CN117316292B - 基于细菌-古菌-真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于评价抗生素生态效应技术领域,尤其涉及基于细菌‑古菌‑真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法。本发明构建了细菌‑古菌‑真菌之间的共现网络,去除了同一类群微生物内的相关关系,基于抗生素浓度进行高低浓度样本分组,对比两个组别下的细菌‑古菌‑真菌共现网络中网络和点的拓扑性质,发现高浓度抗生素条件下不同类群微生物之间的物种平均连接度和图密度更高,网络平均聚类系数和模块度更低,表明高浓度抗生素条件下不同类群微生物间关联增大,连接更紧密,但聚类模块数更少,模块分化程度更小,生态位分化更少,对评价抗生素对不同类群微生物间相互关联程度和生态位分化程度的影响具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于评价抗生素生态效应技术领域,尤其涉及基于细菌-古菌-真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法。
背景技术
抗生素作为微生物产生的一类次级代谢产物及化学合成或半合成的类似化合物,是对抗细菌感染的重要抗菌剂。近些年来,四环素类、大环内酯类和喹诺酮类等多种抗生素被陆续发现并广泛应用于人类和动物的临床医疗。然而抗生素的持续释放导致其在自然环境中广泛存在。这不仅会对天然环境造成污染,同时会影响环境中的微生物群落结构,并为耐药微生物的演化和传播提供前所未有的选择压力。因此,了解抗生素对自然环境中微生物的影响和作用机制十分必要。
自然环境中,不同类群微生物(细菌、古菌和真菌)之间的相互作用在塑造其群落结构方面起着重要作用。微生物种群间的相互作用网络通过促进竞争、合作和交流决定了微生物生态系统的整体组成、稳定性和生物多样性,并进一步塑造其生态功能。微生物共现网络是一种基于微生物分类群共现矩阵的相关性构建的用于研究微生物共现模式的常用统计分析方法。在微生物学和生态学中,微生物共现网络可以帮助我们理解不同微生物物种之间的共存和互斥模式,该方法能够从相对复杂的微生物群落结构数据集中提取出直观的相关关系。目前,对于自然或人工系统中抗生素对微生物共现模式的影响,只考虑了抗生素对同一类群微生物(如细菌)种间互作的影响,很少有研究涉及抗生素对不同类群微生物之间共现模式的影响。
现有技术文件1(CN109785898A)公开了一种基于微生物网络评估环境污染风险的方法,在构建网络和评估环境污染风险时,主要步骤包括:1)根据优势微生物与关键环境指标构建微生物互作网络模型;2)通过微生物共存关系中正负相关比例和网络度变化,评估环境微生态系统稳定性,负相关比例和网络度降低预示环境污染风险增大。该现有技术文件1的不足之处在于,仅探讨污染物(包含营养盐总氮和总磷、金属锌和铜、有机污染物多环芳烃和卤代烃)对在细菌在网络中的相关比例和网络度进行环境污染风险评价,未探讨抗生素这类新污染物对微生物的影响,并忽略了污染物对不同类群微生物之间,即跨类群物种共现关系的影响,同时也未提及污染物对不同类群微生物在共现网络中拓扑性质的影响。
现有技术文件2(CN114707786A)公开了一种基于共线性网络的河流生态系统健康评价方法,该发明中对河流水体和底泥中的细菌、古细菌两种微生物类群,采用共现性网络法识别关键指标物种来确定备选参数,并在此基础上通过Barbour方法和Pearson相关分析进行指标优选,进而确定河流健康的评价标准。该现有技术文件2仅结合共现网络中微生物的相关系数和连接度等指标进行筛选,用来评价河流的健康状况,未涉及污染物特别是抗生素对不同类群微生物共现网络的影响。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了基于细菌-古菌-真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法,本发明提供的方法可以更好地展示不同类群微生物之间的共现情况,有利于直观展示不同浓度抗生素条件下,不同类群微生物之间的共现情况差异。
为了实现以上目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种基于细菌-古菌-真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法,包括以下步骤:
采集目标区域中多个点位的样本,获取所述样本中抗生素浓度数据以及微生物的群落组成和丰度数据,所述微生物包括细菌、古菌和真菌;
根据式Ⅰ计算所述样本中每种微生物的检出率,保留检出率 ≥ 10%的微生物群落组成和丰度数据,检出率=检出的样本数/总样本数×100% 式Ⅰ;
