品の持続可能な供給を保証する。海洋環境で発見される生物として、ウイルス、細菌、古細菌及びいくつかの真核生物が挙げられる。海洋ウイルスは、ウイルス溶解を通じて海洋細菌の集団を制御する上で重要な役割を果たす場合がある。海洋細菌は、他の小さな微生物のための食料源として、ならびに有機物の生産者として重要である。海の水柱全体に見出される古細菌は、外洋性古細菌であり、その豊富さは海洋細菌のそれに匹敵する。
別の実施形態では、試料は、極限環境、すなわち地球上のほとんどの生命体にとって有害な状態にある環境に由来する試料を含む。極限環境下で生育する生物は、好極限性細菌と呼ばれる。古細菌ドメインは、好極限性細菌の周知の例を含んでいるが、細菌ドメインもまた、これらの微生物の代表を含み得る。好極限性細菌として：３以下のｐＨレベルで増殖するａｃｉｄｏｐｈｉｌｅ；９以上のｐＨレベルで増殖するａｌｋａｌｉｐｈｉｌｅ；増殖のために酸素を必要としないＳｐｉｎｏｌｏｒｉｃｕｓ Ｃｉｎｚｉａなどの嫌気性菌；地下深部の地下水で満たされた岩石、亀裂、帯水層及び断層の中の微視的な空間に生息するｃｒｙｐｔｏｅｎｄｏｌｉｔｈ；少なくとも約０．２Ｍの濃度の塩で増殖するｈａｌｏｐｈｉｌｅ；熱水系に見出されるような高温（約８０〜１２２℃）下で増殖するｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ；寒い砂漠の岩の下に生息するｈｙｐｏｌｉｔｈ；黄鉄鉱のような還元鉱物化合物からエネルギーを引き出し、地球化学的サイクルで活性であるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａなどのｌｉｔｈｏａｕｔｏｔｒｏｐｈ；銅、カドミウム、ヒ素及び亜鉛などの高レベルの溶解した重金属に忍容性を有する金属耐性生物；栄養が制限された環境下で生育するｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈ；糖濃度が高い環境で増殖するｏｓｍｏｐｈｉｌｅ；海洋または地下深くに見出されるような高圧下で増殖するｐｉｅｚｏｐｈｉｌｅ（またはｂａｒｏｐｈｉｌｅ）；約−１５℃以下の温度で生存し、増殖し、及び／または生殖するｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ／ｃｒｙｏｐｈｉｌｅ；高レベルの電離放射線に耐性を有する放射線抵抗性生物；４５〜１２２℃の温度で増殖するｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ；極端な乾燥条件下で増殖可能なｘｅｒｏｐｈｉｌｅが挙げられる。Ｐｏｌｙｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅは、１つ以上のカテゴリーの下での極限細菌として適格であり、ｔｈｅｒｍｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｅ（７０〜８０℃の温度及び２〜３のｐＨを好む）を含む生物である。古細菌のＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ群はｔｈｅｒｍｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｅを含む。
試料は、１つ以上のドメイン由来の微生物を含み得る。例えば、一実施形態では、試料は、細菌及び／または真菌（本明細書では細菌または真菌株とも呼ぶ）の異種集団を含む。
試料中の１つ以上の微生物の存在及び絶対細胞数、例えば同じ環境または異なる環境から、及び／または複数の時点にわたって採取した複数の試料中の１つ以上の微生物の絶対細胞数を測定するための本明細書で提供する方法では、１つ以上の微生物は、任意の型のものであり得る。例えば、１つ以上の微生物は、細菌、古細菌、真核生物ドメイン、またはそれらの組合せに由来し得る。細菌及び古細菌は原核生物であり、内部細胞小器官のない非常に単純な細胞構造を有する。細菌は、グラム陽性／外膜なし、グラム陰性／外膜あり及び分類不能な門に分類することができる。古細菌は単細胞微生物のドメインまたは界を構成する。視覚的には細菌と類似しているが、古細菌は、真核生物、特に転写及び翻訳に関与する酵素のものとより密接に関連する遺伝子及びいくつかの代謝経路を有する。古細菌の生化学の他の態様は、細胞膜にエーテル脂質が存在するなど、ユニークなものである。古細菌は、４つの認識される門に分かれる：Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａ、Ａｉｇａｒｃｈａｅｏｔａ、Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ及び Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ。
真核生物のドメインは、核のような膜結合オルガネラによって画定される真核生物を含む。原生動物は単細胞真核生物である。すべての多細胞生物は、動物、植物及び真菌を含む真核生物である。真核生物は：Ｐｒｏｔｉｓｔａ、Ｐｌａｎｔａｅ、Ｆｕｎｇｉ、Ａｎｉｍａｌｉａの４つの界に分類される。しかしながら、いくつかの別の分類が存在する。別の分類は、真核生物を６つの界に分ける：Ｅｘｃａｖａｔａ（様々な鞭毛原虫）；ａｍｏｅｂｏｚｏａ（ｌｏｂｏｓｅ ａｍｏｅｂｏｉｄｓ及びｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ；Ｏｐｉｓｔｈｏｋｏｎｔａ（動物、真菌、ｃｈｏａｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）；Ｒｈｉｚａｒｉａ（Ｆｏｒａｍｉｎｉｆｅｒａ、Ｒａｄｉｏｌａｒｉａ、及び他の様々なａｍｏｅｂｏｉｄ ｐｒｏｔｏｚｏａ）；Ｃｈｒｏｍａｌｖｅｏｌａｔａ（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ（褐藻類、珪藻類）、Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ（またはｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、及びＡｌｖｅｏｌａｔａ）；Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ／Ｐｒｉｍｏｐｌａｎｔａｅ（陸生植物、緑藻類、赤藻類、及び灰色藻）。
真核生物ドメイン内では、真菌は微生物群集において優勢な微生物である。真菌には、ｙｅａｓｔ及びｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉのような微生物ならびによく知られているキノコが含まれる。真菌細胞は、これらの生物のユニークな特徴であるグルカン及びキチンを含む細胞壁を有する。真菌は、共通の祖先を共有するＥｕｍｙｃｏｔａと呼ばれる類縁生物の単一の群を形成する。菌類は１５０万〜５００万種と推定されており、そのうち約５％が公式に分類されている。ほとんどの真菌の細胞は、複数の核を含有し得る菌糸と呼ばれる管状で、細長く、糸状の構造として増殖する。いくつかの種は、出芽または二分裂によって複製される単細胞ｙｅａｓｔとして増殖する。真菌の主要な門（ｐｈｙｌａ）（時には門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と呼ばれる）は、主に生殖構造の特徴に基づいて分類されている。現在、７つの門が提案されている：Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、及びＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ。
本明細書に記載の方法による検出及び定量のための微生物は、ウイルスであってもよい。ウイルスは、他の生物の生細胞内でのみ複製する小さな感染性の物質である。ウイルスは、真核生物、細菌及び古細菌ドメインにおけるすべての型の生命体に感染可能である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られる）は、２つまたは３つの部分からなる：（ｉ）ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る遺伝物質；（ｉｉ）これらの遺伝子を保護するタンパク質コーティング；及びいくつかの場合には（ｉｉｉ）細胞外にある場合にタンパク質コーティングを取り囲む脂質エンベロープ。ウイルスについては、Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒａｌｅｓ、Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓ、Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌｅｓ、及びＴｙｍｏｖｉｒａｌｅｓの７目が確立されている。ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）の、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、逆転写酵素（ＲＴ）を使用する場合も、そうでない場合もある。さらに、ｓｓＲＮＡウイルスは、センス（＋）またはアンチセンス（−）のいずれかであり得る。この分類は、ウイルスを７つのグループに分類する：Ｉ：ｄｓＤＮＡウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスなど）；ＩＩ：（＋）ｓｓＤＮＡウイルス（例えばパルボウイルス）；ＩＩＩ：ｄｓＲＮＡウイルス（例えばレオウイルス）；ＩＶ：（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス）；Ｖ：（−）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）；ＶＩ：ライフサイクルにおいてＤＮＡ中間体を有する（＋）ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、レトロウイルス）；ＶＩＩ：ｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、ヘパドナウイルス）。
本明細書に記載の方法による検出及び定量のための微生物はまた、ウイロイドであり得る。ウイロイドは、知られている中では最も小さい感染性病原体であり、タンパク質コーティングを含まない短鎖環状一本鎖ＲＮＡのみからなる。それらは主に植物病原体であり、そのいくつかは経済的に重要である。 ウイロイドゲノムは、約２４６〜約４６７核酸塩基の範囲の非常に小さいサイズである。
本明細書で提供する方法に従って、試料を処理し、試料中の１つ以上の微生物型の存在を検出する（図１Ｂ、１００１；図２、２００１）。試料中の１つ以上の微生物の生物型の絶対数を測定する（図１Ｂ、１００２；図２、２００２）。 １つ以上の生物型の存在及び少なくとも１つの生物型の絶対数の測定は、並行してまたは連続して行うことができる。例えば、細菌（すなわち、１つの微生物型）及び真菌（すなわち、第二の微生物型）を含む微生物群集を含む試料の場合、一実施形態において、ユーザは、試料中の生物型の１つまたは両方の存在を検出する（図１Ｂ、１００１；図２、２００１）。さらなる実施形態において、ユーザは、試料中の少なくとも１つの生物型の絶対数―この例の場合では、試料中の細菌、真菌またはその組合せの数（図１Ｂ、１００２；図２、２００２）を測定する。
一実施形態では、試料またはその一部をフローサイトメトリー（ＦＣ）分析に供し、１つ以上の微生物型の存在及び／または数を検出する（図１Ｂ、１００１、１００２；図２、２００１、２００２）。フローサイトメーターの一実施形態では、個々の微生物細胞は、少なくとも約３００＊ｓ−１、または少なくとも約５００＊ｓ−１、または少なくとも約１０００＊ｓ−１の速度で照明ゾーンを通過する。しかしながら、当業者であれば、この速度は使用する器具のタイプに応じて様々に異なり得ることを認識するであろう。電子的にゲート制御する検出器は、散乱光の程度を表すパルス振幅を測定する。これらのパルス振幅を、電子的に「ビン（ｂｉｎ）」または「チャネル」にソーティングし、それによって、チャネル数に対して特定の定量的特性（例えば、細胞染色特性、直径、細胞膜）を有する細胞数のヒストグラムを表示することができる。そのような分析は、本明細書中に記載する実施形態において、「微生物型」のビン、例えば細菌、真菌、線虫、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス、ウイロイドなどの各「ビン」における細胞数の測定を可能にする。
一実施形態では、特定の微生物型に特異的な１つ以上の蛍光色素で試料を染色し、フローサイトメーターによる検出、または蛍光顕微鏡検査などの蛍光を利用するいくつかの他の検出及び定量方法を可能にする。本方法により、試料中の所与の生物型の細胞数及び／または細胞体積の定量化が可能になる。さらなる実施形態では、本明細書に記載するように、フローサイトメトリーを利用して、その生物型の酵素発現、細胞表面タンパク質発現などのユニークな第一のマーカー及び／またはユニークな第二のマーカーの存在及び量を測定する。例えば細胞膜染色液からの蛍光に対する光散乱（タンパク質染色もしくはＤＮＡ染色からの蛍光に対する）などの２もしくは３変数ヒストグラムまたは輪郭プロットもまた生成する場合があり、したがって、集団全体における細胞間の関心のある特性の多様性の分布の印象が得られる場合がある。そのようなマルチパラメータのフローサイトメトリーデータの多数のディスプレイは共通して用いられ、それらは本明細書に記載の方法で使用するのに適している。
１つ以上の微生物型の存在及び数を検出するために試料を処理する一実施形態において、顕微鏡検査アッセイを行う（図１Ｂ、１００１、１００２）。一実施形態では、顕微鏡検査は光学顕微鏡法であり、可視光及びレンズシステムを使用して小さな試料の画像を拡大する。デジタル画像は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって捕捉することができる。他の顕微鏡技術として、走査型電子顕微鏡法及び透過型電子顕微鏡法が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。本明細書で提供する態様に従って微生物型を視覚化し、定量化する。
本開示の別の実施形態では、１つ以上の微生物型の存在及び数を検出するために、各試料、またはその一部を蛍光顕微鏡検査に供する。異なる蛍光色素を用いて、試料中の細胞を直接染色し、落射蛍光顕微鏡ならびに上述のフローサイトメトリーを用いて総細胞数を定量化することができる。微生物を定量化するための有用な色素としては、アクリジンオレンジ（ＡＯ）、４，６−ジ−アミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）及び５−シアノ−２，３ ジトリルテトラゾリウムクロライド（ＣＴＣ）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。二つの核酸染色剤を含有するＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（ＢＡＣ−Ｌｉｇｈｔ（商標））などの生存能力染色法によって生存細胞を推定することができる：緑色蛍光ＳＹＴＯ９（商標）色素はすべての膜を浸透し、赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）色素は損傷した膜を浸透する。したがって、損傷した膜を有する細胞は赤く染色され、損傷を受けていない膜を有する細胞は緑色に染色される。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、落射蛍光顕微鏡法を拡張し、特定の生物の迅速な検出及び計数を可能にする。ＦＩＳＨ法は、試料中の生物ＤＮＡに特異的に結合する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（通常は１５〜２５塩基対）を使用し、落射蛍光または共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いた細胞の可視化を可能にする。Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ）法は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、研究対象の微生物から得られたシグナルの強度を増幅することにより、ＦＩＳＨ法を向上させる。ＦＩＳＨ法を他の技術と組み合わせて、微生物群集を特徴づけることができる。組合せ技術の１つは、高親和性ペプチド核酸（ＰＮＡ）−ＦＩＳＨ法であり、そこでは、プローブは、細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）マトリックスを透過するための強化された能力を有する。もう１つの例は、細胞生存率キットとＦＩＳＨ法を組み合わせたＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ−ＦＩＳＨ法であり、飲料水分配システムの消毒効率を評価するために使用されている。
別の実施形態では、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の絶対数を測定するために、各試料、またはその一部をラマンマイクロ分光法に供する（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。ラマンマイクロ分光法は、単一細胞のラマンスペクトル（ＳＣＲＳ）を検出し測定することができる非破壊及び標識フリーの技術である。一般的なＳＣＲＳは、単一細胞の本質的な生化学的「フィンガープリント」を提供する。ＳＣＲＳは、核酸、タンパク質、炭水化物及び脂質を含む、内部の生体分子の豊富な情報を含み、それにより、異なる細胞種、生理学的変化及び細胞表現型の特徴付けを可能にする。ラマン顕微鏡検査は、異なる細胞バイオマーカーの化学結合によるレーザー光の散乱を検査する。ＳＣＲＳは、１つの単一細胞内のすべての生体分子のスペクトルの合計であり、細胞の表現型特性を示す。細胞表現型は、遺伝子発現の結果として、通常、遺伝子型を反映する。したがって、同一の生育条件下で、異なる微生物型は、それらの遺伝子型の相違に対応する異なるＳＣＲＳを与え、したがって、それらを、それらのラマンスペクトルによって同定することができる。
さらに別の実施形態では、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を測定するために、試料、またはその一部を遠心分離に供する（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。このプロセスは、遠心分離機によって生成される遠心力を用いて異種混合物を沈降させる。混合物のより稠密な成分は遠心分離機の軸から離れて移動し、混合物のより密度の低い成分は軸に向かって移動する。遠心分離は、細胞質、膜及び細胞外部分への試料の分画を可能にすることができる。これはまた、関心対象の生体分子の局在化情報を決定するために使用することもできる。さらに、遠心分離を用いて全微生物群集ＤＮＡを分画することができる。異なる原核生物群はＤＮＡのグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量が異なるため、Ｇ＋Ｃ含量に基づく密度勾配遠心分離は、生物型及び各型に関連する細胞の数に差異を生じさせる方法である。この手法は、全群のＤＮＡの分画した特性を生成し、ＤＮＡの存在量をＧ＋Ｃ含量の関数として示す。全群のＤＮＡは、高度に精製した画分へと物理的に分離され、各々が、異なるＧ＋Ｃ含量を表し、変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）／増幅リボソームＤＮＡ制限酵素切断分析（ＡＲＤＲＡ）（本明細書中の考察参照）のような追加の分子技術によって分析し、微生物群集全体の多様性及び１つ以上の微生物型の存在／量を評価することができる。
別の実施形態では、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を測定するために、試料、またはその一部を染色に供する（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。染色及び色素を用いて、細胞内の生物学的組織、細胞またはオルガネラを視覚化することができる。染色を、顕微鏡法、フローサイトメトリーまたはゲル電気泳動と組み合わせて使用して、異なる微生物型に特有の細胞または生体分子を視覚化またはマーキングすることができる。ｉｎ ｖｉｖｏ染色は、生存組織を染色するプロセスであるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ染色は、その生物学的状況から取り除いた細胞または構造を染色することを含む。本明細書に記載の方法で使用するための特定の染色技術の例として：細菌のグラム状態を判定するためのグラム染色、内生胞子の存在を同定するための内生胞子染色、Ｚｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ染色、組織の薄切片を検査するためのヘマトキシリン及びエオシン染色、様々な体液由来の細胞試料を検査するためのパパニコラウ染色、炭水化物の過ヨウ素酸シッフ染色、周囲の結合組織から細胞を区別するための三色染色プロトコールを用いるマッソントリコーム、血液または骨髄試料を検査するためのロマノフスキー染色（またはＷｒｉｇｈｔの染色、Ｊｅｎｎｅｒの染色、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ染色、Ｌｅｉｓｈｍａｎ染色、及びＧｉｅｍｓａ染色）、タンパク質及びＤＮＡを明らかにするためのシルバー染色、脂質のスーダン染色ならびに真の内生胞子を検出するためのＣｏｎｋｌｉｎの染色が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。一般的な生物学的染色として、細胞周期決定のためのアクリジンオレンジ；酸ムチンのビスマルク・ブラウン；グリコーゲンのカルミン；核に対するアルムカーミン；タンパク質に対するクーマシーブルー；ニューロン細胞質の酸性成分に対するクレシルバイオレット；細胞壁に対するクリスタルバイオレット；核に対するＤＡＰＩ；細胞質物質、細胞膜、いくつかの細胞外構造及び赤血球に対するエオシン；ＤＮＡに対する臭化エチジウム；コラーゲン、平滑筋またはミトコンドリアに対する酸性フクシン；核に対するヘマトキシリン；ＤＮＡに対するヘキスト染色、デンプンに対するヨウ素；ジネネズ染色技術においては細菌に対して、及び胞子に対してのマラカイトグリーン；クロマチンに対するメチルグリーン；動物細胞に対するメチレンブルー；Ｎｉｓｓｌ物質に対するニュートラルレッド；核に対するナイルブルー；親油性実体に対するナイルレッド；脂質に対する四酸化オスミウム；蛍光顕微鏡法で使用するローダミン；核に対するサフラニンが挙げられる。染色は、コントラストを高めるために透過型電子顕微鏡にも使用され、例えば、リンタングステン酸、四酸化オスミウム、四酸化ルテニウム、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カドミウム、カルボヒドラジド、塩化第二鉄、ヘキサミン、三塩化インジウム、硝酸ランタン、酢酸鉛、クエン酸鉛、硝酸鉛（ＩＩ）、過ヨウ素酸、リン酸モリブデン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、プロテイン銀、塩化金酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、及び硫酸バナジルが挙げられる。
別の実施形態では、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を測定するために、試料、またはその一部を質量分析（ＭＳ）に供する（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。ＭＳは、以下に議論するように、試料中の１つ以上のユニークなマーカーの存在及び発現を検出するために使用することもできる（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。例えば、微生物型に特有のタンパク質及び／またはペプチドマーカーの存在及び量を検出し、それによって試料中のそれぞれの微生物型の数の評価を提供するために、ＭＳを用いる。定量化は、安定な同位体標識または標識フリーのいずれかで行うことができる。ペプチドの新規配列決定は、ＭＳ／ＭＳスペクトルまたは配列タグ化（データベースと照合可能な短いタグを生成する）から直接行うこともできる。ＭＳは、タンパク質の翻訳後修飾を明らかにし、代謝産物を同定することもできる。ＭＳは、クロマトグラフィー及び他の分離技術（ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、イオン移動度など）と併用して、質量分解能及び定量性を高めることができる。
別の実施形態では、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を測定するために、試料、またはその一部を脂質分析に供する（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。脂肪酸は細胞バイオマスの比較的一定割合で存在し、シグネチャーとなる脂肪酸が微生物細胞に存在し、それによって群内の微生物型を区別することができる。一実施形態では、鹸化により脂肪酸を抽出し、続いて誘導体化してそれぞれの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を取得し、これをガスクロマトグラフィーで分析する。次いで、一実施形態におけるＦＡＭＥ特性を、参照ＦＡＭＥデータベースと比較し、多変量統計解析によって脂肪酸及びそれらの対応する微生物シグネチャーを同定する。
本明細書で提供する方法の態様では、試料中のユニークな第一のマーカーまたはその一部の数（例えば、試料アリコート）ならびにユニークな第一のマーカーのそれぞれの量を測定する（図１Ｂ、１００３；図２、２００３）。ユニークなマーカーは、微生物株のマーカーである。当業者であれば、プロービングし、測定したユニークなマーカーに応じて、試料全体を分析する必要がないことを理解すべきである。例えば、ユニークなマーカーが細菌株にユニークである場合、試料の真菌部分は分析する必要はない。上述のように、いくつかの実施形態では、試料中の１つ以上の生物型の絶対細胞数を測定することは、例えばフローサイトメトリーを介して生物型によって試料を分離することを含む。
