CN113260712A - 分析仪器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于自动且同时执行多种测试的多功能仪器，该多种测试包含鉴定样本中的靶标和其抗微生物剂敏感性测试。专用盒预装载有所有所需试剂并且允许在没有样本制备的情况下在单个测试装置中执行测试以例如快速地检测感染、鉴定传染性病原体并分析其对各种抗微生物剂的敏感性。仪器包含用于执行可以以由计算机控制的仪器所指示的任何顺序随机访问的测试步骤的各种站。转盘储存并温育盒并且利用机械输送臂在所需的站之间转移这些盒以执行这些测试。可以对仪器内的多个靶标执行多个不同测试，并且该多个靶标可以安置在单个盒中。

Description

分析仪器
技术领域
本公开涉及用于自动测试样本的系统和方法。
背景技术
传染性疾病是死亡和医疗成本的主要原因。尽管抗微生物疗法革新了感染的治疗并且已经挽救了无数生命，但是过度使用抗微生物剂加速了抗微生物剂耐药性的扩散。为了确保这些有价值的药物仅在需要时使用并确保正确的患者在正确的时间得到正确的抗微生物剂，需要可在各种场所实施的更快速且更准确的诊断方法。
医院获得性感染对患者来说是重大风险，从而导致重大疾病和高死亡率并造成显著的医疗成本。医院获得性感染的流行率和严重性的显著因素是对多种抗微生物剂具有耐药性的病原体增多。有效治疗感染需要快速诊断以检测感染，鉴定感染病原体，并且然后选择适当的用于有效治疗该病原体的抗微生物剂。
常规方法很费时，需要二到五天来检测感染、鉴定病原体并确定有效的抗微生物疗法。为了在感染之初以及在确定最佳疗法所需的天数期间保护患者，医生最初通过开强力广谱抗微生物剂处方凭经验进行治疗。这些治疗可能是次优的并且甚至是无效的。针对患者的特异性感染延迟实施适当的窄谱疗法可能对发病率和死亡率产生巨大影响。此外，缺乏诊断结果的经验治疗或当使用诊断容易出现假阳性结果导致对未受感染的患者广泛施用强力抗微生物剂。不加选择地使用抗微生物剂是导致抗微生物剂耐药性靶细胞扩散的主要促成因素。最终，由于住院时间增加以及昂贵的医疗并发症，延迟实施最佳疗法招致显著的医疗成本。
发明内容
快速且准确地鉴定患有感染的患者并向这些患者快速实施有效疗法可以挽救生命并减轻抗微生物剂耐药性的扩散。与当今方法所需的天数相比，本发明提供了可以在约30分钟内准确地鉴定患有感染的患者并在若干小时内确定针对患者感染的靶向疗法的系统和方法。早若干天确定有效抗微生物疗法可以显著改善医学结果(包含预防死亡)。
为了检测感染，本发明可以检测、定量并鉴定广泛的病原体，包含细菌、真菌、病毒和寄生虫。对于快速且准确地鉴定患有感染的患者也很有价值的是本发明能够检测并定量诊断信息性毒素、疾病特异性生物标志物、人或宿主细胞和宿主应答生物标志物。本发明可以包含单个测试中上述能力的任何组合以最有效地评估患者样本是否存在感染并确定传染剂。
诊断信息性宿主细胞包含指示对感染的炎性应答的细胞(例如，中性粒细胞)、受病原体感染的细胞(例如，病毒感染细胞)或指示患者样本的质量和解剖来源的细胞(例如，鳞状上皮细胞)。
威胁生命的感染的毒素诊断的实例包含艰难梭菌(Clostridiodes difficile)毒素B，指示艰难梭菌感染的该艰难梭菌毒素B和指示炭疽感染的炭疽杆菌(Bacillusanthracis)致死毒素(或毒素亚基致死因子)的存在指示了疾病。可以帮助鉴定受感染的患者的宿主因素包含细胞因子，如IL-4和IL-6。
在检测感染并鉴定和定量感染病原体之后，本发明的方法可以确定哪种患者疗法将是最有效的。该类型的分析被称为抗微生物剂敏感性测试。本发明与当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法的不同之处在于其可以在几小时内直接从患者样本中递送准确结果而不是当前需要数天的常规方法。不像本发明的方法，该常规方法需要耗时的微生物培养步骤以获得数百万个经过纯化的病原体细胞。相比之下，本发明的新颖抗微生物剂敏感性测试方法可以在没有耗时的培养步骤的情况下直接根据患者样本快速地确定有效疗法，因为该方法需要大量的细胞或细胞纯化。
本发明的新颖和潜在的医学影响能力和实用性是通过用于使用直接来自患者样本的信息生物靶标的非放大数字成像实现单个分子计数和单个细胞计数的本发明的系统和方法来实现的。在没有复杂且昂贵的显微镜和光学器件的情况下使用简单且低成本的相机对微观细胞和亚微观分子进行数字计数允许通过快速、敏感且自动化定量致病毒素和疾病特异性生物标志物来检测感染。用于鉴定并数字计数病原体细胞的本发明的系统和方法强调快速确定对抗微生物剂的敏感性或耐药性的能力。本发明的方法通过确定当在营养素微生物培养基中温育时该药剂是否阻止病原体正常生长(即，通过细胞分裂增加细胞数量)来确定病原体是否对抗微生物剂敏感。这可以通过本发明通过对在含有抗微生物剂的培养基中温育之前和之后的病原体细胞进行计数来进行。
本发明的系统和方法可以自动且同时运行多种测试，该多种测试仅需要样本输入并提供在范围为即时到集中式医院和参考实验室的各种场所中可执行的结果。通过预装载有所有所需试剂的专用盒、直接样本输入到盒中和所有处理和分析以使用户的动手时间最小化的完全自动化、设计用于可扩展通量的台式仪器、仪器的组合，此类测试成为可能。
用于对单分子和单细胞进行计数的本发明的方法的步骤可以包含：对靶分子或细胞进行荧光标记；对靶标进行磁性标记；使用磁力将荧光标记的磁性靶标沉积在装置的成像表面上；在不(或者最小)放大的情况下对靶标进行成像；以及使用成像分析对靶标进行计数。
本发明允许在盒装置中同时进行上文所概述的处理步骤。单个随机存取仪器可以同时处理含有不同类型的患者样本的不同诊断应用的多个测试盒。本发明的仪器和盒的自动化性质允许由没有重大专业培训的医疗专业人员操作。另外，仪器的平台潜在测试菜单的广度提供了减少台式空间的潜力，从而允许更节省成本地利用设施，并且当感染可能产生最大影响时使近患者诊断测试能够为接近感染发作的临床医生提供可能挽救生命的诊断信息。
本发明的系统和方法使用预装载有测试试剂的专用盒。优选地，盒在制造期间与所需测试试剂一起组装和包装并且被分配成使得用户仅需添加待测试的样本(例如，来自患者的呼吸样本)并且将该盒插入到仪器中。在一些情况下，可以预富集待测试样本，如血液样本。例如，血液样本可以在分析之前通过培养经历预富集，因为许多血液感染在不预富集的情况下由于病原体细胞浓度太低而不能直接进行测试。
本文所描述的仪器使用各种站来执行上文概述的不同测试步骤。根据正在执行的测试，可以将站定位在用于接收、储存专用盒并在站之间转移专用盒的转盘周围。站可以包含用于与盒介接并操纵其中的样本和试剂的流控站、用于将靶标磁性地沉积在盒成像孔的检测表面上的磁性选择站、用于检测样本中所沉积的靶标的成像站以及用于处置用过的盒的废物站。在优选的实施例中，测试在所有步骤中使用恒定温度或被修改成使得仪器的内部可以维持在所需温度下，并且转盘可以充当温育步骤的储存站。
该仪器可以使用转盘来访问不同站，使得测试步骤可以按照顺序并利用各种类型的测试所需的定时来执行。对仪器中的各种站的精确计算机调度和计算机控制访问用于自动执行各种测试的所有步骤，而不需要另外的用户输入。在将盒装载到仪器中之后，用户的下次交互可以在仪器处或远程接收或查看测试结果。根据测试类型，平台自动分析的所报告的结果可能指示检测到感染；检测、鉴定和定量病原体、毒素、生物标志物或诊断信息性宿主细胞；或抗微生物剂敏感性结果和特性。一些测试应用对相同仪器运行上的相同盒中的单个样本执行不同类型的测量。在这种情况下，可以报告单个测试的多种类型的结果。
该仪器可以读取盒上的一个或多个条形码或其它标识符以将患者、测试专用或工厂信息与盒相关联。该仪器还可以接受由用户输入的类似输入。该仪器还可以使用该输入来记录和跟踪与被测样本相关联的包含用于报告结果的患者信息的信息。
仪器可以包含计算机，该计算机包括处理器和非暂时性有形存储器并且可操作以调度和控制在仪器内执行的测试并跟踪其中的盒。该计算机可以包含用于提示和接收来自用户的信息并显示结果和状态信息的用户接口。该计算机可以连接到网络并可操作以处理测试结果并通过网络发送到连接的装置。
本发明的仪器可以包含用于在转盘之间移动盒的机械输送臂和用于执行所需测试步骤的各个站。在优选的实施例中，转盘和站包括槽，该槽的大小被设定成接受盒并将该盒定位在站内。旋转该转盘可以将该转盘槽与相关站中的对应槽对准，并且该机械输送臂可操作以接触该盒的一侧并且沿着对准的槽滑动该盒并使其进入所选站中。该机械输送臂避免抓握该盒并减少与抓握机构相关联的堵塞。该机械输送臂可以包括两个可旋转尖头，该尖头可操作以侧接盒并向其一侧提供推动力。当盒滑动时，转盘和站槽的侧面可以提供侧向引导，从而避免需要抓握机构来移动盒。
预装载盒允许控制制造侧上的试剂体积和分配，并且自动化仪器控制测试步骤的执行和其定时。因此，系统和方法可以大大减少用户错误的可能性，从而允许不熟练的工作人员在没有专门培训的情况下进行各种测试并获得可靠且可执行的结果，而没有延误和专门场外测试成本。
在优选的实施例中，专用盒包含在存在基于病原体的身份选择的各种抗微生物剂和微生物生长培养的情况下用于测量样本中的病原体的差异生长的微生物特异性抗微生物剂敏感性测试盒。根据本发明，在最少或无样本制备或培养的情况下直接分析患者样本，如尿液、粪便或血液。对根据本发明处理的样本进行鉴定并将其暴露于各种抗微生物剂或其它治疗模式，从而允许选择最有效的治疗。可以在数小时内鉴定微生物感染并确定适当的治疗，从而大大减少对适当靶向疗法的延误并避免用攻击性广谱抗微生物剂进行经验性治疗的需要。本发明允许卫生保健提供者在开始时开出有效的疗法以适当地治疗受感染的患者。因此，本发明提供了改善患者结果和减少抗微生物剂耐药性扩散的机会。
在很少或无样本制备步骤的情况下，直接从患者样本(如尿液、痰或其它呼吸样本、血液、粪便、伤口样本或脑脊髓液)实现感染检测、靶标鉴定和有效治疗确定。例如，将尿液样本直接吸移到测试装置中以进行在数小时内完成的病原体鉴定(ID)和抗微生物剂敏感性测试(AST)。这与当前基于培养的方法形成对比，该当前方法需要一天或多天的集落纯化以产生大量纯微生物培养物以进行检测。本发明提供了能够接收和内部处理患者样本以鉴定微生物或细胞和/或确定治疗敏感性和功效的测试装置和仪器，所有这些都在测试装置内。可以鉴定样本中的多种靶细胞或病原体，并且可以在单个装置中测试对各种抗微生物剂或治疗的敏感性。本发明的测试系统和方法对于样本基质、变异接种物和样本中共生微生物的存在是稳健的。本发明的测试也为多种微生物感染递送准确的结果。
本发明的系统和方法允许对样本进行直接处理和成像以确定样本中存在的靶细胞的存在和身份。如上所述，处理和成像步骤在测试装置(如盒)中与样本一起进行并且在测试装置外几乎不需要样本制备。通过上述耗时的样本制备技术并使用靶特异性可区分的标记，本发明的系统和方法允许在少至三十分钟或更短时间内鉴定和枚举样本中的靶标。
本发明的系统和方法可以用于鉴定引起感染的病原体。例如，本发明的方法包含用于在不需要基于培养的微生物预富集或核酸扩增的情况下直接在患者样本中鉴定和定量病原体的新颖方法。该方法通过使用基于荧光原位杂交(FISH)方法与磁性选择组合进行标记在单个反应混合物中枚举一个或多个靶病原体，该磁性选择可以在约30分钟内在本文所述的仪器中的微量滴定板或盒中执行。
本发明的系统和方法可以用于诊断抗微生物剂敏感性测试(AST)，即用于确定哪种抗微生物剂可以预防患者样本中的微生物病原体生长。该信息向临床医生提供了关于应该使用哪种抗微生物剂有效治疗特定患者的感染的信息。
抗微生物剂敏感性测试可以视为是逐步过程。目标是确定一组抗微生物剂的哪些成员对引起患者感染的特定病原体菌株有效。通常，当检测到感染时，首先鉴定病原体的物种。鉴定病原体的物种对于选择抗微生物剂和通常可以用于治疗该物种的剂量是有用的。然而，因为引起该感染的特定病原体菌株可能已经对抗微生物剂中的任何抗微生物剂具有耐药性，因此必须进行抗微生物剂敏感性测试以确定该病原体实际对哪种潜在治疗敏感。
在物种鉴定之后，将来自患者样本的病原体细胞进行分配或等分到含有营养素生长培养基、不同浓度的各种抗微生物剂的一系列液体溶液中。然后，允许等分试样在有助于微生物复制的温度(通常35-37℃)下温育。如果该病原体对抗微生物剂敏感，则该病原体可以正常复制，即在不存在抗微生物剂的情况下病原体细胞的数量会增加，正如其在微生物生长培养基中进行的那样。如果该病原体对抗微生物剂敏感，则该病原体无法复制、更小程度地复制或示出指示抗微生物剂的有效性的形态异常或其它异常。最终，在各种等分试样中评估病原体细胞的复制以确定哪种抗微生物剂是有效的。将一组病原体对一系列抗微生物剂的抗微生物剂敏感性/耐药性结果称为其抗微生物剂敏感性特性。
用于抗微生物剂敏感性测试的常规方法和本发明的方法遵循以上步骤，但是本发明的方法在若干小时内确定了病原体的抗微生物剂敏感性特性，而常规方法需要若干天。使用本发明的方法的快速抗微生物剂敏感性测试结果产生于新方法直接测试患者样本的能力，而无需耗时的基于培养的预富集生长以实现高浓度的纯细胞。该富集和纯化最常见地在培养皿上使用集落纯化进行。
对于常规方法，首先使用生化、微生物、核酸方法或基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)对在集落纯化之后回收的细胞进行鉴定。一旦知道病原体物种的身份，就可以选择适当的抗微生物剂和浓度，该适当的抗微生物剂和浓度适于确定该物种的病原体的抗微生物剂敏感性特性。
本发明的系统和方法的若干新颖方面能够使其快速递送直接来自患者样本的抗微生物剂敏感性结果。
首先，患者样本通常含有的细胞比传统抗微生物剂敏感性测试所需的细胞少几个数量级。与当前培养-预富集依赖性方法相比，本发明的方法可以通过使用非放大数字成像进行敏感单细胞计数来枚举少量的病原体细胞。此外，因为该方法枚举少量单独细胞，因此该方法可以非常迅速地-仅在几代细菌中-确定含有抗微生物剂和生长培养基的等分试样中的细胞数量是否增加。
其次，患者样本含有样品基质和与传染性病原体不相关的共生微生物。常规方法的指南(例如，来自临床实验室标准研究所或欧洲抗微生物剂敏感性测试委员会)要求由集落在培养皿中在基于琼脂的生长培养基上克隆生长产生的经过纯化的培养细胞。这些细胞仅含有单个微生物物种且没有样品基质。
如上所述，必须知道病原体物种的身份以便正确解释抗微生物剂敏感性测试结果以得出有效的临床治疗选项。这是为什么常规和最新兴的抗微生物剂敏感性测试方法需要细胞的纯培养物的潜在的关键原因。
如上所述，为了确定抗微生物剂敏感性特性，常规的和最新兴的方法评估不同浓度下的不同抗微生物剂对靶病原体生长的影响。为什么这些方法需要所鉴定的纯细胞群来解释抗微生物剂敏感性测试结果的原因是这些方法使用非特异性方法(例如，光散射或显微镜检查)来评估含有抗微生物剂的等分试样的生长。考虑到如果存在多于一个物种的情况，例如为人微生物组的一部分的正常微生物的病原体和物种-这是大多数主要患者样本的情况。如果在含有抗微生物剂的等分试样中观察到生长，则使用用于检测生长的一般方法将不可能判定致病病原体或共生物种中的一种或多种是否具有耐药性和生长能力。
与常规方法和需要经过纯化的病原体细胞的其它方法相比，因为这些方法使用非特异性方法来检测病原体是否在存在抗微生物剂的情况下生长，本发明的方法使用病原体特异性检测来评估抗微生物剂中的病原体的生长。因为在温育步骤之后仅枚举了致病病原体细胞(没有枚举任何共生微生物)，因此本发明的方法可以用于直接确定含有一种或多种共生微生物物种的非灭菌原始样本中的抗微生物剂敏感性。
本发明的系统和方法可以用于鉴定靶细胞或微生物，并且单独地或在相同装置内测试样本中的靶标的抗微生物剂敏感性。在本发明的优选实施例中，测试装置内部将样本分为单独的部分，其中这些部分中的一些部分可以在成像之前在存在各种抗微生物剂的情况下温育以确定差异生长。可以对这些部分中的一个或多个部分直接进行处理和成像以提供基线参考，以便确定温育部分的生长、生长抑制或形态变化。通过对在各种抗微生物剂中温育的部分的生长进行定量，可以确定每种抗微生物剂在减少或预防靶标生长方面的有效性。通过观察靶细胞计数或细胞形态的变化，可以确定治疗的有效性。
本文所述的测试装置和仪器能够鉴定和测试药剂对不同类别的靶标(例如，病毒、人细胞、细菌细胞或真菌细胞)的功效，并且还同时在单个装置中对多个不同靶标执行此类鉴定和抗微生物剂敏感性测试，由此允许开发执行通常由设计用于不同测试应用(例如，血液、泌尿道、胃肠道和呼吸道感染)的多个测试装置执行的测试的单个仪器。因此，通过本文所述的仪器和测试装置提供了稳健功能。
一旦鉴定了靶标，抗微生物剂敏感性测试可以包含与该靶标相关的抗微生物剂或治疗(例如，通常在治疗中使用或已知抑制所鉴定的靶标生长的那些抗微生物剂或治疗)。如前所述，该靶细胞或微生物的鉴定对于确定适合的靶特异性疗法可能是重要的。可以使用如在本文所述的抗微生物剂敏感性测试方法中使用的相同处理和成像技术来执行鉴定，并且可以使用用于差异生长或治疗功效分析的相同类型的装置、仪器和方法来执行鉴定。在某些实施例中，可以在相同装置中对相同样本(被分成单独部分)执行鉴定和治疗敏感性测试。还可以使用没有落入本发明的系统和方法的其它技术(如利用靶特异性引物进行扩增、免疫测定、质谱法、核酸测序或寡核苷酸探针阵列分析)来执行靶标鉴定。如果鉴定是单独执行的，则可以根据本发明使用用于所鉴定的病原体的含有适当试剂和抗微生物剂的抗微生物剂敏感性测试装置。
根据靶病原体，在存在各种抗微生物剂的情况下检测差异生长可能需要不同的时间量，但是大大减少了标准抗微生物剂敏感性测试技术所需的天数。例如，可以使用本发明的技术在约4小时或更短时间之后观察尿液样本中的通常与泌尿道感染相关联的微生物的差异生长。如上所述，鉴定和定量样本中的微生物可以在三十分钟或更短时间内完成，由此允许在将该样本引入到测试装置之后的数小时内获得抗微生物剂敏感性测试结果。
在某些实施例中，可消耗盒装置的测试套件可以用于综合征感染(例如，肺炎或泌尿道感染)的鉴定(ID)和抗微生物剂敏感性测试(AST)。被称为ID/AST测试的此类测试套件可以包括ID盒和AST盒的综合征感染特异性家族，这些盒中的每个盒都含有用于测试单独病原体或病原体的相关组的适当抗微生物剂。
此类综合征感染测试套件中的ID盒可以检测感染并鉴定和定量该样本中的一种或多种传染性病原体的生物负荷或浓度。相同盒还可以同时在相同装置上测试该样本的诊断信息性标志物，该诊断信息性标志物包含宿主应答生物标志物(例如，细胞因子)和炎性细胞(例如，中性粒细胞)或样品质量的细胞标志物(例如，鳞状上皮细胞)。组合检测和定量相同样本、盒和仪器中的病原体、生物标志物和诊断信息性宿主细胞的能力是本发明的系统和方法的新颖且潜在强大的优势。
如果检测到感染并且使用ID盒(或除了本发明的方法之外的替代性鉴定方法)鉴定了病原体，则将从AST盒家族中选择AST盒以进行AST分析。选择用于分析的AST盒将含有可以用于治疗特定病原体的适当抗微生物剂和用于枚举该特定病原体的适当FISH试剂。
然后使用本发明的系统和方法获得的抗微生物剂敏感性测试结果用于确定该传染性病原体的抗微生物剂敏感性特性并通知患者治疗决定，使得可以用有效的抗微生物剂治疗该患者。
可检测标记可以包含靶特异性荧光寡核苷酸探针(包含包括经过修饰的核苷酸或核苷酸类似物的探针)或荧光抗体、特异性和非特异性配体、凝集素、染色剂和与靶标结合的染料。在某些实施例中，磁性标签与该可检测标记组合使用以在磁性选择靶微生物并对这些靶微生物进行成像之前与这些靶微生物结合。分离可以发生在如本文所述的测试装置内，并且磁场可以用于将经过标记的微生物沉积在该测试装置中的检测表面上以被成像。在某些实施例中，如在通过引用并入本文中的美国专利第9,643,180号中所描述的染料垫层可以用于分离和成像步骤中，以最小化或消除用户的样本制备步骤、消除洗涤步骤并减少背景信号。如在美国专利第9,643,180号和美国专利第8,021,848号中所描述的数字、非放大成像技术可以用于对包含例如单细胞的经过标记的微生物进行定量，这些美国专利中的每一个通过引用并入本文中。
本发明的各个方面提供了用于确定抗微生物剂敏感性的方法。此类方法优选地包含从疑似患有综合征感染的患者中获得样本的步骤，其中该样本类型将可能含有一种或多种传染性病原体。然后将该样本引入到测试装置中，分成多个等分试样。立即对一个等分试样进行分析以确定温育之前病原体细胞的基线浓度。对于该等分试样，对病原体细胞进行荧光标记、磁性标记、吸引通过该染料垫并沉积在该盒中的成像孔的该成像表面上、成像并使用图像分析进行定量。在存在生长培养基和各种抗微生物剂的情况下，将其它等分试样在35℃下温育，所有都在该测试装置内。在存在各种抗微生物剂的情况下差异生长之后，对病原体细胞进行荧光标记、磁性标记、吸引通过染料垫并沉积在该盒中的成像孔的成像表面上、成像并使用图像分析进行定量。将所枚举的含有抗微生物剂的等分试样中的病原体细胞的数量与最初枚举的病原体细胞的数量(温育之前)进行比较以确定抗微生物剂敏感性特性以及哪种抗微生物剂对于治疗该患者将是有效的。
本发明的方法可以包含：检测感染并在将样本引入到测试装置之前检测和鉴定传染性病原体细胞；以及基于靶细胞或微生物的身份选择多种不同抗微生物剂。靶病原体的鉴定优选地包含：将来自患者的第一样本暴露于可以与第一靶标结合的磁性标签和荧光标记，使得特异性地形成包括磁性标记和荧光标记的靶标的复合物。向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以检测和定量该可检测标记，其中可检测标记的存在和浓度指示是否存在靶病原体以及存在多少该靶病原体。该检测步骤可以花费小于约30分钟。
对于本发明的抗微生物剂敏感性测试应用，可以在如上文所述的差异生长之后对该靶病原体细胞进行检测。