将每个样本中获取的所有抗生素浓度分别求和,得到不同样本的抗生素检出总浓度;
将所述抗生素检出总浓度按由小到大的顺序排列,根据式Ⅱ计算每个样本检出总浓度的累积频率;
累积频率=小于等于某个样本抗生素检出总浓度的样本数/总样本数×100% 式Ⅱ;
以每个样本抗生素检出总浓度为横坐标,每个样本抗生素检出总浓度对应的累积频率为纵坐标,绘制抗生素浓度累积频率曲线图,以累积频率为50%对应的抗生素检出总浓度作为分界值,小于等于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为低抗生素浓度样本,大于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为高抗生素浓度样本;
根据保留的微生物的群落组成和丰度数据,对低抗生素浓度样本和高抗生素浓度样本中的微生物分别进行关联网络分析,去除同一类群微生物内的相关关系,保留不同类群微生物之间的共现关系,分别构建高浓度抗生素样本和低浓度抗生素样本的细菌-古菌-真菌的共现网络,并获取共现网络拓扑性质参数和节点的拓扑性质参数;所述共现网络拓扑性质参数包括平均度、图密度、模块度和平均聚类系数;所述节点的拓扑性质参数包括连接度、传递性和中介中心性;
对比高浓度抗生素样本和低浓度抗生素样本的共现网络拓扑性质参数和节点的拓扑性质参数,评价不同浓度抗生素对不同类群微生物的影响;所述平均度和图密度值越大,类群间物种连接关系越紧密;所述平均聚类系数越高和模块度越大,表明节点的聚集程度越高、聚类模块数越多,生态位分化程度越高;所述连接度、传递性和中介中心性越大,类群间物种连接更紧密,类群间微生物的相关关联越大。
优选的,获取所述样本中细菌、古菌和真菌的群落组成和丰度数据的方法包括:对所述样本分别进行16S、18S和ITS扩增子测序。
优选的,所述关联网络分析的参数包括:保留相关系数 ≥ 0.7和p值 ≤ 0.01的微生物数据。
优选的,所述样本的点位数 ≥ 16个。
优选的,获取所述样本中抗生素浓度数据的方法包括:利用液相色谱-质谱联用测定。
优选的,所述抗生素包括:磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、聚醚类抗生素和林可霉素类抗生素。
优选的,所述样本包括:水样、土壤样品和沉积物样品中的一种或多种。
有益效果:
本发明构建了细菌-古菌-真菌之间的共现网络,去除了同一类群微生物内的相关关系,只保留不同类群微生物之间的共现关系,识别不同类群微生物间的共现关系;本发明基于样本中抗生素浓度进行高低浓度样本分组,对比两个组别下的细菌-古菌-真菌共现网络中网络和点的拓扑性质,发现高浓度抗生素条件下不同类群微生物之间的物种平均连接度和图密度更高,网络平均聚类系数和模块度更低,表明高浓度抗生素条件下不同类群微生物间相关关联增大,连接更紧密,但聚类模块数更少,模块分化程度更小,生态位分化更少,对评价抗生素对不同类群微生物间相互关联程度和生态位分化程度的影响具有重要价值。
附图说明
图1是本发明提供的基于细菌-古菌-真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法的流程图;
图2是样本中检出抗生素总浓度的累积频率曲线图;
图3是高浓度抗生素条件和低浓度抗生素条件下,去除同一类群微生物内的相关关系,只保留不同类群微生物之间的共现关系后的细菌、古菌和真菌的共现网络图;
图4是高浓度抗生素条件和低浓度抗生素条件下,去除同一类群微生物内的相关关系,只保留不同类群微生物之间的共现关系后的细菌、古菌和真菌共现网络的网络拓扑性质对比;
图5是高浓度抗生素条件和低浓度抗生素条件下,去除同一类群微生物内的相关关系,只保留不同类群微生物之间的共现关系后的细菌、古菌和真菌共现网络中点的拓扑性质对比。
具体实施方式
本发明提供了一种基于细菌-古菌-真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法,包括以下步骤:
采集目标区域中多个点位的样本,获取所述样本中抗生素浓度数据以及微生物的群落组成和丰度数据,所述微生物包括细菌、古菌和真菌;
根据式Ⅰ计算所述样本中每种微生物的检出率,保留检出率 ≥ 10%的微生物群落组成和丰度数据,检出率=检出的样本数/总样本数×100% 式Ⅰ;
将每个样本中获取的所有抗生素浓度分别求和,得到不同样本的抗生素检出总浓度;
将所述抗生素检出总浓度按由小到大的顺序排列,根据式Ⅱ计算每个样本检出总浓度的累积频率;
累积频率=小于等于某个样本抗生素检出总浓度的样本数/总样本数×100% 式Ⅱ;