生物株にユニークな任意のマーカーを本明細書において用いることができる。例えば、マーカーとして、小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ／１８Ｓ ｒＤＮＡ）、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（２３Ｓ／２５Ｓ／２８Ｓ ｒＤＮＡ）、介在性５．８Ｓ遺伝子、チトクロムｃオキシダーゼ、βチューブリン、伸長因子、ＲＮＡポリメラーゼ及び内部転写スペーサー（ＩＴＳ）を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）、特に小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子、すなわち、真核生物の場合は１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１８Ｓ ｒＤＮＡ）、原核生物の場合は１６Ｓ ｒＲＮＡ（１６Ｓ ｒＤＮＡ）が、微生物群集における微生物型と株の評価のための主なターゲットである。しかしながら、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子である２８Ｓ ｒＤＮＡもまた標的とされている。ｒＤＮＡは分類学的同定に適しており、なぜなら：（ｉ）それらはすべての公知の生物に偏在しており；（ｉｉ）それらは保存領域と可変領域の両方を有し；（ｉｉｉ）比較のために利用可能なそれらの配列の指数関数的に拡張されたデータベースが存在するからである。試料の群解析では、保存領域は、対応するユニバーサルＰＣＲ及び／または配列決定プライマーのためのアニーリングサイトとして機能し、可変領域は系統発生分化に使用することができる。さらに、細胞中のｒＤＮＡの高いコピー数は、環境試料からの検出を容易にする。
１８Ｓ ｒＤＮＡと２８Ｓ ｒＤＮＡとの間に位置する内部転写スペーサー（ＩＴＳ）も標的とされている。ＩＴＳは転写されるが、リボソームの組立て前にスプライシングされる。ＩＴＳ領域は、２つの非常に可変性のスペーサー、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２、ならびに介在性５．８Ｓ遺伝子からなる。このｒＤＮＡオペロンは、ゲノム中の複数コピーで生じる。ＩＴＳ領域はリボソーム成分をコードしないため、可変性が高い。
一実施形態では、ユニークなＲＮＡマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカーまたはリボソームＲＮＡマーカーであり得る。
タンパク質をコードする機能的遺伝子もまた、本明細書においてユニークな第一のマーカーとして用いることができる。そのようなマーカーとして：リコンビナーゼＡ遺伝子ファミリー（細菌ＲｅｃＡ、古細菌ＲａｄＡ及びＲａｄＢ、真核生物Ｒａｄ５１及びＲａｄ５７、ファージＵｖｓＸ）；転写開始及び伸長に関与するＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（ＲｐｏＢ）遺伝子；シャペロニンが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。細菌＋古細菌に対する候補マーカー遺伝子もまた同定されている：リボソームタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ｒｐｓＪ）、リボソームタンパク質Ｌ１（ｒｐｌＡ）、翻訳伸長因子ＥＦ−２、翻訳開始因子ＩＦ−２、メタロエンドペプチダーゼ、リボソームタンパク質Ｌ２２、ｆｆｈシグナル認識粒子タンパク質、リボソームタンパク質Ｌ４／Ｌ１ｅ（ｒｐｌＤ）、リボソームタンパク質Ｌ２（ｒｐｌＢ）、リボソームタンパク質Ｓ９（ｒｐｓＩ）、リボソームタンパク質Ｌ３（ｒｐｌＣ）、フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼβサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１４ｂ／Ｌ２３ｅ（ｒｐｌＮ）、リボソームタンパク質Ｓ５、リボソームタンパク質Ｓ１９（ｒｐｓＳ）、リボソームタンパク質Ｓ７、リボソームタンパク質Ｌ１６／Ｌ１０Ｅ（ｒｐｌＰ）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ｒｐｓＭ）、フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼαサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１５、リボソームタンパク質Ｌ２５／Ｌ２３、リボソームタンパク質Ｌ６（ｒｐｌＦ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ｒｐｌＫ）、リボソームタンパク質Ｌ５（ｒｐｌＥ）、リボソームタンパク質Ｓ１２／Ｓ２３、リボソームタンパク質Ｌ２９、リボソームタンパク質Ｓ３（ｒｐｓＣ）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ｒｐｓＫ）、リボソームタンパク質Ｌ１０、リボソームタンパク質Ｓ８、ｔＲＮＡシュードウリジンシンターゼＢ、リボソームタンパク質Ｌ１８Ｐ／Ｌ５Ｅ、リボソームタンパク質Ｓ１５Ｐ／Ｓ１３ｅ、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素、リボソームタンパク質Ｓ１７、リボソームタンパク質Ｌ１３（ｒｐｌＭ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼ（ｒｐｓＥ）、リボヌクレアーゼＨＩＩ及びリボソームタンパク質Ｌ２４。細菌に対する他の候補マーカー遺伝子として：転写伸長タンパク質ＮｕｓＡ（ｎｕｓＡ）、ｒｐｏＢ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットβ（ｒｐｏＢ）、ＧＴＰ結合タンパク質ＥｎｇＡ、ｒｐｏＣ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットβ’、ｐｒｉＡプリモゾーム集合タンパク質、転写共役修復因子、ＣＴＰシンターゼ（ｐｙｒＧ）、ｓｅｃＹタンパク質前駆体トランスロカーゼサブユニットＳｅｃＹ、ＧＴＰ結合タンパク質Ｏｂｇ／ＣｇｔＡ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ｒｐｓＦ ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６、ｐｏＡ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットα、ペプチド鎖解離因子１、ｒｐｌＩ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ９、ポリリボヌクレオチド・ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ｔｓｆ伸長因子Ｔｓ（ｔｓｆ）、ｒｐｌＱ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１７、ｔＲＮＡ（グアニン−Ｎ（１）−）−メチルトランスフェラーゼ（ｒｐｌＳ）、ｒｐｌＹ 予想５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２５、ＤＮＡ修復タンパク質ＲａｄＡ、グルコース阻害分裂タンパク質Ａ、リボソーム結合因子Ａ、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＬ、ｓｍｐＢ ＳｓｒＡ結合タンパク質（ｓｍｐＢ）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシルメチルトランスフェラーゼＭｒａＷ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニン−Ｄ−グルタミン酸リガーゼ、ｒｐｌＳ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１９、ｒｐｌＴ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２０（ｒｐｌＴ）、ｒｕｖＡ ホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼ、ｒｕｖＢ ホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼＢ、ｓｅｒＳ セリルｔＲＮＡシンテターゼ、ｒｐｌＵ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２１、ｒｐｓＲ ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１８、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ、ｒｐｓＴ ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２０、ＤＮＡ修復タンパク質ＲｅｃＮ、ｆｒｒリボソームリサイクル因子（ｆｒｒ）、組換えタンパク質ＲｅｃＲ、機能不明のタンパク質ＵＰＦ００５４、ｍｉａＡ ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質ＹｃｈＦ、染色体複製開始タンパク質ＤｎａＡ、デホスホ−ＣｏＡキナーゼ、１６Ｓ ｒＲＮＡプロセシングタンパク質ＲｉｍＭ、ＡＴＰ−コーンドメインタンパク質、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、脂肪酸／リン脂質合成タンパク質ＰｌｓＸ、ｔＲＮＡ（Ｉｌｅ）−ライシジン合成酵素、ｄｎａＧ ＤＮＡプライマーゼ（ｄｎａＧ）、ｒｕｖＣ ホリデイジャンクションリゾルバーゼ、ｒｐｓＰ ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１６、リコンビナーゼＡ ｒｅｃＡ、リボフラビン生合成タンパク質ＲｉｂＦ、グリシルｔＲＮＡシンテターゼβサブユニット、ｔｒｍＵ ｔＲＮＡ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジル酸）−メチルトランスフェラーゼ、ｒｐｍＩ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３５、ｈｅｍＥ ウロポルフィリノーゲン・デカルボキシラーゼ、Ｒｏｄ ｓｈａｐｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｒｐｍＡ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７（ｒｐｍＡ）、ペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ、翻訳開始因子ＩＦ−３（ｉｎｆＣ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−トリペプチドシンテターゼ、ｒｐｍＦ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２、ｒｐＩＬ ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（ｒｐＩＬ）、ｌｅｕＳ ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ、ｌｉｇＡ ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ、細胞分裂タンパク質ＦｔｓＡ、ＧＴＰ結合タンパク質ＴｙｐＡ、ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼ、ＡＴＰ結合サブユニットＣｌｐＸ、ＤＮＡ複製及び修復タンパク質ＲｅｃＦならびにＵＤＰ−Ｎ−アセチレノールピルボイルグルコサミンレダクターゼが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ）もまた、本明細書に記載する方法に従ったユニークな第一のマーカーとして使用してもよい。ＰＬＦＡは、微生物の増殖中に迅速に合成され、貯蔵分子中には見出されず、細胞死の過程で急速に分解するため、現在の生活環境の正確な全数調査を提供する。すべての細胞は脂肪酸（ＦＡ）を含有しており、これを抽出してエステル化し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を形成することができる。ＦＡＭＥをガスクロマトグラフィー−質量分析法を用いて分析する場合、得られるプロファイルは、試料中の微生物の「指紋」を構成する。細菌及び真核生物ドメインにおける生体細胞膜の化学組成は、エステル型結合（リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ））によってグリセロールに結合した脂肪酸からなる。対照的に、古細菌の膜脂質は、エーテル型結合（リン脂質エーテル脂質（ＰＬＥＬ））によってグリセロールに結合した長鎖及び分枝炭化水素からなる。これは、３つのドメインを区別するために最も広く使用される非遺伝学的基準の１つである。これに関連して、様々なアシル鎖を特徴とする微生物細胞膜に由来するリン脂質は、そのような脂質構造の多様性が特定の微生物分類群に関連し得るため、優れたシグネチャー分子である。
本明細書で提供するように、生物株が活性であるかどうかを判定するために、第一のマーカーと同じかまたは異なり得る１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ユニークな第一のマーカーは上記に記載されている。ユニークな第二のマーカーは、微生物活性のマーカーである。例えば、一実施形態では、上記の第一のマーカーのいずれかのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、本開示の目的のためのユニークな第二のマーカーとみなされる。
一実施形態では、第二のマーカーの発現レベルが、閾値レベル（例えば、対照レベル）を上回る場合、または閾値レベルにある場合、微生物は活性であるとみなされる（図１Ｂ、１００５；図２、２００５）。一実施形態では、活性は、第二のマーカーの発現レベルが、いくつかの実施形態では対照レベルである閾値レベルに比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％変動するかどうかで判定する。
一実施形態では、タンパク質、ＲＮＡまたは代謝産物のレベルで第二のユニークなマーカーを測定する。ユニークな第二のマーカーは、第一のマーカーと同じかまたは異なる。
上記で提供するように、本明細書に記載の方法により、いくつかのユニークな第一のマーカー及びユニークな第二のマーカーを検出することができる。さらに、ユニークな第一のマーカーの検出及び定量は、当業者に周知の方法に従って実施する（図１Ｂ、１００３〜１００４、図２、２００３〜２００４）。
一実施形態において、核酸配列決定（例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を利用して、ユニークな第一のマーカー及び／またはユニークな第二のマーカーの絶対細胞数を決定する。配列決定プラットフォームとして、Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ及びＮａｎｏｐｏｒｅから利用可能なサンガー配列決定法及びハイスループット配列決定法が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。配列決定法は、特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列のアンプリコンシークエンシングまたは全メタゲノム／トランスクリプトームのショットガンシークエンシングであり得る。
伝統的なサンガー配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，ｐｐ．５４６３−５４６７、上記文献はその全体を参照として本明細書に援用する）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ複製中のＤＮＡポリメラーゼによる鎖終結ジデオキシヌクレオチドの選択的組込みに依存しており、本明細書に記載の方法で使用するのに適している。
別の実施形態では、試料、またはその一部を、核酸の抽出、関心対象のＤＮＡ（ｒＲＮＡ遺伝子など）の適切なプライマーによる増幅、及び配列決定用ベクターを用いたクローンライブラリーの構築に供する。次いで、選択したクローンをサンガー配列決定法により配列決定し、関心対象のＤＮＡのヌクレオチド配列を引き出し、これにより、試料中のユニークな微生物株の数を計算することができる。
Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによる４５４ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、長い読み取り結果が得られ、本明細書に記載の方法で利用可能である（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３７，ｐｐ．３７６−３８０；米国特許第６，２７４，３２０号；第６，２５８，５６８号；第６，２１０，８９１号、これらの各々は、すべての目的のためにその全体を本明細書に援用する）。配列決定する核酸（例えば、アンプリコンまたは噴霧したゲノム／メタゲノムＤＮＡ）は、ＰＣＲまたはライゲーションによっていずれかの末端に付加した特異的アダプターを有する。アダプターを有するＤＮＡを、油中水型エマルジョン中に懸濁した小さなビーズ（理想的には、１つのビーズが１つのＤＮＡ断片を有する）に固定する。次いで、エマルジョンＰＣＲ工程を実施して、各ＤＮＡ断片の複数のコピーを作製し、それによって、各ビーズが同じＤＮＡ断片の多くのクローン化コピーを有するビーズのセットを得る。次いで、各ビーズを、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ反応に必要な酵素を含有する光ファイバーチップのウェルに入れる。塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴなど）の添加はピロリン酸の放出を引き起こし、これにより光のフラッシュを生成し、これを記録して各ウェルのＤＮＡ断片の配列を推定する。最大１，０００塩基長の読み取りによって約１００万回の読み取りを達成することができる。Ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行うことができ、これにより、それぞれが所与のＤＮＡ断片の一方の末端で始まる一対の読み取り結果を生成する。分子バーコードを作成し、多重反応中でアダプター配列と関心のある配列との間に配置して、各配列をバイオインフォマティクス的に試料に割り当てることができる。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ配列決定法は、約２５塩基対（ｂｐ）〜約３００ｂｐの平均読み取り長を生じる（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，６：３７３−３８２；Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５，ｐ．６３；Ｆａｄｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ２，ｐ．６；Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＩＳＭＥ Ｊ，６，ｐ．１６２１−１６２４；Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ａｃｃｕｒａｔｅ ｗｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９）。この配列決定技術もまた、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法であるが、可逆的色素ターミネーターと、オリゴ結合領域を有するフローセルとを使用する。配列決定するＤＮＡ断片は、いずれかの末端に特異的なアダプターを有し、断片の末端にハイブリダイズする特異的オリゴヌクレオチドで満たしたフローセル上でこれを洗浄する。次に、各断片を複製して、同一断片のクラスターを作製する。次いで、可逆的色素ターミネーターヌクレオチドをフローセル上で洗浄し、所定の時間付着させる。余分なヌクレオチドを洗い流し、フローセルを画像化し、可逆的ターミネーターを除去し、これによってプロセスを繰り返すことができ、続くサイクルでヌクレオチドを添加し続けることができる。それぞれ長さ３００塩基のＰａｉｒｅｄ−ｅｎｄ読み取り結果を達成することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームは、１回の操作でそれぞれの読み取り結果ごとに１２５塩基を有する４０億個の断片をＰａｉｒｅｄ−ｅｎｄ方式で生成することができる。バーコードも試料の多重化に用いることができるが、インデキシングプライマーを用いる。
ＳＯＬｉＤ（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プロセスは、「ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ」アプローチであり、第一のマーカー及び／または第二のマーカーの存在及び量を検出するために、本明細書に記載の方法とともに使用することができる（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）（Ｐｅｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ． ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ２−Ｂａｓｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７；Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｕｓｉｎｇ ＳＯＬｉＤ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＳＯＬｉＤ ｓｈｏｔｇｕｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４（Ｓｕｐｐｌ ５）：Ｓ１６；Ｍａｒｄｉｓ（２００８）Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，９：３８７−４０２；上記文献の各々は、その全体を参照として本明細書に援用する）。配列決定しようとする試料からＤＮＡ断片のライブラリーを調製し、これを用いてクローンビーズ集団を調製し、そこでは各ビーズの表面上にはただ１種の断片のみが存在する。磁気ビーズに付着した断片は、ユニバーサルＰ１アダプター配列を有するため、各断片の開始配列は既知であり、同一である。プライマーは、ライブラリー鋳型内のＰ１アダプター配列にハイブリダイズする。４つの蛍光標識した２塩基プローブのセットは、配列決定用プライマーへのライゲーションに対して競合する。２塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応において第一及び第二塩基ごとに調べることによって達成される。最終的な読取り長を決定するサイクル数で、ライゲーション、検出及び切断の複数のサイクルを実施する。ＳＯＬｉＤプラットフォームは、１回の実行当たり最大３０億回の読取り結果を生成し、７５塩基長の読取りが可能である。本明細書においてＰａｉｒｅｄ−ｅｎｄ配列決定法が利用可能であり、用いることができるが、ペアの第二の読取りはわずか３５塩基長である。Ｉｌｌｕｍｉｎａで使用されているシステムに似たシステムを使用して、試料の多重化が可能であり、別々のインデキシングの実行が可能である。
Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは、４５４ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法のように、第一のマーカー及び／または第二のマーカーの存在及び量を検出するための本明細書に記載の方法で使用するのに適している（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。このシステムは、ＤＮＡ断片が結合したビーズを含有するマイクロウェルプレートを使用する。しかしながら、このシステムは、塩基の組込みを検出する方式であるという点において、他のすべてのシステムと異なっている。伸長中のＤＮＡ鎖に塩基が付加されると、プロトンが遊離し、周囲のｐＨをわずかに変化させる。ｐＨ感受性の高いマイクロ検出器がプレート上のウェルに連結しており、検出器はこれらの変化が起こった場合にそれを記録する。ウェル上で異なる塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を順次洗浄し、それによって各ウェルに由来する配列を推定することができる。Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームは、２００塩基の読取り長を有する最大５千万の読取りを、１回の実行あたりに生成することができる。Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅプラットフォームは、より長い４００塩基の読取り長を有する。二方向の配列決定が利用可能である。標準的なインライン分子バーコード配列決定法により、多重化が可能である。
Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）ＳＭＲＴ配列決定法は、単一分子のリアルタイム配列決定アプローチを用い、一実施形態では、第一のマーカー及び／または第二のマーカーの存在及び量を検出するために、本明細書に記載の方法とともに用いられる（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＰａｃＢｉｏ配列決定システムは増幅工程を必要とせず、この点において他の主要な次世代シークエンシングシステムとは異なるものとなっている。一実施形態では、多くのゼロモード導波路（ＺＭＷ）検出器を含有するチップ上で配列決定を実行する。ＤＮＡポリメラーゼがＺＭＷ検出器に結合し、ＤＮＡ鎖の合成に伴って、リン酸化した色素標識ヌクレオチドの組込みをリアルタイムで画像化する。ＰａｃＢｉｏシステムでは、非常に長い読取り長（平均約４，６００塩基）、及び１回の実行あたりの非常に高い読取り回数（約４７，０００）が得られる。ＣＣＳを介して断片を各末端から独立して配列決定する必要なく、読取りが、通常、複数回にわたってカバーできるほど十分に長いことから、ＰａｃＢｉｏでは一般的な「ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ」アプローチは用いない。ＰａｃＢｉｏによる多重化は、独立した読取りを伴わず、むしろ標準の「インライン」バーコードモデルに従う。
第一のユニークなマーカーがＩＴＳゲノム領域である一実施形態において、試料中の微生物株の数及び同一性を判定するために、一実施形態では自動リボソーム間遺伝子スペーサー分析（ＡＲＩＳＡ）を使用する（図１Ｂ、１００３、図２、２００３）（Ｒａｎｊａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００３）． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５，ｐｐ．１１１１−１１２０、すべての目的のためにその全体を参照として援用する）。ＩＴＳ領域は、長さ及びヌクレオチド配列の両方において有意な異種性を有する。蛍光標識フォワードプライマーと自動ＤＮＡシークエンサーを使用することで、高分離能と高スループットが実現可能になる。各試料に内部標準を含めることで、一般的な断片のサイジングが正確になる。