本发明的系统和方法可以使用类似策略来检测和定量亚细胞靶标(例如，毒素、生物标志物、宿主应答因素、病毒特异性分子或病毒颗粒)。靶特异性磁性标签和荧光标记优选地用于与此类靶标结合以形成复合物。本发明的系统和方法用于通过成像和图像分析将这些复合物沉积在成像表面上以进行枚举。用于检测亚细胞靶标的靶特异性磁性标签和荧光标记优选地是与靶特异性结合剂(例如，抗体、适体、受体、配体)缀合的磁性颗粒和荧光颗粒。磁性标记和荧光标记的靶复合物的特异性形成以不同方式出现。磁性标签或荧光标记可以被设计成与靶标特异性地结合。可替代地，磁性标签和荧光标记两者可以被设计成与靶标特异性地结合。在任一情况下，与磁性选择的复合物的成像组合的磁性选择导致检测和枚举样本中的特异性靶标。存在各种机构，磁性标签和荧光标记可以通过各种机构与靶标相关联。
有各种磁性标签或荧光标记可以与靶标特异性地结合的方式。例如，可以通过将磁性标签或荧光标记与和那些位点结合的部分(例如，抗体或其它蛋白结合配偶体、凝集素或配体)缀合来实现在各种类别的靶标中与保守位点结合的结合磁性标签或荧光标记。磁性标签或荧光标记还可能由于通用化学或胶体属性而非特异性地结合。例如，带正电荷的磁性颗粒或荧光标记可以非特异性地与细菌细胞结合，这些细菌细胞通常是带负电荷的。可以通过各种染料(例如，荧光增白剂(calcofluor))或荧光染料(例如，碘化丙啶、荧光素二乙酸酯)非特异性地标记细胞。经过染色的荧光颗粒可以用作荧光标记，这些荧光标记借助于其化学或胶体属性或通过将其与如上文所述的那些非特异性结合分子结合而与靶细胞非特异性地结合。
还可以以各种方式选择磁性标签或荧光标记，使得其与靶标特异性地结合。例如，可以将磁性标签(或荧光团)与和靶特异性抗原结合的抗体缀合。为了类似的效果，可以将磁性标签或荧光团与和配体(例如，生物素)特异性结合的分子(例如，亲和素)缀合，该配体与(或可以与)此类靶特异性抗体结合。还可以通过与本身用荧光团标记的靶特异性核酸探针(或核酸类似物探针)重新关联或杂交来特异性地标记细胞。经过染色的荧光颗粒可以用作荧光标记，这些荧光标记通过将其与如针对某些实施例所述的那些靶特异性结合分子缀合而与靶细胞特异性地结合，标记和成像步骤包含：将样本部分暴露于荧光团标记的靶特异性结合分子和磁性颗粒，其中荧光团标记的靶特异性结合分子和磁性颗粒与靶标结合，从而形成复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像。荧光团标记的靶特异性结合分子可以包含与该靶细胞特异性结合的寡核苷酸探针。暴露和成像步骤可以包含荧光原位杂交(FISH)方法和分析。
本发明的方法可以包含确定针对该患者的推荐抗微生物剂，该推荐抗微生物剂通常包括确定抑制靶标生长的抗微生物剂或其它治疗。确定抑制靶标生长的治疗可以发生在将样本引入到测试装置中之后约4小时。人体样本可以是组织样本(例如，伤口或活检样本)或体液样本。与本发明一起使用的优选体液包含但不限于呼吸(例如，痰、气管内抽吸物、防污染样本刷、支气管-肺泡灌洗)、血液、尿液、粪便、拭子(例如，鼻拭子、口/咽拭子、外科手术部位拭子、皮肤拭子和软组织拭子、直肠拭子)和脑脊髓液。
在某些方面，本发明提供了用于确定样本中的靶细胞或微生物的治疗敏感性的系统。优选的系统包含：测试装置，该测试装置可操作以接收来自患者和靶细胞或微生物的体液的样本；以及仪器或仪器。该仪器优选地可操作以操纵测试装置以在该测试装置内将样本分成多个部分；在存在多种不同治疗剂的情况下在该测试装置内温育这些部分；荧光标记和磁性标记该测试装置内的经过温育的部分内的靶细胞；将磁性标记和荧光标记的靶复合物与未经结合的荧光标记分离；并且在该测试装置内对这些部分进行成像以定量靶复合物，以便确定哪种治疗抑制靶细胞复制。
系统可以包括用于微生物应用的可以用于检测感染并鉴定病原体的测试装置。可以将患者样本添加到装置，在该装置中，该患者样本可以被分成多个等分试样，该多个等分试样中的每个等分试样可以与磁性标签和多种类型的靶特异性可检测标记接触(例如，使分子与不同的荧光团标记结合)，使得形成了经过标记的磁性标记靶复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；并且对该检测表面进行成像以检测经过标记的复合物，其中在特定等分试样中检测到标记有特定可检测标记的复合物指示存在特定靶标。
该仪器可操作以使样本等分试样与各种抗微生物剂接触以进行抗微生物剂敏感性应用；将含有样本的等分试样或部分与所选磁性标签和可检测标记接触，使得利用靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；对该检测表面进行成像；并且执行图像分析以确定测试结果。
检测经过温育的样本中的每个样本中的所鉴定的靶细胞或微生物的数量可以包含：接触经过温育的样本磁性标签和所选可检测标记，使得利用靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向该复合物施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以确定治疗剂中的每种治疗剂对所鉴定的靶标中的每个靶标的生长的影响。
多个等分试样可以与不同浓度的相同抗微生物剂组合，该不同浓度优选地对应于该抗微生物剂的2倍系列稀释液或对应于与抗微生物剂敏感性测试的CLSI断点相对应的浓度。可以选择此类部分和浓度的抗微生物剂的数量以便递送敏感/耐药性结果、绝对(敏感、中等耐药性、耐药性或SIR结果)或最小抑制浓度(MIC)结果。临床实验室标准协会(CLSI)记录了用于特异性微生物病原体物种的抗微生物剂的相关浓度。
附图说明
图1示出了本发明的示意图。
图2示出了500nm荧光颗粒的非放大数字成像。
图3示出了本发明的示例性方法的示意图。
图4示出了染料垫的背景消除。
图5用图解释了本发明的示例性方法的步骤。
图6示出了示例性测试盒。
图7是盒的透视图。
图8给出了用于执行包括细菌的样本的抗微生物剂敏感性测试的工作流。
图9示出了在本发明的系统和方法中有用的仪器。
图10A是装置内的转盘的顶视图。
图10B是转盘的透视图。
图11示出了示例性计算机和仪器配置。
图12A和图12B示出了示例性机械输送臂。
图13示出了示例性仪器。
图14示出了装载有样本的示例性盒。
图15示出了装载到示例性仪器中的示例性盒。
图16示出了在装载盒的示例性仪器内的转盘的视图。
图17示出了根据本发明的实施例的仪器的内部组件的侧视图。
图18示出了根据本发明的实施例的仪器的侧视图。
图19示出了根据本发明的实施例的仪器的前视图。
图20示出了根据本发明的实施例的仪器的侧视图。
图21示出了根据本发明的实施例的仪器的后视图。
图22示出了该仪器的布局的顶视图的实施例。
图23示出了转盘的实施例。
图24示出了移动臂的实施例。
图25示出了移动臂的实施例。
图26示出成像模块的实施例。
图27示出了成像模块的顶视图。
图28示出了光学组合件的实施例。
图29示出了流控模块的实施例。
图30示出了流控模块的实施例。
图31示出了磁性模块的实施例的顶视图。
图32示出了磁性模块的实施例的侧视图。
图33示出了成像孔中本发明的方法的示意图，其中在没有用户干预的情况下，由于染料垫引起的样本制备和洗涤步骤的取消以及所有步骤发生在自动化仪器上的盒中。
图34示出了根据本发明的方法的导管相关泌尿道感染(CAUTI)ID测试的实施例。
图35示出了根据本发明的方法的CAUTI AST测试的实施例。
图36示出了尿液中的大肠杆菌(E.coli)的敏感性FISH检测。
图37示出了针对大肠杆菌的FISH测定的包容性。
图38示出了针对大肠杆菌的FISH技术的特异性。
图39示出了根据本发明的方法的CAUTI ID测试。
图40示出了CAUTI AST测试和过夜肉汤微量稀释参考方法的MIC的比较，其中浓阴影指示准确匹配并且较浅阴影指示相差1到2倍的稀释。
图41示出了大肠杆菌的检测极限(LoD)。
图42示出了铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的检测极限(LoD)。
图43示出了肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的检测极限(LoD)。
图44是在该实例中使用的探针序列的表。
图45示出了针对11个大肠杆菌菌株绘制的平均信号(n＝3)。
图46示出了检测到的输入细胞(如通过平板计数所确定的)的百分比。
图47是给出4种另外的细菌的包容性结果的表。
图48是给出在该实例中使用的探针序列的表。
图49示出了测试的细菌物种和菌株。
图49是示出对检测的大肠杆菌的特异性进行测试的挑战细菌的表。
图50是示出在该实例中使用的探针序列的表。
图51示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种挑战细菌。
图52示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种另外的挑战细菌。
图53示出了完整采集的图像的一部分。
图54是在实例4中使用的探针序列的表。
图55示出了在存在呋喃妥因(Nitrofurantoin)的情况下的BIUR0017。
图56示出了在存在头孢唑啉(Cefazolin)的情况下的BIUR047。
图57示出了在存在环丙沙星(Ciprofloxacin)的情况下的BIUR057。
图58示出了在存在甲氧苄氨嘧啶(Trimethoprim)/磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)的情况下的BIUR052。
图59是在该实例6中使用的探针序列的表。
图60示出了该方法如何可以用于产生MIC。
图62示出了测试的所有菌株的整体性能。
图60是正常细菌(左图)与丝状细菌(右图)的视觉比较。
图61示出了在0.25μg/mL下调用通过本发明中描述的新颖快速AST方法产生的MIC。
图62是AST结果的表。
图63是在实例7中使用的探针序列的表。
图64示出了MultipathTM UTI-AST盒。
图65是示出测试的抗生素浓度的表。
图66是在实例8中使用的寡核苷酸的表。
图67示出了BIUR0067结果。
图68示出了BIUR0084结果。
图69比较了获得的结果。
图70示出了与常规BMD方法相比，使用在此所描述的新方法产生的各种接种水平的MIC结果。
图71是产生的各种接种水平的MIC结果的汇总。
图72是在实例9中使用的探针序列的表。
图73示出了在存在呋喃妥因的情况下大肠杆菌BAA-2469的数据。
图74示出了在存在增加的脱靶细菌的情况下大肠杆菌的总体基本一致性。
图74示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性的汇总。
图75示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii))的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图76示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、极小棒状杆菌(Corynebacteriumminutissimum))的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图77示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(肺炎克雷伯菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图78是在该实例10中使用的探针序列的表。
图79示出了在存在对亚胺培南(Imipenem)抗生素具有耐药性的肺炎克雷伯菌菌株的量增加的情况下，对亚胺培南敏感的大肠杆菌菌株的MIC。
图80示出了内酰胺类抗生素美罗培南(Meropenem)的类似结果。
图79是新颖快速AST和BMD方法的比较。
图80示出了在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯(carbapenem)的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而标准BMD现在也是如此。
图81是在实例11中使用的探针序列的表。
图82示出了15份尿液的基本一致性。
图83示出了15份掺有培养阴性临床UTI尿液样品中的每份与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。
图84示出了与标准BMD方法(“符合CLSI”)相比，掺有如通过新颖AST方法所确定的大肠杆菌的15份尿液样品的MIC。浓度以微克/毫升为单位。
图85是在该实例12中使用的探针序列的表。
图86示出金黄色葡萄球菌细胞(左图)检测为明亮荧光斑点，而没有细胞的培养基(右图)仅含有被分类为碎片的对象。
图87仅示出了金黄色葡萄球菌细胞(左图)和TSB培养基(右图)。
图88示出了MultiPath测定的结果。
图89示出了在该实例中使用的环丙沙星敏感性菌株和环丙沙星耐药性菌株。
图90是在该实例13中使用的探针序列表的前半部分。
图91是在该实例13中使用的探针序列表的后半部分。
图92示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的基本一致性。
图93示出了多种微生物感染的分类一致性。
图94示出了在对大肠杆菌/肺炎克雷伯菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。
图95示出了在对大肠杆菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。
图96示出了对肺炎克雷伯菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒。
图97是示出检测到靶病原体而未检测到其它非靶病原体的表“实例14的表A”。
图98是示出在实例14中使用的探针序列的表“实例14的表B”。
图99示出方法返回估计的检测极限。
具体实施方式
本发明提供了用于使用单个仪器同时且自动化执行不同测试的系统和方法。设想将由仪器执行的测试包含鉴定样本中的靶细胞、分子、病毒或微生物以及对其进行抗微生物剂敏感性测试分析，需要用户制备很少样本或无需制备样本。本发明提供了用于检测、定量并鉴定样本中的靶病原体、诊断信息性宿主细胞和诊断信息性分子生物标志物的系统和方法。本发明的实施例执行不同类型的测定或单种分析物的评估。本发明的一些实施例执行对单个盒中的单个样本进行的测试或一组测定。根据本发明的测定检测特异性分子靶标和细胞靶标并确定有效疗法。
设想使用本发明的系统和方法测试的靶微生物、病原体和细胞包含病毒、细菌或真菌细胞、人细胞(包含但不限于白细胞、鳞状上皮细胞或病毒感染的人细胞)或其它真核细胞(包含寄生虫、动物和植物细胞)。设想用于测试的靶分子包含靶特异性抗体、核酸探针、配体、适体和他汀类。在存在各种抗微生物剂的情况下可以分析样本中的靶细胞、分子、病毒或微生物的差异生长，或者可以使用本文所描述的系统和方法来确定治疗剂对细胞活力、形态学、病毒载量、细胞功能或治疗功效的其它量度的影响。
在约三十分钟内在单个测试装置内对靶细胞、分子、波形蛋白(vim)或微生物鉴定执行样本操纵、温育、处理和分析步骤，并且在对泌尿道感染的常见原因进行尿液分析的情况下在约四个半小时内进行抗微生物剂敏感性测试。分析时间可以基于被分析的靶标(例如，根据靶标的生长速率)和被测试的治疗剂而变化。系统和方法使用非放大数字成像和图像分析来检测特异性靶标以准确且快速地对样本中的靶标进行定量。
本发明的实施例允许使用用户制备的最少样本或不使用样本进行测试。与在常规技术的情况下的多天时间相比，在某些情况下通过减少多余的步骤并使用能够定量单细胞或集落形成单位(CFU)的成像方法和图像分析，可在几个小时内获得直接来自患者样本的靶细胞、分子、病毒或微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试的可执行结果。各种靶细胞、分子、病毒和微生物可能需要的变型可以包含靶特异性结合分子(例如，靶特异性抗体、核酸探针、配体、适体和他汀类)、被测试的治疗方法(例如，抗病毒剂、抗微生物剂或其它疗法)、温育次数、被分析的特性、图像分析算法、参数和报道的结果。
测试装置可以由仪器自动操纵以在存在不同抗微生物剂或其它治疗方法的情况下执行样本分离、培养以及对所得样本部分进行处理和成像的步骤中的每一个步骤以测量差异生长并确定被测试的抗微生物剂的有效性。
特定应用的盒可以包含一系列预装载有特定测试所需的试剂的互连孔。用户仅需要将样本添加到用于期望测试和样本类型的盒中，并且然后将盒装载到仪器中以进行自动处理。仪器可以扫描含有关于专用盒本身的信息和患者样本信息两者的标签。可替代地，可以由操作者通过用户接口输入信息。如本文所描述的仪器可以包含用于执行不同测试可能所需的各种步骤的站，并且可以包含用于储存多种过程中盒以及在如执行测试步骤所需的站之间转移此类盒的转盘或其它机构。
盒可以包含孔和各种阀以及用于根据需要在其中连接不同孔以执行期望测试的步骤的通道。例如，用于抗微生物敏感性测试的盒可以包含一系列预装载有生长培养基和待分析的不同抗微生物剂的分离孔。盒还可以包含用于处理生长后样本并在其中标记靶标的孔以及提供用于对经过标记的靶标进行成像的检测表面的成像孔。仪器可以包含流控模块以与盒介接，以便允许外部操纵盒中的阀和压力以连接不同孔并在其间移动如各种测试所需的样本体积。
仪器可以是被设计成适应用于主要传染性疾病的专用耗材盒的菜单的自动化台式仪器。由于独特的非放大数字成像技术，仪器允许高性能。仪器允许取消用户步骤，使用廉价试剂和流线型仪器，从而产生低成本和易于使用的优势。
在无需放大的情况下，仪器实现单分子计数并对单独细胞进行计数。仪器的独特能力在于快速并敏感地检测靶毒素分子、生物标志物、细胞和抗微生物剂耐药性。图1示出了仪器的成像技术在不放大的情况下如何检测到标记有荧光纳米颗粒的单独靶分子。照亮荧光颗粒标记的分子使经过标记的靶标发射光子。光子照射在数码相机(如手机中的数码相机)中的CMOS芯片上，该芯片包含独立光敏像素元件的阵列。因此，直接位于单独靶标上方的像素元件“点亮”为所得图像中的白色斑点(图2，其示出了500nm荧光颗粒的非放大数字成像)。计算机会瞬时地枚举指示存在的靶标的数量的照亮像素。在低分析物浓度下，与跨检测区域集成信号的更常见方法相比，对单独标记的靶标进行数字计数产生更好的信噪比。非放大成像允许大的场瞬时成像——允许少量的靶标在大体积的样本中被快速检测到。由方法的创新性非放大数字成像方法产生的关键技术优势是技术能够快速地且利用非常低成本的组件检测到非常低水平的分子或细胞。
独特的染料垫层允许仪器技术在不需要样本制备的情况下快速并具体地对复杂样本中的靶分子进行计数(图3)。图3示出了本发明的成像孔中的方法的示意图。染料垫消除了对样本制备和洗涤步骤的需要。所有步骤在没有用户干预的情况下在自动化仪器上运行的盒中发生。将可能含有靶标的液体样本添加到含有以下两种类型的干试剂的透明底的成像孔中：染料(例如，直接黑(Direct Black))和密实剂(OptiPrep)。当水合时，在成像孔的底表面处的干染料垫试剂形成新颖致密层。靶特异性荧光和磁性纳米颗粒稳定在小的冻干球(约1mm直径)中。
在一个实例中，艰难梭菌是靶分子。磁性纳米颗粒涂覆有对艰难梭菌毒素分子上的抗原位点具有特异性的抗体，并且荧光纳米颗粒涂覆有与相同分子上的不同抗原位点结合的互补抗体。在干试剂被样本水合时，形成了两层：致密染料垫层和测定层。在测定层中，靶分子与磁性和荧光纳米颗粒结合，从而将其栓系在一起。高浓度(约109/ml)和小尺寸(200-500nm)的颗粒仅通过扩散混合就能驱动快速结合动力学，这通过消除对机械混合功能的需要而简化了仪器。
将成像孔放置在永磁体上持续3分钟吸引磁性颗粒——以及通过靶分子与这些磁性颗粒栓系的任何荧光颗粒——穿过染料垫层，从而将这些磁性颗粒和荧光颗粒沉积在底部成像表面上。利用如上文的非放大数字成像瞬时对所捕获的荧光颗粒进行成像并计数。因为单个分子可以在低靶标浓度下将荧光颗粒与磁性颗粒栓系，对磁性沉积颗粒的数量进行计数对应于所捕获的靶分子的数量——并且这在不放大的情况下进行。
染料垫消除了样本制备和洗涤步骤。图4示出染料垫完全阻断数千万个高度荧光的未结合颗粒的强烈荧光。在某些实施例中，染料垫是由两种廉价的有机化学品构成：直接黑(服装行业中常见的染料)和OptiPrep(用于细胞分离的碘化密实剂)。染料垫层被动地形成了吸收光的激发波长和发射波长两者的致密着色层。该层防止光到达测定层中的未结合的荧光颗粒(存在数百万个，并且其将在其它方面非常亮)。类似地，干染料在光学和物理学上将样本与成像表面隔离，这使得在不需要用户制备样本的情况下测定对甚至最难的样本基质也很稳健。因此，染料垫创新消除了对用户样本制备的需求并且消除了所有测定洗涤步骤，从而显著地降低了仪器的成本和复杂度。
本发明可以用于检测广泛的分析物。除了检测如毒素和生物标志物等分子靶标之外，仪器还可以检测并计数细胞病原体(例如，细菌、真菌和寄生虫)、病毒和诊断重要的人细胞。例如，技术可以在仅30分钟内检测到感染并鉴定细菌性病原体。而且，抗微生物剂敏感性测试允许选择靶抗微生物疗法以在仅4个小时内治疗感染——与使用传统的培养测试所需的2到4天相比。
图5用图解释了本发明的示例性方法101的步骤。103可以获得患者样本104。样本104可以包含来自患者的人体样本，如血液或其一部分(例如，血浆或血清)、尿液、唾液、痰、脑脊髓液、羊水、粪便、腹水、脓液、淋巴液、阴道分泌物、呕吐物、汗液或从人体获得的任何其它流体。样本可以包含组织和其它非流体样本，如活检和拭子样本，如鼻拭子、直肠拭子、阴道拭子、外科手术部位拭子、皮肤拭子、粘膜组织拭子和口腔拭子样本。在某些实施例中，可以测试非医学样本，这些非医学样本包含但不限于兽医样本、环境样本、农业样本和食物样本。
在一些实施例中，样本104可以直接引入107到测试装置109中并且通常不需要任何预处理步骤。例如，可以将直接来自患者的尿液样本吸移到测试装置104中而不需要之前的样本制备，该样本制备包含与试剂混合、靶标纯化、去除样本组分的处理、离心、生化浓缩、集落纯化或其它处理。一旦获得103，将样本104引入107到测试装置109中。