以每个样本抗生素检出总浓度为横坐标,每个样本抗生素检出总浓度对应的累积频率为纵坐标,绘制抗生素浓度累积频率曲线图,以累积频率为50%对应的抗生素检出总浓度作为分界值,小于等于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为低抗生素浓度样本,大于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为高抗生素浓度样本;
根据保留的微生物数据的群落组成和丰度数据,对低抗生素浓度样本和高抗生素浓度样本中的微生物分别进行关联网络分析,去除同一类群微生物内的相关关系,保留不同类群微生物之间的共现关系,分别构建高浓度抗生素样本和低浓度抗生素样本的细菌-古菌-真菌的共现网络,并获取共现网络拓扑性质参数和节点的拓扑性质参数;所述共现网络拓扑性质参数包括平均度、图密度、模块度和平均聚类系数;所述节点的拓扑性质参数包括连接度、传递性和中介中心性;
对比高浓度抗生素样本和低浓度抗生素样本的共现网络拓扑性质参数和节点的拓扑性质参数,评价不同浓度抗生素对不同类群微生物的影响;所述平均度和图密度值越大,类群间物种连接关系越紧密;所述平均聚类系数越高和模块度越大,表明节点的聚集程度越高、聚类模块数越多,生态位分化程度越高;所述连接度、传递性和中介中心性越大,类群间物种连接更紧密,类群间微生物的相关关联越大。
本发明采集目标区域多个点位的样本。在本发明中,所述样本的点位数优选 ≥16个,更优选 ≥ 66个;所述样本优选包括目标区域的水样、土壤样品和沉积物样品中的一种或多种。
所述样本为水样时,本发明优选将水样进行过滤,得到待测样本。在本发明中,所述过滤优选为将用0.22 μm滤膜过滤,过滤后的滤膜-80 ℃保存。所述样本为土壤或沉积物时,优选将样本采集后储存在铝盒-20 ℃冷冻保存,得到待测样本。
得到待测样本后,本发明获取所述待测样本中抗生素浓度数据以及细菌、古菌和真菌的群落组成和丰度数据。
在本发明中,所述样本为水样时,所述待测样本中抗生素浓度数据的获取方法优选包括:用0.7μm玻璃滤膜过滤水样,每2 L中加入100 µL内标溶液(浓度为500 ppb)和0.5g的Na2EDTA;待Na2EDTA完全溶解之后,进行固相萃取提取并富集抗生素,之后进行洗脱、氮气吹扫和定容;
在本发明中,所述样本为沉积物或土壤时,所述待测样本中抗生素浓度数据的获取方法优选包括:沉积物或土壤样本冷冻干燥并研磨,用2 mm金属筛过筛,称取5.0 g样本于50 mL玻璃离心管中,加入5 mL 10 ppb内标,包好封口膜,置于4 ℃冰箱一周,一周后取出离心管,打开盖子,置于通风橱中36 h,使水分自然干燥,开始提取;使用柠檬酸缓冲溶液(0.1 M,pH = 3)与乙腈1:1混合溶液作为提取液进行提取,离心得到提取液上清液;重复提取三次;将得到的提取液上清液,用去离子水稀释到500 mL,加入0.125 g Na2EDTA,待其完全溶解后,进行固相萃取提取并富集抗生素,之后进行洗脱、氮气吹扫和定容。
在本发明中,所述样本中抗生素浓度数据的检测方法优选包括:利用液相色谱-质谱联用测定样本中抗生素浓度;所述抗生素优选包括:磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、聚醚类抗生素和林可霉素类抗生素;更优选为22种磺胺类抗生素(磺胺苯甲酰胺、磺胺醋酰胺、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺胍、磺胺甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲恶唑、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹恶啉、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺异恶唑、甲氧苄啶)、16种喹诺酮类抗生素(环丙沙星、达氟沙星、地氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、奥比沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星)、15种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、氨苄西林、头孢羟氨苄、头孢匹林、头孢唑林、头孢噻肟、头孢氨苄、头孢拉定、氯西林、脱乙酰头孢噻肟、双氯西林、纳夫西林、奥沙西林、青霉素G、青霉素V)、13种四环素类抗生素(4-差向脱水金霉素、4-差向脱水四环素、4-差向金霉素、4-差向土霉素、4-差向四环素、脱水金霉素、脱水四环素、金霉素、去甲金霉素、多西环素、异金霉素、土霉素、四环素)、10种大环内酯类抗生素(脱水红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、沙霉素、白霉素、罗红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素)、5种聚醚类抗生素(拉沙里菌素、马渡霉素、莫能菌素、尼日利亚菌素、盐霉素)和2种林可霉素类抗生素(克林霉素、林可霉素);获取所述样本中细菌、古菌和真菌的群落组成和丰度数据的优选方法包括:对所述样本分别进行16S、18S和ITS扩增子测序。