別の実施形態では、増幅したリボソームＤＮＡの制限酵素切断分析（ＡＲＤＲＡ）としても知られるＰＣＲ増幅ｒＤＮＡ断片の断片長多型（ＲＦＬＰ）を用いて、試料中のユニークな第一のマーカーとそれらの量を特徴付ける。（図１Ｂ、１００３、図２、２００３）（詳細は、Ｍａｓｓｏｌ−Ｄｅｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）． Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｍａｎｕａｌ．３．３．２，ｐｐ．１−１８を参照されたく、上記文献はすべての目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する）。一般的なプライマーを用いたＰＣＲによってｒＤＮＡ断片を生成し、制限酵素で消化し、アガロースまたはアクリルアミドゲル中で電気泳動し、臭化エチジウムまたは硝酸銀で染色する。
ユニークな第一のマーカーの存在及び存在量の検出に使用する１つのフィンガープリンティング技術は、一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ）である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６２，ｐｐ．３１１２−３１２０；Ｓｃｈｅｉｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）． Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６，ｐｐ．１０３−１１７；Ｓｃｈｗｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｔｅｂｂｅ（１９９８）． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，ｐｐ．４８７０−４８７６、これらの文献の各々は、その全体を参照として本明細書に援用する）。本技術では、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物などのＤＮＡ断片を変性させ、非変性ゲル上で直接電気泳動する。分離は、電気泳動移動度に影響を及ぼす一本鎖ＤＮＡのサイズ及び折り畳みコンフォメーションの差異に基づいている。電気泳動中のＤＮＡ鎖の再アニーリングは、ＰＣＲにおいて片方にリン酸化プライマーを使用し、続いてλエキソヌクレアーゼによってリン酸化鎖を特異的に消化すること、及び単一のビオチン化プライマーを使用して、変性後に片方の一本鎖を磁気で分離することを含む多くの戦略によって防止することができる。所与の微生物群集における優勢な集団の同一性を評価するために、一実施形態では、バンドを切り出して配列決定するか、またはＳＳＣＰパターンを特異的プローブにハイブリダイズさせることができる。ゲルマトリックス、温度、及びグリセロールのゲルへの添加などの電気泳動条件は、分離に影響を及ぼし得る。
配列決定に基づく方法に加えて、第二のマーカーの発現（例えば、遺伝子、タンパク質の発現）を定量化するための他の方法は、１つ以上の第二のマーカーの発現レベルを測定するための本明細書で提供する方法とともに使用するのに適している（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などのリニア増幅技術はすべて、本明細書に記載の方法とともに使用するのに適しており、当業者に周知の方法に従って実施することができる。
別の実施形態において、試料、またはその一部を、第一のマーカー及び／または第二のマーカーの存在及び量を検出するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供する（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。転写されたリボソーム及び／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ）の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写と、それに続くＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、特定の微生物株の活性を測定する。
別の実施形態では、試料、またはその一部を、第一のマーカー及び／または第二のマーカーの存在及び量を検出するためにＰＣＲベースのフィンガープリンティング技術に供する（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＰＣＲ産物は、ヌクレオチド組成に基づいて電気泳動によって分離することができる。異なるＤＮＡ分子間の配列の差異は融解挙動に影響を及ぼし、したがって、異なる配列を有する分子は、ゲル中の異なる位置で移動を停止する。したがって、異なるバンドまたはピークの位置及び相対強度によって電気泳動特性を定義することができ、多様性指標の計算のために数値データに変換することができる。バンドをゲルから切除し、続いて配列決定して、群のメンバーの系統学的所属を明らかにすることもできる。電気泳動法として：変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型解析（ＲＦＬＰ）または増幅リボソームＤＮＡ制限酵素切断解析（ＡＲＤＲＡ）、末端制限断片長多型解析（Ｔ−ＲＦＬＰ）、自動リボソーム間遺伝子スペーサー分析（ＡＲＩＳＡ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）及びＢｂ−ＰＥＧ電気泳動が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
別の実施形態では、試料、またはその一部を、マイクロアレイまたはマイクロ流体などのチップベースのプラットフォームに供し、ユニークな第一のマーカーの量及び／またはユニークな第二のマーカーの存在／量を測定する（図１Ｂ、１００３〜１００４、図２、２００３〜２００４）。試料中の全ＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅し、マイクロアレイに固定化した既知の分子プローブに直接ハイブリダイズさせる。蛍光標識したＰＣＲアンプリコンをプローブにハイブリダイズさせた後、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて陽性シグナルを記録する。マイクロアレイ技術により、複製とともに迅速に試料を評価することが可能になり、これは微生物群集解析において有意な利点である。マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルの強度は、標的生物の量に正比例する。普遍的な高密度１６Ｓマイクロアレイ（例えば、ＰＨＹＬＯＣＨＩＰ）は、いくつかの培養した微生物種及び「候補門」を標的とする約３０，０００の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のプローブを含有する。これらのプローブは、１２１種類のすべての画定した原核生物の配列を標的とし、８，７４１種の細菌及び古細菌分類を同時に検出することを可能にする。微生物群集をプロファイリングするために使用する別のマイクロアレイは、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ（ＦＧＡ）である。ＰＨＹＬＯＣＨＰとは異なり、ＦＧＡは主に特定の代謝群の細菌を検出するように設計されている。したがって、ＦＧＡは群集の構造を明らかにするだけでなく、ｉｎ ｓｉｔｕでの群集の代謝の潜在能力についても明らかにする。ＦＧＡは、その生物学的機能が公知である遺伝子由来のプローブを含むため、微生物の群集組成を生態系機能に結びつけるのに有用である。ＧＥＯＣＨＩＰと名付けられたＦＧＡは、アンモニア酸化、メタン酸化、及び窒素固定などの様々な生物化学的、生態学的、及び環境的プロセスに関与するすべての公知の代謝遺伝子由来の２４，０００を上回るプローブを含む。
一実施形態において、タンパク質発現アッセイを、１つ以上の第二のマーカーの発現レベルを測定するために、本明細書に記載の方法とともに使用する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。例えば、一実施形態では、質量分析、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイを利用して、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを定量化し、そこにおいて１つ以上のユニークな第二のマーカーはタンパク質である。
一実施形態では、試料、またはその一部をブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組込みに供し、第二のユニークなマーカーのレベルを測定する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。チミジンの合成ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵを、複製細胞の新規合成ＤＮＡに組み込むことができる。次いで、ＢＲｄＵに特異的な抗体を、塩基類似体の検出に使用することができる。したがって、ＢｒｄＵの組込みは、本明細書に記載の方法の一実施形態による微生物の活性の尺度であるＤＮＡを活発に複製している細胞を同定する。ＢｒｄＵ組込みをＦＩＳＨと組み合わせて使用し、標的細胞の同一性及び活性を提供することができる。
一実施形態では、試料、またはその一部を、ＦＩＳＨと組み合わせたミクロオートラジオグラフィー（ＭＡＲ）に供し、第二のユニークなマーカーのレベルを測定する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＭＡＲ−ＦＩＳＨは、放射性基質の細胞への取り込み、オートラジオグラフィーを用いた活性細胞の検出、及びＦＩＳＨを用いた細胞の同定に基づいている。顕微鏡を用いて、単一細胞の分解能での活性細胞の検出及び同定を行う。ＭＡＲ−ＦＩＳＨは、全細胞、プローブ標的細胞及び所定の放射性標識物質を取り込んだ細胞の割合に関する情報を提供する。本方法は、標的化微生物のｉｎ ｓｉｔｕ機能の評価を提供し、微生物のｉｎ ｖｉｖｏ生理学を研究する有効なアプローチである。ＭＡＲ−ＦＩＳＨと組み合わせた細胞特異的な基質の取込みを定量化するために開発された技術は、定量的ＭＡＲ（ＱＭＡＲ）として公知である。
一実施形態では、試料、またはその一部を、ＦＩＳＨ（ラマンＦＩＳＨ）と組み合わせた安定同位体ラマン分光法に供して、第二のユニークなマーカーのレベルを測定する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。本技術は、安定同位体のプロービング、ラマン分光法及びＦＩＳＨを組み合わせて、代謝プロセスを特定の生物と関連付ける。細胞が安定同位体を取り込む割合は、光散乱に影響を与え、タンパク質及びｍＲＮＡ成分を含む標識した細胞成分のピークを測定可能なレベルでシフトさせる。ラマン分光法を用いて、細胞が、以下の化合物を含むが必ずしもこれらに限定されない化合物を合成するかどうかを同定することができる：油（アルカンなど）、脂質（トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）など）、特定タンパク質（ヘムタンパク質、メタロタンパク質など）、チトクロム（Ｐ４５０、チトクロムｃなど）、クロロフィル、発色団（集光性色素カロテノイド及びロドプシンなど）、有機ポリマー（ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリヒドロキシブチラート（ＰＨＢ））、ホパノイド、ステロイド、デンプン、硫化物、硫酸塩ならびに二次代謝産物（例えば、ビタミンＢ１２など）。
一実施形態では、試料、またはその一部を、ＤＮＡ／ＲＮＡ安定同位体プロービング（ＳＩＰ）に供し、第二のユニークなマーカーのレベルを測定する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＳＩＰにより、特定の代謝経路に関連する微生物多様性を測定することが可能になり、ＳＩＰは、炭素及び窒素化合物の利用に関与する微生物の研究に一般的に用いられている。関心対象の基質を安定同位体（例えば１３Ｃまたは１５Ｎ）で標識し、試料に加える。基質を代謝することができる微生物のみが、それらをその細胞内に取り込む。続いて、１３Ｃ−ＤＮＡ及び１５Ｎ−ＤＮＡを密度勾配遠心分離によって単離し、メタゲノム解析に用いることができる。ＲＮＡそのものは細胞の活動の反映であるため、ＲＮＡベースのＳＩＰは、ＳＩＰ研究での使用に応答性の高いバイオマーカーである可能性がある。
一実施形態では、試料、またはその一部を同位体アレイに供して、第二のユニークなマーカーのレベルを測定する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。同位体アレイにより、ハイスループット方式での活性な微生物群集の機能的及び系統発生的スクリーニングが可能になる。本技術は、基質取り込み特性をモニタリングするためのＳＩＰと、活性な微生物群集の分類学的同一性を決定するためのマイクロアレイ技術を組み合わせて用いる。増殖中に微生物バイオマスに取り込まれる１４Ｃ標識基質とともに試料をインキュベートする。１４Ｃ標識ｒＲＮＡを未標識ｒＲＮＡから分離し、次いで蛍光色素で標識する。蛍光標識したｒＲＮＡを系統発生マイクロアレイにハイブリダイズさせた後、放射性及び蛍光シグナルをスキャンする。したがって、本技術により、複合微生物群集の代謝的に活性な微生物による微生物群集の組成と特定の基質の消費を同時に調べることが可能になる。
一実施形態では、試料、またはその一部をメタボロミクスアッセイに供し、第二のユニークなマーカーのレベルを測定する（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。メタボロミクスは、生物学的細胞、組織、器官または生物における、細胞プロセスの最終生成物であるすべての代謝産物の集合を表すメタボロームについて調べる。本方法は、特定の代謝産物特性を異なる微生物に関連付けることができるため、本方法を用いて微生物及び／または微生物を介したプロセスの存在をモニタリングすることができる。ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）などの技術を用いて、微生物活性に関連する細胞内及び細胞外代謝産物の特性を得ることができる。メタボローム試料の複雑な混合物を、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動などの技術によって分離することができる。代謝産物の検出は、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、イオン移動度分光法、電気化学的検出（ＨＰＬＣと組み合わせた）及び放射性標識（薄層クロマトグラフィーと組み合わせた場合の）によって行うことができる。
本明細書に記載の実施形態に従って、試料中の１つ以上の活性微生物株の存在及びそれぞれの数を判定する（図１Ｂ、１００６；図２、２００６）。例えば、第一のマーカーの数及び存在をアッセイすることで得られる株同一性情報を解析して、ユニークな第一のマーカーの出現数を決定し、それによってユニークな微生物株を表現する（例えば、配列決定アッセイにおける配列読み取りの数を計測することによって）。一実施形態では、この値を第一のマーカーの全配列読取りの割合として表し、特定の微生物型のユニークな微生物株の割合を与えることができる。さらなる実施形態では、この割合に微生物型の数（工程１００２または２００２で得られた、図１Ｂ及び図２参照）を掛け合わせ、試料中の１つ以上の微生物株の絶対的細胞数及び所定の体積を与える。
第二のユニークなマーカー発現のレベルが、閾値レベルにあるか、閾値よりも高い、例えば、対照レベルに比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％または少なくとも約３０％高い場合、上記のように、１つ以上の微生物株を、活性であるとみなす。
本開示の別の態様では、１つ以上の微生物株の絶対細胞数を測定する方法は、複数の試料（図２、特に２００７を参照）中で測定する。微生物株が活性型に分類されるためには、試料のうちの１つにおいてのみ活性である必要がある。試料は、同じ供給源から複数の時点にわたって採取可能であるか、または異なる環境源（例えば、異なる動物）由来であり得る。
一実施形態では、試料に対する絶対細胞数値を用いて、１つ以上の活性微生物株と環境パラメータとを関連付ける（図２、２００８）。一実施形態では、環境パラメータは、第二の活性微生物株の存在である。１つ以上の活性微生物株と環境パラメータとの関連付けは、一実施形態では、ネットワーク解析によって株とパラメータとの共起性を判定することによって実施する。
一実施形態では、１つ以上の活性微生物株と環境パラメータとの共起性の判定は、ネットワーク内の複数もしくは単一の株と環境パラメータとの連結性を測定するためのネットワーク及び／またはクラスター解析方法を含み、そこにおいてネットワークは、共通または類似の環境パラメータを共有する２つ以上の試料の集合体である。別の実施形態では、ネットワーク解析は、変数間の連結性を確定するための相互情報を含むノンパラメトリックアプローチを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュール性解析、ロバストネス測定、媒介性測定、連結性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せを含む。別の実施形態では、クラスター解析法は、連結性モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築すること、及び／またはＬｏｕｖａｉｎ、Ｂｒｏｎ−Ｋｅｒｂｏｓｃｈ、Ｇｉｒｖａｎ−Ｎｅｗｍａｎ、Ｃｌａｕｓｅｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、Ｐｏｎｓ−Ｌａｔａｐｙ、及びＷａｋｉｔａ−Ｔｓｕｒｕｍｉアルゴリズムなどの群集検出アルゴリズムを使用することを含む。
一実施形態では、クラスター解析法は、モジュール性の最適化に基づくヒューリスティックな方法である。さらなる実施形態では、クラスター解析法はＬｏｕｖａｉｎ法である（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｆａｓｔ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ２００８，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８参照、上記文献はすべての目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する）。
別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクマイニング及び予測、集合分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似度、またはそれらの組合せによるネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデル化を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析はＬｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
一実施形態では、試料中の１つ以上の活性微生物株の環境パラメータへの関連付け（例えば、共起性の判定）は、環境パラメータと微生物株との関連性を示すリンクで構成されたマトリックスを作製することを含む。
一実施形態では、工程２００７で得られる複数の試料データ（例えば、各時点が個々の試料に対応する２つ以上の時点において収集可能な２つ以上の試料にわたって）を集計する。さらなる実施形態では、各試料中の１つ以上の微生物株のそれぞれの細胞の数を、関連性マトリックス（いくつかの実施形態では、量マトリックスであり得る）に記録する。一実施形態では、関連性マトリックスを用い、関連性（例えば、量）データで重み付けしたルールマイニングアプローチを使用して、特定の時点の試料中の活性微生物株間の関連性を同定する。一実施形態では、フィルターを適用して重要でないルールを除去する。
一実施形態では、１つ以上のまたは２つ以上の活性微生物株の絶対細胞数を、例えば共起判定を介して、１つ以上の環境パラメータ（図２、２００８）に関連付ける。環境パラメータは、解析する試料（複数可）に応じてユーザが選択し、本明細書に記載の方法によって限定されない。環境パラメータは、試料自体のパラメータ、例えば、ｐＨ、温度、試料中のタンパク質の量であり得る。あるいは、環境パラメータは、微生物群集の同一性の変化に影響を及ぼす（すなわち、微生物群集の「同一性」が、微生物株のタイプ及び／または群集内の特定の微生物株の数によって特徴付けられる場合）か、または微生物群集の同一性の変化に影響を受けるパラメータである。例えば、一実施形態における環境パラメータは、動物の摂食量または泌乳反芻動物が産生する泌乳量（または牛乳中のタンパク質もしくは脂肪含有量）である。一実施形態では、環境パラメータは、同一試料中に存在する微生物群集内の第二の微生物株の存在、活性、及び／または量である。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、環境パラメータは、メタデータパラメータと呼ばれ、その逆も同様である。
メタデータパラメータの他の例として、試料を採取した宿主由来の遺伝情報（例えば、ＤＮＡ変異情報）、試料のｐＨ、試料の温度、特定のタンパク質またはｍＲＮＡの発現、周囲環境／生態系の栄養条件（例えば、１つ以上の栄養のレベル及び／または同一性）、疾患に対する感受性または耐性、疾患の発症または進行、試料の毒素に対する感受性または耐性、生体異物化合物（医薬品）の有効性、天然産物の生合成、またはそれらの組合せが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
例えば、一実施形態によれば、図２の方法（すなわち、２００１〜２００７）に従って複数の試料に対して微生物株数の変化を計算する。１つ以上の活性株の経時的な株数変化を集計し（例えば、最初に工程２００６によって活性であると同定した１つ以上の株）、変化の方向性に注目する（すなわち、マイナスの値は減少を示し、プラスの値は増加を示す）。時間経過に伴う細胞の数を、ネットワークとして表し、微生物株はノードを表し、量で重み付けしたルールはエッジを表す。マルコフ連鎖とランダムウォークを利用して、ノード間の連結性を判定し、クラスターを定義する。所望のメタデータに関連するクラスターを識別するために、一実施形態におけるクラスターを、メタデータを使用してフィルタリングする（図２、２００８）。
さらなる実施形態では、時間経過に伴う細胞数の変化と、標的クラスターに存在する株とを統合することによって、微生物株を重要性に従ってランク付けし、最も多くの細胞数変化を最も高くランク付けする。
一実施形態では、ネットワーク及び／またはクラスター解析方法を用いて、ネットワーク内の１つ以上の株の連結性を測定し、そこにおいてネットワークは、共通または類似の環境パラメータを共有する２つ以上の試料の集合体である。一実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュール性解析、ロバストネス測定、媒介性測定、連結性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクマイニング及び予測、ソーシャルネットワーク理論、集合分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似度、またはそれらの組合せによるネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、相互情報、最大情報係数計算、または他の、連結性を確定するための変数間のノンパラメトリックな方法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデル化を含む。さらに別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
クラスター解析法は、連結性モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。
例えば、図２の方法の工程２００８を実行するためのネットワーク及びクラスターベースの解析は、プロセッサ、コンポーネント及び／またはモジュールを介して実行することができる。本明細書中で使用する場合、コンポーネント及び／またはモジュールは、例えば、任意のアセンブリ、命令及び／または動作可能に結合した電気的構成要素のセットであり、例えば、メモリ、プロセッサ、電気トレース、光学コネクタ、ソフトウェア（ハードウェアで実行する）及び／または同様のものを備え得る。
図３Ａは、一実施形態による、微生物分析、スクリーニング及び選択プラットフォームならびにシステム３００を示す模式図である。本開示によるプラットフォームは、天然の微生物群集内の多次元種間相互作用及び依存性を測定するためのシステム及びプロセスを含むことができ、その一例を図３Ａに示す。図３Ａはアーキテクチャ図であり、したがって、本開示の文脈で見た場合、これらの態様は当業者には明らかであるが、特定の態様を省略して説明の明確性を高めている。
図３Ａに示すように、微生物スクリーニング及び選択プラットフォームならびにシステム３００は、１つ以上のプロセッサ３１０、データベース３１９、メモリ３２０、通信インターフェース３９０、ユーザ入力デバイス３９６及び周辺デバイス３９７と相互通信するように構成された入出力インターフェース（例えば、ＦＡＣなどのデータ収集及び解析デバイス、選択／インキュベーション／策定デバイス、及び／または追加のデータベース／データソース、リモートデータ収集デバイス（例えば、試料の特性、温度、天候などのメタデータ環境データを収集するための、携帯スマートフォンならびに他の携帯型または据置型デバイスの実行アプリを含むそのような情報を収集可能なデバイス）、通信ネットワーク３９２を介してクライアント３９３ｂ及びユーザ３９３ａへデータを送受信するように構成されたネットワークインターフェース（例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、及び／または他の通信ネットワーク）；データ収集コンポーネント３３０、絶対数計測コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、ならびに株選択／微生物アンサンブル生成コンポーネント３５５を含む。いくつかの実施形態では、微生物スクリーニングシステム３００は、単一の物理的デバイスであり得る。他の実施形態では、微生物スクリーニングシステム３００は、複数の物理的装置（例えば、ネットワークによって動作可能に結合する）を含むことができ、その各々が、図３Ａに示す１つ以上のコンポーネント及び／またはモジュールを含むことができる。
微生物スクリーニングシステム３００内の各コンポーネントまたはモジュールは、それぞれの残りのコンポーネント及び／またはモジュールに動作可能に連結させることができる。微生物スクリーニングシステム３００の各コンポーネント及び／またはモジュールは、そのコンポーネント及び／またはモジュールに関連する１つ以上の特定の機能を実行することができるハードウェア及び／またはソフトウェア（ハードウェアにおいて格納及び／または実行される）の任意の組合せであり得る。