在一些实施例中，步骤包含样本处理106。103可以获得患者样本104。然后，使患者样本104经历样本处理106，之后将其被引入107到测试装置109。在某些实施例中，样本处理可以是预先样本处理。一些实施例可以包含机载样本处理，该机载样本处理包含过滤、细胞纯化、特异性去除、浓缩或其用于特定类别的细胞或分析物的任何组合。
图6示出了在本发明的各种系统和方法中使用的测试盒201。测试盒201包含用于接收样本的入口203、分离孔205、试剂孔209、成像孔211和用于在孔之间移动样本的通道213以及用于控制该移动的阀207。当与控制仪器介接时，盒201可操作以接收入口203中的样本并通过通道213在分离孔205中将样本分成若干部分。
盒201可以在例如气动端口217处与如本文所描述的仪器的流控模块介接。阀207可以通过打开和关闭其间的连接来控制分离孔205与处理209和成像孔211之间的流体的移动。阀207可以被配置成允许样本的一个或多个部分绕过分离孔205并直接到处理209和成像孔211以提供用于鉴定靶细胞或微生物的存在、用于抗微生物剂敏感性测试或两者的未经温育的参考(nt0)。如图6中所示，阀207可以具有滑杆223设计。滑杆223可以由如本文所描述的仪器的流控模块与在气动端口217处应用的压力或真空协调操纵以便计算机控制的仪器根据正在执行的盒特异性测试的经过编程的参数来计时并引导盒内的流体移动。
分离孔205可以预填充有生长培养基和/或一种或多种抗微生物剂。阀207可以将样本部分保持在分离孔205中以在存在各种抗微生物剂的情况下在任何时间段内进行温育。
样本可以在样本104的引入107和温育115之间的任何点与测试装置109内的一定量的生长培养基混合。温育115步骤可以持续小于约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时或更久，但优选地是约4小时以允许可测量样本104中的靶细胞或微生物的差异生长。最左边的路径示出了未经温育的部分，该未经温育的部分被成像成在不存在温育的情况下确定存在的靶细胞的初始数量(nt0)。
温育115之后，可以将经过温育的部分117暴露于例如可以与样本部分中的特异性靶细胞形成复合物119的磁性标签和可检测标记以进行成像127。然后，可以将经过标记的靶复合物121磁性沉积123在检测表面上。可以对所沉积的靶复合物125进行部分成像127，并且可以通过仪器的图像分析软件分析图像129以对在每个部分中检测到的靶标121的量进行定量。
通过将在存在各种抗微生物剂的情况下已经温育的部分中的靶细胞或微生物的数量进行比较，可以确定那些药剂中的哪一种抑制了生长。比较优选地包含从对样本的未经温育的参考部分进行处理和成像获得的靶细胞数量(nt0)。
本发明的系统和方法可以用于鉴定病原体(包含细菌、真菌、寄生虫和病毒)的适当的治疗性治疗。对于这些应用，在不存在治疗剂的情况下将导致病原体活力降低的条件下，利用各种治疗剂温育靶病原体。通过确定哪种药剂对靶标活力产生负面影响来鉴定用于治疗由靶病原体引起的感染的可能有效的药剂，如通过指示这些品质和行为的繁殖、复制、生长或表型所证明的。例如，可以在存在各种抗微生物剂的情况下将靶细菌性病原体在营养素细菌生长培养基中温育，并且可以对那些药剂对样本中的靶细菌生长的影响进行分析以确定抗微生物剂的有效性。
图7是分析盒201的透视图。可以将样本直接插入到样本孔203中。可以将气动端口217打开以施加压力或真空，以便将样本分配给分析盒201内的孔。首先可以将样本从样本孔203分配到分离孔203，并在温育期间由阀207将该样本保持在该分离孔中并释放到试剂孔209以进行标记，并且然后释放到成像孔211以进行成像。仪器的流控模块可以与盒介接以根据特定测试的要求控制阀与样本和试剂分配协调移动。分析盒201可以具有一个或多个标识符219(例如，条形码)，当由仪器或仪器中的读取器分析或读取时，该一个或多个标识符将盒与一组指令相关联以在仪器内进行处理，并且可以包含用于将测试结果与某个患者相关联的关于患者和样本的信息。
在含有生长培养基和抗微生物剂的分离孔205中温育后，微生物病原体的差异生长对确定抗微生物剂敏感性测试是有用的。在各个实施例中，样本部分可以在分离孔205中温育小于约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时，之后在成像孔中进行处理和成像。基于样本中待分析的靶细胞或微生物，可以选择生长培养基和/或抗微生物剂并将其包含在测试装置201中。例如，可以选择已知支持经过鉴定的靶细胞或微生物的生长的生长培养基以及通常用于治疗经过鉴定的靶标的治疗剂或抗微生物剂。在各个实施例中，对于某个靶标，测试装置201可以预先设置有生长培养基和治疗剂，使得已经鉴定样本中的靶标(例如，已经确定患者感染的来源)的用户可以选择适当的预包装测试装置来进行靶微生物的抗微生物剂敏感性测试或靶细胞的治疗功效分析。
在适当的温育时间段之后，可以操纵阀207以将经过温育的样本部分从分离孔205转移到试剂孔209。处理209孔可以预填充有处理试剂以对靶细胞进行标记或微生物以进行成像。可以将处理试剂冻干或风干以进行储存并在与流体样本部分和生长培养基接触时被活化。试剂孔209例如可以含有靶特异性可检测标记和磁性标签。当经过温育的样本部分穿过试剂孔209时，形成了包括靶细胞、可检测标记和磁性标签的靶特异性复合物。
然后，可以使测试装置201经受磁场(例如，放置在永磁体上)以将复合物拉到成像孔211的底部上的检测表面。成像孔211可以含有染料垫，该染料垫形成位于如本文所描述的成像孔中的上测定层下方的致密不透明水层。将包含靶复合物(其是磁性标记的荧光标记的靶复合物)的所有磁性颗粒拉动穿过下部染料垫层，并且通过磁场使经过标记的靶细胞或微生物穿过染料垫层直到成像孔211上的检测表面215来将这些磁性颗粒沉积在成像孔211的检测表面215上。检测表面215可以是光学透明的以允许对经过标记的靶细胞、分子、病毒或微生物进行光学检测。在处理和磁性选择之后，可以将测试装置201放置在成像台上以进行如下文所描述的图像处理。
测试装置可以具有任何数量的分离孔以及对应的处理和成像孔。尽管本文主要在测试装置具有互连孔以进行自动化处理的上下文中描述了本发明的系统和方法，但是技术也可以在任何已知的流控平台中执行，该技术包含在微量滴定板的孔中或在具有液滴功能的底物上进行手动处理。在一些实施例中，孔的数量优选地大(例如，一百或更多个)并仅受测试装置和仪器的尺寸约束所限制。
在存在各种抗微生物剂的情况下进行温育和与从样本预温育获得的未经温育的生长参考(nt0)进行比较之后，通过对每个样本部分中存在的靶细胞、分子、病毒或微生物的量进行定量，可以确定每种治疗剂对靶细胞、分子、病毒或微生物生长的影响。通过确定哪种抗微生物剂最能抑制生长，可以确定有效疗法以治疗患者的感染。
盒用于处理检测特异性分子靶标、特异性细胞靶标的测定并用于确定有效疗法。当检测特异性微观或亚微观细胞或分子靶标时，靶特异性光学探针(如荧光探针)被设计成与特异性细胞靶标或特异性分子靶标结合。靶特异性磁性颗粒还可以被设计成与细胞靶标或分子靶标结合。首先将可能含有靶标的样本与盒中的标记的探针和颗粒混合。将盒温育一段时间以便形成复合物，每种复合物包括靶标、光学探针和磁性颗粒。施加磁场以将磁性颗粒和剩余的复合物下拉穿过染料垫。与靶标结合的光学探针将发出荧光，并且成像用于鉴定靶细胞或分子的存在。在不放大的情况下，成像技术检测用光学探针标记的靶标。照亮经过标记的靶标使这些靶标发出荧光。所发射的光子照射在含有独立光敏像素元件的阵列的数码相机的CMOS芯片上。直接位于单独靶标上方的像素元件“点亮”为所得图像中的白色斑点。计算机会瞬时地枚举指示存在的靶标的数量的照亮像素。在低分析物浓度下，与跨检测区域集成信号的更常见方法相比，对单独标记的靶标进行数字计数产生更好的信噪比。非放大成像允许大的场瞬时成像——允许少量的细胞靶标在大体积的样本中被快速检测到。
图8是用于执行包括细菌的样本的抗微生物剂敏感性测试的工作流的实例。工作流是根据本发明的各种方法可以在分析盒中执行的温育和处理步骤的示例。样本可以与生长培养基501混合，该生长培养基可以基于对样本中存在的靶微生物的知识来选择(例如，选择阳离子调整的米勒-海顿肉汤(Mueller Hinton broth)以分析样本中的大肠杆菌)。然后可以将样本和生长培养基分成许多(n)个分离孔503以进行温育507。分离孔中的一个或多个可以含有各种抗微生物剂。在没有温育505的情况下可以对一个或多个部分进行分析以对靶微生物进行定量，以便随后与在存在或不存在抗微生物剂的情况下温育之后已经分析的样本部分进行比较。在不存在治疗剂的情况下温育可以提供重要信息，该重要信息包含如果患者已经接受治疗，则可能发生指示非活微生物。对此类经过温育的部分的分析还可以充当抑制生长干扰和试剂稳定性的内部控制。
优选地，已经鉴定了靶细胞、分子、病毒或微生物，并且相应地选择了各种抗微生物剂作为例如通常用于治疗所鉴定的靶标的抗微生物剂。每个分离孔可以含有单一抗微生物剂或抗微生物剂的组合以评估对靶细胞、分子、病毒或微生物生长的组合效果。在不同浓度下的不同抗微生物剂可以与不同分离孔中的样本部分或等分试样组合，并且一些分离孔可以用于复制用相同抗微生物剂进行的治疗以强化结果。由于非抗微生物推断或试剂不稳定性，在一些分离孔中的样本部分或等分试样可以不与抗微生物剂组合以对未经抑制的生长进行定量和/或检测生长抑制。
在温育507之后，可以对经过温育的样本等分试样进行处理并以类似于t0样本等分试样的方式进行成像505，并且细菌或其它微生物的计数可以相互比较、与t0样本等分试样或与其它对照计数509进行比较以确定抗微生物剂或其组合的有效性。例如，Abx孔2中的抗微生物剂抑制了生长，而其它抗微生物剂则没有。因此，来自Abx孔2的抗微生物剂将被推荐用于治疗获得样本的患者。
各种仪器或仪器可以用于与测试装置相互作用以在其它测试中执行样本的靶标鉴定和抗微生物剂敏感性测试。仪器可以包含用于接受测试装置并对其进行分类的输入机构。测试装置可以包含仪器可读的一个或多个标识符标签(例如，条形码)以确定专用测试装置的类型以及样本和患者信息。
仪器优选地由计算机控制以自动操纵测试装置、执行靶细胞、分子、病毒或微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试分析以及产生并分析成像结果。可以将仪器与用户接口(如触摸屏)连接以显示提示和结果以及接收命令。仪器可以包括输送机或机器人臂以在仪器内移动测试装置。为了执行靶标鉴定所需的步骤，仪器优选地包括磁性模块，该磁性模块具有例如永磁体或电磁体以提供磁场，以便将磁性颗粒和经过标记的靶标的复合物沉积在待成像的检测表面上。仪器还可以包含：成像模块，如在美国专利第9,643,180号和美国专利第8,021,848号中所述的那些成像模块，这些美国专利中的每个美国专利的内容通过引用并入本文中，以便捕获经过标记的靶细胞的图像；以及用于相对于仪器的成像模块操纵测试装置的检测表面的台。可以将成像模块可操作地与计算机相关联以提供图像处理、分析和显示能力。仪器还可以包括用于处置使用后的测试装置的废物模块。
对于抗微生物剂敏感性测试分析，仪器可以包含用于在温育期间储存测试装置以进行生长和/或测试温育的一个或多个温育区域。温育区域可以包含加热和/或冷却元件和恒温器以控制该元件将温育区域维持在靶细胞或微生物生长所期望的温度(例如，35℃)下或执行测试温育所期望的温度下。仪器可以包含流控模块以例如通过使用由液压、气动压力或真空提供的功能操纵阀、柱塞和致动器来驱动测试装置内的样本和试剂移动穿过并入到流控模块中的机械装置。在一些实施例中，机械输送臂可操作以在包含温育模块、流控模块、磁性模块、成像模块和废物模块的各种功能模块中操纵测试装置。
图9示出了用于在测试装置内对样本执行靶细胞、分子、波形蛋白或微生物鉴定以及抗微生物剂敏感性测试的示例性仪器。仪器包含转盘、机械输送臂和温育模块、流控模块、磁性模块、成像模块和废物模块。仪器601可以用于与分析盒相互作用以执行样本的靶标鉴定、抗微生物剂敏感性测试或其它测试。仪器601包含至少一个用户接口603(例如，触摸屏)以显示提示、结果、报告并接收命令。仪器601可以分为不同的孔。孔可以包含用于运输和温育分析盒的转盘605、用于容纳处理和温育设备的上孔607和用于容纳电子、成像和气动设备的下孔609。本公开的仪器和方法可以用于检测感染、鉴定并定量各种靶细胞、分子或微生物(包含病毒、细菌、真菌、寄生虫、人细胞、动物细胞、植物细胞)。通过定制靶标的生长培养基和抗微生物剂，可以对各种靶细胞、分子、病毒或微生物进行抗微生物剂敏感性测试。
可检测标记可以包含任何合适类型的光学可检测标记。可检测标记的非限制性实例包含共振光散射颗粒和量子点。可检测标记可以包括靶特异性部分以优选地与靶细胞、分子、微生物、病毒、宿主细胞或其它非细菌分子结合。靶特异性结合分子可以包含例如与靶特异性抗原结合的抗体或与靶特异性核酸序列互补的核酸(或核酸类似物)探针。
不同荧光探针上的荧光团可以具有不同光子信号，使得测试中不同类别的靶细胞或微生物的荧光信号可以由不同光子信号区分。用于区分多种不同光子信号的成像方法是熟悉本领域的技术人员已知的。例如，可以使用对应于不同荧光团的动作光谱的不同对的激发和发射滤光片来获取多个成像。因此，可以测试在单个处理和成像孔中单个样本部分的多个特异性靶细胞、分子、病毒或微生物的存在。
在某些实施例中，可检测标记和磁性标签以及靶特异性结合分子可以是单独的或组合的/连接的。在某些实施例中，磁性颗粒和可检测标记可以是非特异性的，如亲和素涂覆的磁性颗粒和SYBR绿色染料。例如，生物素标记的靶特异性抗体(即，靶特异性结合分子)可以用于靶向特异性细胞或微生物，该特异性细胞或微生物然后将由亲和素磁性颗粒标记以进行特异性磁性选择。所有细胞都将由SYBR绿色标记，但只有磁性分离的(即生物素标记的)靶标将沉积在检测表面上以进行成像。
在非限制性实施例中，微生物的可检测标记包括荧光原位杂交(FISH)。FISH分析使用包括核酸(或核酸类似物)探针部分和荧光团部分的荧光探针来通过与靶特异性核酸序列重新关联而结合，使得靶标然后可以被光学探测到。例如，可以使用靶向靶特异性16SrRNA的探针来选择性地标记并检测微生物。参见Volkhard等人,2000,荧光原位杂交允许快速鉴定血液培养物中的微生物(Fluorescent In Situ Hybridization Allows RapidIdentification of Microorganisms in Blood Cultures),《临床微生物学杂志(J ClinMicrobiol)》,38(2):830-838，其通过引用并入本文中。对于鉴定测试，多种不同的靶特异性荧光探针可以用于独立鉴定单个样本中的多个不同类别的靶标。不同的荧光探针可以包括不同的核酸探针部分，该核酸探部分被设计成使得在测试重新关联条件下，荧光探针的核酸探针部分优选地与不同类别的靶细胞或微生物的靶特异性细胞核酸序列重新关联。可以在美国专利公开2003/0228599中找到探针重新关联的详细讨论，该美国专利通过引用并入本文中。
在某些实施例中，可以等温地执行用于鉴定和/或定量样本中的靶细胞或微生物的FISH分析，而没有试剂变化并且没有细胞固定，从而允许在反应开始与获得成像结果之间的约30分钟或更少时间内进行自动的、装置上处理。
磁性颗粒和施加的磁场可以用于物理分离溶液中已经结合的可检测标记与未经结合的可检测标记，无需洗涤步骤。如通过引用并入本文中的美国专利第9,643,180号中所描述的，可以通过使用染料垫层最小化或消除图像背景以将样本基质和未经结合的光学标记与成像孔的检测表面光学隔离。优选地选择染料垫层中的染料以吸收仪器所使用的激发和发射的光以进行成像。因此，来自测定层中的未经结合的标记部分的信号不会显著干扰检测来自磁性沉积在检测表面上的经过标记的靶细胞、分子、波形蛋白或微生物复合物的信号。类似地，使用染料垫防止来自样本基质的任何自发荧光(也包含在测定层中)显著干扰检测来自所沉积的经过标记的靶细胞复合物的信号。染料垫的这些属性可以使检测靶细胞或微生物成为可能，而不需要用户制备样本并且也不需要从测试装置中去除未经结合的标记的洗涤步骤。
经过标记的靶细胞、分子、病毒或微生物的数字成像可以使用数字成像仪实现。在优选荧光标记的情况下，可以使用各种透镜、照明源、激发光源和滤光片。成像模块可以包含能够产生溶液中或被拉到孔或测试装置中的检测表面的可检测标记的靶细胞、分子、病毒或微生物的数字图像的任何装置。成像模块可以包含例如CCD相机、CMOS相机、线扫描相机、CMOS雪崩光电二极管(APD)、光电二极管阵列、光电倍增管阵列或其它类型的数字成像检测器。
成像可以在单组条件下执行，或者光源、滤光片和/或透镜可以在图像之间变化以检测不同的光学可区分的标记(例如，对应于不同靶细胞或微生物的不同荧光探针)。在美国专利第9,643,180号和第8,021,848号中所描述的成像技术和仪器(这些美国专利中的每个美国专利的内容通过引用并入本文中)可以允许观察并枚举单独细胞靶标、分子靶标或病毒靶标。
图10A是仪器的功能布局601的示例性顶视图。仪器601可以包含用于接受多个分析盒并对其进行分类的输入机构703(例如，装载架或盘)。仪器601还可以包含转盘605和机械输送臂707以接受、移动并操纵仪器705内的分析盒。仪器601还可以包含任务调度器。仪器601优选地由计算机控制以自动操纵分析盒、执行微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试分析并且产生结果。仪器601可以包含用于执行本发明的方法的多个子系统。图10B是转盘的透视图。
仪器601的子系统可以包含气动子系统709、磁性子系统711、成像子系统713和垃圾子系统715。磁性子系统711可以包含例如永磁体或电磁体以提供磁场，以便将磁性颗粒和靶标的复合物沉积在分析盒的检测表面上以进行成像。成像子系统713可以是如美国专利第9,643,180号和美国专利第8,021,848号中所述的那些成像子系统以及用于相对于仪器601的成像模块操纵分析盒109的检测表面的台，这些美国专利中的每个美国专利的内容通过引用并入本文中，如上文所讨论的。成像子系统713可以与计算机可操作地相关联以提供图像处理、分析和显示能力。气动子系统709可操作以例如通过使用由气动压力或真空提供的功能操纵阀207(例如，柱塞和致动器)来驱动分析盒109内的样本104和试剂移动穿过。在一些实施例中，液压或机械装置还可以并入到气动子系统709中以实现样本104的移动。废物子系统715可以包含用于处置使用后的分析盒109的容器(例如，可拆卸的箱)。
仪器601还可以包含用于在温育期间保持(或储存)分析盒以进行生长和/或测试温育的一个或多个温育区域。温育区域可以包含加热和/或冷却元件和恒温器以控制该元件将温育区域维持在靶细胞或微生物生长所期望的温度(例如，35℃)下或执行测试温育所期望的温度下。在各个实施例中，在仪器上运行的测试可以被设计成等温的，使得需要单一温度并且仪器内部可以维持在该温度下。在此类情况下，邻近转盘的简单储存槽或转盘本身可以充当温育储存以进行正在执行的测试的各个温育步骤。
在一些实施例中，机械输送臂机构707可操作以操纵仪器601内的各个子系统中的分析盒109。在本发明的一些实施例中，机械输送臂707在仪器的转盘605与各个子系统之间转移分析盒109中的每个分析盒。机械输送臂707施加拉力或推力以将分析盒109转移到转盘605上并从该转盘上移除该分析盒。转盘605旋转以将分析盒109定位成邻近子系统中的另一个子系统，并且机械输送臂707然后施加力以将分析盒109滑动到子系统上。分析盒109从不会被机械输送臂707或仪器601的任何其它元件抓住。在仪器601内滑动或推动分析盒109减少暴露于碎片。仪器内的各种站或子系统以及转盘605包括槽717、719，该槽的大小被设定成当盒109在转盘605与各种站之间滑动时接受并引导盒。旋转转盘605用于将其上的槽717与站上的对应槽719对准，使得形成导轨或轨道，盒109可以沿着该导轨或轨道通过机械输送臂707滑动。
在一些实施例中，仪器包含用于管理仪器601内的分析盒109的任务调度器。任务调度器可操作以控制移动，如在多个子系统中运输并转移分析盒109中的每个分析盒。在一些实施例中，每个分析盒109在子系统中花费的时间也可以由任务调度器管理。任务调度器可以根据需要在各个子系统上储备时间以对分析盒109中的每个分析盒进行分析。在本发明的一些实施例中，任务调度器可以通过鉴定盒的内容来管理分析盒109的移动(即，待执行的分析的步骤/参数)。
调度器可以包括存储在有形的非暂时性存储器1305上并由处理器1303操作的软件，如图11中所示。处理器可以与仪器601和各个电机以及子系统或其上的站通信以例如操作转盘和机械输送臂，并且控制成像装置以及记录如从成像子系统或站接收到的存储器1305中的图像。处理器1303和存储器1305可以构成计算机1301，该计算机还可以包含输入/输出装置1307，如监测器、键盘、鼠标或触摸屏。此类计算机1301可以连接到网络1309以允许接收包含测试结果的数据并将该数据传递到其它连接装置。
在一些实施例中，仪器601还可以包含读取器，该读取器可操作以分析位于分析盒109上的一个或多个标识符(例如，条形码)219。分析盒109的内容和所需处理可以与分析盒109上的标识符219相关联。分析盒109中的每个分析盒可以包含可由仪器601读取的标识符109。仪器601可以通过读取器读取标识符219并将标识符219与任务调度器执行的一组特定指令相关联。读取器可以位于仪器601的外部，并且可以在分析盒109从装载架703转移到转盘605之前读取标识符219。标识符219可以是条形码，并且对分析盒109中的样本可以是特定的/唯一的。一个或多个标识符可以指定样本信息、患者信息、测试信息或其组合。