获取样本中细菌、古菌和真菌的群落组成和丰度数据后,根据式Ⅰ计算所述样本中每种微生物的检出率,保留检出率 ≥ 10%的微生物群落组成和丰度数据;
检出率=检出的样本数/总样本数×100% 式Ⅰ。
获取样本中抗生素浓度数据后,本发明将每个样本中获取的所有抗生素浓度分别求和,得到不同样本的抗生素检出总浓度,将所述抗生素检出总浓度按由小到大的顺序排列,根据式Ⅱ计算每个样本检出总浓度的累积频率;
累积频率=小于等于某个样本抗生素检出总浓度的样本数/总样本数×100% 式Ⅱ;
以每个样本抗生素检出总浓度为横坐标,每个样本抗生素检出总浓度对应的累积频率为纵坐标,绘制抗生素浓度累积频率曲线图,以累积频率为50%对应的抗生素检出总浓度作为分界值,小于等于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为低抗生素浓度样本,大于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为高抗生素浓度样本。
本发明基于保留的微生物群落组成和丰度数据和高低浓度分组的样本,对两种抗生素浓度条件下的样本微生物分别进行关联网络分析,去除同一类群微生物内的相关关系,保留不同类群微生物之间的共现关系分别构建高浓度抗生素样本和低浓度抗生素样本的细菌-古菌-真菌的共现网络,并获取共现网络拓扑性质参数和点的拓扑性质参数。在本发明中所述关联网络分析的参数优选包括:保留相关系数 ≥ 0.7和p值 ≤ 0.01的微生物数据;所述共现网络拓扑性质参数包括平均度、图密度、模块度和平均聚类系数;所述点的拓扑性质参数包括连接度、传递性和中介中心性。
本发明优选对高低抗生素浓度条件下的样本微生物进行基于R语言中MbioAssy1.0包的Spearman关联网络分析,去除同一类群微生物内的相关关系,只保留不同类群微生物之间的共现关系,构建高浓度和低浓度抗生素下的细菌-古菌-真菌的共现网络。
本发明优选使用Gephi(v. 0.9.2)获得共现网络中的网络连接度、图密度、模块度和平均聚类系数等网络拓扑性质。对两种抗生素浓度条件下不同样本的细菌、古菌和真菌物种分类信息使用基于R语言的igraph包获取微生物共现网络中连接度、传递性和中介中心性等点的拓扑性质。
本发明根据共现网络拓扑性质参数和点的拓扑性质参数评价抗生素对不同类群微生物的影响。由实施例可知,高浓度抗生素条件下类群间物种连接更紧密,共现模块分化程度更低,不同类群微生物间关联增大。
下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
采集66个点位水样,每个采样点抽取50 L水,用0.22 μm无菌滤膜对每个水样进行过滤。将过滤后的滤膜于-80℃条件下保存并分别进行DNA提取。通过16S、18S和ITS扩增子测序,扩增的引物序列如下:
16S-338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3',SEQ ID NO.1;
16S-806R:5'-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3',SEQ ID NO.2;
18S-524F-10-ext:5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3',SEQ ID NO.3;
18S- Arch958R-mod:5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3',SEQ ID NO.4;
ITS-1F:5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3',SEQ ID NO.5;
ITS-2R:5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3',SEQ ID NO.6。