メモリ３２０は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（例えば、ダイナミックＲＡＭ、スタティックＲＡＭ）、フラッシュメモリ、リムーバブルメモリ、ハードドライブ、データベースなどであり得る。いくつかの実施形態では、メモリ３２０は、例えば、データベース（例えば３１９にあるような）、プロセス、アプリケーション、仮想マシン、及び／またはいくつかのその他のソフトウェアコンポーネント、プログラム及び／またはモジュール（ハードウェアにおいて格納及び／または実行される）、または、微生物スクリーニングプロセス及び／または微生物スクリーニング及びアンサンブル生成のための１つ以上の関連する方法を実行するように構成されたハードウェアコンポーネント／モジュール（例えば、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計測コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、株選択／微生物アンサンブル生成コンポーネント３５５（及び／または同様のモジュール）を介して）を含む。そのような実施形態では、微生物スクリーニング及び／またはアンサンブル生成プロセス及び／または関連する方法を実行する命令を、メモリ３２０内に格納し、プロセッサ３１０で実行することができる。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０を介して収集するデータは、データベース３１９及び／またはメモリ３２０に格納することができる。
プロセッサ３１０は、例えば、通信インターフェース３９０の動作を制御し、メモリ３２０に対してデータを読み書きし、メモリ３２０に保存された命令を実行するように構成することができる。プロセッサ３１０は、例えば、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計測コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント、及びネットワーク解析コンポーネント３５０の動作を本明細書においてさらに詳細に記載するように実行及び／または制御するように構成することもできる。いくつかの実施形態では、プロセッサ（複数可）３１０の制御下で、メモリ３２０内に格納した方法またはプロセスに基づいて、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計測コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、及び株選択／アンサンブル生成コンポーネント３５５は、本明細書においてさらに詳細に記載するように、微生物スクリーニング、選択及び合成アンサンブル生成プロセスを実行するように構成することができる。
通信インターフェース３９０は、微生物スクリーニングシステム３００の１つ以上のポートを備え、及び／またはこれらを管理する（例えば、入出力インターフェース（複数可）３９５を介して）ように構成することができる。いくつかの例では、例えば、通信インターフェース３９０（例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ））は、１つ以上のラインカードを含むことができ、その各々は、デバイス（例えば、周辺デバイス３９７及び／またはユーザ入力装置３９６）に（動作可能に）連結した１つ以上のポートを備える。通信インターフェース３９０に含まれるポートは、連結したデバイスまたはネットワーク３９２を介して能動的に通信する（例えば、エンドユーザデバイス３９３ｂ、ホストデバイス、サーバなどと通信する）ことができる任意のエンティティであり得る。いくつかの実施形態では、そのようなポートは必ずしもハードウェアポートである必要はないが、仮想ポートまたはソフトウェアによって定義されるポートであり得る。通信ネットワーク３９２は、情報（例えば、データ及び／または信号）を送信することができる任意のネットワークまたはネットワークの組合せであることができ、例えば、電話ネットワーク、イーサネット（登録商標）ネットワーク、光ファイバネットワーク、ワイヤレスネットワーク及び／またはセルラーネットワークを含み得る。通信は、例えば、Ｗｉ−Ｆｉまたは無線ローカルエリアネットワーク（「ＷＬＡＮ」）接続、無線ワイドエリアネットワーク（「ＷＷＡＮ」）接続、及び／またはセルラー接続などのネットワークを介して行うことができる。ネットワーク接続は、例えば、イーサネット（登録商標）接続、デジタル加入回線（ＤＳＬ）接続、広帯域同軸接続、及び／または光ファイバ接続などの有線接続であり得る。例えば、微生物スクリーニングシステム３００は、１つ以上の計算デバイス３９３ｂからネットワーク３９２を介してアクセスされるように構成されるホスト装置であり得る。そのような方式で、計算デバイスは、ネットワーク３９２を介して微生物スクリーニングシステム３００に情報を提供し、及び／または情報を受信する。そのような情報は、例えば、本明細書においてさらに詳細に記載するように、微生物スクリーニングシステム３００が、活性な、ネットワーク解析する微生物を、収集し、関連付け、測定し、解析及び／または生成するための情報であり得る。同様に、計算デバイスは、微生物スクリーニングシステム３００からの測定情報を、引き出し、及び／または要求するように構成することができる。
いくつかの実施形態では、通信インターフェース３９０は、入出力インターフェース３９５を、備え、及び／または備えるように構成することができる。入出力インターフェースは、ユーザ入力デバイス、周辺デバイス、暗号化プロセッサデバイス、及び／または同様のものに対し、これを承諾し、通信し、及び／または接続してもよい。いくつかの例では、１つの出力装置は、映像ディスプレイであってもよく、例えば映像インターフェースから信号を受信するインターフェース（例えば、デジタルビジュアルインタフェース （ＤＶＩ）回路とケーブル）を有するブラウン管（ＣＲＴ）もしくは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、ＬＥＤ、またはプラズマベースのモニタを含み得る。そのような実施形態では、通信インターフェース３９０は、他の機能の中でも、データ及び／または情報を受信し、微生物スクリーニングの改変、指令、及び／または命令を送信するように構成することができる。
データ収集コンポーネント３３０は、絶対数計測コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、及び／または株選択／アンサンブル生成コンポーネント３５５によって実行される天然の微生物群集内の多次元種間相互作用及び依存性に関する解析のためにデータを収集し、処理し、及び／または標準化するように構成された任意のハードウェア及び／またはソフトウェアコンポーネント及び／またはモジュール（メモリ３２０などのメモリに格納され、及び／またはプロセッサ３１０などのハードウェアで実行される）であり得る。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０は、試料の所与の体積中の１つ以上の活性生物株の絶対細胞数を測定するように構成することができる。１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数に基づいて、データ収集コンポーネント３３０は、マーカー配列を用いて絶対細胞数計測データセット内の活性株を同定することができる。データ収集コンポーネント３３０は、一定期間データを連続的に収集し、試料中の微生物集団の動態を表すことができる。データ収集コンポーネント３３０は、一時的なデータを集計し、量的マトリックス中の各活性生物株の細胞数を、メモリ３２０などのメモリ内に格納することができる。
試料関連付けコンポーネント３４０及びネットワーク解析コンポーネント３５０は、天然の微生物群集内の多次元種間相互作用及び依存性を集合的に判定するように構成することができる。試料関連付けコンポーネント３４０は、メタデータパラメータを１つ以上の活性微生物株の存在に関連付ける（環境パラメータ、例えば、共起性を介して）ように構成された任意のハードウェア及び／またはソフトウェアコンポーネント（メモリ３２０などのメモリに格納し、及び／またはプロセッサ３１０などのハードウェアで実行する）であり得る。いくつかの実施形態では、試料関連付けコンポーネント３４０は、１つ以上の活性生物株を１つ以上の環境パラメータに関連付けることができる。
ネットワーク解析コンポーネント３５０は、試料中の１つ以上の活性微生物株の環境（メタデータ）パラメータに対する共起性を判定するように構成された任意のハードウェア及び／またはソフトウェアコンポーネント（メモリ３２０などのメモリに格納し、及び／またはプロセッサ３１０などのハードウェアで実行する）であり得る。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０によって収集したデータ、及び試料関連付けコンポーネント３４０によって判定した１つ以上の活性微生物株と１つ以上の環境パラメータとの関連性に基づいて、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、環境パラメータと微生物株との関連性を示すリンク、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数、及び１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを集合させ、微生物株の異種集団の１つ以上のネットワークを表現するマトリックスを作成することができる。例えば、ネットワーク解析は、関連性（量及び／または存在量）マトリックスを用いて、試料中の活性微生物株とメタデータパラメータの関連性（例えば、２つ以上の活性微生物株の関連性）を、数量データで重み付けしたルールマイニングアプローチを用いて同定することができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、フィルターを適用してルールを選択及び／または除去することができる。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、変化の方向性に注目して、活性株の細胞数の時系列変化を計算することができる（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、マトリックスをネットワークとして表すことができ、そこでは微生物株がノードを表し、数量で重み付けしたルールがエッジを表す。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、レバレッジ・マルコフ連鎖及びランダムウォークを利用して、ノード間の連結性を判定し、クラスターを定義することができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、望ましいメタデータに関連するクラスターを同定するために、メタデータを用いてクラスターをフィルタリングすることができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、細胞数の時系列変化と、標的クラスターに存在する株とを統合することにより、標的微生物株をランク付けすることができ、そこでは最も多い細胞数変化を最も高くランク付けする。
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュール性解析、ロバストネス測定、媒介性測定、連結性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せを含む。別の実施形態では、連結性モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む、クラスター解析法を使用することができる。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクマイニング及び予測、集合分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似度、またはそれらの組合せによるネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、相互情報、最大情報係数計算、または他の、連結性を確定するための変数間のノンパラメトリックな方法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデル化を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
図３Ｂは、本開示の一実施形態による例示的な論理フローを示す。まず、複数の試料及び／または試料セットを収集し、及び／または受け取る３００１。本明細書中で使用する場合、「試料」とは、１つ以上の試料、試料セット、複数の試料（例えば、特定の集団からの）を指し得るものであって、その結果、理解を容易にするために、２つ以上の異なる試料について議論する場合には、各試料が複数のサブ試料を含み得ることを理解されたい（例えば、第一の試料及び第二の試料を議論する場合、第一の試料は、第一の集団から収集した２、３、４、５またはそれ以上のサブ試料を含むことができ、第二の試料は、第二の集団から、あるいは第一の集団から収集するが第一のサブ試料を収集してから１週間後または１か月後などの異なる時点において収集した２、３、４、５またはそれ以上のサブ試料を含むことができる）。サブ試料を収集する場合、環境パラメータ、定性的及び／または定量的観察、集団メンバー同一性を含む、個々の収集の証拠及び各サブ試料のパラメータをモニタリング及び保存することができる（例えば、試料を２つ以上の異なる時点に同じ集団から採取する場合、サブ試料は、同一性によって対になるため、時間１の動物１からのサブ試料を、時間２の同じ動物から採取したサブ試料にリンクさせ、以下同様である）。
各試料、試料セット、及び／またはサブ試料について、標的生物型に基づいて細胞を染色し３００２、各試料／サブ試料またはその一部を秤量し、段階的に希釈し３００３、処理し３００４、各試料／サブ試料における各微生物型の細胞数を測定する。１つの例示的な実施態様では、セルソーターを使用して、環境試料などの試料由来の個々の細菌及び真菌細胞を計数することができる。本開示の一部として、特定の色素を開発し、従来の方法では不可能であった微生物の計数を可能にした。本開示の方法に続いて、特定の色素を使用して細胞壁（例えば、細菌及び／または真菌の）を染色し、標的細胞の個別集団を、レーザーを用いた細胞特性に基づいてより大きな集団から計数することができる。特定の一例では、環境試料を調製し、等張性緩衝液に希釈し、色素で染色する：（ａ）細菌については、以下の色素を用いて染色することができる―ＤＮＡ：Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ、呼吸：５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロリド及び／またはＣＴＣ、細胞壁：マラカイトグリーン及び／またはクリスタルバイオレット；（ｂ）真菌については、以下の色素を用いて染色することができる―細胞壁：カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、トリパンブルー、ダイレクトイエロー９６、ダイレクトイエロー１１、ダイレクトブラック１９、ダイレクトオレンジ１０、ダイレクトレッド２３、ダイレクトレッド８１、ダイレクトグリーン１、ダイレクトバイオレット５１、コムギ胚芽凝集素―ＷＧＡ、リアクティブイエロー２、リアクティブイエロー４２、リアクティブブラック５、リアクティブオレンジ１６、リアクティブレッド２３、リアクティブグリーン１９、及び／またはリアクティブバイオレット５。
本開示の開発において、直接及び反応染料は、一般的にはセルロース系素材（すなわち、綿、亜麻、及びビスコースレーヨン）の染色に関連するが、キチン及びキトサンに、それぞれβ−（１→４）結合Ｎ−アセチルグルコサミン鎖、ならびにβ−（１→４）結合Ｄ−グルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン鎖が存在することから、それらの染色にも使用できるという利点が見出された。これらのサブユニットが集合して鎖になると、セルロース鎖に非常に類似した平坦な繊維様構造が形成する。直接染料は、染料と繊維分子との間のファンデルワールス力によってキチン及び／またはキトサン分子に接着する。両者の接触面積が大きいほど相互作用が強くなる。一方、反応染料は、キチン及び／またはキトサンと共有結合を形成する。
染色した各試料を、カウントするためにＦＡＣ３００４にロードする。試料は、個々の液滴の流れ（例えば、およそ１μＬの１／１０（０．１μＬ））を生成する特定のサイズのノズル（例えば１００μｍであり、これは実施及び用途に応じて選択される）を有するマイクロ流体チップを通過することができる。これらの変数（ノズルサイズ、液滴形成）は、それぞれの標的微生物型に対して最適化することができる。理想的には、各液滴に封入するのは、１個の細胞、すなわち「事象」であり、各液滴がレーザーに当たる際に、染色した物質は励起され、異なる波長の光を放出する。ＦＡＣは、各発光を光学的に検出し、それらを事象としてプロットすることができる（例えば、二次元グラフ上に）。一般的なグラフは、事象のサイズ（「前方散乱」によって測定する）に関する１つの軸と、蛍光強度に関するもう１つの軸とからなる。これらのグラフ上の個々の集団の周りに「ゲート」を描くことができ、これらのゲート内の事象をカウントすることができる。
図３Ｃは、ダイレクトイエローで染色した真菌のデータの例を示す図であり；ｙｅａｓｔ単独培養３００５ａ（陽性対照、左）、Ｅ．ｃｏｌｉ ３００５ｂ（陰性対照、中）及び環境試料３００５ｃ（実験、右）を含む。図中、「後方散乱」（ＢＳＣ−Ａ）は事象の複雑さを測定し、ＦＩＴＣはダイレクトイエローからの蛍光発光の強度を測定する。各ドットは１つの事象を表しており、緑色から赤色への色の変化によって事象の密度を示す。ゲートＢは、標的事象（この場合、ダイレクトイエローで染色した真菌）が見出されると予想される一般的な領域を示している。
図３Ｂに戻り、１つ以上の供給源から採取する２つ以上の試料３００１（個々の動物または単一の地理的場所から経時的に；地理、品種、性能、食事、病気などにおいて異なる２つ以上の群から；生理学的摂動または事象を経験する１つ以上の群から；及び／または同様のものから採取する試料を含む）から開始し、上述のように、試料を解析し、染色３００２を含むフローサイトメトリーを用いて絶対数を確定することができる。試料を秤量し、段階的に希釈し３００３、ＦＡＣを使用して処理する３００４。次に、ＦＡＣからの出力を処理して、各試料中の所望の生物型の絶対数を測定する３００５。以下のコード断片は、一実施形態による、そのような処理の例示的な方法を示している：
＃ユーザ定義変数
＃
＃ｖｏｌｕｍｅ ＝ ＦＡＣによって測定した試料の体積
＃ｄｉｌｕｔｉｏｎ ＝希釈係数
＃ｂｅａｄｓ＿ｎｕｍ ＝ビーズ係数のカウント
＃ｔｏｔａｌ＿ｖｏｌｕｍｅ ＝試料の総体積（ｍＬ）（該当する場合）
＃
＃ｔｏｔａｌ＿ｖｏｌｕｍｅに関する注記：これは直接測定可能であるか（すなわち、
＃第一胃の全容積を測定するための第一胃排出）、
＃または安定したトレーサーを介して（すなわち、小腸の体積を逆算する
＃ために既知量で投与する消化不可能なマーカーの使用）
ＦＡＣ出力をｘとして読み取る
ｆｏｒ ｉ ｉｎ ｒａｎｇｅ（ｌｅｎ（ｘ））：
ｈｏｌｄｅｒ ＝ ｘ［ｉ］
ｍｕｌｅ＝［］
ｆｏｒ ｊ ｉｎ ｒａｎｇｅ（ｌｅｎ（ｈｏｌｄｅｒ））：
ｂｅａｄｓ ＝ ｈｏｌｄｅｒ［−１］
ｉｆ ｂｅａｄｓ ＝＝ ０：
ｔｅｍｐ ＝
（（（ｈｏｌｄｅｒ［ｊ］／ｂｅａｄｓ＿ｎｕｍ）＊（５１３００／ｖｏｌｕｍｅ））＊１０００）＊ｄｉｌｕｔｉｏｎ＊１００＊ｔｏｔａｌ＿ｖｏｌｕｍｅ
ｍｕｌｅ．ａｐｐｅｎｄ（ｔｅｍｐ）
ｅｌｓｅ：
ｔｅｍｐ ＝ （（（ｈｏｌｄｅｒ［ｊ］／ｈｏｌｄｅｒ［−１］）＊（５１３００／ｖｏｌｕｍｅ））＊１０００）＊ｄｉｌｕｔｉｏｎ＊１００＊ｔｏｔａｌ＿ｖｏｌｕｍｅ
ｍｕｌｅ．ａｐｐｅｎｄ（ｔｅｍｐ）
ｏｒｇａｎｉｓｍ＿ｔｙｐｅ＿１ ＝ ｍｕｌｅ［ｃｏｌｕｍｎ＿ｌｏｃａｔｉｏｎ］
ｃａｌｌ ＝ ｓａｍｐｌｅ＿ｎａｍｅｓ［ｉ］
ｃｅｌｌ＿ｃｏｕｎｔ ＝ ［ｃａｌｌ， ｏｒｇａｎｉｓｍ＿ｔｙｐｅ＿１］
ｓａｖｅｔｘｔ（ｏｕｔｐｕｔ＿ｆｉｌｅ，ｃｅｌｌ＿ｃｏｕｎｔ）
ｏｕｔｐｕｔ＿ｆｉｌｅ．ｃｌｏｓｅ（）
全核酸を各試料３００６から単離する。核酸試料の溶出物を２つの部分に分割し（一般的には２等分）、各部分を酵素的に精製して精製ＤＮＡ ３００６ａまたは精製ＲＮＡ ３００６ｂのいずれかを得る。精製ＲＮＡは、ｃＤＮＡ ３００６ｃへ酵素的に変換して安定化させる。ＰＣＲを用いて精製ＤＮＡ及び精製ｃＤＮＡの両方について配列決定ライブラリー（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ配列決定ライブラリー）を調製し、適切なバーコード及びアダプター領域を付着させ、所望の生物型を測定するために適切なマーカー領域を増幅する３００７。ライブラリー品質を評価し、定量化することができ、その後、すべてのライブラリーをプールして配列決定することができる。
生の配列読取り結果を、高い品質でトリミングし、マージする３００８。処理した読取り結果の重複を取り除き、クラスター化し、複数の試料に存在するすべてのユニークな株のリストを生成する３００９。このリストは、複数の試料中に存在する各株の分類学的同定に用いることができる３０１０。ＤＮＡ試料由来の配列決定ライブラリーを同定することができ、各試料中にどの株が存在するのかを同定し、各試料中の各株についての読取り結果の数を定量化するために、同定したＤＮＡライブラリーからの配列読取り結果を、重複を取り除いた株のリストに対してマッピングする３０１１。次に、各株の絶対数または細胞数を判定するために、定量化した読取り結果のリストを標的微生物型の絶対細胞数と統合する３０１３。以下のコード断片は、一実施形態による、そのような処理の例示的な方法を示している：
＃ユーザ定義変数
＃
＃ｉｎｐｕｔ＝配列解析からの定量化カウント出力
＃ｃｏｕｎｔ＝生物型の計算した絶対細胞数
＃ｔａｘｏｎｏｍｙ＝各株の予測分類
＃
ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔファイルをｃｏｕｎｔとして読み取る
ｔａｘｏｎｏｍｙファイルをｔａｘとして読み取る
ｎｃｏｌｓ＝ ｌｅｎ（ｃｏｕｎｔｓ）
ｎｕｍ＿ｓａｍｐｌｅｓ ＝ ｎｃｏｌｓ／２
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ ＝ ［］
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ．ａｐｐｅｎｄ（ｕｎｉｑｕｅ（ｔａｘｏｎｏｍｙ［‘ｋｉｎｇｄｏｍ’］．ｖａｌｕｅｓ．ｒａｖｅｌ（）））
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ．ａｐｐｅｎｄ（ｕｎｉｑｕｅ（ｔａｘｏｎｏｍｙ［‘ｐｈｙｌｕｍ’］．ｖａｌｕｅｓ．ｒａｖｅｌ（）））
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ．ａｐｐｅｎｄ（ｕｎｉｑｕｅ（ｔａｘｏｎｏｍｙ［‘ｃｌａｓｓ’］．ｖａｌｕｅｓ．ｒａｖｅｌ（）））
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ．ａｐｐｅｎｄ（ｕｎｉｑｕｅ（ｔａｘｏｎｏｍｙ［‘ｏｒｄｅｒ’］．ｖａｌｕｅｓ．ｒａｖｅｌ（）））
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ．ａｐｐｅｎｄ（ｕｎｉｑｕｅ（ｔａｘｏｎｏｍｙ［‘ｆａｍｉｌｙ’］．ｖａｌｕｅｓ．ｒａｖｅｌ（）））
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ．ａｐｐｅｎｄ（ｕｎｉｑｕｅ（ｔａｘｏｎｏｍｙ［‘ｇｅｎｕｓ’］．ｖａｌｕｅｓ．ｒａｖｅｌ（）））
ｔａｘ＿ｌｅｖｅｌ．ａｐｐｅｎｄ（ｕｎｉｑｕｅ（ｔａｘｏｎｏｍｙ［‘ｓｐｅｃｉｅｓ’］．ｖａｌｕｅｓ．ｒａｖｅｌ（）））
ｔａｘ＿ｃｏｕｎｔｓ ＝ ｍｅｒｇｅ（ｌｅｆｔ＝ｃｏｕｎｔｓ，ｒｉｇｈｔ＝ｔａｘ）
＃ 種のレベルの解析
ｔａｘ＿ｃｏｕｎｔｓ．ｔｏ＿ｃｓｖ（‘ｓｐｅｃｉｅｓ．ｔｘｔ’）
＃ ＤＮＡ試料のみ実行
ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ ＝ ｌｏａｄｃｓｖ（‘ｓｐｅｃｉｅｓ．ｔｘｔ’， ｕｓｅｃｏｌｓ＝ｘｒａｎｇｅ（２，ｎｃｏｌｓ，２））
ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ＿ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ＝ ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ／ｓｕｍ（ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ）
ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｕｎｔｓ ＝ ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ＿ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＊ｃｏｕｎｔｓ
分類レベルごとに繰り返す
ｃＤＮＡ試料に由来する配列決定ライブラリーを同定する３０１４。同定したｃＤＮＡライブラリーからの配列読取り結果を、各試料中でどの株が活性であるかを判定するために、重複を取り除いた株のリストに対してマッピングする。読取り回数が特定または指定の閾値を下回る場合３０１５、その株を非活性であるとみなすかまたは同定し、その後の解析から取り除く３０１５ａ。読取り回数が閾値を上回る場合３０１５、その株を活性であるとみなすかまたは同定し、解析に残す３０１５ｂ。次いで、非活性な株を出力からフィルタリングし３０１３、各試料中の活性な株のリスト及びそれぞれの絶対数／細胞カウントを生成する３０１６。以下のコード断片は、一実施形態による、そのような処理の例示的な方法を示している：
＃上記の変数を用いて継続
＃ＲＮＡ試料のみ実行
ａｃｔｉｖｅ＿ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ ＝ ｌｏａｄｃｓｖ（‘ｓｐｅｃｉｅｓ．ｃｓｖ’， ｕｓｅｃｏｌｓ＝ｘｒａｎｇｅ（３，ｎｃｏｌｓ＋１，２））
ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ＝ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ（ａｃｔｉｖｅ＿ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ， ７０）
ｆｏｒ ｉ ｉｎ ｒａｎｇｅ（ｌｅｎ（ａｃｔｉｖｅ＿ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ））：
ｉｆ ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ＿ａｃｔｉｖｉｔｙ ＞＝ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ［ｉ］ ＝ １
ｅｌｓｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ［ｉ］ ＝ ０