在读取标识符时，计算机处理器可以访问与该标识符相关联的测试(例如，大肠杆菌的抗微生物剂敏感性测试)。处理器然后可以确定执行测试所需步骤的时间表并在开始时确定何时将需要每个站或子系统以及多久完成测试。处理器可以从其存储器访问当前在仪器中运行的其它盒的时间表并比较在所需时间各个站的可用性。某些步骤可以是灵活的(例如，温育)，并且时间表可以提供可以改变以适应其它盒上的其它调度操作的长度范围。如果在某个时间开始测试将会导致子系统或站中的任何子系统或站的不可调和的冲突，则仪器可以拒绝盒并通知用户开始并运行无冲突测试的可接受的稍后时间。在某些实施例中，仪器可以包括子系统或站中的任何子系统或站中的两个或更多个以避免此类冲突。例如，根据期望的仪器容量，如流控模块等高业务量站可以保证包含两个或更多个子系统或站。
图12A和图12B示出了根据某些实施例的示例性机械输送臂1901。机械输送臂1901包含略长于待操纵的盒109的长度的可旋转轴1905。机械输送臂1901还包含定位于可旋转轴1905的任一端处的一个尖头1903。机械输送臂1901可以使尖头1903在如图12A中所见的升高位置与如图12B中所示的降低位置之间旋转。当在升高位置时，机械输送臂1901可以定位于待操纵的盒109之上，并且一旦位于适当位置，尖头1903可以如图12B中所见的降低成侧接待操纵的盒109的任一侧。然后，机械输送臂1901的移动将使尖头1903中的一个尖头接触盒109的一侧并将移动机械输送臂1903的力传递到盒109。由于可旋转轴1905的长度和尖头1903的分离，仅一个尖头1903一次可以接触盒109，使得盒不会被仪器抓握或压缩。如上所讨论的，转盘或站中的槽充当轨道以引导盒109侧向移动，使得仅需要与机械输送臂1901接触的单个接触点来移动盒109。
图13示出了在本公开的方法中使用的示例性仪器601。仪器601包含用户接口603以接收用户输入并显示结果、状态和其它信息。将仪器601围封以在仪器601内维持期望的温育或反应温度。仪器具有出入门，该出入门是敞开的以允许进入装载盘703，用户可以将盒装载到装载盘中以进行分析。仪器603可以读取装载盘703内的盒上的标识符，之后打开内部门并将盒带到转盘内以开始处理。那样，如果有任何错误或调度冲突，该错误或冲突可以在载入盒之前被解决。装载盘703将盒定位在相对于仪器的设置位置，从而允许仪器扫描标识符和机械输送臂的已知位置以与盒接合并将该盒带到转盘中。盒和装载盘可以包括非对称占用空间，使得盒仅可以以一个朝向插入到盘中以避免堵塞或错误，如标识符指向远离仪器的扫描仪。
图14示出了装载到装载盘中的盒109以及装载有从患者获得的样本104(例如，尿液样本)的盒201。样本正被装载到盒201中的入口203中，之后将盒201装载到装载盘中并插入到仪器中。因为用于测试的所有试剂被预装载在盒上并且仪器可操作以自动执行所有测试步骤并提供可执行结果，所以图14中示出的样本装载步骤是所需的唯一用户交互。因此，根据需要频繁用户干预的标准实验室技术减少了用户错误的机会。
图15示出了用户将装载盘703中的盒109装载到仪器601的接收区域中。将仪器601的内部门关闭并且可以保持关闭，直到仪器601识别出装载盘703中的所装载的盒109，扫描这些盒并准备处理这些盒为止。
图16示出了包含转盘605的仪器601的内部视图，其中仪器601的内部门已经打开并且盒正被机械输送臂滑动到转盘上以进行处理。
图17示出了根据本发明的实施例的仪器的内部组件的侧视图。废物箱2205被安置在转盘组合件605下面，温育室2210位于转盘组合件605远侧的仪器的上部部分，并且电子器件部分2215位于转盘组合件605远侧的仪器的下部部分。图18和图20示出了根据本发明的实施例的仪器的侧视图。图19示出了根据本发明的实施例的仪器的前视图并且示出了显示面板或用户接口603。图21示出了根据本发明的实施例的仪器的后视图。
图22示出了该仪器的布局的顶视图的实施例。盒装载到仪器的盒装载架703处。转盘组合件605被安置在盒装载架703远侧并且在仪器内的中央。流控模块2220、磁性模块2230和成像模块2240被安置在转盘组合件605远侧。机械输送臂2250在仪器内运输盒。
图23示出了转盘605的实施例。转盘605安置在仪器隔板2260上。机械输送臂2250在仪器内运输盒并包括R-θ运输机构2253和臂延伸驱动器2257。图24示出了机械输送臂2250的R-θ运输机构2253的实施例，该运输机构具有盒运输指2259并运输转盘605中的盒。图25示出了机械输送臂2250的臂延伸驱动器2257的实施例，该臂延伸驱动器将盒从转盘605运输到流控模块2220、磁性模块2230和成像模块2240。
图26示出了成像模块2240的实施例。成像模块2240包含XYZ台组合件2270，该组合件在成像期间在x、y和z方向上移动盒进行放置并被安置在仪器隔板2260上方。光学组合件2280安置在仪器隔板2260下方。图27示出了成像模块2240的顶视图，该成像模块包含仪器隔板2260、XYZ台组合件2270和盒巢2275。盒安置在盒巢2275中，该盒巢然后通过XYZ台组合件2285移动以放置在光学组合件2280上方以进行成像。图28示出了光学组合件2280的实施例，该光学组合件包含光2282、透镜2284、滤光片轮2286和相机2288。
图29示出了流控模块2220的实施例的顶视图。盒插入到盒槽2224中，该盒槽具有安置在盒槽2224的相对侧上的加热块2223。具有盒夹2222的盒夹紧机构2221用于将盒夹到盒槽2224中并与盒阀致动器2225接触。图30示出了流控模块2220的实施例的侧视图，该流控模块包含盒阀推指2227和盒气动端口2228。
图31示出了磁性模块的实施例的顶视图。盒滑动到盒安装槽3100中。每个盒安装槽具有安置在盒安装槽的底表面上的磁体3120，其中每个槽具有围绕磁性槽安置的磁体罩3130。图32示出了磁性模块的实施例的侧视图。
本发明的系统和方法可以包含计算机，该计算机可操作以控制仪器和测试装置和/或以处理成像结果。计算机可以包括耦接到非暂时性存储器装置的处理器。存储器优选地存储处理器可执行的指令以使系统操纵仪器内的测试装置并获得和处理经过标记的靶细胞的图像。
处理器是指执行处理操作的任何装置或装置的系统。处理器将通常包含用于提供中央处理单元(CPU)的芯片，如单核或多核芯片。可以由来自英特尔公司(Intel)或AMD公司的芯片提供处理。处理器可以是任何合适的处理器，如英特尔公司(加利福尼亚州圣克拉拉)以XEON E7商标销售的微处理器或AMD公司(加利福尼亚州桑尼维尔)以OPTERON 6200商标销售的微处理器。
存储器是指以机器可读格式存储数据或指令的装置或装置的系统。存储器可以包含一组或多组指令(例如，软件)，当由所公开的计算机的处理器中的一个或多个处理器执行时，该一组或多组指令可以完成本文所描述的方法或功能中的一些或全部。优选地，计算机包含非暂时性存储器，如固态驱动器、闪存驱动器、磁盘驱动器、硬盘驱动器、订户身份模块(SIM)卡、安全数字卡(SD卡)、微型SD卡或固态驱动器(SSD)、光学和磁性介质等或其组合。
输入/输出装置是用于向计算机输入或输出数据的机构或系统。示例性输入/输出装置包含视频显示单元(例如，液晶显示器(LCD)或阴极射线管(CRT))、字母数字输入装置(例如，键盘)、光标控制装置(例如，鼠标)、磁盘驱动单元、信号生成装置(例如，扬声器)、触摸屏、加速度计、麦克风、蜂窝射频天线和网络接口装置，该网络接口装置可以是例如网络接口卡(NIC)、Wi-Fi卡或蜂窝调制解调器。输入/输出装置可以用于允许用户控制仪器并接收由仪器从测试装置获得的数据。
实例
实例0：概述
用于病原体鉴定和抗微生物剂敏感性测试的微量滴定板
本发明的系统和方法允许各种感染的病原体鉴定(ID)和抗微生物剂敏感性测试(AST)，该各种感染包含卫生保健相关感染(HAI)(如败血症)、导管相关泌尿道感染(CAUTI)、呼吸机获得性肺炎和外科手术部位感染。本发明通过其直接从患者样本中枚举低水平的病原体的能力来实现快速结果，从而避免当前培养方法所需的天数。本发明通过使用数字非放大成像来实现高灵敏度和定量以对用特异性荧光核酸探针标记的病原体细胞进行鉴定和计数。鉴定之后，本发明使用稳健的表型AST方法来确定适当的靶向疗法。测试在约30分钟内检测感染并鉴定病原体并且在约4小时内递送敏感性特性。除了对患者样本进行直接测试之外，测试工作流类似于自动化鉴定和抗微生物剂敏感性测试，从而消除了耗时的基于培养的集落纯化步骤。本发明消除了细胞裂解、扩增、生化纯化和洗涤步骤。方法需要很少或不需要样本制备。其它优势包含递送多种微生物感染的测试结果的能力、高通量(>80次测试/轮)和成本，该成本是竞争快速方法的一部分。因此，需要可以快速检测感染、鉴定病原体并确定适当的靶向抗微生物剂疗法的诊断测试。
用于快速检测综合征感染并确定靶向疗法的ID/AST平台：通过提供快速且成本有效地鉴定患有严重综合征感染的患者、鉴定病原体并确定适当的靶向抗微生物疗法的测试，ID/AST平台解决了当前基于培养的技术的缺口。本发明的ID测试本质上是定量的，并且本发明的AST测试使用评估在一系列抗微生物稀释液中的生长的稳健表型方法。然而，与培养相比，本发明的方法在约30分钟内检测到感染并鉴定病原体并且可以在约4小时内递送AST结果。测试的速度由以下造成：(1)能够直接对样本进行测试，从而避免了耗时的集落纯化步骤；(2)技术能够使用非放大数字成像技术来快速枚举少量病原体细胞；以及(3)能够评估在几代细菌中病原体对抗微生物剂的敏感性。
平台概述：ID/AST平台提供了快速的ID/AST结果，使得患有严重综合征感染的患者在感染开始时接受适当的靶向疗法。自动化ID/AST仪器容纳了专用的基于微量滴定板的ID和AST消耗品的菜单。
为了检测感染并鉴定病原体，分析ID消耗品中的患者样本以首先确定是否存在感染，并且如果存在感染，则使用荧光标记的细胞的数字成像来鉴定病原体。一旦检测到感染并且鉴定出病原体，就在含有相关抗微生物剂的各种稀释液的营养培养基中的AST消耗品中温育相同样本的另一个等分试样。通过确定病原体生长的抗微生物剂的浓度来确立敏感性特性。
技术优势：本发明的针对综合征感染ID/AST测试的优势包含：快速的感染监测和病原体ID：约30分钟；快速的、稳健的、全面的表型AST：约4小时；非无菌样本类型的ID/AST结果；多种微生物感染的ID和AST结果；低成本消耗品和试剂；简单可负担的仪器；无样本制备或最少样本制备，对样本基质稳健；超灵敏病原体检测和枚举；高通量(>100份样本/轮/仪器)；全自动化样本跟踪(无需分型)；以及为了准确度的内部对照。
本发明在不放大的情况下检测单独微观靶标或亚微观靶标：本发明的成像技术在不放大的情况下检测用荧光寡核苷酸探针标记的靶细胞。照亮经过标记的细胞使这些发出荧光。所发射的光子照射在含有独立光敏像素元件的阵列的数码相机的CMOS芯片上。直接位于单独靶标上方的像素元件“点亮”为所得图像中的白色斑点。计算机会瞬时地枚举指示存在的靶标的数量的照亮像素。在低分析物浓度下，与跨检测区域集成信号的更常见方法相比，对单独标记的细胞进行数字计数产生更好的信噪比。非放大成像允许大的场瞬时成像——允许少量的细胞靶标在大体积的样本中被快速检测到。
图33示出了本发明在没有样本制备或洗涤步骤的情况下如何快速并具体地对复杂样本中的靶细胞进行计数。首先将可能含有靶病原体的液体样本与荧光原位杂交(FISH)标记试剂进行混合。试剂包含与核糖体RNA(rRNA)、细胞透化试剂结合的荧光标记的靶特异性寡核苷酸探针以及与带负电的细菌细胞结合的带正电的磁性纳米颗粒。将混合物添加到透明底的成像孔中，该成像孔的底表面用由染料和密实剂构成的干染料垫试剂涂覆。在染料垫样本水合时，形成了两层：位于测定层下面的密实不透明染料垫层，在该测定层中，靶细胞与磁性颗粒结合并由荧光探针标记。将成像孔放置在永磁体之上吸引磁性颗粒以及与其结合的任何细胞穿过染料垫层，从而将这些磁性颗粒和细胞沉积在底表面上，在该底表面上，对荧光标记的靶细胞立即进行成像和计数。染料垫创新将样本和未经结合的荧光试剂与成像表面光学隔离，从而消除了测定洗涤步骤和仪器液体处理，因此显著地提高了易用性并且降低了仪器的成本和复杂度。
微量滴定板格式允许大量孔以允许确定许多抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)以及对大范围综合征感染、病原体和抗微生物剂进行测试的可消耗管道。基于FISH的ID用于实现探针设计的特异性、效率和成本有效性。简单、高效且成本有效的磁性选择方法使用与带负电的细菌细胞结合的阳离子顺磁颗粒。简单且经过证明的仪器简化了产品开发并降低了成本。
CAUTI ID测试：CAUTI ID测试确定患者是否患有由常见CAUTI病原体中的一种或多种病原体引起的UTI。表1列出了将由测试鉴定的病原体。这些病原体共同造成了美国95％的CAUTI病例，病原体计数大于10,000CFU/ml的样本将被评为阳性的。
表1：所鉴定的病原体
Figure BDA0003101035740000331
图34示出了CAUTI ID测试的工作流。在没有靶特异性寡核苷酸标记的探针的情况下，首先将尿液样本与如上所述的FISH试剂混合。然后将混合物添加到CAUTI ID成像板的孔中，这些孔中的每个孔含有靶向不同CAUTI病原体的荧光核酸探针。在FISH标记和磁性选择(约30分钟)之后，在ID/AST仪器中对孔进行成像。
为了评估总细菌生物负荷，CAUTI ID测试还枚举了使用DNA染色的微生物细胞。测试包含使用革兰氏阳性细菌靶标和革兰氏阴性细菌靶标两者进行表明测定有效性的内部阳性和阴性对照。
CAUTI AST测试：AST方法评估了通过CAUTI ID测试鉴定的病原体在存在抗微生物剂的情况下生长的能力。图35示出了CAUTI AST测试的工作流。首先将样本与生长培养基混合，并且然后分到多个生长孔中，这些生长孔含有与该病原体相关的抗微生物剂的稀释液。开发了两个基于微量滴定板的面板：针对革兰氏阴性病原体的CAUTI AST GN面板和针对革兰氏阳性病原体的CAUTI AST GP面板。面板含有干燥的抗微生物剂的2倍连续稀释液。表2中列出了用于面板的候选抗微生物剂。
表2：候选抗微生物剂
Figure BDA0003101035740000332
Figure BDA0003101035740000341
在约35℃下选择性生长之后，枚举了各个孔中的靶细胞的数量以确定每种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)。为了评估差异生长，将与所鉴定的病原体相对应的荧光病原体特异性探针和FISH试剂与每个孔的内含物组合，这些内含物被转移到含有干燥染料垫的成像板上。在温育和磁性选择之后，ID/AST医院仪器在枚举每个孔中的靶细胞的数量之后确定每种抗微生物剂的MIC。
仪器：平台是半自动化系统，该半自动化系统包括自动化ID/AST医院仪器、微量滴定板的磁性站和用于液体转移的现成96孔移液器。ID/AST仪器和磁性站将基于当前的自动化成像仪器和用于分析微量滴定板的磁性站。
可行性数据：开发针对病原体的快速、简单、高性能FISH测定。开发了针对病原体的基于FISH的30分钟测定。所有步骤在单个测定中进行、混合并且方法无需洗涤步骤。协同的细胞透化、杂交/标记并且与磁性颗粒结合，之后是磁性选择和成像。方法使用廉价且容易获得的试剂，如未修饰的磁性颗粒、寡核苷酸和去垢剂。
通过优化探针设计透化和杂交条件，开发了大大提高FISH信号强度的标记方法。方法使用多个经过标记的靶特异性寡核苷酸探针和帮助解开rRNA二级结构的辅助探针。表明了在仅30分钟内在所需阈值(10,000CFU/ml)下直接在尿液样本中检测到8种靶CAUTI病原体(大肠杆菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))。开发了用于使用DNA染色枚举尿液样本中的总细菌计数的方法，该方法对于排除感染和鉴定多种微生物样本和无症状UTI是有价值的。
尿液中病原体的检测极限：图36示出针对大肠杆菌的新方法的检测极限(LoD)为约170个细胞/测定，该大肠杆菌被掺入到含有10％尿液的测定中。这显著低于250个细胞/测定的靶LoD，该靶LoD将需要满足在10％尿液中10,000个病原体细胞/mL的阳性阈值(假设测定体积为250uL)。此外，期望通过使用浓度更高的尿液(例如，≥20％)显著提高LoD，正如在含有多达70％尿液的测定中已经示出的测定稳健性一样。
FISH测定必须是包含性的，也就是说，该测定必须检测到给定靶病原体的任何菌株。图37示出了大肠杆菌的代表性包容性数据，这表明新方法可以实现靶病原体的高包容性。还表明了方法的特异性。至关重要的是，由于与样本中的其它病原体或共生微生物交叉反应，因此病原体特异性测定不会产生假阳性。图38中的代表性特异性数据表明可以利用方法实现优异特异性。
图39中的CAUTI ID结果表明了实现准确鉴定的潜力。使用了微量滴定板测试格式，从而将不同靶特异性探针放置在不同的孔中(列)。测试了掺有不同CAUTI病原体(行)的尿液样本。使用公司提议的仪器原型对测试进行处理和分析。
图40示出了大肠杆菌和粪肠球菌的CAUTI AST测试的结果，大肠杆菌和粪肠球菌是引起CAUTI的最常见的革兰氏阴性病原体和顶级革兰氏阳性病原体。结果表明了4小时CAUTI AST方法的MIC与传统肉汤微量稀释参考测试之间的100％基本一致性。在此未示出的其它结果表明了在室温下利用至少12个月的干燥染料垫的微量滴定板消耗品的超过4个数量级的动态范围和稳定性。这些数据示出了开发快速、敏感、多重UTI测试的可行性，该测试在几小时内直接从患者样本中递送准确的表型抗微生物剂敏感性结果。
实例1.使用新颖、快速荧光原位杂交测定的革兰氏阴性细菌的检测极限(LoD)
概述：以下实例表明可以使用新颖等温荧光原位杂交方法检测非常低浓度的细胞。示出了三种常见人泌尿道感染(UTI)病原体的检测极限。
实验方法：
细菌细胞制备：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司(Hardy Diagnostics)，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得大肠杆菌ATCC 19138、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和铜绿假单胞菌ATCC 9721的细菌培养物。在细胞在600nm处达到0.15-0.30的光密度读数之后，在稀释前将细胞放置在冰上持续至少15分钟。冷却之后，将细胞稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司(Teknova)，目录号M5860)中达到待测定的浓度(大约19200、9600、4800、2400、1200、600、300和150个集落形成单位(CFU)/反应)。对于更准确的细胞浓度，使用集落计数对这些估计的细菌输入进行调整。通过将对数期培养物在MHBII中稀释到约500CFU/mL，将100μL平板接种于TSA平板上并在35℃下生长16到24小时之后对集落进行计数来确定板计数。使用平均板计数，计算了每个被测浓度中存在的实际CFU。
磁性颗粒的制备：聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)和羧基涂覆的铁含量高的磁性颗粒(羧基磁性颗粒，Spherotech，目录号CM-025-10H)用于非特异性地捕获细菌细胞。将每个颗粒以1:40稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中，其中聚天冬氨酸性颗粒的最终浓度为大约1.38×109个颗粒每反应，并且羧基颗粒的最终浓度为大约3.46×109个颗粒每反应。将含有绿色染料(深绿色荧光微球(Dragon GreenFluorescent Microspheres)，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。
FISH探针的制备：将大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的两组物种特异性DNA低聚物与铜绿假单胞菌的一组物种特异性DNA低聚物在介于80到85℃之间的水浴中加热10分钟并且然后放置在冰上以减少聚合。DNA低聚物组含有在寡核苷酸和2-6辅助寡核苷酸的5'端或5'和3'端两者上用荧光染料(Alexa647N，赛默飞世尔公司(Thermo Fischer))标记的物种特异性DNA寡核苷酸，这些辅助寡核苷酸邻近或靠近特异性探针结合并被设计成破坏核糖体亚单位的局部二级结构，并且允许经过标记的特异性探针对靶rRNA具有更大的杂交效率。图44中的表A中示出了此实例中使用的探针序列。
干燥杂交缓冲液板的制备：制备了10X SSC(1.5M NaCl、0.15M柠檬酸钠，西格玛公司(Sigma)，目录号S6639)、2.6％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、2.4％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.43M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)和0.6％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)的混合物。将30uL的该混合物添加到96孔板的每个孔中。将板放置到50℃下的对流烘箱中并允许干燥过夜。当将100uL的液体添加到这些孔中，实现了3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)和0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)的正确杂交缓冲液浓度。