进行PCR产物纯化后,使用 Illumina Miseq 2×250bp 进行PE 250上机测序;对原始读数进行过滤,以去接头和低质量碱基;使用 USEARCH 8.0 从原始数据中提取干净的数据;使用 UPARSE去除嵌合序列后,根据 97% 的相似度对66个点位水样的 OTU 进行分类,并获得每个 OTU 簇的代表序列;使用 BLAST 软件将代表序列与相应的数据库进行比对,并注释物种分类信息,即分别在各个分类水平上(域、门、纲、目、科、属、种)统计样本的物种信息,获取细菌、古菌和真菌的物种分类信息。
对扩增子测序所得到的反映物种相对丰度的OTU数据进行预处理,计算全部微生物(细菌、古菌和真菌)在全部样本点的物种检出率(物种检出率=检出的样本数/总样本数×100%),保留检出率 ≥ 10%的物种。
目标区域每个采样点同时采集约4.5升水样于干净的棕色玻璃瓶中,在4℃条件下于24 h内送至实验室。尽快用滤膜过滤去除样本中的颗粒物,将过滤后的水样每2 L中加入100 µL内标溶液(氘取代或C13取代的抗生素标准品,浓度为500 ppb)和0.5 g的Na2EDTA。待Na2EDTA完全溶解之后,用固相萃取提取和富集抗生素,并进行洗脱、氮气吹扫和定容。利用液相色谱-质谱联用测定样本中抗生素浓度。获取抗生素在不同样本中检出的总浓度,计算检出总浓度的出现频率并绘制抗生素浓度累积频率曲线图,依据样本数量和抗生素浓度频率分布规律确定该地区水样的低浓度抗生素(未检出~33.8 ng/L)和高浓度抗生素(33.8~466 ng/L)分组(图2)。
计算全部微生物(细菌、古菌和真菌)在全部样本点的物种检出率(物种检出率=检出的样本数/总样本数×100%),保留检出率 ≥ 10%的物种。在低浓度抗生素条件下共筛选得到5792种细菌、1284种古菌和829种真菌,共计7905种物种;高浓度抗生素条件下共筛选得到5624种细菌、1195种古菌和818种真菌,共计7637种。相较于低浓度抗生素条件,高浓度抗生素条件下检出的三类微生物物种数均更少。
对两种抗生素浓度条件下不同样本的细菌、古菌和真菌物种分类信息进行基于R语言中MbioAssy1.0包的Spearman关联网络分析,检测细菌、古菌和真菌的共存模式(保留相关系数 ≥ 0.7,p ≤ 0.01的细菌、古菌和真菌数据)。对两种抗生素浓度条件下的细菌、古菌和真菌的共现关系作进一步筛选,去除同一类群微生物间的自相关,只保留不同类群微生物之间的共现关系。在低浓度抗生素条件下共计得到475种细菌、297种古菌和37种真菌,共计809种物种存在类群间相关;而高浓度抗生素条件下共计709种细菌、384种古菌和45种真菌,共计1138种物种存在类群间相关。相较于低浓度抗生素条件,高浓度抗生素条件下得到的存在类群间相关的物种数更多。
此外,低浓度抗生素条件下得到细菌和古菌共现的边有1224条,细菌和真菌共现的边有53条,真菌和古菌共现的边有13条,类群间相关边数共计1290条;而在高浓度抗生素条件下,共计得到2986条细菌和古菌共现的边,细菌和真菌共现的边有87条,真菌和古菌共现的边有28条,类群间相关边数共计3101条,高于低浓度条件。
基于获取的高低浓度下的不同类群间微生物共现网络的边和点的特征数据,使用Gephi(v. 0.9.2)将共现网络可视化(图3),使用Gephi(v. 0.9.2)获得微生物共现网络拓扑性质数据(表1)。
表1 高浓度和低浓度抗生素条件下的微生物共现网络拓扑性质
分组 | 平均度 | 图密度 | 模块度 | 平均聚类系数 |
低浓度 | 3.189 | 0.004 | 0.816 | 0.012 |
高浓度 | 5.450 | 0.005 | 0.651 | 0.009 |
结果表明,高浓度抗生素条件下,去除同一类群微生物间的自相关,只保留不同类群微生物间共现关系后的共现网络的物种平均连接度和图密度升高,表明高浓度抗生素条件下,类群间物种之间的连接关系更为紧密。此外,高浓度抗生素条件下,类群间共现网络的模块度更低,平均聚类系数更小,表明高抗生素浓度条件下,类群间物种之间的聚类模块数更少,模块分化程度更小,生态位分化更少。
对两种抗生素浓度条件下不同样本的细菌、古菌和真菌物种分类信息使用基于R语言的induced_subgraph函数(igraph包)获取微生物共现网络中点的拓扑性质(连接度、传递性和中介中心性),结果见图4。结果表明高浓度抗生素条件下物种的连接度显著高于低浓度条件,点的传递性和中介中心性显著低于低浓度条件,进一步表明高浓度抗生素条件下类群间物种连接更紧密性,共现模块分化程度更低,不同类群微生物间相关关联增大。