ａｃｔｉｖｅ＿ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｕｎｔｓ ＝ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ＊ｄａｔａ＿ｍｕｌｅ＿ｗｉｔｈ＿ｃｏｕｎｔｓ
分類レベルごとに繰り返す
各試料（試料のセット、サブ試料など）について定性的及び定量的メタデータ（例えば、環境パラメータなど）を同定し、引き出し、及び／または収集し３０１７、データベース（例えば３１９）に保存する３０１８。適切なメタデータを同定することができ、データベースに問い合わせて、応用例／実施態様に応じて、解析する各試料の同定した及び／または関連するメタデータを引き出す３０１９。次いで、メタデータのサブセットを、活性な株のリスト及びそれらの対応する絶対数／細胞カウントとマージして、試料マトリックスによって多数の種及びメタデータを作成する３０２０。
次いで、株とメタデータとの間で３０２１ａ、及び株の間で３０２１ｂ、最大情報係数（ＭＩＣ）を計算する。結果をプールして、すべての関係性スコア及び対応するＭＩＣスコアのリストを作成する３０２２。関係性スコアが所定の閾値を下回る場合３０２３、その関係を関係性なしとみなす／同定する３０２３ｂ。関係性が所定の閾値を上回る場合３０２３、その関係を関係性ありとみなし／同定し２０２３ａ、さらにネットワーク解析に供する３０２４。以下のコード断片は、一実施形態による、そのような処理の例示的な方法を示している：
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｆｉｌｅのリスト全体をリンクとして読み取る
ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ＝ ０．８
ｆｏｒ ｉ ｉｎ ｒａｎｇｅ（ｌｅｎ（ｌｉｎｋｓ））：
ｉｆ ｌｉｎｋｓ ＞＝ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ［ｉ］ ＝ １
ｅｌｓｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ［ｉ］ ＝ ０
ｅｎｄ ｉｆ
ｌｉｎｋｓ＿ｔｅｍｐ ＝ ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ＊ｌｉｎｋｓ
ｆｉｎａｌ＿ｌｉｎｋｓ ＝ ｌｉｎｋｓ＿ｔｅｍｐ［ｌｉｎｋｓ＿ｔｅｍｐ ！＝ ０］
ｓａｖｅｔｘｔ（ｏｕｔｐｕｔ＿ｆｉｌｅ，ｆｉｎａｌ＿ｌｉｎｋｓ）
ｏｕｔｐｕｔ＿ｆｉｌｅ．ｃｌｏｓｅ（）
選択した株を含む生成物（例えばアンサンブル、凝集体、及び／または他の合成グループ）を調製するために、ネットワーク解析の出力に基づいて活性株を選択する３０２５。ネットワーク解析の出力は、さらなる生成物の組成試験のために株の選択を通知するためにも使用することができる。
解析及び判定のための閾値の使用は上記で議論されている。閾値は、実施態様及び応用例に応じて、（１）経験的に決定する（例えば、分布レベルに基づいて低レベルの読取り結果の特定のまたは重要な部分を除去する数でカットオフを設定する）；（２）ゼロ以外の任意の値；（３）百分率／百分位数に基づいて；（４）正規化した第二のマーカー（すなわち活性）の読取り結果が、正規化した第一のマーカー（細胞数）の読取り結果よりも大きい株のみ；（５）活性と量または細胞数との間のｌｏｇ２倍の変化；（６）正規化した第二のマーカー（活性）の読取り結果が、試料全体（及び／または試料のセット）の第二のマーカー（活性）の読取り結果の平均より大きい；及び／または統計的閾値（すなわち、有意性試験）に加えて上述の任意の大きさの閾値、であり得る。以下の実施例は、一実施形態による、ＤＮＡベースの第一のマーカーの測定値に関連するＲＮＡベースの第二のマーカーの測定値の分布についての閾値処理の詳細を提供する。
１匹のオスのＣｏｂｂ５００の小腸内容物を収集し、本開示に従って解析に供した。簡潔に述べると、試料中の細菌細胞の総数を、ＦＡＣ（例えば３００４）を用いて測定した。固定化した小腸試料から全核酸を単離した（例えば３００６）。ＤＮＡ（第一のマーカー）及びｃＤＮＡ（第二のマーカー）配列決定ライブラリーを調製し（例えば３００７）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＭＩＳＥＱにロードした。各ライブラリーからの生の配列読取り結果は、高い品質でフィルタリングし、重複を取り除き、クラスター化し、及び定量化した（例えば３００８）。ＤＮＡベース及びｃＤＮＡベースのライブラリーの両方から定量した株リストを細胞数データと統合して、試料中の各株の細胞の絶対数（例えば３０１３）を確定した。ｃＤＮＡは、必ずしも株の量を直接測定することにはならないが（すなわち、高活性株は同じＲＮＡ分子の多くのコピーを有する可能性がある）が、本実施例ではｃＤＮＡベースのライブラリーを細胞数データと統合して、ＤＮＡライブラリーに対して使用する同じ正規化手順を維持する。
解析後、ｃＤＮＡベースのライブラリー中で７０２株（４６種のユニークな株）を同定し、ＤＮＡベースのライブラリー中で１１４０種の株を同定した。活性閾値として０を用いる（すなわち、非ゼロ値を維持する）場合、ＤＮＡベースの第一のマーカーを有するこの試料中の５７％の株は、ｃＤＮＡベースの第二のマーカーとも関連していた。これらの株は、微生物群集の活性部分として同定され／みなされ、これらの株のみについて、その後の解析を継続した。閾値をより厳しくし、第二のマーカーの値が第一のマーカーの値を上回る株のみを活性とみなす場合、２８９株（２５％）のみが閾値を満たす。この閾値を満たす株は、図３ＤのＤＮＡ（第一のマーカー）ライン上の株に対応する。
本開示は、互いに影響を及ぼす複数の活性微生物株ならびに１つ以上のパラメータまたはメタデータを同定し、共通の機能を実行するか、もしくは影響を与える点で連動しているか、または関心対象の表現型形質（例えば、反芻動物における乳生産の増加）のような認識可能なパラメータに関与しているか、もしくはそれをもたらすか、もしくは関連していると記述することができる個々の微生物種の微生物群集の選択サブセットを含む微生物アンサンブルにおいて使用するために、同定した微生物を選択する様々な方法を含む。本開示はまた、方法を実施及び／または促進する様々なシステム及び装置を包含する。
いくつかの実施形態では、本方法は：少なくとも１つの共通の特性（例えば、試料の測位、試料のタイプ、試料の供給源、試料の供給個体、試料の標的動物、試料の時間、品種、食餌、温度など）を共有し、少なくとも１つの異なる特性（例えば、試料の測位／時間的位置、試料のタイプ、試料の供給源、試料の供給個体、試料の標的動物、試料の時間、品種、食餌、温度などであって、上記共通の特性とは異なる）を有する少なくとも２つの試料を採取する。各試料について、１つ以上の微生物型の存在を検出し、各試料中の１つ以上の微生物型のうち、検出した各微生物型の数を測定し；各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びそれらの量を測定し、ここで各々のユニークな第一のマーカーは微生物株のマーカーである。これに続いて、各微生物型の数及び第一のマーカーの数を統合して、各試料中に存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し；特定の閾値に基づいて各微生物株についての少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定して、各試料中のその微生物株の活性レベルを測定し；測定した活性によって絶対細胞数をフィルタリングして、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれらのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングした絶対細胞数を互いに比較し、及び少なくとも２つの試料の各々について測定した少なくとも１つのメタデータと比較し、予測した機能及び／または化学作用に基づいて活性微生物株を少なくとも２つのグループにカテゴライズすることを含む。例えば、比較は、それぞれの微生物株の間、及び各微生物株とメタデータとの間、及び／またはメタデータと微生物株との間の結び付きを同定するネットワーク解析であり得る。少なくとも１つの微生物を少なくとも２つの群から選択し、これらを組み合わせて、少なくとも１つのメタデータに対応する特性（例えば、ウシまたは牛集団の乳生産）を変更するように構成された微生物のアンサンブルを形成することができる。アンサンブルを形成することは、その微生物株または各微生物株を単離し、解析に基づいて以前に単離した微生物株を選択し、及び／または解析に基づいて特定の微生物株を培養／増殖させ、ならびに株を組み合わせて微生物アンサンブルを形成することを含む。アンサンブルは、アンサンブル中の微生物の送達を可能にする適切な培地、担体、及び／または製薬用担体を含み、それによって、アンサンブルはレシピエントに影響を及ぼすことができる（例えば、乳生産を増加させる）。
ユニークな第一のマーカーの数の測定は、各試料中のユニークなゲノムＤＮＡマーカーの数の測定、各試料中のユニークなＲＮＡマーカーの数の測定、各試料中のユニークなタンパク質マーカーの数の測定、及び／または各試料中のユニークな代謝マーカーの数を測定することを含む（各試料中のユニークな脂質マーカーの数の測定及び／または各試料中のユニークな炭水化物マーカーの数の測定を含む）。
いくつかの実施形態では、ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することは、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応に供すること及び／または各試料由来のゲノムＤＮＡをメタゲノム配列決定に供することを含む。ユニークな第一のマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカーの少なくとも１つを含み得る。ユニークな第一のマーカーは、σ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素の少なくとも１つを追加的にまたは代替として含むことができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定することは、各試料中の少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することを含み、試料中のｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供することを含み得る。遺伝子発現解析は、配列決定反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトーム配列決定、及び／またはトランスクリプトーム配列決定を含み得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルの測定は、各試料またはその一部を質量分析に供すること及び／または各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリング、またはリボソームプロファイリングに供することを含む。１つ以上の微生物型として、細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せが挙げられ、１つ以上の微生物株として、１つ以上の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組合せが挙げられる。１つ以上の微生物株は、１つ以上の真菌種または亜種であり得、及び／または１つ以上の微生物株は、１つ以上の細菌種または亜種であり得る。
いくつかの実施形態では、各試料中の１つ以上の微生物型の数を測定することは、各試料またはその一部を、配列決定、遠心分離、光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供することを含む。
ユニークな第一のマーカーは、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムＣオキシダーゼサブユニット遺伝子、βチューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組合せを含む系統発生学的マーカーを含み得る。ユニークなマーカーの数及びその量の測定は、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応に供し、ゲノムＤＮＡをゲノム配列決定に供し、及び／またはゲノムＤＮＡをアンプリコン配列決定に供することを含み得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なる特性には：第一の試料の収集時間が第二の試料の収集時間と異なるような、少なくとも２つの試料のそれぞれを収集した収集時間と、第一の試料の収集場所が、第二の試料の収集場所と異なるような、少なくとも２つの試料のそれぞれを収集した収集場所（地理的な位置の違い及び／または個々の試料の標的／動物の収集の違いのいずれか）が含まれる。少なくとも１つの共通特性は、第一の試料の試料供給源の型が第二の試料の試料供給源の型と同じであるような、試料供給源の型を含み得る。試料供給源の型は、動物型、器官型、土壌型、水型、堆積型、油型、植物型、農産物型、バルク土壌型、土壌根圏型、植物部分型などのうちの１つであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通特性は、少なくとも２つの試料のそれぞれが胃腸試料であり、一部の実施態様では、第一胃の試料であり得ることを含む。いくつかの実施態様では、本明細書に提供する共通／異なる特性は、代替的に、特定の試料間の異なる／共通の特性であってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通特性は、各試料が組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料であるような、さらなる共通特性を有する動物試料供給源の型を含む。
いくつかの実施形態では、上記方法は、少なくとも１つの測定したメタデータに基づいて、標的から少なくとも１つのさらなる試料を取得することをさらに含むことができ、そこにおいて標的からの少なくとも１つのさらなる試料は、少なくとも２つの試料との間で少なくとも１つの共通特性を共有する。次いで、標的由来の少なくとも１つのさらなる試料について、１つ以上の微生物型の存在を検出し、１つ以上の微生物型のそれぞれの検出した微生物型の数を判定し、ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、各微生物型の数と第一のマーカーの数とを統合して存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し、各微生物株について少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定してその微生物株の活性レベルを判定し、判定した活性によって絶対細胞数をフィルタリングして、標的由来の少なくとも１つのさらなる試料についての活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数のリストを提供する。そのような実施形態では、少なくとも２つの群からの少なくとも１つの微生物株の選択は、標的由来の少なくとも１つのさらなる試料についての活性微生物株（複数可）及びその／それらのそれぞれの絶対細胞数のリストに基づいており、それによって形成されるアンサンブルは、少なくとも１つのメタデータに対応する標的の特性を変更するように構成される。例えば、そのような実施態様を用いると、ホルスタイン牛から採取した試料と、ジャージー牛または水牛から採取した標的試料から、微生物アンサンブルを同定することができ、そこでは解析は、元の試料及び標的試料（複数可）由来の同一または同様の微生物株の間の、同一の、実質的に同様の、または同様のネットワーク関係性を同定する。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングした絶対細胞数を、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定したメタデータまたはさらなる活性微生物株と比較することは、少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株を用いて、各試料中の１つ以上の活性微生物株の共起性を判定することを含む。少なくとも１つの測定したメタデータは、１つ以上のパラメータを含むことができ、そこにおいて１つ以上のパラメータは、試料のｐＨ、試料の温度、脂肪の豊富さ、タンパク質の豊富さ、炭水化物の豊富さ、ミネラルの豊富さ、ビタミンの豊富さ、天然物の豊富さ、特定の化合物の豊富さ、試料供給源の体重、試料供給源の飼料摂取量、試料供給源の体重増加、試料供給源の飼料効率、１つ以上の病原体の存在の有無、試料供給源の物理的特性（複数可）または測定値（複数可）、試料供給源の生産特性、またはそれらの組合せである。パラメータには、乳清タンパク質の豊富さ、カゼインタンパク質の豊富さ、及び／または試料供給源が産生する乳脂肪の豊富さも含まれ得る。
いくつかの実施形態では、各試料中の１つ以上の活性微生物株と、少なくとも１つの測定したメタデータまたはさらなる活性微生物株の共起性を判定することは、２つ以上の試料セット中のメタデータと微生物株との関連性を示すリンク、１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数、及び１つ以上のユニークな第二のマーカーの測定値を集合させたマトリックスを作成して、異種微生物群集または複数の異種微生物群集の１つ以上のネットワークを表すことを含む。１つ以上の活性微生物株及び少なくとも１つの測定したメタデータまたは追加の活性微生物株の共起性を判定すること、及び活性微生物株を分類することは、ネットワーク内の各微生物株の連結性を測定するためのネットワーク解析及び／またはクラスター解析を含むことができ、ネットワークは共通の特性、測定したメタデータ、及び／または関係する環境パラメータを共有する少なくとも２つの試料の集合体を表す。ネットワーク解析及び／またはクラスター解析は、連鎖解析、モジュール性解析、ロバストネス測定、媒介性測定、連結性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せを含み得る。クラスター解析は、連結性モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、及び／または重心モデルの構築を含み得る。いくつかの実施態様では、ネットワーク解析は、リンクマイニング及び予測、集合分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似度、及びそれらの組合せなどによるネットワーク（複数可）の予測モデリングを含み得る。ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデル化及び／またはＬｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデル化を含み得る。解析はヒューリスティックな方法であり得る。いくつかの実施形態では、解析はＬｏｕｖａｉｎ法であり得る。ネットワーク解析は、変数間の連結性を確定するためのノンパラメトリックな方法、及び／または連結性を確定するための変数間の相互情報及び／または最大情報係数計算を含み得る。
いくつかの実施形態では、２つ以上の試料セットに基づいて環境内の特徴または特性を変更するように構成された活性微生物株のアンサンブルを形成する方法であって、上記試料セットが、２つ以上の試料間で少なくとも１つの共通のまたは関連する環境パラメータを共有し、２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの異なる環境パラメータを有し、各試料セットが異種微生物群集を含有する少なくとも１つの試料を含み、そこにおいて１つ以上の微生物株が１つ以上の生物型の部分分類群である、上記方法は：各試料中の複数の微生物型の存在を検出し；各試料中の検出した微生物型の各々の細胞の絶対数を測定し；及び各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することを含み、そこにおいてユニークな第一のマーカーは微生物株のマーカーである。次に、タンパク質またはＲＮＡレベルで、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定し、そこにおいてユニークな第二のマーカーは微生物株の活性のマーカーであり、特定の閾値を上回る１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルに基づいて、各試料について、検出した微生物株の活性を測定し、検出した微生物株の活性を、上記１つ以上の第一のマーカーの量及び１つ以上の微生物株がその部分分類群である上記微生物型の細胞の絶対数に基づいて、各試料中の検出した各活性微生物株の絶対細胞数を計算し、そこにおいて１つ以上の活性微生物株は、指定の閾値を上回る第二のユニークなマーカーを発現する。次に、少なくとも１つの環境パラメータを有する試料中の活性微生物株の共起性を最大情報係数ネットワーク解析に基づいて判定し、ネットワーク内の各微生物株の連結性を測定し、そこにおいてネットワークは、少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを有する少なくとも２つの試料セットの集合体である。ネットワーク解析に基づいて、１つ以上の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択し、選択した複数の活性微生物株から活性微生物株のアンサンブルを形成し、活性微生物株のアンサンブルは、活性微生物株のアンサンブルをその環境に導入する場合に、環境の特徴または特性を選択的に変更するように構成される。いくつかの実施態様では、第一の試料セットの少なくとも１つの共通または関連する環境因子の少なくとも１つの測定指標は、第二の試料セットの少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定指標とは異なる。例えば、試料／試料セットがウシ由来である場合、第一の試料セットは牧草で飼育したウシ由来であり、第二の試料セットはトウモロコシ飼料で飼育したウシ由来であり得る。１つの試料セットは単一の試料であり得るが、代わりに複数の試料であることも可能であり、試料セット内の各試料についての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定指標は実質的に同様であり（例えば、１つのセット中の試料はすべて牧草で飼育した群れに由来する）、１つの試料セットの平均測定指標は、別の試料セットの平均測定指標とは異なる（第一の試料セットは牧草で飼育した群れに由来し、第二の試料セットはトウモロコシで飼育した群れに由来する）。異なる品種、異なる飼料、異なる性能、異なる年齢、異なる飼料添加物、異なる成長段階、異なる生理学的特徴、異なる健康状態、異なる標高、異なる環境温度、異なる季節、異なる抗生物質など、解析において考慮される追加の相違点及び類似点が存在し得る。いくつかの実施形態では、各試料セットは複数の試料を含み、第一の試料セットを第一の集団から採取し、第二の試料セットを第二の集団から採取するが、追加的または代替の実施形態では、各試料セットは複数の試料を含み、第一の試料セットを第一の集団から第一の時間に採取し、第二の試料セットを第一の集団から第一の時間とは異なる第二の時間に採取する。例えば、牧草で飼育している間にウシの群れから第一の試料セットを第一の時間に採取し、第二の試料セットを第二の時間（例えば、２か月後）に採取し、第一の試料セットを採取した直後からトウモロコシ飼料に切り替えた。そのような実施形態では、試料を採取し、集団に対して解析を実施してもよく、及び／または個々の動物に特異的な参照を含めてもよく、それによって、時間経過に伴って個々の動物に起こった変化を同定し、精細なレベルのデータを提供することができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通または関連する環境因子には、栄養素情報、食餌情報、動物特性、感染情報、健康状態などが含まれる。
測定する少なくとも１つの指標には、試料のｐＨ、試料の温度、脂肪の豊富さ、タンパク質の豊富さ、炭水化物の豊富さ、ミネラルの豊富さ、ビタミンの豊富さ、天然物の豊富さ、特定の化合物の豊富さ、試料供給源の体重、試料供給源の飼料摂取量、試料供給源の体重増加、試料供給源の飼料効率、１つ以上の病原体の存在の有無、試料供給源の物理的特性（複数可）または測定値（複数可）、試料供給源の生産特性、試料供給源が生産する乳中の乳清タンパク質の豊富さ、試料供給源が生産する乳中のカゼインタンパク質の豊富さ、及び／または試料供給源が生産する乳中の乳脂肪の豊富さ、またはそれらの組合せが含まれ得る。
各試料中のユニークな第一のマーカーの数の測定は、実施形態に応じて、ユニークなゲノムＤＮＡマーカーの数の測定、ユニークなＲＮＡマーカーの数の測定、及び／またはユニークなタンパク質マーカーの数の測定を含み得る。複数の微生物型は、１つ以上の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せを含み得る。