检测极限(LoD)测定程序：将适合于所关注细菌的DNA寡核苷酸组的混合物与尿液和浓阳离子调整的米勒海顿储备液(MHBII)组合以制备含有1X MHBII和30％合并人尿液(创新研究公司(Innovative Research)，目录号IRHUURE500ML)的最终溶液。探针浓度在不同的细菌物种之间变化，但经过标记的寡核苷酸的范围为0.2-0.6μM，并且对应的辅助探针的范围为1.5-6μM。将90uL的该混合物放置在适当干燥的杂交缓冲板中。添加10uL的磁性颗粒混合物，然后添加10uL适当的细胞稀释液。评估被测的每个靶细菌的每种细胞浓度的十二个复制品和空白(不含细菌的培养基)的24个复制品。将100μL的最终反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方(Orient)，目录号191L)的微量滴定板，并在35℃下温育30分钟以允许同时再水合“染料垫”，标记细菌细胞并将磁性颗粒与细菌细胞表面结合。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司(Dexter magnetic technologies)，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(Prior Scientific)(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼(Sony)IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：在每个细胞浓度下，确定了检测到的荧光对象的数量。将来自所有八个细胞浓度的数据拟合为线性回归线，并且最低3个细胞输入的斜率、截距和标准偏差用于确定被测的每种细菌的空白极限(LoB)和检测极限(LoD)。
结果：
被测的所有三种细菌都示出了低检测极限。图示出了利用用于计算LoB和LoD的线性拟合产生的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的数据。可在单个反应孔中检测到的CFU中指示了LoB和LoD。
结论：在该实例中描述的新颖且快速的FISH方法示出为使用最少处理的尿液基质，每次反应的检测极限为约500CFU或更少的敏感方法。
变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图41示出了所示大肠杆菌ATCC 19138的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为89CFU/测定，并且LoD为284CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即9,467CFU/ml。
图42示出了所示铜绿假单胞菌ATCC 9721的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为104CFU/测定，并且LoD为506CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即16,867CFU/ml。
图43示出了所示肺炎克雷伯菌ATCC 700603的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为109CFU/测定，并且LoD为319CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即10,633CFU/ml。
图44是在该实例中使用的探针序列的表。
实例2.包容性：使用本发明的快速FISH方法检测并鉴定细菌物种的不同菌株
概述：该实例表明使用本发明来检测靶向细菌物种的不同菌株。呈现了11种不同大肠杆菌菌株的原始数据，并且总结了肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和肠球菌的数据。使用等温荧光原位杂交(FISH)在30分钟内对细菌细胞靶标进行标记并在MultiPathTM基于CCD相机的检测系统上进行检测。
实验方法：
细菌细胞制备：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得不同菌株的细菌培养物。使用600nm处的光密度来估计细胞浓度，将细胞稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到每个反应大约600个CFU和3000个CFU。对于更准确的细胞检测计算百分比，使用集落计数对这些估计的细菌输入进行调整。通过将对数期培养物在MHBII中稀释到约500CFU/mL，将100μL平板接种于TSA板上并在35℃下生长16到24小时之后对集落进行计数来确定板计数。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
细菌细胞的标记：通过将经过稀释的细胞、等温杂交缓冲液(0.9X MHBII、3X SSC(1.5M NaCl、0.15M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)、靶向16S或23S细菌rRNA的物种特异性Alexa647N标记的DNA或含LNA的DNA探针(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，IDT)、促进有效杂交(IDT)的辅助探针和30μL的合并人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)组合来制备100μL标记反应。图48中的表示出了探针序列。
根据制造商的说明书，通过Zeba 7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893或89892，取决于尿液量)首先对尿液进行处理。然后，将10μL的磁性颗粒制剂添加到该混合物中。将最终反应混合物转移到含有50μL(先前干燥的)“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板，在35℃下温育30分钟以允许同时再水合“染料垫”、标记细菌细胞并且将磁性颗粒与细菌细胞表面结合。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：经过标记的细菌细胞位于MultiPath实验室成像系统上，该实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：对于每种细菌，确定荧光对象的数量(测定信号)。如果在无细胞条件下检测到的信号高于信号的三个标准偏差，则认为检测到细菌菌株。
结果：
图41示出了11个大肠杆菌菌株的测定信号。检测到所有11个菌株高于细胞输入为大约600个CFU每测定时的背景“无细胞”条件。
图42示出了表示为检测到的细胞百分比(细胞输入孔中的总测定信号-背景测定信号/总细胞输入*100)的数据。尽管检测效率在菌株与菌株之间稍微有所变化，但这没有抑制测定检测11个不同大肠杆菌菌株中的每个菌株的能力。
图47中的表总结了以与大肠杆菌相同的方式分析的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和肠球菌的包容性结果。被测的肺炎克雷伯菌菌株是ATCC13833、CDC80、CDC44、CDC87、CDC47、CDC43、BAA2470、CDC34、CDC39、ATCC700603和BAA-2472。被测的铜绿假单胞菌菌株是CDC263、CDC242、9721、CDC236、27853、BAA-2110、CDC233、15692、CDC234、CDC246和CDC261。被测的奇异变形杆菌菌株是CDC155、CDC29、CDC159、CDC59、ATCC 7002和CDC156。被测的肠球菌菌株包含ATCC 19433、ATCC 29212、ATCC 33186、ATCC 51575、ATCC 51299和BAA-2128。
结论：在该实例中描述的新颖FISH方法检测了引起患有UTI的患者的临床症状的主要病原体中的5种不同细菌物种的被测的所有菌株。
变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图45示出针对输入细胞浓度为大约600个CFU/测定(浅灰色条)和3000个CFU/测定(深灰色条)的11个大肠杆菌菌株绘制的平均信号(n＝3)。在图的左侧示出了源自无细胞对照(空白)的信号。误差条表示1标准偏差。
图46示出针对11个大肠杆菌菌株中的每个菌株示出的检测到的(如通过板计数所确定的)输入细胞的百分比。每个条表示6种确定方式的平均值，3种来自两个不同输入细胞水平中的每一个。细胞检测百分比计算为[(测定信号-背景信号)/输入细胞]*100。
图47是给出4种另外的细菌的包容性结果的表。
图48是给出在该实例中使用的探针序列的表。
实例3.使用快速等温FISH进行靶细菌的特异性检测
概述：该实例表明新颖等温FISH方法特异性地检测到靶细菌，而甚至在非常高的浓度下没有检测到相关非靶细菌。该实例呈现了特异性地检测到大肠杆菌但没有检测到也引起泌尿道感染(UTI)、具有类似rRNA序列或为共生生物的16种其它细菌的测定条件。
实验方法：
细菌细胞制备：16种脱靶细菌(列于表1中)的细菌培养物和大肠杆菌菌株ATCC25922由选自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的单集落生长而来，接种到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下生长过夜。将50-80μL的过夜培养物添加到新鲜TSB中并生长1.5-2小时，直到光密度在600nm处达到0.15-0.3为止。然后将每种细菌稀释于阳离子调整的米勒海顿(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到大约1×108个细胞每毫升。
选择待评估的细菌靶标：选择细菌病原体以测试特异性，因为这些细菌病原体的rRNA序列类似于靶细菌rRNA序列或者因为这些细菌病原体是泌尿道感染(疾病靶标)中常见的病原体，并且因此与这些生物的交叉反应性将最有可能有问题。图49中的表示出了被测的细菌物种和菌株。
FISH探针的制备：将一组大肠杆菌的DNA探针在介于80到85℃之间的水浴中加热10分钟并且然后放置在冰上以减少聚合。图50中的表示出了该DNA探针组。该组含有用荧光染料(Alexa647N，赛默飞世尔公司)标记的物种特异性DNA寡核苷酸和辅助寡核苷酸，这些辅助寡核苷酸邻近或靠近特异性探针结合并被设计成破坏核糖体亚单位的局部二级结构，并且允许经过标记的特异性探针对靶rRNA具有更大的杂交效率。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。
细菌细胞的标记：通过将经过稀释的细胞、等温杂交缓冲液(0.9X MHBII(天惠华公司，目录号M5860)、3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)、靶向16S或23S细菌rRNA的物种特异性Alexa647N标记的探针(集成DNA技术公司，IDT)、促进有效杂交(IDT)的辅助探针和30μL的合并人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)组合来制备100μL标记反应。图50中的表示出了被测的特异性探针组。根据制造商的说明书，通过Zeba 7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893或89892，取决于尿液量)首先对尿液进行处理。然后将10μl的磁性颗粒制剂添加到该混合物中。将最终反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板，并在35℃下温育30分钟以允许同时再水合“染料垫”、标记细菌细胞并将磁性颗粒与细菌细胞表面结合。在最终浓度为1×106个细胞每反应时对每种细菌进行测试。该浓度比确定的大肠杆菌的检测极限高大约3000倍。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：对于每种细菌，确定荧光对象的数量(测定信号)。如果在空白(未添加细菌)中的信号的三个标准偏差内检测到信号，则认为细菌具有交叉反应性。
结果：
图像示出快速新颖FISH方法仅检测到大肠杆菌但没有检测到其它16种不同的挑战细菌，并且每个图像示出在对大肠杆菌靶向细菌产生高测定信号的相同测定条件下没有检测到非常高浓度(每个反应1×106个细胞)的8种临床相关挑战细菌。两个条表示被设计成对大肠杆菌具有特异性的两种不同探针组(参见图50中的表)。16种挑战细菌中的每种挑战细菌的测定信号比无细胞对照加上三个标准偏差(125)更小。
结论：通过设计，该实例中描述的新颖快速FISH方法特异性地检测到大肠杆菌而没有检测到16种临床相关潜在交叉反应性细菌。这表明方法对靶UTI病原体的鉴定具有高特异性，该高特异性对感染的临床治疗非常重要。
变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。测定也已经被设计成表明对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和粪肠球菌具有高特异性。
图49是示出测试检测大肠杆菌的特异性的挑战细菌的表。
图50是示出在该实例中使用的探针序列的表。
图51示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种挑战细菌。
图52示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种另外的挑战细菌。
实例4.同时鉴定4种不同微生物的多重FISH方法
概述：该实例表明使用对每种细菌rRNA具有特异性的荧光标记的探针，在单个反应中使用本发明同时检测到大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和产酸克雷伯菌。通过使用4种不同荧光团——每种荧光团针对每个细菌物种——在混合物中特异性地检测到每个病原体，这些荧光团具有不同的激发/发射光谱特性。
实验方法：细菌细胞生长：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在37℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC13883、铜绿假单胞菌ATCC 27853和产酸克雷伯菌ATCC 8724的细菌培养物。然后将每种培养物稀释于阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到在600nm处光密度为0.15，该光密度为大约1.0×108个集落形成单位(CFU)每毫升。
磁性颗粒的制备：聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)和羧基涂覆的磁性颗粒(羧基磁性颗粒，Spherotech，目录号CM-025-10H)用于非特异性地捕获细菌细胞。将每个颗粒以1:40稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中，其中聚天冬氨酸性颗粒的最终浓度为大约1.38×109个颗粒每反应，并且羧基颗粒的最终浓度为大约3.46×109。
细菌细胞的标记：通过将所有四种细菌的经过稀释的细胞、等温杂交缓冲液(0.9XMHBII、3X SSC(1.5M NaCl、0.15M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)、靶向16S或23S细菌rRNA的物种特异性DNA探针(集成DNA技术公司，IDT)、促进有效杂交(IDT)的辅助探针和30μL的合并人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)组合来制备100μL标记反应。然后将10μl的磁性颗粒制剂添加到该混合物中。图54中的表中示出了探针序列及其染料修饰的位置。
将细胞/杂交混合物(1mL)转移到盒中。将盒放置到分析仪(如下文所描述)上，该分析仪自动操作剩余的测定步骤和图像采集和分析。简而言之，分析仪的流体系统将反应混合物移动到每孔(先前干燥的)含有46μL“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的光学窗口中。将盒在分析仪内在35℃下温育30分钟。在该温育之后，将盒移动到磁体站(德克斯特磁站公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过再水合的“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。磁体站之后，将盒移动到分析仪内的成像站并在四个颜色通道中的每个通道中拍摄一系列图像(红色(激发635/25nm，发射680/40nm)、黄色(激发530/20nm，发射572/23nm)、绿色(激发470/40nm，发射520/40nm)、橙色(激发569/25nm，发射609/34nm))。
经过标记的细胞的成像：MultiPath分析仪成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。分析仪可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。对于红色通道，使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。对于橙色通道，使用569/25nm激发滤光片和609/34nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获24个帧。对于黄色通道，使用530/20nm激发滤光片和572/23nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获48个帧。对于绿色通道，使用470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获32个帧。在该实例中实验地确定了对经过标记的细胞进行成像的聚焦平面。
结果：
图53示出了完整采集的图像的一部分，在该完整采集的图像中，在4个颜色通道中的每个通道中检测到荧光，每个通道对4种输入细菌中的一种输入细菌具有特异性。每个斑点对应于单细胞或细胞群。算法用于鉴定不同于伪影(例如，碎片)的有意义的对象并将那些对象计数为细胞。如每种细菌的插入物中所示，检测到如所预期的类似数量的细胞，因为输入细胞浓度大约相同。当被覆盖时，如所预期的具有4种不同细菌靶标的这些斑点不对应，这指示在每个通道中观察到不同的对象。
结论：该方法允许单一快速FISH方法以同时检测并定量盒的单个孔中的四种不同的细菌。
变型：
该实例说明了该新颖FISH方法的多重能力并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)和替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌和非细菌病原体。
图53是示出使用CCD成像方法和4种不同荧光团(每个荧光团针对每种细菌)在4个不同颜色通道中拍摄的相同视场的图像。可以在单个孔中检测到所有四种细菌。
图54是在该实例4中使用的探针序列的表。
实例5：使用抗体涂覆的磁性颗粒和荧光标记的抗体特异性地检测多形核中性粒 细胞
(PMN)
概述：多形核中性粒细胞(PMN)的存在和数量可以为检测感染提供诊断信息。例如，尿液样品中的数量少的中性粒细胞帮助排除泌尿道感染。在该实例中，非放大数字成像用于枚举用荧光标记的抗体染色的多形核中性粒细胞(PMN)靶标。在该实例中，已经使用抗CD15和抗CD16抗体来捕获和检测，这些抗体是存在于多形核中性粒细胞(PMN)的表面上的特异性分子。在一个实施例中，抗CD15抗体与磁性颗粒缀合，这些磁性颗粒用于PMN捕获和荧光标记的抗CD16抗体以使用非放大数字成像进行检测。
实验方法：
血液样品
从研究血液组分公司(Research Blood Components)(马萨诸塞州波士顿)获得来自健康供体的新鲜血液样品并将其用作PMN的来源。
磁性颗粒的制备：
通过使用标准ED AC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联化学将磁性颗粒(Ademtec，292nm)与小鼠抗CD15抗体(百进生技公司(Biolegend))偶联来制备抗体缀合的磁性颗粒。
检测抗体
将Alexa
Figure BDA0003101035740000461
488抗人CD16抗体(百进生技公司)用作检测抗体。
PMN的标记和捕获：
在96孔微量滴定板中执行测定。每个孔包含38ul磷酸盐缓冲盐水(PBS)、2uL新鲜血液样品或2uL PBS(无PMN对照)、5uL Alexa-488标记的抗CD16抗体(1ug)和5ul抗体缀合的磁性颗粒(2e10/mL)。在室温下将反应温育15分钟。在温育之后，将40uL的反应混合物仔细地覆盖在75ul的“染料垫”(具有5mg/mL铬变素(Chromotrope)2R的15％Optiprep)上，该染料垫在黑色透明底半区微量滴定板(葛莱娜公司(Greiner)675096，VWR部件号82050-056)上进行预等分。将微量滴定板放置到磁场上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
PMN的成像：