对低浓度抗生素和高浓度抗生素条件下,细菌、古菌和真菌在类群间共现网络中的拓扑性质(图5)。结果表明,低抗生素条件下,细菌和古菌的连接度显著高于真菌(曼努惠特尼检验:p < 0.05);然而在高抗生素条件下,古菌显著高于细菌,细菌又显著高于真菌,表现出和低浓度抗生素条件下不一致的连接度特征。进一步的结果表明古菌相较于细菌和真菌,在低浓度和高浓度抗生素条件下均具备显著较高的中介中心性(图5),表明古菌这一物种在类群间连接中,尤其是在高抗生素浓度条件下占有重要作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.基于细菌-古菌-真菌共现网络评价抗生素生态效应的方法,其特征在于,包括以下步骤:
采集目标区域中多个点位的样本,获取所述样本中抗生素浓度数据以及微生物的群落组成和丰度数据,所述微生物包括细菌、古菌和真菌;
根据式Ⅰ计算所述样本中每种微生物的检出率,保留检出率 ≥ 10%的微生物群落组成和丰度数据,检出率=检出的样本数/总样本数×100% 式Ⅰ;
将每个样本中获取的所有抗生素浓度分别求和,得到不同样本的抗生素检出总浓度;
将所述抗生素检出总浓度按由小到大的顺序排列,根据式Ⅱ计算每个样本检出总浓度的累积频率;
累积频率=小于等于某个样本抗生素检出总浓度的样本数/总样本数×100% 式Ⅱ;
以每个样本抗生素检出总浓度为横坐标,每个样本抗生素检出总浓度对应的累积频率为纵坐标,绘制抗生素浓度累积频率曲线图,以累积频率为50%对应的抗生素检出总浓度作为分界值,小于等于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为低抗生素浓度样本,大于所述分界值的抗生素检出总浓度的样本为高抗生素浓度样本;
根据保留的微生物的群落组成和丰度数据,对低抗生素浓度样本和高抗生素浓度样本中的微生物分别进行关联网络分析,去除同一类群微生物内的相关关系,保留不同类群微生物之间的共现关系,分别构建高浓度抗生素样本和低浓度抗生素样本的细菌-古菌-真菌的共现网络,并获取共现网络拓扑性质参数和节点的拓扑性质参数;所述共现网络拓扑性质参数包括平均度、图密度、模块度和平均聚类系数;所述节点的拓扑性质参数包括连接度、传递性和中介中心性;
对比高浓度抗生素样本和低浓度抗生素样本的共现网络拓扑性质参数和节点的拓扑性质参数,评价不同浓度抗生素对不同类群微生物的影响;所述平均度和图密度值越大,类群间物种连接关系越紧密;所述平均聚类系数越高和模块度越大,表明节点的聚集程度越高、聚类模块数越多,生态位分化程度越高;所述连接度、传递性和中介中心性越大,类群间物种连接更紧密,类群间微生物的相关关联越大。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,获取所述样本中细菌、古菌和真菌的群落组成和丰度数据的方法包括:对所述样本分别进行16S、18S和ITS扩增子测序。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述关联网络分析的参数包括:保留相关系数 ≥ 0.7和p值 ≤ 0.01的微生物数据。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本的点位数 ≥ 16个。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,获取所述样本中抗生素浓度数据的方法包括:利用液相色谱-质谱联用测定。
6.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于,所述抗生素包括:磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、聚醚类抗生素和林可霉素类抗生素。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本包括:水样、土壤样品和沉积物样品中的一种或多种。
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Exploring diversity patterns and driving mechanisms of the antibiotic resistome and microbiome in saline groundwater;Moran Tang 等;《Journal of Hazardous Materials》;全文 * |
江苏省代表性水源地抗生素及抗性基因赋存现状;王龙飞 等;《环境科学》;第42卷(第2期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN117316292A (zh) | 2023-12-29 |
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