いくつかの実施形態では、各試料中の微生物型のそれぞれの絶対数を測定することは、試料またはその一部を、配列決定、遠心分離、光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動及び／またはフローサイトメトリーに供することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性微生物株は、１つ以上の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せから選択される１つ以上の微生物型の部分分類群である。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性微生物株は、１つ以上の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性微生物株は、１つ以上の細菌種または亜種である。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性微生物株は、１つ以上の真菌種または亜種である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのユニークな第一のマーカーは、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃオキシダーゼサブユニット遺伝子、βチューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組合せを含む系統発生学的マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することは、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応に供し、及び／または各試料由来のゲノムＤＮＡをメタゲノム配列決定に供することを含む。いくつかの実施態様では、ユニークな第一のマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカーを含み得る。いくつかの実施態様では、ユニークな第一のマーカーは、σ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、代謝酵素、またはそれらの組合せを含み得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することは、各試料のｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供することを含み、いくつかの実施態様では、遺伝子発現解析は配列決定反応を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子発現解析は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトーム配列決定、及び／またはトランスクリプトーム配列決定を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することは、各試料またはその一部を、質量分析、メタリボソームプロファイリング、及び／またはリボソームプロファイリングに供することを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つ以上のユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することは、各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリング（Ｒｉｂｏ−Ｓｅｑ）（Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，Ｓ．Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ，Ｊ．Ｒ．Ｎｅｗｍａｎ，ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ．２００９． Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：２１８−２２３；Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．２０１４． Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ｎｅｗ ｖｉｅｗｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｄｏｎｓ ｔｏ ｇｅｎｏｍｅ ｓｃａｌｅ． Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２０５−２１３）するために供することを含む。Ｒｉｂｏ−ｓｅｑは、ゲノムスケールでｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質合成を判定するために使用できる分子技術である。本方法は、フットプリンティングリボソームがｍＲＮＡと結合して相互作用することから、それらを介してどの転写産物が能動的に翻訳されているかを直接測定する。次いで、結合したｍＲＮＡ領域を処理し、ハイスループット配列決定反応に供する。Ｒｉｂｏ−ｓｅｑは定量的プロテオミクスと強い相関があることが示されている（Ｌｉ，Ｇ．Ｗ．，Ｄ．Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｃ．Ｇｒｏｓｓ，ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ． ２０１４． Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒａｔｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ． Ｃｅｌｌ １５７：６２４−６３５）。
試料供給源の型は、動物、土壌、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、バルク土壌、土壌根圏、植物部分、野菜、極限環境のうちの一つ、またはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施態様では、各試料は、消化管及び／または第一胃の試料である。いくつかの実施態様では、試料は、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、組織試料、及び／または器官試料であり得る。
実施態様に応じて、本開示の微生物アンサンブルは、２つ以上の実質的に純粋な微生物または微生物株、所望の微生物／微生物株の混合物を含む場合があり、また、例えば微生物叢を動物において回復させるために、標的に投与可能な任意のさらなる成分を含む場合もある。本開示に従って作製する微生物アンサンブルは、微生物が標的環境（例えば動物の胃腸管であり、そこではアンサンブルが低ｐＨに抵抗し、胃腸環境で増殖するように構成されている）で生き残ることを可能にする薬剤と共に投与してもよい。いくつかの実施形態では、微生物アンサンブルは、アンサンブルに含まれる微生物／株に存在するか、または存在しない１つ以上の所望の微生物または微生物株の数及び／または活性を増加させる１つ以上の薬剤を含み得る。そのような薬剤の非限定的な例として、フラクトオリゴ糖（例えば、オリゴフルクトース、イヌリン、イヌリン型フルクタン）、ガラクトオリゴ糖、アミノ酸、アルコール、及びそれらの混合物が挙げられる（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｆａｒｉａｓ ｅｔ ａｌ． ２００８． Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．４：１−１０及びＰｏｏｌ−Ｚｏｂｅｌ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ ２００７． Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３７：２５８０−２５８４ならびに補足、上記文献の各々は、すべての目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する）。
本開示の方法によって同定した微生物株は、アンサンブルに含める前に培養／増殖させてもよい。培地は、そのような増殖のために使用することができ、微生物の増殖をサポートするのに適した任意の培地を含んでもよく、非限定的な例として、天然または人工のガストリン補充寒天、ＬＢ培地、血清、及び／または組織培養用ゲルが挙げられる。培地は、単独で、または１つ以上の他の培地と組み合わせて使用してもよいことを理解すべきである。また、外来性栄養素の添加の存在下または非存在下で使用してもよい。培地は、追加の化合物または成分、例えば微生物及び／またはその株の特定の群の相互作用及び／または選択を補助する成分を用いて修飾または富化させてもよい。例えば、抗生物質（ペニシリンなど）または滅菌剤（例えば第四級アンモニウム塩及び酸化剤など）を存在させることができ、及び／または物理的条件（塩分、栄養素（例えば有機及び無機ミネラル（リン、窒素塩、アンモニア、カリウムならびにコバルト及びマグネシウムなどの微量栄養素）、ｐＨ及び／または温度）を改変することができる。
上述のように、システム及び装置は、本開示に従って構成することができ、いくつかの実施形態では、プロセッサ及びメモリを備えることができ、メモリは、方法（複数可）を実行するプロセッサ読込み可能／発行可能な命令を格納することができる。一実施形態では、システム及び／または装置は、本方法を実行するように構成される。また、図３Ａへの参照とともに記載したように、本方法のプロセッサの実施態様も開示する。例えば、プロセッサによって実施する方法は：少なくとも１つの共通特性を共有し、少なくとも１つの異なる特性を有する少なくとも２つの試料から試料データを受信し；各試料について、各試料中の１つ以上の微生物型の存在を判定し；各試料中の１つ以上の微生物型の各検出した微生物型の細胞数を測定し；各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、各々のユニークな第一のマーカーは、微生物株のマーカーであり；１つ以上のプロセッサを介して、各微生物型の数及び第一のマーカーの数を統合して、各試料中に存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し；特定の閾値を上回る各微生物株について、少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値に基づいて、各試料中の各微生物株の活性レベルを判定し、微生物株は、その株の少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値が、対応する閾値を上回る場合に活性であると同定され；判定した活性によって各微生物株の絶対細胞数をフィルタリングして、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれらのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；少なくとも１つの測定したメタデータを有する少なくとも２つの試料の各々についての活性微生物株または少なくとも２つの試料の各々についての追加の活性微生物株のフィルタリングした絶対数を１つ以上のプロセッサを介して解析し、機能、予測される機能、及び／または化学的性質に基づいて活性微生物株を分類し；上記分類に基づいて複数の活性微生物株を同定し；及び標的に適用した場合に、少なくとも１つの測定したメタデータに対応する標的の特徴を変更するように構成された活性微生物アンサンブルを組み立てるために、同定した複数の活性微生物株を出力することを含み得る。いくつかの実施形態では、トランスジェニック微生物及び微生物株の生成、合成、評価及び／または試験に出力を利用することができる。いくつかの実施形態は、方法（複数可）の実行を行い、及び／または容易にするための命令を格納するプロセッサ可読の非一時的なコンピュータ可読媒体を備え得る。いくつかの実施形態では、本開示による解析及びスクリーニング方法、装置ならびにシステムは、以下の実施例４で論じるように、病原体などの問題の微生物及び株を同定するために使用することができる。そのような状況では、病変スコアなどの公知の症状のメタデータを、試料のネットワーク解析に使用すると考えられる。
本明細書に記載のシステム及び方法は、ソフトウェア（メモリ内に格納し、及び／またはハードウェア上で実行する）、ハードウェア、またはそれらの組合せによって実行可能であることを想定している。ハードウェアコンポーネント及び／またはモジュールは、例えば、汎用プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、及び／または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含む場合がある。ソフトウェアコンポーネント及び／またはモジュールは、Ｕｎｉｘ（登録商標）ユーティリティ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（例えばＥＣＭＡＳｃｒｉｐｔ６）、Ｒｕｂｙ、ＳＱＬ、ＳＡＳ（登録商標）、Ｒプログラミング言語／ソフトウェア環境、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ（商標）、及びその他のオブジェクト指向、手続き型、またはその他のプログラミング言語及び開発ツールなどの様々なソフトウェア言語（例えばコンピュータコード）で表現することができる。コンピュータコードの例として、マイクロコードまたはマイクロ命令、コンパイラによって生成するような機械命令、ウェブサービスを生成するために使用するコード、及びインタプリタを使用するコンピュータによって実行する高レベルの命令を有するファイルが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。コンピュータコードのさらなる例として、制御信号、暗号化コード、及び圧縮コードが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、様々なコンピュータ実装の動作を実行するための命令またはコンピュータコードを有する非一時的なコンピュータ可読媒体（非一時的プロセッサ可読媒体またはメモリとも呼ぶことができる）を備えた装置に関する。コンピュータ可読媒体（またはプロセッサ可読媒体）は、一時的な伝播信号自体（例えば、空間またはケーブルなどの伝送媒体上の情報を保有する伝搬性電磁波）を含まないという意味で非一時的である。媒体及びコンピュータコード（コードとも呼び得る）は、特定の目的または複数の目的のために設計及び構築したものであってもよい。非一時的なコンピュータ可読媒体の例として：ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体；コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）、コンパクトディスク−リードオンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、及びホログラフィックデバイスなどの光記憶媒体；光ディスクなどの光磁気記録媒体；搬送波信号処理コンポーネント及び／またはモジュール；ならびに特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブル論理素子（ＰＬＤ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）デバイスなどのプログラムコードを格納及び実行するように特別に構成されたハードウェアデバイスが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。本明細書に記載の他の実施形態は、例えば、本明細書で論じる命令及び／またはコンピュータコードを含み得るコンピュータプログラム製品に関する。
図３Ａの様々な実施形態を上記に記載したが、それらは単に例示としてのみ提示したに過ぎず、それらに限定するものではないことを理解すべきである。上記の方法及び工程が特定の順序で起こる特定の事象を示す場合、特定の工程の順序は変更してもよい。さらに、ある種の工程は、可能な場合には、並行プロセスにおいて並行して実行してもよく、ならびに上記のように順次実行してもよい。様々な実施形態を、特定の特徴及び／または構成要素の組合せを有するものとして説明してきたが、本明細書に記載する実施形態のいずれかに基づく任意の特徴及び／または構成要素の任意の組合せまたは部分組合せを有する他の実施形態も可能である。さらに、様々な実施形態を、特定のコンピューティングデバイスに関連付けた特定のエンティティを有するものとして説明してきたが、他の実施形態では、異なるエンティティを、他の及び／または異なるコンピューティングデバイスに関連付けることができる。
［実験データ及び実施例］
本発明の開示を、以下の実験データ及び実施例を示すことによってさらに説明する。しかしながら、これらの実験データ及び実施例は、上述の実施形態と同様に、例示的なものであり、いかなる点においても開示する発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないことに留意すべきである。
［実施例１］
図２に提供する工程を参照されたい。
２０００：ウシ第一胃試料由来の細胞をマトリックスから剪断した。これは、超音波処理またはボルテックスによって試料を激しく配合または混合し、続いて細胞からのマトリックス除去のための分画遠心法によって行うことができる。遠心分離には、ＮｙｃｏｄｅｎｚまたはＰｅｒｃｏｌｌを用いる勾配遠心分離工程が含まれ得る。
２００１：生物を、特定の生物型を標的とする蛍光色素を用いて染色する。フローサイトメトリーを用いて、染色特性及びサイズに基づいて異なる集団を同定する。
２００２：試料中の生物の絶対数を、例えばフローサイトメトリーによって測定する。本工程では、所定の体積中に存在する生物型（細菌、古細菌、真菌、ウイルスまたは原生生物など）の数に関する情報が得られる。
２００３：ウシ第一胃試料を取得し、マトリックスに接着した細胞をビーズ法によって直接溶解させる。全核酸を精製する。全精製核酸をＲＮＡｓｅで処理して精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を得る。ｑＰＣＲを用いて、バルクｇＤＮＡから特定のマーカーを同時に増幅し、配列決定アダプター及びバーコードを各マーカーに付加する。指数関数的増幅の開始時にｑＰＣＲ反応を停止させて、ＰＣＲ関連のバイアスを最小化する。試料をプールし、プールした試料に対してＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑを用いて多重化配列決定を行う。
２００４：ウシ第一胃試料由来の、マトリックスに接着した細胞を、ビーズ法によって直接溶解させる。全核酸を、カラムに基づくアプローチを用いて精製する。全精製核酸をＤＮＡｓｅで処理して精製ＲＮＡを得る。全ＲＮＡを、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換する。ｑＰＣＲを用いて、バルクｃＤＮＡから特定のマーカーを同時に増幅し、配列決定アダプター及びバーコードを各マーカーに付加する。指数関数的増幅の開始時にｑＰＣＲ反応を停止させて、ＰＣＲ関連のバイアスを最小化する。試料をプールし、プールした試料に対してＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑを用いて多重化配列決定を行う。
２００５：配列決定出力結果（ｆａｓｔｑファイル）を、品質の低い塩基対及びトランケートされた読取り結果を除去することによって処理する。カスタマイズしたＵＰＡＲＳＥパイプラインを用いてＤＮＡベースのデータセットを解析し、配列読取り結果を、既存のデータベースエントリと照合して、集団内の株を同定する。ユニークな配列をデータベースに追加する。カスタマイズしたＵＰＡＲＳＥパイプラインを用いて、ＲＮＡベースのデータセットを解析する。更新したデータベースを用いて活性株を同定する。
２００６：前のステップ（２００５）で得られた株同一性データを用いて、各株を表す読取り結果の数を測定し、全読込みに対する割合として表す。割合に細胞数を乗じて（２００２）、試料及び所与の体積中の各生物型の絶対細胞数を計算する。ＲＮＡベースのデータセットに存在するマーカー配列を適切な閾値と共に使用して、絶対細胞数データセット内で活性株を同定する。閾値を満たさない株は解析から除外する。
２００７：２００３〜２００６を繰り返し、複数のウシ第一胃内の微生物集団の動態を表す時系列変化を確立する。時間的なデータをコンパイルし、各試料について各活性生物株の細胞数及びメタデータを、数量または存在量マトリックスに格納する。数量データを重み付けしたルールマイニング手法を使用して、数量マトリックスを用いて、特定の時点の試料中の活性株間の関連を同定する。フィルターを適用して重要でないルールを除去する。
２００８：変化の方向性（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）に注目して、活性株の細胞数の時系列変化を計算する。マトリックスをネットワークとして表し、生物株はノードを表し、数量で重み付けしたルールはエッジを表す。マルコフ連鎖とランダムウォークを利用して、ノード間の連結性を判定し、クラスターを定義する。所望のメタデータ（環境パラメータ(複数可)）に関連するクラスターを同定するために、クラスターをフィルタリングする。時間経過に伴う細胞数の変化及び標的クラスターに存在する株を統合することによって標的生物株をランク付けし、細胞数における最も多くの変化を最も高くランク付けする。
［実施例２］
実験計画ならびに材料及び方法
目的：乳牛の乳脂肪生産に影響を与える第一胃の微生物群集成分を決定する。
動物：実験に使用するために、反芻胃にカニューレを挿入した８頭の泌乳ホルスタイン牛を個々のタイストールに収容した。ウシに毎日２回給餌し、１日２回搾乳し、常に淡水にアクセス可能な状態にした。実験前の流産に起因する合併症のために、最初の食物由来の乳脂肪減少の後に、１頭のウシ（ウシ１）を研究から除外した。
実験計画及び治療：この実験は、２つの群及び１つの実験期間を有するクロスオーバーデザインを用いた。実験期間は３８日間に及び：共変量／休薬期間が１０日間、データ収集及びサンプリングが２８日間であった。データ収集期間は、１０日間の食物由来の乳脂肪減少（ＭＦＤ）及び１８日間の回復からなっていた。第一の実験期間の後、期間２の開始前に、１０日間の休薬期間をすべてのウシに与えた。
高デンプン分解性（７０％分解性）及び高度不飽和脂肪酸レベル（ＰＵＦＡ、３．７％）を有する繊維含量の低い（２９％ＮＤＦ）混合飼料（ＴＭＲ）を用いて、食物由来のＭＦＤを誘導した。回復期には、デンプン分解性の異なる２つの食餌が含まれていた。４頭のウシには、高い繊維含量（３７％ＮＤＦ）、低いＰＵＦＡ（２．６％）、及び高いデンプン分解性（７０％分解性）の回復用食餌を無作為に割り当てた。残りの４頭のウシには、高い繊維含量（３７％ＮＤＦ）、低いＰＵＦＡ（２．６％）だが、低いデンプン分解性（３５％）の回復用食餌を与えた。
１０日間の共変量及び１０日間の休薬期間の間、高繊維、低ＰＵＦＡ、及び低デンプン分解性の食餌をウシに与えた。
試料及び測定：共変量、休薬、及び試料採取期間を通して、各動物の産乳量、乾物摂取量、及び飼料効率を毎日測定した。栄養組成に関してＴＭＲ試料を測定した。採取期間中、３日毎に乳試料を採取し、解析した。乳成分濃度（乳脂肪、乳タンパク質、乳糖、乳中尿素窒素、体細胞数、及び固形分）ならびに脂肪酸組成物について試料を解析した。
採取期間中、３日ごとに第一胃の試料を採取し、微生物群集の組成及び活性について解析した。食物由来のＭＦＤの０日目、７日目、及び１０日目の給餌の、０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２時間後に第一胃から集中的に採取した。同様に、回復期の１６日目及び２８日目の給餌の、０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２時間後に第一胃から集中的に採取した。第一胃の内容物を、ｐＨ、酢酸濃度、酪酸濃度、プロピオン酸濃度、イソ酸濃度、ならびに長鎖及びＣＬＡ異性体濃度について解析した。
第一胃試料調製及び配列決定：採取後、第一胃の試料をスイングバケット遠心分離機内で、４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離した。上清をデカントし、各第一胃の内容物の試料（１〜２ｍｇ）の一定分量を、０．１ｍｍのガラスビーズを事前に充填した滅菌１．７ｍＬチューブに添加した。第二のアリコートを採取し、細胞計数のために空の滅菌１．７ｍＬチューブに保存した。
ガラスビーズを含む第一胃の試料（第一のアリコート）をビーズ法でホモジナイズして微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑでの配列決定用に調製した。３００塩基対を有する試料を、ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてライブラリーの各末端上で配列決定した。空のチューブの第一胃の試料（第二のアリコート）を染色し、フローサイトメーターに通して、各試料中の各微生物型の細胞数を定量した。
配列読取り結果の処理及びデータ解析：配列読取り結果を、マーカー遺伝子に基づいて第一胃内に存在する細菌種を同定するために高い品質でトリミングし、処理した。カウントデータセット及び活性データセットを配列読取り結果と統合して、第一胃微生物群集内の活性微生物種の絶対細胞数を測定した。生産した牛乳のポンド量を含む、ウシの生産特性の時系列変化は、相互情報を用いた実験の過程における各試料内の活性微生物の分布に関連していた。生産した乳脂肪のポンド量と各活性微生物の絶対細胞数との間の最大情報係数（ＭＩＣ）スコアを計算した。微生物をＭＩＣスコアでランク付けし、最も高いＭＩＣスコアを有する微生物を、生産した牛乳のポンド量に最も関連する標的種として選択した。
カウントデータ、活性データ、ならびに最終産物へのカウント及び活性の影響を判定するためのテストケースを、配列決定解析から適切なデータセットを省略することによって実施した。ＭＩＣよりもむしろ線形相関が標的選択へ及ぼす影響を評価するために、活性微生物の絶対細胞数及びすべての微生物の相対存在量と比較した場合の、生産した乳脂肪のポンド量に対するピアソン係数も計算した。
結果と考察
相対的存在量に対する絶対細胞数
ＭＩＣスコアに基づいて、細胞数データ（絶対細胞数、表２）を含むデータセット、及び細胞数データ（相対存在量、表１）を含まないデータセットについて、上位１５種の標的種を同定した。最終的な標的選択への細胞数データの影響を分離するために、本解析では活性データを使用しなかった。最終的に、上位８つの標的は２つのデータセットで同じであった。残りの７つのうち、５つの株が両方のリストに様々な順序で存在していた。これらの５株のランクの差異にもかかわらず、各株について算出したＭＩＣスコアは２つのリスト間で同一であった。絶対細胞数リストに存在するが、相対存在量リストには存在しない２つの株ａｓｃｕｓ＿１１１及びａｓｃｕｓ＿２８８は、相対存在量リスト上ではそれぞれランク９１及びランク１６であった。相対存在量リストには存在するが、絶対細胞数リストには存在しない２つの株ａｓｃｕｓ＿１０２及びａｓｃｕｓ＿２５２は、絶対細胞数リスト上ではそれぞれランク５０及びランク１９であった。これらの４株は、各リスト上で異なるＭＩＣスコアを有しており、このことは、これらの株のランクのシフト、及びリスト内の他の株へのその後の影響を説明するものであった。
細胞計数データの統合は、各株に割り当てられた最終ＭＩＣスコアに必ずしも影響を与えなかった。これは、３８日間の実験の過程にわたって、微生物の個体数が毎日第一胃内でシフトしたにもかかわらず、それは常に１０７〜１０８細胞／ｍＬの範囲内にあったという事実によるものである可能性がある。個体数の大幅な変化は、間違いなく最終的なＭＩＣスコアに大きな影響を及ぼすと考えられる。
非活性種に対する活性種
活性データに基づいた株のフィルタリングの影響を評価するために、標的種は、活性データあり（表３）及び活性データなし（表１）での相対的存在量を利用したデータセットならびに活性データあり（表４）及び活性データなし（表２）での絶対細胞数を利用したデータセットから同定した。
相対存在量の場合について、活性データを適用する前に、ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、ａｓｃｕｓ＿３４１、及びａｓｃｕｓ＿２５２を標的株とみなした。これらの８つの株（最初の上位１５種の標的の５３％）は、活性データを統合した後にランク１５より下位に落ちた。絶対細胞数の場合についても同様の傾向が認められた。Ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、及びａｓｃｕｓ＿３４１（最初の上位１５ターゲットの４６％）は、活性データセット統合後にランク１５より下位に落ちた。
活性データセットは、細胞数データセットよりも標的ランク及び選択に対してはるかに深刻な影響を及ぼした。これらのデータセットを共に統合する際、試料が不活性であると分かった場合には、試料を本質的に「０」に変更し、解析の一部とはみなさない。このため、試料内の点の分布は、統合後に大きく変化するか、または歪曲するようになる場合があり、そのことが今度は、最終的なＭＩＣスコア、したがって標的微生物のランク順位に大きく影響を及ぼす。