在磁性捕获经过标记的PMN:磁性颗粒复合物之后，将微量滴定板放置在CCD数码相机(IDS，型号UI-2250SE-M)上方的台上并用来自LED的穿过滤光片(469nm，35nm FWHM)的光照亮。通过相机检测到穿过发射滤光片(520-35nm)的荧光信号以创建荧光复合物的图像。使用枚举单独细胞的FLimage软件(第一光生物科学公司(First Light Biosciences))对图像进行分析。
结果：
图88示出了指示特异性地检测在血液样品中存在的PMN的MultiPath测定的结果，而没有血液样品的缓冲液具有非常低的可检测荧光信号。
结论：该大区域、非放大成像系统能够检测并枚举来自用针对细胞表面标志物的荧光标记的抗体标记的血液样品的PMN。结果示出了用于枚举诊断信息性人细胞或宿主细胞的本发明的系统和方法的潜力。
变型：使用其它细胞特异性抗体，可以检测各种生物样品中的不同细胞。例如，其它细胞表面标志物抗体可以识别不同的诊断信息性细胞。例如，定量鳞状上皮细胞对评估肺炎诊断中的呼吸道样品质量很重要。可以使用多种抗体/细胞表面标志物，并且可以通过使用多种用于荧光检测的激发和发射波长来区分经过标记的细胞。与对象相关联的荧光光谱可以用于确定是否为特定类型的细胞的信号。
实例6.对仪器上的盒中的临床尿液样本中的大肠杆菌进行自动化快速AST
概述：该实例表明使用本发明的系统、装置和方法在无需细胞纯化的情况下在4小时内确定靶向细菌病原体(在该实例中的大肠杆菌)的抗微生物剂敏感性。在差异生长之后，使用非放大数字成像，实例使用协同FISH方法来标记和磁性选择并定量特异性靶细胞。该新方法与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法具有相当的性能。
实验方法：
尿液样本：从贝斯以色列医院(Beth Israel Hospital)(马萨诸塞州，波士顿)的Kirby博士实验室接收从患有泌尿道感染(UTI)的患者中收集并且已知含有大肠杆菌的48份剩余的未经鉴定的尿液样本。样品在收集之后1到5天收到并且含有用于限制细胞活力损失的尿液防腐剂。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，执行常规尿液培养以确定存在的细菌的近似CFU/mL并确认如由Kirby博士实验室所报告的单个或混合细菌形态。简而言之，将经过校准的1μL环放置到充分混合的尿液样品中，并且将1μL均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA，BD目录号221185)板上并在35℃的温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行处理和测定，如下文所述。
尿液处理：在测试之前，使用尺寸排阻色谱法去除尿液防腐剂和其它潜在干扰化合物。根据制造商的说明书，将2.5mL的每种临床阳性尿液样品应用于预洗涤ZebaTM7KMWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893)并进行离心。对该经过处理的样品重复如上文所描述的尿液培养以检查处理之后的细菌损失。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前的时间零点(TO)的针对每份临床尿液样本的测定信号。将30μL的每种经过处理的尿液添加到含有物种特异性Alexa647N标记的DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针的70μL 1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)中。在表A中示出了所使用的探针序列。然后将100μL的混合物添加到含有脱水的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277))的微量滴定板的孔中。然后将所制备的10μL的磁性颗粒混合物添加到孔中。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/vOptiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
抗生素板的制备：以比预期最小抑制浓度(MIC)高10倍的浓度开始，按2倍系列稀释制备含有六种浓度的每种抗生素的微量滴定板。所使用的抗生素是头孢唑啉、环丙沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑。抗生素通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入在CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证稀释液处于适当耐受性内。选择用于测试跨越CLSI报道的大肠杆菌抗生素断点的每种抗生素的浓度。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，含有水或稀释剂的八个孔包含在板中以允许无抗生素阳性和阴性生长对照。
四小时生长：当存在时间零点细胞定量时，将32.4μL经过处理的临床尿液和75.6μL1.43X MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到抗生素板(已经含有12μL抗生素)的每个孔中。允许样品在35℃下在标准温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有所有6种浓度的每种抗生素的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果：
图55到图58示出了表明该方法如何可以用于在与黄金标准肉汤微稀释方法相匹配的三种单独的尿液中产生MIC的三个来自较大数据集的实例。
图55示出了针对单一药物(呋喃妥因)的单个临床尿液样品(BIUR0017)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
图56示出了针对单一药物(头孢唑啉)的单个临床尿液样品(BIUR0047)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
图57示出了针对单一药物(环丙沙星)的单个临床尿液样品(BIUR0057)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
图58示出了针对单一药物(甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑)的单个临床尿液样品(BIUR0052)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
结论：该新颖方法示出可以用仅4个小时的最少处理的尿液临床样本的差异生长得到准确的AST结果(MIC确定)，特别是没有冗长的集落纯化步骤。不管是否报告为MIC分类抗生素敏感性结果，AST结果与黄金标准肉汤微稀释方法相比是有利的。
变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它抗生素、生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图55示出了在存在呋喃妥因的情况下的BIUR0017。
图56示出了在存在头孢唑啉的情况下的BIUR047。
图57示出了在存在环丙沙星的情况下的BIUR057。
图58示出了在存在甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑的情况下的BIUR052。
图59是在该实例6中使用的探针序列的表。
实例7.对尿液样品中的细菌进行快速且准确的抗微生物剂敏感性测试
概述：该实例表明在将已知抗生素敏感性特性添加到不含细菌的尿液中情况下利用本发明来准确地确定病原体的抗微生物剂敏感性。在含有抗微生物剂的微生物培养基中进行差异生长，然后评估生长，使用本发明的协同FISH方法在仅4.5小时内进行所需的靶特异性细胞定量。该新方法与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法具有相当的性能。
实验方法：
细菌细胞制备：从ATCC或从CDC抗生素耐药性库(AR库)收集具有已知耐药性特性的50个细菌菌株并在表A中示出。通过用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得这些中的每一个的细菌培养物。使用600nm处的光密度来估计细胞浓度，将每种培养物稀释于阳离子调整的米勒海顿II(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到大约5×106个集落形成单位(CFU)/mL。
尿液处理：测试之前，根据制造商的说明书，将合并的人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)按4mL尿液与一个预洗涤的10mL旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893)的比率应用于预洗涤的ZebaTM 7K MWCO旋转柱中并进行离心。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前的时间零点(TO)的针对每种细菌的测定信号。制备了反应混合物，该反应混合物由以下组成：30μL经过处理的尿液、10μL 5×106CFU/mL的细菌稀释液、60μL MHBII(100μL中的1X最终浓度)和适当的物种特异性Alexa647N标记的DNA寡核苷酸FISH探针和其用于靶向细菌物种的相关未经标记的DNA辅助探针。图63中的表中示出了所使用的探针序列。然后将100μL的混合物添加到含有脱水的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277))的微量滴定板的孔中。然后将所制备的10μL的磁性颗粒混合物添加到孔中。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPath实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
抗生素板的制备：按2倍系列稀释制备了含有六种浓度的每种抗生素的微量滴定板。在最终肉汤微稀释中以比期望的浓度高10倍的浓度制备了2倍稀释系列，使得添加细胞/尿液/培养基混合物将产生正确的抗生素范围。然后将12uL的每种抗生素稀释液等分到96孔板的适当的孔中。测试了针对不同细菌的不同抗生素。通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证抗生素稀释液处于适当耐受性内。选择用于测试跨越CLSI报道的适当细菌物种的抗生素断点的每种抗生素的浓度，使得(敏感/中等/耐药性)分类确定可以根据该数据得出。除了含有抗微生物稀释系列的孔之外，还包含含有水或其它稀释剂的若干孔用于无抗生素阳性生长和阴性生长(无细胞)对照。将抗生素板在-80℃下冷冻并在使用之前完全解冻。
四小时生长：当发生时间零点细胞定量时，将12μL制备的细菌培养物、如测定时间零点所做经过处理的36uL合并的人尿液、60uL 2X MHB II(天惠华公司，目录号M5860)和2uL水添加到制备的抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在标准温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有所有浓度的每种抗生素的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种细菌样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将结果与通过ATCC或CDC报告的MIC值和分类调用进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保将活细菌添加到每个样品中或当计算抑制倍数时使用。
图60示出了除了针对头孢他啶(CAZ)测试的细菌之外，独有丝状细菌(如用眼睛可以容易地区分，将左边(正常细菌)与右边(丝状细菌)进行比较)的存在作为指示在该抗生素浓度中即将发生的细胞死亡，并且在适当的时候对MIC浓度相应地进行调整。在针对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)测试的细菌的情况下，阈值是基于抑制倍数而产生的(含有细菌但不含抗生素的孔中的测定信号被含有抗生素和细菌两者的孔分开)。
结果：
图60示出该方法如何可以在存在与CDC或CFSI公布的MIC相匹配的尿液基质的情况下用于在单独的细菌上产生MIC。实例示出了针对单一药物(环丙沙星)的单一细菌(肺炎克雷伯菌CDC0126)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。公布的MIC(>0.25μg/mL)与通过本发明所述的新颖快速AST方法确定的MIC精确匹配。通过水平灰线示出了生长倍数的阈值(在该实例中为20)。
图62中的表示出了被测的所有菌株中的整体性能。如果通过新颖AST方法确定的MIC精准匹配，则被测的MIC基本上一致或是在公布的值的2倍稀释内。除了两个个案外，所有细菌/抗生素组合具有100％的基本一致性。
结论：该新颖方法示出在样品基质的上下文中用仅4个小时可以作出与具有多种药物耐药性机制的细菌的高度表征菌株的公布的值相匹配的MIC确定。
变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它抗生素、生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌。
图60是正常细菌(左图)与丝状细菌(右图)的视觉比较。
图61示出了在0.25μg/mL下调用通过本发明中描述的新颖快速AST方法产生的MIC。
表A：在该实例中使用的细菌和其先前确定的抗生素耐药性(用“X”示出)
Figure BDA0003101035740000541
Figure BDA0003101035740000551
图62是在该实例中测试的所有细菌和抗生素的AST结果的表。
图63是在该实例7中使用的探针序列的表。
实例8.在不使用细胞纯化的情况下临床尿液样本的快速且准确的自动化AST结果
概述：该实例表明使用本发明的系统和方法在4小时内自动确定临床尿液样品中的病原体的AST结果，无需冗长的细胞纯化步骤。自动化仪器执行含有试剂的盒中所需的步骤以在恒定的生理温度下确定抗微生物剂敏感性。温度与微生物生长和用于检测并定量靶细胞的本发明的方法两者相兼容。使用基于FISH的标记、磁性颗粒和非放大数字成像对本发明的系统执行后一种方法。
使用仪器的气动子系统自动地将盒中的样本分配到含有各种浓度的各种抗微生物剂加上微生物培养基的部分或等分试样中。这些部分中的一部分用于定量生长温育之前的病原体细胞。系统温育盒持续4小时，并且然后对含有抗微生物剂的孔中的靶细胞的数量进行定量。将含有抗微生物剂的温育部分中的细胞的数量与在温育之前测量的细胞的数量进行比较用于确定各种抗体中的病原体的抗微生物剂敏感性。
实例示出了使用本发明的自动化系统、装置和方法直接在来自尿液中具有大肠杆菌的医院患者的临床样本中进行快速且自动化抗微生物剂敏感性测试的结果。与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法相比，本发明在仅4小时内递送准确的性能。
实验方法：
尿液样本：从贝斯以色列医院(马萨诸塞州，波士顿)的Kirby博士实验室接收从患有泌尿道感染(UTI)的患者中收集并且已知含有大肠杆菌的剩余的未经鉴定的尿液样本。样品在收集之后1到5天收到并且含有用于限制细胞活力损失的尿液防腐剂。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，执行常规尿液培养以确定存在的细菌的近似CFU/mL并确认如由Kirby博士实验室所报告的单个或混合细菌形态。简而言之，将经过校准的1μL环放置到充分混合的尿液样品中，并且将1μL均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上并在35℃的温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行处理和测定，如下文所述。
AST盒-培养基和抗微生物剂的制备：
通过将25uL 4X MHB II(天惠华公司，目录号101320-356)分配到8个单独的生长孔中的每个生长孔中(参见图中的盒示意图)来制备盒之前的天数。生长孔1和2用于时间零点测量(参见下文的描述)，因此仅生长培养基包含在生长孔中。生长孔3和4也仅包含培养基。这些孔充当阳性对照以确保超过四个小时观察到生长。将2种浓度的抗生素添加到生长孔5和6以及7和8中。为此，将比以微克每毫升为单位的目标浓度更浓22.2倍的4.5μL抗生素沉积到适当的生长孔中。盒含有2种浓度的环丙沙星(CIP)和呋喃妥因(NIT)两者或头孢唑啉(CFZ)和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)。对于盒中的每种抗生素的最终浓度，参见表1。然后将培养基和抗生素在40℃的对流烘箱中干燥16到20小时。
AST盒-杂交试剂的制备：
制备了含有以下的杂交缓冲液：3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠，pH 7.5)(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)和0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)。将海藻糖(西格玛公司，目录号T9449)溶解在该混合物中直到最终浓度为10％w/v。将该杂交缓冲液-海藻糖混合物冻干在8.3μL体积珠中。将两个8.3uL珠放置到8个试剂孔中的每个试剂孔中(关于盒上的位置，参见图)。
AST盒-磁性颗粒的制备：
将聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中直到浓度为2.75×1014个颗粒/mL，最终浓度为10％w/v海藻糖(西格玛，目录号T9449)。为了该稀释，将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。在立即用于最小化聚合之前，对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。然后将混合物冻干在10μL体积珠(2.64×1012个颗粒每反应)中。将一个磁性颗粒冻干珠与2个杂交混合珠放置在8个试剂孔中的每个试剂孔中。
将样品放置到盒中的程序-尿液处理
在测试之前，使用尺寸排阻色谱法去除尿液防腐剂和其它潜在干扰化合物。根据制造商的说明书，将2.5mL的每种临床阳性尿液样品应用于预洗涤ZebaTM7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893)并进行离心。对该经过处理的样品重复如上文所描述的尿液培养以检查处理之后的细菌损失。
将样品放置到盒中的程序-将样品放在盒上
将750μL的每种经过处理的尿液样品与1705μL的水和45μL物种特异性DNA寡核苷酸荧光原位杂交(FISH)探针和未经标记的DNA辅助探针进行组合以制备含有30％尿液v/v最终浓度的溶液。可以在表2中找到用于每种细菌的寡核苷酸的浓度和染料标记。将1mL的混合物添加到盒的样品罐中并将盒放置到分析仪上。
在自动化分析仪上运行AST盒
在然后将盒放置在仪器上之后，除了数据分析之外的所有随后动作都是自动执行的。首先将尿液/水/FISH探针混合物(样品)在真空下引导到盒顶部的8个生长孔中。然后将前两个生长孔中的样品立即重新定位到反应孔中，从而再水合杂交缓冲液/FISH探针混合物和所冻干的磁性颗粒。然后样品继续到含有46μL脱水的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的成像窗口，在60℃下在对流烤箱中干燥3小时并在35℃下在分析仪上温育30分钟。在该温育之后，然后将盒重新定位到磁体站并放置在强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)顶部持续4分钟以使经过标记的和磁性颗粒相互作用的细菌细胞邻近成像表面。最后，将盒移动到成像站并且使用下文所描述的非放大CCD成像仪进行成像。
将剩余的六个生长孔中的样品保持在该位置中，并且在存在或不存在抗生素的情况下允许细菌在35℃下在再水合的培养基中生长4小时。在生长之后，将细胞悬浮液如时间零点测定一样重新定位到试剂孔中，并且如上文所描述的执行完全相同的杂交反应、磁性下拉和成像。
分析仪成像系统和成像过程
MultiPath分析仪成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。分析仪可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有两种浓度的每种抗生素的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。将生长倍数与在符合CLSI肉汤微稀释中的对应孔中观察的生长进行比较，选择生长倍数截止值的阈值以最大化与肉汤微稀释结果的一致性。在细胞在存在抗生素的情况下生长的条件下(并且因此在该浓度下具有耐药性)，生长倍数将会高，并且在细胞在染色的过程中的条件下(并且因此在该浓度下敏感)，生长倍数将会低。在这些盒中，如果抗生素的两种浓度基于其生长倍数示出无生长，则在该尿液样品中的细菌被称为敏感的。如果在较低浓度下有生长但在较高浓度下没有生长，则尿液样品中的细菌在环丙沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑的情况下是中等的，并且在头孢唑啉的情况下是耐药性的。如果抗生素的两种浓度基于其生长倍数阈值示出了生长，则在该尿液样品中的细菌被称为耐药性的。将所有敏感/耐药性调用与通过在符合CLSI的标准BMD中的MIC确定做出的敏感/耐药性调用进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果：
图65示出了含有临床尿液样品BIUR0067的两个盒中的四种复制品的平均生长倍数，该临床尿液样品含有大肠杆菌菌株。图示出了在2个不同盒中的4种复制品中的环丙沙星和呋喃妥因中的每一种在2个浓度中的每个浓度下的平均生长倍数。使用生长倍数值为2的两种抗生素，MulitPath测定将两种环丙沙星(CIP)浓度调用为生长并且将两种呋喃妥因(NIT)浓度调用为未生长。因此，通过MulitPath，BIUR0067对环丙沙星具有耐药性并且对呋喃妥因敏感。将大肠杆菌从该尿液中分离出来并在与这些敏感/耐药性调用相匹配的CLSI标准肉汤微稀释中进行测试。
图示出了含有临床尿液样品BIUR0084的两个盒中的四种复制品的平均生长倍数，该临床尿液样品含有肺炎克雷伯菌菌株。图示出了在2个不同盒中的4种复制品中的头孢唑啉和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑中的每一种在2个浓度中的每个浓度下的平均生长倍数。使用生长倍数值为2的两种抗生素，MulitPath测定将头孢唑啉和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑两者的所有抗生素浓度调用为生长。因此，肺炎克雷伯菌的该菌株对两种抗生素具有耐药性。这与在内部进行的CLSI标准肉汤微稀释相匹配。
结论：实例示出了使用本发明的自动化系统、装置和方法直接在来自尿液中具有大肠杆菌的医院患者的临床样本中进行快速且自动化抗微生物剂敏感性测试的结果。与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法相比，本发明在仅4小时内递送准确的性能。
变型：该实例说明了该新颖AST方法在盒上的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序以及对反应物和抗微生物稳定的改变、不同细菌靶标、不同抗微生物剂等。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图64示出了MulitPathTM UTI-AST盒。
图65是示出被测的抗生素浓度的表。
图66是在该实例8中使用的寡核苷酸的表。
图67示出了BIUR0067结果。
图68示出了BIUR0084结果。
实例9.直接用于尿液样本的快速AST方法对病原体浓度变化是稳健的
概述：对可变接种物浓度的稳健性对快速AST方法很重要，因为当直接从样本中测试样本时，靶细胞浓度是未知的。该实例表明，当针对覆盖宽范围的靶细胞浓度的人为样本时，使用本发明直接从尿液样本提供准确且一致的结果。该实例表明，与用于AST的肉汤微稀释(BMD)黄金标准相比，在存在10％尿液的情况下大肠杆菌BAA-2469、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和肺炎克雷伯菌CDC-0043的可变细胞输入递送准确的AST结果。
实验程序：
抗生素板的制备：通过以比期望的最终浓度高10倍的浓度将10μL分配到96孔板的孔中来以2倍系列稀释制备含有任一浓度的三到五种抗生素的抗生素板。选择用于测试跨越被测的细菌菌株的CLSI报道的MIC的每种抗生素的浓度。利用以下抗生素中的全部或子集制备板：头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑。除了含有抗生素稀释系列的孔之外，含有水的四个孔允许阳性(在不存在抗生素的情况下细菌生长)和阴性(无细菌细胞)对照。
培养物的制备：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得大肠杆菌BAA-2469、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和肺炎克雷伯菌CDC-0043的细菌培养物。将细胞在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中稀释成各种接种物(2×103CFU/mL-1×107CFU/mL)。对于更准确的细胞浓度，使用集落计数对这些估计的细菌输入进行调整。通过将对数期培养物在MHBII中稀释到约500CFU/mL，将100μL平板接种于TSA板上并在35℃下生长16到24小时之后对集落进行计数来确定板计数。使用平均板计数，计算了每个被测浓度中存在的实际CFU。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对每种生物体和接种物的测定信号。将10μL的每种样品添加到80μL的杂交缓冲液中以得到最终浓度为3X SSC(0.45M NaCl，0.045M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、1％CHAPS(西格玛公司，目录号C3023)、1％NOG(西格玛公司，目录号08001)、1X阳离子调整的米勒-海顿(MHBII)、物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针。表B中示出了所使用的寡核苷酸探针。通过将10μL的合并尿液(内部收集和过滤)直接添加到混合物中来获得最终浓度为10％的尿液。然后添加如上文所描述制备的10μL磁性颗粒混合物。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)(染料垫板)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：当存在时间零点细胞定量时，将10μL的每种生物体接种物、10μL的合并尿液和70μL 1X MHBII添加到抗生素板(已经含有10μL抗生素)的适当孔中。允许样品在35℃下在标准空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将10μL经过温育的样品-抗生素板(10％)转移到微量滴定板并以与上文所述相同的方式与100μL杂交缓冲液、FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将使用在此所描述的新颖AST方法的结果与根据CLSI M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有所有浓度的每种抗生素的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种样品接种物/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果：
下面的图示出当与黄金标准肉汤微稀释方法匹配时，该方法如何对不同接种水平而言是稳健的。
图69将用新颖AST方法获得的结果与在单一浓度下执行的针对被测的所有药物的标准BMD的结果进行比较。列3将通过新颖AST方法和黄金标准BMD获得的MIC进行比较。所有MIC调用均在符合CLSI的BMD的2倍稀释(基本一致性)内。列4将基于MIC(分类一致性)的分类抗生素敏感性结果(S＝敏感性，I＝中等，R＝耐药性)进行比较。尽管在肉汤微稀释中的克雷伯菌属浓度的子集给出了不同于MIC的分类调用，但是通过标准AST方法将所有这些仅分类为微小的错误。
图70示出与标准肉汤微稀释方法(24小时BMD，虚线)相比，对于大肠杆菌BAA-2469的所有接种水平利用上文所描述的新颖4小时方法(实心圆圈)产生的MIC。利用该新颖方法确定的所有MIC都基本一致(阴影区域)。
图71示出了原始数据。
结论：
在此呈现的快速4小时AST方法对超过宽范围的靶细胞浓度的初始细胞浓度而言是稳健的。对可变接种物浓度的稳健性对快速AST方法很重要，因为当直接从样本中测试样本时，靶细胞浓度是未知的。
变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌和非细菌病原体以及其它抗微生物剂或化学剂。
图69是所有生物体、抗生素和接种水平的总体基本一致性和分类一致性的汇总。
图70示出了与常规BMD方法相比，使用在此所描述的新方法产生的各种接种水平的MIC结果。
图71是产生的各种接种水平的MIC结果的汇总。
图72是在该实例9中使用的探针序列的表。
实例10.在不进行细胞纯化的情况下，在含有多种细菌物种的尿液临床样本中对 靶病原体进行快速抗微生物剂敏感性测试
概述：当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含其它微生物的靶病原体群。通常方法(即集落纯化)需要2到5天递送结果。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。
当前方法需要冗长的细胞纯化过程，因为这些方法使用非特异性检测方法，如增加浊度以确定哪些抗微生物剂抑制微生物培养基中的靶病原体的生长。当使用细胞复制品的非特异性测量时，仅可以在仅含有靶病原体的细胞的情况下知道所示生长是由于靶病原体引起的。细胞纯化必须经历当前的抗微生物剂敏感性测试方法，因为大多数医学样本是非无菌的。样本通常含有构成人微生物组的微生物、填充人身体的良性正常细菌群。
相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需集落纯化步骤。该方法与当前方法的不同之处在于，其特异性地评估靶病原体在含有抗微生物剂的微生物培养基中的生长。
该实例表明，在包括15份不同培养阴性尿液样品的尿液基质(10％)的人为样品中，快速抗微生物剂敏感性测试方法准确地确定了大肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)。在此示出，使用新方法(即抗微生物剂敏感性测试结果)是准确的并且不会受到含有高浓度的其它微生物物种的尿液样品中的脱靶细菌的显著影响。
实验程序：
抗生素板的制备：在启动实验程序之前，通过以比期望浓度高10倍的浓度分配10μL来以2倍系列稀释系列制备含有五种浓度的板。选择用于测试跨越CLSI报道的大肠杆菌抗生素断点的每种抗生素的浓度。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，含有水的四个孔包含在板中以允许阳性和阴性对照。
培养物的制备：分别将大肠杆菌BAA-2469的三到五个集落以及八个其它脱靶物种(金黄色葡萄球菌ATCC 25923、弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864、鲍氏不动杆菌ATCC 19606、表皮葡萄球菌ATCC 12228、藤黄微球菌(M.luteus)(环境分离物)、极小棒状杆菌ATCC 23348-BAA 949、肺炎克雷伯菌CDC 0043、肺炎克雷伯菌CDC 0141)各自接种到5mL的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下温育1到2个小时。通过分光光度计来测量光密度，并且将生物体稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中。将大肠杆菌稀释成大约5×106CFU/mL(最终测定浓度为5×105CFU/m)，而将其它脱靶物种稀释成各种接种物(范围为l×105到5×108CFU/mL)。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对大肠杆菌的每个物种的测定信号。将10μL的每种样品添加到80μL的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)(西格玛公司，目录号S6639)、1％CHAPS(西格玛公司，目录号C3023)、1％SB3-12(西格玛公司，目录号08001)、1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)、大肠杆菌特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针))中。图78中的表中示出了探针序列。通过将10μL的合并尿液(内部收集和过滤)直接添加到混合物中来获得最终浓度为9.1％的尿液。将如上文所描述制备的10μL磁性颗粒混合物直接添加到该混合物中。将现在含有杂交混合物、尿液和磁性颗粒的100μL样品转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：在存在表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、极小棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的情况下，测试大肠杆菌BAA 2469对以下3种抗微生物剂的敏感性：环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)和呋喃妥因(NIT)。在存在肺炎克雷伯菌的情况下，针对以下5种抗微生物剂对大肠杆菌BAA 2469进行测试：头孢唑啉(CFZ)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、呋喃妥因(NIT)和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)。根据上文所描述的方法制备含有这些抗微生物剂的抗生素板。当存在时间零点细胞定量时，将10μL的大肠杆菌物种(5×106CFU/mL)、10μL的脱靶物种(l×105到5×108CFU/mL)、10μL的合并尿液和60μL的MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到已经含有10μL抗生素的抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立的空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将10μL经过温育的样品-抗生素板(10％)转移到含有干燥“染料垫”的微量滴定板并如上文所述与100μL杂交缓冲液、FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒的混合物进行组合以测定时间零点。
比较方法：将在此所描述的新颖测定方法的结果与根据M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有所有浓度的每种抗生素的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种细菌样品/药物浓度，生长倍数被计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。
结果：
示出的数据表明上文所描述的4小时AST方法对于非无菌样品是稳健的，而对其中存在额外细菌的CLSI BMD方法则不稳健。
图73示出在存在呋喃妥因的情况下并且在金黄色葡萄球菌ATCC 25923浓度增加最多超过100倍时大肠杆菌BAA-2469的数据。CLSI样肉汤微稀释方法中的大肠杆菌MIC受到添加金黄色葡萄球菌菌株(在图中以X标记)的影响，其中MIC从不存在金黄色葡萄球菌时的8增加到黄色葡萄球菌过量100倍时的32。相比之下，不论金黄色葡萄球菌细胞的量如何，本发明所述的新颖4小时AST测定(MulitPath，圆圈)具有相同的MIC(8)(虚线)。
图75到图77示出与仅存在大肠杆菌BAA-2469的CLSI肉汤微稀释相比，使用该新颖方法(MulitPath)确定的原始MIC值。图74中的表示出在存在增加的脱靶细菌的情况下大肠杆菌的总体基本一致性。仅1e7弗氏柠檬酸杆菌与呋喃妥因的单一条件导致缺乏基本一致性，但这没有改变在所有抗生素和所有脱靶细菌中有100％一致性的分类敏感/中等/耐药性确定。
结论：实例表明，使用本发明的抗微生物剂敏感性测试，在含有甚至大量的其它物种的其它微生物的样品中实现靶病原体的准确抗微生物剂敏感性测试结果不需要细胞纯化。
变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图73示出在存在金黄色葡萄球菌的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而BMD的MIC随着金黄色葡萄球菌的增加而增加。
图74示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性的汇总。
图75示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii))的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图76示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(藤黄微球菌、鲍氏不动杆菌、极小棒状杆菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图77示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(肺炎克雷伯菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图78是在该实例10中使用的探针序列的表。
实例11.在存在表达β-内酰胺酶的细菌的情况下快速抗微生物剂敏感性测试对内 酰胺抗生素而言是准确的
概述：当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含其它微生物的靶病原体群。通常方法(即集落纯化)需要2到5天来递送结果。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。
一个原因是，当前方法需要冗长的细胞纯化过程，因为这些方法使用非特异性检测方法，如增加浊度以确定哪些抗微生物剂抑制微生物培养基中的靶病原体的生长。当使用细胞复制品的非特异性测量时，仅可以知道如果仅含有靶病原体的细胞，则所示生长是由于靶病原体引起的。
相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需集落纯化步骤。该方法与当前方法的不同之处在于，其特异性地评估靶病原体在含有抗微生物剂的微生物培养基中的生长。在另一个实例中表明，在存在大量来自脱靶物种的细胞的情况下，本发明的方法是准确的。
在该实例中，通过在存在脱靶物种的情况下执行靶病原体的抗微生物剂敏感性测试来解决可能引起的另一个挑战。在此表明，在含有大量的使已知的酶分解正在测试的抗微生物剂的脱靶物种的人为尿液样本中，本发明的方法递送靶病原体的准确抗微生物剂敏感性测试结果。理论上，这可以潜在地显著改变抗微生物剂的浓度以改变抗微生物剂敏感性测试结果。
在该实例中，表明在存在大量的产生分解该类型的抗微生物剂的酶的脱靶病原体的情况下，快速抗微生物剂敏感性测试实现了两种碳青霉烯抗生素(美罗培南和亚胺培南)的准确抗微生物剂敏感性测试结果。
实验程序：抗生素板的制备：在非无菌样品对靶MIC的影响的实例中如所描述的制备抗生素板。
培养物的制备：分别将大肠杆菌ATCC 25922的三到五种集落、对大多数抗生素和肺炎克雷伯菌CDC 0141敏感的细菌菌株、在许多其它耐药性基因中表达β-乳糖酶OXA-181的菌株各自接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下温育1到2小时。通过光谱仪来测量光密度，并且将生物体稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中。将大肠杆菌稀释成5×105CFU/mL(CLSI标准浓度)，而将肺炎克雷伯菌稀释成各种接种物(范围为1×106和5×108CFU/mL)。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成3.75×106个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前的时间零点(TO)的针对每份临床尿液样本的测定信号。将30μL的每种经过处理的尿液添加到含有物种特异性Alexa647N标记的DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针的70μL 1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)中。在表A中示出了所使用的探针序列。然后将100μL的混合物添加到含有脱水的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277))的微量滴定板的孔中。然后将所制备的10μL的磁性颗粒混合物添加到孔中。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/vOptiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：在存在肺炎克雷伯菌-OXA的不同接种物的情况下，测试大肠杆菌对以下2种抗微生物剂的敏感性：亚胺培南和美罗培南。当存在时间零点细胞定量时，将10μL的大肠杆菌物种(5×106CFU/mL)、10μL的肺炎克雷伯菌(l×106到1×108CFU/mL)或10μL培养基(对照)、10μL的合并尿液和60μL MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到已经含有10μL抗生素的抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立的空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有所有6种浓度的每种抗生素的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果：