相対的存在量及び不活性、それに対する絶対細胞数及び活性
最終的に、本明細書で定義する方法は、細胞数データ及び活性データの両方を利用して、関連するメタデータ特性に高度に関連する微生物を同定する。両方の方法（表４、表１）を用いて選択した上位１５種の標的のうち、７つの株のみが両方のリストに見出された。８つの株（５３％）は絶対細胞数及び活性のリストに固有のものであった。両方のリストの上位３つの標的は、株とランクの両方において一致した。しかしながら、３つのうち２つは両方のリスト上で同じＭＩＣスコアを有しておらず、このことは、活性データセットの統合の影響を受けているが、ランク順位を転覆させるには十分ではないことを示唆している。
線形相関に対するノンパラメトリックアプローチ
生産した乳脂肪のポンド量と各試料中の活性微生物の絶対細胞数との間のピアソン係数及びＭＩＣスコアを計算した（表５）。ＭＩＣ（表５ａ）またはピアソン係数（表５ｂ）のいずれかによって株をランク付けし、乳脂肪生産に最も関連する標的株を選択した。ＭＩＣスコア及びピアソン係数を、いずれの場合においても報告する。６つの株が両方のリストに見出され、これはＭＩＣアプローチを用いて９つの（６０％）ユニークな株を同定したことを意味している。リスト間の株のランク順位は一致せず、各方法によって同定した上位３種の標的株もユニークであった。
ピアソン係数のように、ＭＩＣスコアは０〜１の範囲にわたって報告され、１は２つの変数間の非常に緊密な関係を示唆する。ここで、上位１５種の標的は０．９７〜０．７４の範囲のＭＩＣスコアを示した。しかしながら、相関テストの場合のピアソン係数は、０．５３〜０．４５の範囲であり、相互情報テストの場合よりも大幅に低かった。この不一致は、各解析方法に固有の差異による可能性がある。相関は線の周りの点の分散を測定する線形推定であるが、相互情報は確率分布を利用し、２つの分布間の類似性を測定する。実験の過程で、生産した乳脂肪のポンド量は非線形に変化した（図４）。この特定の関数は、相関よりも相互情報によって良好に表現され、近似される。このことを調べるために、相関及び相互情報を用いて同定した上位標的株Ａｓｃｕｓ＿７１３（図５）及びＡｓｃｕｓ＿７（図６）をそれぞれプロットし、各方法が株と乳脂肪との間の関係をどれくらいうまく予測したかを判定した。２つの変数が強い相関関係を示す場合、それらを互いに対してプロットした際に、それらは点の分散がほとんどまたは全くない線によって表される。図５において、Ａｓｃｕｓ＿７１３は広範な点で示されるように、乳脂肪と弱く相関している。相互情報は、ここでも、点の２つの分布がどれほど類似しているかを測定する。Ａｓｃｕｓ＿７を乳脂肪でプロットすると（図６）、２点の分布は非常に類似していることは明らかである。
従来のアプローチに対する現行の方法のすべて
微生物群集を解析する従来のアプローチは、活性情報を組み込まない相対存在量データの使用に依存しており、最終的に微生物種のメタデータに対する単純な相関で終了する（例えば、米国特許第９，２０６，６８０号を参照されたく、上記文献は、すべての目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する）。ここでは、各データセットの組込みが標的の最終リストに漸進的にどのように影響を与えるかを示した。その全体を適用する場合、本明細書中に記載する方法は、従来の方法（表５ａ及び５ｃ）と比較した場合に、全く異なる標的のセットを選択した。従来の手法を用いて選択した最上位の標的株Ａｓｃｕｓ＿３０３８を、乳脂肪に対してプロットし、相関の強さを視覚化した（図７）。先の実施例と同様に、Ａｓｃｕｓ＿３０３８もまた乳脂肪との相関が弱かった。
表５：相互情報または相関を用いた上位１５種の標的株
［実施例３］
ウシの総乳脂肪、乳タンパク質、及びエネルギー調整乳（ＥＣＭ）を増加させる
実施例３は、泌乳反芻動物が産生した乳脂肪及び乳タンパク質の総量及び計算したＥＣＭを増加させることを目的とする特定の実施態様を示す。本明細書中で使用する場合、ＥＣＭとは、乳量、乳脂肪、及び乳タンパク質に基づく乳中のエネルギー量を表す。ＥＣＭは乳成分を脂肪３．５％、タンパク質３．２％に調整し、したがって動物の性能を均等化し、それによって個々の動物及び群の生産量を時間の経過とともに比較することができるようになる。本開示に関連してＥＣＭを計算するために使用する方程式は：
ＥＣＭ＝（０．３２７×牛乳のポンド量）＋（１２．９５×脂肪のポンド量）＋（７．２×タンパク質のポンド量）
開示する方法を利用して、活性な相互関係のある微生物／微生物株を同定し、そこから微生物アンサンブルを生成する本明細書に提示する方法論の適用は、泌乳反芻動物が生産する乳脂肪及び乳タンパク質の総量の増加を示す。これらの増加は、ホルモンのさらなる添加を必要とせずに実現した。
本実施例では、上記の開示に従って同定して生成した２つの単離した微生物Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙを含む微生物アンサンブルを、ホルスタイン牛に、５週間の期間にわたる泌乳期の中間段階で投与した。ウシを無作為に８つのうち２つの群に割り当て、そこにおいて群のうちの１つは、微生物アンサンブルを含まない緩衝液を与えた対照群であった。第二の群、実験群には、Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙを含む微生物アンサンブルを１日１回、５週間投与した。各ウシを個々の飼育室に収容し、飼料及び水に随時アクセス可能な状態にした。食餌は、産乳量を高める食餌であった。ウシを自由に飼育し、その日の終わりに飼料の重量を測定し、前日の拒絶量を計量して差し引いた。計量は、Ｓａｌｔｅｒ Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（フェアモント、ミネソタ州）のＰＳ−２０００スケールを用いて行った。
ウシにカニューレを挿入して、カニューレをウシの第一胃内に延出させる。カニューレ挿入後、対照投薬量または実験投薬量を投与する前に、ウシにはさらに少なくとも１０日間の回復を与えた。
対照群への投与は中性生理食塩水２０ｍｌからなり、実験群への投与は２０ｍｌの中性生理食塩水に懸濁したおよそ１０９個の細胞からなっていた。対照群には、１日１回２０ｍｌの生理食塩水を与えたが、実験群には、記載の微生物アンサンブルの１０９個の微生物細胞をさらに含む生理食塩水２０ｍｌを与えた。
０、７、１４、２１、及び３５日目にすべてのウシの第一胃を採取し、そこにおいて０日目は微生物投与の前日であった。実験及び対照投与は、第一胃を採取した後、その日のうちに行ったことに留意されたい。第一胃の毎日のサンプリングは、０日目に、採取した第一胃液に、記録のためにＨａｎｎａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ウーンソケット、ロードアイランド州）のｐＨメーターを挿入することとともに開始した。第一胃のサンプリングには、カニューレを通した第一胃の中央、背側、腹側、前側、及び後側領域からの微粒子及び流体サンプリングの両方が含まれ、５つの試料すべてを、１．５ｍｌの停止溶液を含む１５ｍｌのコニカルバイアルにプールした（９５％エタノール、５％フェノール）。各サンプリング日に糞便試料も採取し、そこにおいて触診スリーブを用いて直腸から糞便を採取した。各サンプリング時にウシの体重を測定した。
糞便試料を２オンスのバイアルに入れ、凍結保存し、解析して、見かけの中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）消化率、見かけのデンプン消化率、及び見かけのタンパク質消化率の値を測定した。第一胃のサンプリングは、第一胃の流体部分及び粒子部分の両方をサンプリングすることからなり、その各々を１５ｍｌコニカルチューブに保存した。細胞を１０％停止溶液（５％フェノール／９５％エタノール混合物）で固定化し、４℃に保ち、氷上でＡｓｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンディエゴ、カリフォルニア州）に輸送した。
産乳量は、朝に１回、夜に１回、１日２回測定した。乳組成（脂肪％及びタンパク質％など）を、１日に２回、朝に１回、夜に１回測定した。トゥーレアリ乳牛群改良協会（ＤＨＩＡ）（トゥーレアリ、カリフォルニア州）において、乳試料を、タンパク質脂肪、固形分、乳中尿素窒素（ＭＵＮ）の解析、及び体細胞数（ＳＣＣ）の近赤外分光法でさらに解析した。個々のウシの飼料摂取量及び第一胃のｐＨを１日１回測定した。
混合飼料（ＴＭＲ）の試料を、適応期間の最終日に採取し、次いで週に１回連続して採取した。サンプリングは、四分法で実施し、試料を真空密閉袋に入れ、Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ Ｖａｌｌｅｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ヘイガーズタウン、メリーランド州）に輸送し、ＮＩＲ１パッケージで解析した。緩衝液及び／または微生物のバイオアンサンブルの投与の最終日は３５日目であったが、他のすべての測定及びサンプリングは、記載したように４６日目まで継続した。
図８Ａは、開示する方法に基づいて微生物アンサンブルを摂取したウシが、緩衝溶液のみを投与したウシに対して乳脂肪の平均生産を２０．９％増加させることを示す。図８Ｂは、微生物アンサンブルを投与したウシが、緩衝溶液のみを投与したウシに対して乳タンパク質の平均生産を２０．７％増加させることを示す。図８Ｃは、微生物アンサンブルを投与したウシが、エネルギー調整乳の平均生産を１９．４％増加させることを示す。図８Ａ〜Ｃに認められる増加は、データ点と交差する垂直線によって描かれているように、アンサンブルの投与が終了した後、あまり顕著にならなかった。
［実施例４］
ブロイラーニワトリにおける病変形成の原因物質としてのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの検出
１６０羽のオスのＣｏｂｂ ５００を、様々なレベルのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓで投与した（表６ａ）。それらを２１日間飼育し、屠殺し、病変をスコア付けして壊死性腸炎の進行及びＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの影響を定量化した。
実験計画
トリを、［約０．６９平方フィート／トリ］の床面積及びトリの密度、温度、照明、フィーダーならびに水を提供する木製の養鶏柵（約４’×４’−フィーダースペース２．２５平方フィート）内の環境管理設備に収容した。トリを、適切な深さの木屑を入れたきれいな養鶏柵に入れて、雛に快適な環境を提供した。試験中に、試験対象のトリにとって快適な条件に対して湿り過ぎとなった場合、追加の木屑を養鶏柵に加えた。照明は白熱灯を介して行い、以下のように市販の照明プログラムを使用した。
トリの環境条件（すなわち、トリの密度、温度、照明、フィーダー及び水のスペース）は、すべての処置群で同様であった。養鶏柵から別の養鶏柵へのトリの移動及び細菌の拡散を防ぐために、各養鶏柵は、養鶏柵の間におよそ２４インチの高さの固体（プラスチック）の仕切りを備えていた。
ワクチン接種及び治療薬：
孵化場でトリにマレック病に対するワクチン接種を行った。受取り後（試験０日目）、トリにニューカッスル病及び感染性気管支炎に対するワクチン接種をスプレー噴霧により行った。ワクチン製造業者の記録、ロット番号及び有効期限を、最終報告とともに提供した。
水：
１つの養鶏柵あたり１つのプラソン給水器を介して、試験を通して水を随時提供した。給水器を毎日２回点検し、必要に応じて洗浄し、トリへの清潔で一定した水の供給を確保した。
飼料：
養鶏柵あたり１個の吊り下げ式の直径約１７インチのチューブフィーダーを介して、飼料を、試験を通して随時提供した。雛鳥フィーダートレーをおよそ最初の４日間、各養鶏柵に入れた。実験計画に従って、受け取り（第０日）に際して、トリをそれぞれの処置用食餌下に置いた。０日目から試験終了まで、養鶏柵に添加及び取り除いた飼料を計量して記録した。
毎日の観察：
試験設備、養鶏柵及びトリを、一般的な集団状態、照明、水、飼料、換気及び予期しない事象について、少なくとも１日２回、観察した。１日２回の観察のいずれかで異常な状態または異常な行動が認められた場合、それらを文書に記録し、その文書記録を試験記録とともに含めた。試験設備の最低−最高温度を１日１回記録した。
養鶏柵の札：
各養鶏柵に２枚の札を取り付けた。１枚の札は養鶏柵の番号を識別するものであり、２枚目は処置番号を示すものであった。
動物の取扱い：
動物を、居住性に対して理想的な条件下に保持した。怪我や不必要なストレスを軽減するように動物を扱った。人道的措置を厳格に施行した。
獣医医療、介入及び安楽死：
試験手順と無関係の臨床的に重大な併発疾患を発症したトリは、試験調査員またはその代理人の裁量で、試験から除外し、部位ＳＯＰに従って安楽死させた。また、瀕死のトリや怪我をしたトリも、現場の獣医師または資格のある技術者の権限で安楽死させた。任意の除外理由を文書に記録した。動物が死亡した場合、または人道的理由のために除外し、安楽死させた場合は、養鶏柵の死亡票に記録し、剖検を実施し、除外理由を文書ファイル化した。
安楽死が必要であると試験調査員が判断した場合、動物を頸椎脱臼により安楽死させた。
死亡率及び選別処分：
試験０日目に開始して、死亡が認められたか、または除外して屠殺したトリを秤量し、剖検した。飼料や水に到達することができなかったトリを選別処分し、秤量し、文書に記録した。重量、ならびに死亡及び剖検所見の推定原因を、養鶏柵の死亡率記録に記録した。
体重及び摂食量：
およそ１４日目及び２１日目に、トリを、養鶏柵ごとに、及び個々に秤量した。各養鶏柵に残っている飼料を計量し、試験日１４日及び２１日に記録した。１４〜２１日目の飼料摂取量を計算した。
体重増加及び飼料変換：
各秤量日における養鶏柵及び個別個体に基づいたトリの平均体重をまとめた。試験日２１日目（すなわち、０〜２１日目）における養鶏柵の総飼料消費量を、生存しているトリの総重量で割ったものを用いて、平均飼料変換率を計算した。補正飼料変換率は、養鶏柵内の全飼料消費量を、生存しているトリの総重量、及び死亡したかまたはその養鶏柵から除外したトリの重量で割ったものを用いて計算した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの投与
投与方法：
本試験におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５、Ａ型、α及びβ２毒素）培養物を、飼料を介して投与した。培養物との混合に、各養鶏柵のフィーダーからの飼料を用いた。培養物を養鶏柵に入れる前に、約４〜８時間、処置用飼料をトリから取り出した。トリの各養鶏柵について、約２．０〜９．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度の試験設計に基づく一定量のブロス培養物を、フィーダートレー中の一定量の飼料（約２５ｇ／トリ）と混合し、投与したすべての養鶏柵を同じように扱った。ほとんどの培養飼料は１〜２時間以内に消費された。すべての処置におけるトリを同様に扱うために、投与していない群も、投与した群と同じ期間に飼料を取り出した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの投与：
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物（ＣＬ−１５）を、デンプンを含有する流体チオグリコール酸培地中、約３７℃で約５時間増殖させた。ＣＬ−１５は、コロラド州でのブロイラーの大流行に由来するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外株である。新鮮なブロス培養物を調製し、毎日使用した。トリの各養鶏柵について、固定量の一晩培養液をフィーダートレー中で一定量の処理飼料と混合した（投与参照）。飼料の量、培養種菌の量及び定量、ならびに投与日数を、最終報告書に文書で記録し、すべての養鶏柵を同じように扱う。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物をトリに１日間与えた（試験１７日目）。
収集データ：
−本開示によるＡｓｃｕｓプラットフォーム法による解析のための腸の内容物。
−およそ１４日目と２１日目に、トリの体重を養鶏柵ごとに、及び個別に、ならびに飼料効率を養鶏柵ごとに。
−０日目から試験終了までに、各養鶏柵に添加し、及び取り除いた飼料の量。
−死亡率：０日目から試験終了までの、性別、重量及び死亡原因。
−除外したトリ：０日目から試験終了までの、選別処分の理由、性別及び重量。
−設備とトリの毎日の観察結果、毎日の設備の温度。
−およそ２１日目におけるトリ５羽／養鶏柵の病変
病変のスコア付け：
最後のＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物投与の４日後に、第一のトリ捕獲によって、各養鶏柵から無作為に５羽のトリを選択し、屠殺し、腸病変を壊死性腸炎に関してスコア付けした。病変を以下のようにスコア付けした：
−０＝正常：ＮＥ病変がなく、小腸は正常な弾力性を有する（開創後に正常な位置に戻る）
−１＝軽度：小腸壁は薄く、弛緩している（開創時は平らなままであり、開創後は正常な位置に戻ることはない）；粘液膜を覆う過剰な粘液
−２＝中等度：腸壁の顕著な赤み及び腫れ；腸膜の軽度の潰瘍形成及び壊死；過剰な粘液
−３＝重度：小腸膜の広範な領域（複数可）での壊死及び潰瘍；重大な出血；粘液膜上のフィブリン及び壊死破片の層（トルコタオル様の外観）
−４＝死亡または瀕死：２４時間以内に死亡が見込まれ、ＮＥ病変スコアが２以上であるトリ
結果
結果は、上記の方法（例えば、図１Ａ、１Ｂ、及び２を参照して、ならびに本明細書を通して説明したように）、ならびに従来の相関アプローチ（上記のような）を用いて解析した。各トリの小腸の内容物について、株レベルの微生物の存在量及び活性を測定し、これらの特性を２つの異なるトリの特徴：すなわち個々の病変スコア、及び養鶏柵の平均病変スコアに関して解析した。
個々の病変スコア解析には３７羽のトリを用いた―４０羽のトリをスコア付けしたものの、解析するのに十分な腸内物質を有していたのは３７羽のみであった。同一の配列読取り結果及び同一の配列決定解析パイプラインを、本開示のＡｓｃｕｓアプローチ及び従来のアプローチの両方に用いた。しかしながら、Ａｓｃｕｓアプローチには、以前に詳述したように、各試料の細胞数情報だけでなく活性情報も統合した。
Ａｓｃｕｓの相互情報アプローチを用いて、３７羽のブロイラーの活性株の豊富さと個々の病変スコアとの間の関係をスコア付けした。従来型アプローチについて、３７羽のブロイラーの、株と個々の病変スコアとの間でピアソン相関を計算した。原因株Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、試料のプールから同定した生物のリストに対するグローバルアラインメント検索によって確認した。次いで、各解析方法の出力において、この特定の株のランクを同定した。Ａｓｃｕｓアプローチは、実験で投与したＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを、個々の病変スコアと関連する最上位の株として同定した。従来のアプローチでは、この株は個々の病変スコアと関連する２６番目に高い病原菌であった。
平均病変スコア解析に１０２羽のトリを使用した。前の事例と同様に、Ａｓｃｕｓアプローチと従来のアプローチの両方で同じ配列読取り結果及び同じ配列決定解析パイプラインを使用した。ここでもまた、Ａｓｃｕｓアプローチには、各試料の細胞数情報だけでなく、活性情報も統合した。
Ａｓｃｕｓ相互情報アプローチを用いて、各養鶏柵の活性株の存在量と平均病変スコアとの間の関係をスコア付けした。従来のアプローチについては、各養鶏柵の株と平均病変スコアとの間でピアソン相関を計算した。原因株Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、試料のプールから同定した生物のリストに対するグローバルアラインメント検索によって確認した。次いで、各解析方法の出力において、この特定の株のランクを同定した。Ａｓｃｕｓアプローチは、実験で投与したＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを、養鶏柵の平均病変スコアと関連する４番目に高い株として同定した。従来のアプローチでは、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、養鶏柵の平均病変スコアと関連する１５番目に高い株であった。養鶏柵の平均病変スコアは、Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの感染レベルが様々に異なっており、それがバルク／平均測定によってマスクされているため、個々の病変スコアに比べてあまり正確ではない。個々の病変スコア解析を養鶏柵の平均病変スコア解析と比較した場合、ランクが低下することが予想された。収集したメタデータを以下のように提供する。
［実施例５］
相関ベースのアプローチと比較した場合の、相互情報ベースのアプローチを用いた複雑な微生物群集における関係性を検出する能力
乳脂肪減少エピソードの間に、３頭の授乳中期ホルスタイン牛からカニューレを介して一連の第一胃の飼料を採取した。０日目、７日目、１０日目、１６日目、及び２８日目の午前４時に第一胃試料を採取した。第一胃の内容物から精製したＤＮＡから配列決定ライブラリーを調製し、配列決定した。
生の配列読取り結果を使用して、試料プール中に存在するすべての微生物株を同定した。４，７２９個のユニークな株を、試料プール中で同定した。次いで、各微生物株の相対存在量を計算し、その後の解析に用いた。
各時点で各動物が生産した乳脂肪の測定したポンド量を表８ａに示す。この解析に使用するために、乳脂肪値を導出し、そこから１を引くことによってｍｏｃｋ株を作成し、ｍｏｃｋ株と乳脂肪値が時間の経過と共に同一になるようにした。すなわち、ｍｏｃｋ株と乳脂肪値との間には公知の線形傾向／関係性が存在する。次に、このｍｏｃｋ株を、以前に群集内で同定したすべての株のマトリックスに加えた。ＭＩＣ値及びピアソン係数を、生産した乳脂肪のポンド量と様々な条件（後述）についてのマトリックス内のすべての株との間で同時に計算し、関係の予測因子としてこれらの尺度の感度及びロバスト性を確定した。
伝統的な方法と比較した場合の、開示する本発明の方法の、関係性を検出する能力を試験するために、ｍｏｃｋ株のデータ点を１つずつ除去した（相対存在量を０に設定した）。各データポイントの除去後にＭＩＣ及びピアソン係数を再計算し、ｍｏｃｋ株のランクを記録した（表８ｂ）。理解されるように、ＭＩＣは、ピアソン係数よりはるかにロバスト性の高い尺度であった。どちらの方法も、データ点を除去しなかった場合には、生産した乳脂肪のポンド量に関連する最上位の株としてｍｏｃｋ株を同定することができた。しかしながら、ある点を除去した場合、相関法ではｍｏｃｋ株はランク５５に下がり、その後、さらに点を除去した場合、ランク２１４２となった。ＭＩＣは、６点を除去するまで、ｍｏｃｋ株を最上位ランクの株として予測し続けた。
感度を試験するために点を除去することの背後にある１つの理論的根拠は、標的群（例えば、動物）のマイクロバイオームを見る際、それらのすべてに共通する特定の株が存在するということであり、それらは、コアマイクロバイオームと呼ぶことができる。この群は、特定の標的（例えば、特定の動物）の微生物集団の少数を表すことができ、標的／動物のサブセット／小部分においてのみ見出される株の完全な別個の集団が存在し得る。いくつかの実施形態では、よりユニークな株（すなわち、すべての動物に見出されない株）は、特に関連性のある株であり得る。開示する方法のいくつかの実施形態は、データセットにおけるそのような「ギャップ」に対処し、したがって特に関連する微生物及び株を標的とするために開発された。
［実施例６］
ブロイラーニワトリにおける飼料効率を改善するための活性微生物群集のアンサンブルの選択
９６羽のオスのＣｏｂｂ ５００を２１日間飼育した。個々のトリについて重量及び飼料摂取量を測定し、屠殺後に盲腸掻爬物を採取した。本開示の方法を用いて盲腸試料を処理して、生産環境においてブロイラーニワトリに投与した場合に飼料効率を高める微生物のアンサンブルを同定した。
実験計画
１２０羽のＣｏｂｂ ５００の雛を、食餌処理に基づいて分割し、養鶏柵に入れた。０〜１４日の処理によってトリを養鶏柵に入れた。試験設備は、２つの養鶏柵の１ブロックと２つの個々のケージの４８ブロックとに分けた。完全な無作為ブロック設計を用いて、処理を養鶏柵／ケージに割り当て；養鶏柵／ケージは試験を通してその処理を保持した。処理は数値コードによって識別した。トリはケージ／養鶏柵にランダムに割り当てた。特定の処理群は、表９において以下の通りであった。
ハウジング：
ケージ／養鶏柵の処理の割り当ては、コンピュータプログラムを用いて行った。コンピュータで生成した割り当ては、次のとおりである：
きれいなリターを有する固体プラスチック（高さ４’）で構築した大きなコンクリート製の養鶏柵（４’×８’）内の環境管理設備にトリを収容した。１４日目に９６羽のトリを同じ環境管理設備内のケージに移した。各ケージは２４”×１８”×２４”であった。
照明は白熱灯を介して行い、市販の照明プログラムを使用した。２４時間毎の連続光の時間は、表１０において以下の通りであった。
トリの環境条件（すなわち、０．５３ｆｔ２）、温度、照明、フィーダー及び水空間）は、すべての処理群で同様であった。
トリの移動を防止するために、各養鶏柵をチェックして、養鶏柵間の高さおよそ１４インチの間に１インチ以上の開口部が存在しないことを確認した。
ワクチン接種：
孵化場でトリにマレック病に対するワクチン接種を行った。受取り後（試験０日目）、トリにニューカッスル病及び感染性気管支炎に対するワクチン接種をスプレー噴霧により行った。ワクチン製造業者の記録、ロット番号及び有効期限を、最終報告とともに提供した。
水：
試験を通して水を随時提供した。養鶏柵の水は自動ベル給水器を介して供給した。バタリーケージの水は、１つのニップル式給水器を介して供給した。給水器を毎日２回点検し、必要に応じて洗浄し、トリへの清潔で一定した水の供給を確保した。
飼料：
試験を通して、飼料を随時提供した。養鶏柵への給餌は、直径約１７インチの吊り下げ式のフィーダーを介して行った。バタリーケージへの給餌は、９”×４”の１つのフィーダー飼葉桶を介して行った。およそ最初の４日間、雛用のフィーダートレーを各養鶏柵に配置した。
毎日の観察：
試験設備、養鶏柵及びトリを、一般的な集団状態、照明、水、飼料、換気及び予期しない事象について少なくとも１日２回観察した。試験設備の最低−最高温度を１日１回記録した。
死亡率及び選別処分：
試験０日目に開始して、死亡が認められたか、または除外して屠殺したトリを剖検した。飼料や水に到達することができないトリを屠殺し、剖検した。死亡の推定原因及び剖検所見を、養鶏柵の死亡票に記録した。
体重及び摂食量：
約９６羽のトリを毎日個別に計量した。各ケージに残った飼料を計量し、１４〜２１日間、毎日記録した。各ケージの飼料摂取量を毎日測定した。
体重増加及び飼料変換：
１４〜２１日の、ケージベースでの体重増加及び処理ベースでの平均体重増加を測定した。飼料の変換を、ケージの飼料総消費量をトリの体重で割ったものを用いて、毎日及び１４〜２１日の期間の全体で計算した。処理中の各ケージからの個々の飼料変換を平均することにより、１４〜２１日の期間の平均処理飼料変換を決定した。
獣医医療、介入及び安楽死：
重篤な併発疾患を発症し、損傷を受けており、その状態が試験の結果に影響を与える可能性のある動物を試験から除外し、決定を下した時点で安楽死させた。投与の６日後に、ケージ内のすべてのトリを取り除き、病変をスコア付けした。
収集データ：
トリの体重及び飼料変換を１４〜２１日目まで毎日個別に。
０日目から試験終了までの、養鶏柵及びケージに添加し、取り除いた飼料の量。
死亡率：０日目から試験終了までの死亡の推定原因。
除外したトリ：０日から試験終了までの選別処分の理由。
設備及びトリの毎日の観察、毎日の設備温度。
２１日目の各トリ由来の盲腸の内容物。
結果
上に開示した方法を用いて結果を解析した（例えば、図１Ａ、１Ｂ、及び２を参照して、ならびに明細書全体を通じて論じたように）。各トリの盲腸の内容物について、株レベルの微生物の存在量及び活性を測定した。９６羽のブロイラーの盲腸試料全体で合計２２，４６１種のユニークな株を検出した。各株の絶対細胞数を活性閾値でフィルタリングして、活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数のリストを作成した。平均して、各ブロイラーにおいて屠殺する際に４８．３％の株のみが活性であると考えられた。フィルタリング後、これらの形質のすべての性能を向上させるアンサンブルを選択するために、各トリにおける活性微生物の特性を、飼料効率、最終体重、及び食餌中のサリノマイシンの有無を含む様々なトリのメタデータと統合した。
本開示の相互情報アプローチを用いて、活性株の絶対細胞数と性能測定値との間の関係、ならびに２つの異なる活性株間の関係性をすべての９６羽のトリについてスコア付けした。閾値を適用した後、４０３９のメタデータ−株の関係性が有意とみなされ、８８４２の株−株の関係性が有意とみなされた。その後、ＭＩＣスコアで重み付けしたこれらのリンクをエッジとして使用して（メタデータと株をノードとして）、その後の群集検出解析のためのネットワークを作成した。Ｌｏｕｖａｉｎ法の群集検出アルゴリズムをネットワークに適用して、ノードをサブグループに分類した。
Ｌｏｕｖａｉｎ法は、まず、現在のサブグループからノードを除去し、隣接するサブグループに配置することによってネットワークモジュール性を最適化する。ノードの隣接ノードのモジュール性が向上した場合、ノードを新しいサブグループに再割り当てする。複数のグループのモジュール性が向上した場合、最もポジティブな変化を有するサブグループを選択する。新しい割り当てが行われなくなるまで、ネットワーク内のすべてのノードに対してこの工程を繰り返す。次の工程は、新しい粗粒度のネットワークの作成を含み、すなわち、発見したサブグループは新しいノードになる。ノード間のエッジは、各サブグループ内のすべての下位ノードの合計によって定義される。ここから、それ以上のモジュール性最適化の変化を行えなくなるまで、第一工程と第二工程を繰り返す。極大値（すなわち、反復工程で作成したグループ）及び最大値（すなわち、最終グループ化）の両方を調べて、全微生物群集内で生じるサブグループを解決し、ならびに存在する可能性のある階層を特定することができる。
モジュール性：
式中、Ａは、メタデータ−株及び株−株関係のマトリックスであり；ｋｉ＝ΣｊＡｉｊは、ノードｉに付加した総リンク重みであり；ｍ＝１／２ΣｉｊＡｉｊである。Ｋｒｏｎｅｃｋｅｒデルタδ（ｃｉ，ｃｊ）は、ノードｉとノードｊを同じ群集に割り当てる場合は１、そうでない場合は０である。
ノードを移動させる際のモジュール性の変化を計算する：
ΔＱは、サブグループＣにおけるモジュール性の利得であり、Σｉｎは、Ｃにおけるリンクの重みの合計であり、Σｔｏｔは、Ｃにおけるノードに入射するリンクの重みの合計であり、ｋｉは、ノードｉへの入射リンクの重みの合計であり、ｋｉ，ｉｎは、Ｃ におけるＩからノードへのリンクの重みの合計であり、ｍは、ネットワーク内のすべてのリンクの重みの合計である。
Ｌｏｕｖａｉｎ群集検出法を用いて、ニワトリ微生物群集において５つの異なるサブグループを検出した。自然界には膨大な量の微生物の多様性が存在するが、機能の多様性ははるかに少ない。代謝能力の類似性と重複は冗長性を生む。同じ環境刺激または栄養素に応答する微生物株にも同様の傾向がありそうである―これは本開示の方法によって捕捉され、これらの微生物は最終的に共に分類される。得られる分類及び階層から、群集検出解析の後に分類する群に基づいた株の機能の予測が明らかになる。
株の分類が完了した後、試料から微生物株を培養する。異種微生物群集からの単離及びその無菌培養物を増殖させることに伴う技術的困難に起因して、本開示の方法の、活性及び関係性の閾値の両方をパスする株のほんの一部のみが実験室環境において無菌的に伝播する。培養が完了した後、微生物株のアンサンブルを、無菌培養物が存在するか否か、及び株がどのサブグループに分類されたかに基づいて選択する。アンサンブルはできるだけ多くの機能的多様性を含むように作成する―つまり、ある範囲の多様性のサブグループをアンサンブルで表現するように株を選択する。これらのアンサンブルを、有効性と現場試験で試験し、製品としての株のアンサンブルの有効性を判定し、株のアンサンブルが生産に寄与していることが示されれば、その株のアンサンブルを生産し、製品として流通させることができる。
開示する発明は、その特定の実施形態を参照して記載したが、当業者であれば、開示する発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよく、均等物に置換してもよいことは、理解すべきである。さらに、特定の状況、物質、組成物、プロセス、プロセス工程または工程を、記載する発明の客観的な精神及び範囲に取り入れるための多くの修正を行ってもよい。このような改変はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書で参照する特許、特許出願、特許出願公開、刊行物、学術論文及びプロトコールは、すべての目的のためにその全体を参照として援用する。

Claims (18)

  1. 方法であって：
    少なくとも１つの共通特性を共有し、少なくとも１つの異なる特性を有する少なくとも２つの試料のうちの各試料について１つ以上の微生物型の存在を検出し、
    各試料中の前記１つ以上の微生物型のそれぞれの検出した微生物型の数を判定し；
    各試料中の、微生物株のマーカーであるユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し；
    各微生物株についての前記ユニークな第一のマーカーの数の割合を算出し；
    前記各微生物型の数を前記ユニークな第一のマーカーの数の割合と掛け合わせて、各試料中に存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し；
    特定の閾値に基づいて各微生物株についての少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定して、各試料中のその微生物株の活性レベルを測定し；
    前記測定した活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングして、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれらのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；
    前記少なくとも２つの試料の各々についての前記フィルタリングした絶対細胞数の活性微生物株を、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定したメタデータと比較し、前記比較が、各試料中の１つ以上の活性微生物株の、前記少なくとも１つの測定したメタデータとの共起性を判定することを含み、
    前記活性微生物株を、予測される機能に基づいて少なくとも２つの群に分類し；そこにおいて、
    （ｉ）各試料中の前記１つ以上の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定したメタデータとの共起性を判定することが、メタデータと微生物株との間の関連性、前記１つ以上の活性微生物株の絶対細胞数、及び１つ以上のユニークな第二のマーカーの測定値を解析して、異種微生物群集または複数の群集の１つ以上のネットワークを表すことを含む、かつ／または
    （ｉｉ）前記１つ以上の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定したメタデータとの共起性を判定することが、ネットワーク内の各微生物株の連結性を測定するネットワーク解析及び／またはクラスター解析を含み、そこにおいて前記ネットワークが、共通の特性、測定したメタデータ、及び／または関連する環境パラメータを共有する前記少なくとも２つの試料の集合を表し、
    前記少なくとも２つの群から少なくとも１つの微生物株を選択し；ならびに
    前記少なくとも２つの群から選択した前記少なくとも１つの微生物株を組み合わせて、前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変更するように構成された微生物のアンサンブルを形成することを含む、前記方法。
  2. （ｉ）前記少なくとも１つの異なる特性が、
    （ａ）前記少なくとも２つの試料のそれぞれを採取した採取時間を含み、第一の試料の前記採取時間が、第二の試料の前記採取時間と異なる、または
    （ｂ）前記少なくとも２つの試料のそれぞれを採取した採取地域を含み、第一の試料の前記採取地域が第二の試料の前記採取地域と異なる、かつ／または
    （ｉｉ）前記少なくとも１つの共通特性が、
    （ａ）試料供給源の型を含み、第一の試料の前記試料供給源の型が第二の試料の前記試料供給源の型と同一であり、必要に応じて、前記試料供給源の型が、動物型、器官型、土壌型、水型、堆積物型、油型、植物型、農産物型、バルク土壌型、土壌根圏型、または植物部分型のいずれか１つである、または
    （ｂ）前記少なくとも２つの試料のそれぞれが胃腸試料であることを含む、または
    （ｃ）動物試料供給源の型を含み、各試料が組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料であるような、さらなる共通特性を各試料が有する、
    請求項１に記載の方法。
  3. 請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法であって：
    前記少なくとも１つの測定したメタデータに基づく、標的からの少なくとも１つのさらなる試料であって、そこにおいて前記標的由来の少なくとも１つのさらなる試料が、前記少なくとも２つの試料と少なくとも１つの共通特性を共有する試料について、１つ以上の微生物型の存在を検出し、１つ以上の微生物型のそれぞれの検出した微生物型の数を判定し、ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、各微生物株についての前記ユニークな第一のマーカーの数の割合を算出し、前記各微生物型の数を前記第一のマーカーの数の割合と掛け合わせ、存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し、各微生物株の少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定して、その微生物株の活性レベルを決定し、決定した活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングし、活性微生物株及び前記標的由来の少なくとも１つのさらなる試料についてのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；
    そこにおいて、前記少なくとも２つの群の各々からの少なくとも１つの微生物株の選択が、前記標的由来の前記少なくとも１つのさらなる試料についての活性微生物株及びそのそれぞれの絶対細胞数のリストに基づいており、それによって、形成するアンサンブルが前記少なくとも１つのメタデータに対応する前記標的の特性を変更するように構成される、前記方法。
  4. 前記少なくとも１つの測定したメタデータが、１つ以上のパラメータを含み、前記１つ以上のパラメータが、試料のｐＨ、試料の温度、脂肪の豊富さ、タンパク質の豊富さ、炭水化物の豊富さ、ミネラルの豊富さ、ビタミンの豊富さ、天然物の豊富さ、特定の化合物の豊富さ、試料供給源の体重、試料供給源の飼料摂取量、試料供給源の体重増加、試料供給源の飼料効率、１つ以上の病原体の存在の有無、試料供給源の物理的特性（複数可）または測定値（複数可）、試料供給源の生産特性、またはそれらの組合せのうちの少なくとも１つであり、必要に応じて、前記１つ以上のパラメータが、乳清タンパク質の豊富さ、カゼインタンパク質の豊富さ、及び／または乳中脂肪の豊富さのうちの少なくとも１つである、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つの測定したメタデータが、第二の微生物株の存在、活性及び／または量を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ｉ）前記ネットワーク解析及び／またはクラスター解析が、連鎖解析、モジュール性解析、ロバストネス測定、媒介性測定、連結性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せを含む、または
    （ｉｉ）前記クラスター解析が、連結性モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む、または
    （ｉｉｉ）前記ネットワーク解析が、リンクマイニング及び予測、集合分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似度、またはそれらの組合せによるネットワークの予測モデリングを含む、または
    （ｉｖ）前記ネットワーク解析が、微分方程式に基づく集団のモデリングを含み、必要に応じて、前記ネットワーク解析が、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む、または
    （ｖ）前記クラスター解析がヒューリスティックな方法、必要に応じて、Ｌｏｕｖａｉｎ法である、または
    （ｖｉ）前記ネットワーク解析が、変数間の連結性を確定するノンパラメトリックな方法を含む、または
    （ｖｉｉ）前記ネットワーク解析が、連結性を確定するための変数間の相互情報及び／または最大情報係数計算を含む、
    請求項１（ｉｉ）に記載の方法。
  7. ２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを共有する前記２つ以上の試料セットに基づいて、環境内の特徴または特性を変更するように構成された活性微生物株のアンサンブルの形成方法であって、各試料セットが、異種微生物群集を含む少なくとも１つの試料を含み、前記１つ以上の微生物株が１つ以上の生物型の部分分類群であり；前記方法が：
    各試料中の複数の微生物型の存在を検出し；
    各試料中の前記検出した微生物型の各々の細胞の絶対数を決定し；
    各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、そこにおいてユニークな第一のマーカーは微生物株のマーカーであり；
    各微生物株についての前記ユニークな第一のマーカーの数の割合を算出し；
    タンパク質またはＲＮＡレベルで、１つ以上のユニークな第２のマーカーの発現レベルを測定し、そこにおいてユニークな第二のマーカーは微生物株の活性のマーカーであり；
    特定の閾値を上回る前記一つ以上のユニークな第二のマーカーの前記発現レベルに基づいて、各試料についての前記検出した微生物株の活性を測定し；
    前記１つ以上のユニークな第一のマーカーの数の割合と、前記１つ以上の微生物株をその部分分類群とする前記微生物型の細胞の絶対数との掛け合わせに基づいて、各試料中の検出した各活性微生物株の絶対細胞数を計算し、そこにおいて前記１つ以上の活性微生物株は、前記特定の閾値を上回る前記第二のユニークなマーカーを発現し；
    ネットワーク内の各微生物株の連結性を測定する最大情報係数ネットワーク解析に基づいて、少なくとも１つの環境パラメータを用いて試料中の活性微生物株の共起性を判定し、そこにおいて前記ネットワークは、前記少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを有する少なくとも２つ以上の試料セットの集合であり；前記ネットワーク解析に基づいて、前記１つ以上の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択し；及び
    前記選択した複数の活性微生物株から活性微生物株のアンサンブルを形成することを含み、前記活性微生物株のアンサンブルをその環境に導入した場合に、前記活性微生物株のアンサンブルが環境の特徴または特性を選択的に変更するように構成される、前記方法。
  8. （ｉ）前記少なくとも１つの環境パラメータが、第二の微生物株の存在、活性及び／または量を含む、または
    （ｉｉ）前記第一の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の少なくとも１つの測定指標が、第二の試料セットについての前記少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定指標とは異なり、必要に応じて、少なくとも１つの測定指標が、試料のｐＨ、試料の温度、脂肪の豊富さ、タンパク質の豊富さ、炭水化物の豊富さ、ミネラルの豊富さ、ビタミンの豊富さ、天然物の豊富さ、特定の化合物の豊富さ、試料供給源の体重増加、試料供給源の飼料効率、１つ以上の病原体の存在の有無、試料供給源の物理的特性（複数可）または測定値（複数可）、試料供給源の生産特性、またはそれらの組合せである、または
    （ｉｉｉ）前記少なくとも１つのパラメータが、乳清タンパク質の豊富さ、カゼインタンパク質の豊富さ、及び／または乳中脂肪の豊富さのうちの少なくとも１つである、
    請求項７に記載の方法。
  9. 各試料セットが複数の試料を含み、
    （ｉ）試料セット内の各試料についての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定指標が実質的に類似しており、１つの試料セットの平均測定指標が、別の試料セットからの平均測定指標と異なる、または
    （ｉｉ）第一の試料セットを第一の集団から採取し、第二の試料セットを第二の集団から採取する、または
    （ｉｉｉ）第一の試料セットを第一の時間に第一の集団から採取し、第二の試料セットを前記第一の時間とは異なる第二の時間に前記第一の集団から採取する、
    請求項７または８（ｉ）に記載の方法。
  10. 少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、栄養素情報、食餌情報、動物の特徴、感染情報または健康状態を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. （ｉ）各試料中のユニークな第一のマーカーの数を測定することが、ユニークなゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質マーカーの数を測定することを含む、または
    （ｉｉ）前記ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することが、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応またはメタゲノム配列決定に供することを含む、または
    （ｉｉｉ）前記ユニークな第一のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、リボソームＲＮＡマーカー、σ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、代謝酵素、またはそれらの組合せを含む、
    請求項１または７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. （ｉ）前記１つ以上の微生物型または前記複数の微生物型が、１つ以上の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せを含む、または
    （ｉｉ）各試料中の微生物型の各々の絶対細胞数を測定することが、試料またはその一部を、配列決定、遠心分離、光学顕微鏡検査、蛍光顕微鏡検査、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動及び／またはフローサイトメトリーに供することを含む、または
    （ｉｉｉ）１つ以上の活性生物株が、１つ以上の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組合せから選択される１つ以上の微生物型の部分分類群である、または
    （ｉｖ）前記１つ以上の微生物株または前記１つ以上の活性生物株が、１つ以上の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組合せである、または
    （ｖ）前記１つ以上の微生物株または前記１つ以上の活性微生物株が、１つ以上の真菌種、真菌亜種、細菌種及び／または細菌亜種である、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 少なくとも１つのユニークな第一のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムＣオキシダーゼサブユニット遺伝子、βチューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組合せを含む系統発生学的マーカーを含み、必要に応じて、前記ユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定することが、各試料由来のゲノムＤＮＡをハイスループット配列決定反応、ゲノム配列決定またはアンプリコン配列決定に供することを含む、請求項１または７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーを測定することが、各試料中の前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することを含み、必要に応じて、前記少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの発現レベルを測定することが、
    （ｉ）前記試料中のｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供することを含み、必要に応じて、前記遺伝子発現解析が、配列決定反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトーム配列決定、及び／またはトランスクリプトーム配列決定を含む、または（ｉｉ）各試料またはその一部を質量分析に供することを含む、または
    （ｉｉｉ）前記試料またはその一部をメタリボソームプロファイリング及び／またはリボソームプロファイリングに供することを含む、
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. （ｉ）前記試料供給源の型が、動物、土壌、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、バルク土壌、土壌根圏、植物部分、野菜、極限環境、またはそれらの組合せのうちの１つである、または
    （ｉｉ）各試料が胃腸試料である、または
    （ｉｉｉ）各試料が、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、組織試料、または器官試料のうちの１つである
    請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. プロセッサで実施する方法であって：
    少なくとも１つの共通特性を共有し、少なくとも１つの異なる特性を有する少なくとも２つの試料から試料データを受け取り；
    各試料について、各試料中の１つ以上の微生物型の存在を判定し；
    各試料中の前記１つ以上の微生物型のそれぞれの検出した各微生物型の数を測定し；
    各試料中のユニークな第一のマーカーの数及びその量を測定し、それぞれのユニークな第一のマーカーは微生物株のマーカーであり；
    各微生物株についての前記ユニークな第一のマーカーの数の割合を算出し；
    プロセッサを介して、各微生物型の数を前記ユニークな第一のマーカーの数の割合と掛け合わせて、各試料中に存在する各微生物株の絶対細胞数を取得し；
    特定の閾値を上回る各微生物株についての少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値に基づいて、各試料中の各微生物株の活性レベルを測定し、微生物株は、その株に対する少なくとも１つのユニークな第二のマーカーの測定値が、対応する閾値を上回る場合に、活性であると同定され；
    前記測定した活性によって各微生物株の絶対細胞数をフィルタリングして、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれらのそれぞれの絶対細胞数のリストを提供し；
    少なくとも１つのプロセッサを介して、少なくとも２つの試料の各々についての少なくとも１つの測定したメタデータを有する、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについて、前記フィルタリングした活性微生物株の絶対細胞数のネットワーク解析を実施し、前記ネットワーク解析は、各活性微生物株と他のすべての活性微生物株との間の最大情報係数スコアを測定し、各活性微生物株と前記それぞれの少なくとも１つの測定したメタデータとの間の最大情報係数スコアを測定し；
    予測される機能及び／または化学に基づいて前記活性微生物株を分類し；
    前記分類に基づいて複数の活性微生物株を同定し；ならびに
    前記同定した複数の活性微生物株を出力することを含む、前記方法。
  17. 請求項１６に記載のプロセッサで実施する方法であって：
    （ｉ）標的に適用した場合に、少なくとも１つの測定したメタデータに対応する特性を変更するように構成された活性微生物アンサンブルを組み立てることを含む、または
    （ｉｉ）前記出力した複数の活性微生物株を用いて、標的に適用した場合に、前記少なくとも１つの測定したメタデータに対応する特性を変更するように構成された活性微生物アンサンブルを組み立てる、または
    （ｉｉｉ）前記出力した複数の同定した活性微生物株に基づいて少なくとも１つの病原体を同定することをさらに含む、
    前記方法。
  18. 前記出力した複数の活性微生物株をさらに用いて、標的に適用した場合に少なくとも１つの同定した病原体を標的とし、少なくとも１つの同定した病原体に付随する症状を治療及び／または予防するように構成された活性微生物アンサンブルを組み立てる、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
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