图79示出了在存在通过产生使亚胺培南抗生素降解的β-内酰胺酶而对亚胺培南抗生素具有耐药性的肺炎克雷伯菌菌株的量增加的情况下，对亚胺培南敏感的大肠杆菌菌株的MIC。将本发明的新颖快速AST方法与BMD方法进行比较。新颖4.5小时AST方法不受甚至高浓度的β-内酰胺酶存在的影响，该β-内酰胺酶产生MIC始终小于1μg/mL亚胺培南的肺炎克雷伯菌。相比之下，BMD方法在16到24小时生长之后示出敏感大肠杆菌菌株的MIC随着肺炎克雷伯菌水平的增加而增加，该菌株将被错误地确定为对该抗生素具有耐药性。
图80示出了内酰胺类抗生素美罗培南的类似结果。
结论：本发明的新颖4.5小时AST方法示出，即使在存在表达使抗生素降解的碳青霉烯酶的高浓度耐药性细菌的情况下，对碳青霉烯抗微生物剂敏感的细菌的MIC确定是准确的。
变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以扩展到另外的内酰胺敏感配对和表达细菌的β-内酰胺酶。
图79是在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的情况下，对用于确定大肠杆菌的亚胺培南MIC的新颖快速AST和BMD方法的比较。
图80示出了在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而标准BMD现在也是如此。
图81是在该实例11中使用的探针序列的表。
实例12.在不进行基于培养的细胞纯化的情况下对尿液中的细菌进行准确快速抗 微生物剂敏感性测试
概述：当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含样本本身的仅病原体细胞群。因此，指示哪种抗生素对杀死引起感染的病原体最佳的抗微生物剂敏感性测试结果在2到5天内尚不可用。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。
相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需冗长的集落纯化步骤。在此示出当在没有集落纯化的情况下测试尿液样品中的细菌时，新抗微生物剂敏感性测试结果没有受到显著影响。该实例表明，在包括15份不同培养阴性尿液样品的尿液基质(10％)的人为样品中，快速抗微生物剂敏感性测试方法准确地确定了大肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)。
实验程序：尿液样本：从发现生命科学公司(Discovery Life Sciences)购买十五份培养阴性临床尿液样品(剩余的)。在收集之后>7天接收样品并将其储存在-80℃下直到使用为止。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，对尿液执行常规尿液培养以确定样品是培养阴性的。简而言之，将经过校准的1uL环放置到充分混合的尿液样品中，并且均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上并在35℃的空气温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行测定，如下文所述。
抗生素板的制备：以比预期最小抑制浓度(MIC)高10倍的浓度开始，按2倍系列稀释制备含有六种浓度的每种抗生素的微量滴定板。所使用的抗生素是头孢唑啉、环丙沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑。通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证抗生素稀释液处于适当耐受性内。选择用于测试跨越CLSI报道的大肠杆菌抗生素断点的每种抗生素的浓度。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，含有水或稀释剂的八个孔包含在板中以允许无抗生素阳性和阴性生长对照。
培养物的制备：使用三到五个接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下温育1到2小时的集落来生长大肠杆菌(BAA-2469)的对数培养物。通过分光光度计来测量光密度，并且将生物体在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中稀释成5×106CFU/mL(在每个100μL的反应中，最终浓度为5×105CFU/mL)。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对每种尿液样品的测定信号。将10μL经过稀释的大肠杆菌添加到70μL杂交缓冲液中：最终浓度：3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、1％CHAPS(西格玛公司，目录号C3023)、1％NOG(西格玛公司，目录号08001)、1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)(来自2X储备液)(天惠华公司，目录号M5866)和非特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针(关于探针标记、序列和浓度，参见表A)。通过将10μL的每种单独尿液直接添加到混合物中来获得最终浓度为10％的尿液。将如上文所描述制备的10μL磁性颗粒混合物直接添加到该混合物中。将现在含有杂交混合物、尿液和磁性颗粒的100μL样品转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222))的微量滴定板，在60℃下在对流烘箱中干燥3小时并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：测试掺有培养阴性临床UTI尿液样品对以下5种抗微生物剂的敏感性：头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑。根据上文所描述的方法制备含有这些抗微生物剂的抗生素板。同时，当发生时间零点细胞定量时，将10μL大肠杆菌、10μL尿液和70μL 1X MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立的空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有所有6种浓度的每种抗生素的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果：下面的图示出基质对AST结果几乎没有影响。
图82示出了通过新颖AST方法(黑色圆圈)确定的大肠杆菌BAA-2469的MIC与在不存在针对左氧氟沙星的尿液的情况下(虚线)通过黄金标准CLSI BMD方法确定的MIC的比较。阴影区域是基本一致性区域，该区域通常被认为是在符合CLSI的BMD过程的可接受误差范围内。使用与CLSI方法精确匹配的新颖AST方法确定针对大肠杆菌BAA-2469的大多数左氧氟沙星的MIC，并且剩余两个落在2倍基本一致性区的范围内。
图83总结了获得的所有5种抗生素的结果。使用新颖AST方法在15份培养阴性临床尿液样品中观察到与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。
图84示出使用新颖AST方法确定的掺有大肠杆菌的15份培养阴性临床尿液样品的MIC与在被测的5种抗生素中的符合CLSI的BMD过程中观察到的MIC的比较。
图82示出了左氧氟沙星与15份掺入标准BMD中的培养阴性临床UTI尿液样品中的每份的100％基本一致性。
结论：本发明的方法准确地确定了(在相对于黄金标准BMD方法的基本一致性区内)在所有15种不同的尿液基质中测试的所有5种抗生素的UTI病原体(大肠杆菌)的MIC。因此，该新颖4小时抗微生物剂敏感性测试有能力提供直接来自尿液样本的准确结果，而不需冗长的基于生长的集落纯化，从而节省大量时间。通过允许快速启动正确、有效的抗生素治疗并避免加剧抗生素耐药性扩散，快速AST结果可以改善患者护理。
变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)和尿液浓度。该方法还可以清楚地应用于其它细菌和非细菌病原体以及尿液之外的最少处理的临床基质。
图82示出了15份尿液的基本一致性。
图83示出了15份掺有培养阴性临床UTI尿液样品中的每份与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。
*头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑。
图84示出了与标准BMD方法(“符合CLSI”)相比，掺有如通过新颖AST方法所确定的大肠杆菌的15份尿液样品的MIC。浓度以微克/毫升为单位。
图85是在该实例12中使用的探针序列的表。
实例13.对多种微生物中的多种靶标进行快速且准确的AST
概述：多种微生物感染在包含伤口的许多类型的感染中很常见。对于此类可能威胁生命的感染，确定哪些抗微生物剂可能对每种传染性病原体有效是至关重要的。当前的抗微生物剂敏感性测试方法需要2到5天来纯化多种微生物感染中的大量的每种传染性病原体，之后对该传染性病原体进行分析。
该实例表明本发明的系统和方法在仅4.5小时内直接从患者样本中产生快速AST结果，而无需冗长的集落纯化的潜力。与肉汤微稀释参考标准结果相比，该方法在人为的2种靶多种微生物混合物中实现了针对每个靶标物种的AST结果(MIC值)。
实验程序：
抗生素板的制备：制备了含有6个环丙沙星浓度的2倍系列稀释系列的微量滴定板。在最终肉汤微稀释中以比期望的浓度高10倍的浓度制备了2倍稀释系列，使得添加细胞/尿液/培养基混合物将产生正确的抗生素范围。然后将10μL的每种抗生素稀释液等分到96孔板的适当的孔中。通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证抗生素稀释液处于适当耐受性内。除了含有抗微生物稀释系列的孔之外，包含含有水或其它稀释剂的足够的孔用于无抗生素阳性生长对照。将抗生素板在-80℃下冷冻并在使用之前完全解冻。
培养物的制备：选择针对四种不同生物体(大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌BAA-2469、肺炎克雷伯菌CDC 0076、肺炎克雷伯菌CDC 0043、铜绿假单胞菌CDC 0233、铜绿假单胞菌CDC 0236、粪肠球菌ATCC 29212和屎肠球菌ATCC 19434)的敏感菌株和耐药性菌株两者。表A中示出了菌株和其对每种被测的抗生素的耐药性。利用三到五个接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)并在35℃下在振荡时温育1到2小时的集落来分别生长每个菌株。通过光谱仪来测量光密度，并且将生物体在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHB II)(天惠华公司，目录号M5860)中稀释成1×107CFU/mL。
磁性颗粒的制备：将聚天冬氨酸缀合磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)的溶液以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。利用2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)进行相同的程序。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对每个物种和菌株的测定信号。将5μL靶标A与5μL靶标B或5μL MHB II组合以达到最终浓度5×106CFU/mL每生物体，将其添加到80μL杂交缓冲液(最终浓度：3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠pH 7)(西格玛公司，目录号S6639)、0.25M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号503-84-0)、5％PEG MW 3350(西格玛公司，目录号P-3640)、7.5％Igepal CA-630(西格玛公司，目录号13021)、0.2％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)、物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针(在表B中找到序列和浓度))。通过将10μL的合并尿液(创新研究公司，目录号IR100007P-24203)直接添加到100μL总反应的混合物中来获得最终浓度为10％的尿液。将如上文所描述制备的10μL SiMag-Q磁性颗粒混合物(针对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌菌株正被标记的条件)或Fluidmag-PAA磁性颗粒混合物(针对肠球菌被标记的条件)直接添加到该混合物中。将现在含有杂交混合物、尿液和磁性颗粒的100μL样品转移到含有50μL的染料垫(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的微量滴定板，在60℃下进行干燥(干垫板)并在35℃下温育30分钟。在该温育之后，将微量滴定板放置到强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使经过标记的和磁性颗粒相互作用的细菌细胞极其邻近成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：测试含有两个物种的多种微生物样品对以下1种抗微生物剂的敏感性：环丙沙星。根据上文所描述的方法制备含有这些抗微生物剂的抗生素板。同时，当发生时间零点细胞定量时，将5μL待标记和检测到的物种和5μL可能存在于多种微生物UTI感染(但将不标记)或MHB II中作为对照的细菌物种、10μL合并尿液和70μL MHB II添加到抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立的空气温育箱中生长4小时。在该实例中的每个菌株在一种情况下充当经过标记的靶标物种，并且在另一个情况下充当多种微生物对的未经标记的成员。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将10μL经过温育的样品-抗生素板(10％)转移到微量滴定板并以与上文所述相同的方式与10μL杂交缓冲液、FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒组合以测定时间零点。
比较方法：将使用在此所描述的新颖AST方法的结果与根据CLSI M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在没有抗生素但有所有6种浓度的环丙沙星的情况下，在时间零点和时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种样品接种物/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。基于CLSI M100Ed28 2018指南，将MIC结果对应地分配到敏感、中等或耐药性种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。
结果：
图152和153总结了所有48种不同的成对组合与抗生素环丙沙星的结果。
图92示出不论是否存在第二敏感或耐药性细菌，通过新颖4.5小时AST方法确定的靶细菌的所有MIC在2倍容差范围内，被针对每种靶细菌的(在不存在第二细菌的情况下确定的)黄金标准BMD方法(称为基本一致性)所接受。
图93示出通过新AST方法对每种靶细菌的敏感和耐药性确定不受这些成对组合的影响并且与BMD确定100％一致。
结论：本发明的AST方法可以在4.5小时内准确地确定多种微生物样品中的每个物种的抗生素敏感性，而无需当前方法所需的耗时的集落纯化。结果示出本发明确定抗微生物剂可以在仅数小时内而不是当今方法所需的数天内有效地治疗威胁生命的多种微生物感染的潜力。
变型：该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)和替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本、其它细菌和其它抗生素。
图89示出了在该实例中使用的环丙沙星敏感性菌株和环丙沙星耐药性菌株。
图90是在该实例13中使用的探针序列表的前半部分。
图91是在该实例13中使用的探针序列表的后半部分。
图92示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的基本一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的基本一致性。
图93示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的分类一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的分类一致性。
实例14.对自动化仪器上的盒中的单个样本中的多个靶病原体的快速且准确检测
概述：多种微生物感染(即由多于一个细菌物种引起的感染)是常见的。当前用于鉴定病原体的基于培养和基于MALDI-TOF的方法需要冗长的集落纯化步骤以单独纯化每个靶标物种的大量细胞。该实例表明，本发明的FISH方法用于在30分钟内在含有所有测定试剂的一次性消耗盒内部的自动化分析仪上检测并鉴定人为尿液样品中存在的靶病原体的多个物种。实例示出了本发明的系统和方法快速并特异性地鉴定多种微生物感染中的多种靶病原体的潜力。
实验程序：
尿液样本：从发现生命科学公司购买十份培养阴性临床尿液样品(剩余的)。在收集之后>7天接收样品并将其储存在-80℃下直到使用为止。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，对尿液执行常规尿液培养以确定样品是培养阴性的。简而言之，将经过校准的1uL环放置到充分混合的尿液样品中，并且均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA，BD目录号221185)板上并在35℃的空气温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行处理和测定，如下文所述。
尿液处理：在执行鉴定(ID)之前，使用尺寸排阻色谱法去除尿液防腐剂和其它潜在干扰化合物。将2.5mL的每种临床阴性尿液样品应用于预洗涤的ZebaTM旋转脱盐柱，7KMWCO(赛默飞世尔公司，目录号89893)。如制造商所描述的，通过离心使样品穿过柱。
盒中脱水试剂的制备：在执行鉴定(ID)之前，将45μL 2.2X浓杂交缓冲液(6.7XSSC(1M NaCl、0.1M柠檬酸钠、(西格玛公司，目录号S6639)、0.4％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、1.71％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、1.6％SB3-12w/v(西格玛公司，目录号D0431)和0.29M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)分配到盒的6个试剂孔中。一旦通过分析仪处理之后在最终100μL体积中再水合，就将产生正常的1X杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、0.18％溴化十六烷基三甲铵、0.77％CHAPSO、0.72％SB3-12和0.13M硫氰酸胍)。将1.8μL的每种靶标物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针混合物添加到8个试剂孔中的2个试剂孔中(对于1个盒中的每个靶标，N＝2)。将大肠杆菌FISH寡核苷酸探针集添加到对应于盒位置A1和A2的试剂孔中，将肺炎克雷伯菌探针集添加到对应于盒位置A3和A4的试剂孔中，并且将铜绿假单胞菌探针集添加到对应于盒位置A5和A6的试剂孔中。然后，将含有杂交缓冲液和特异性探针的这些盒孔在50℃的对流烘箱中温育16到20小时以使材料脱水。
磁性颗粒的制备：将聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中直到浓度为2.75×1012个颗粒/mL，最终浓度为10％w/v海藻糖(西格玛，目录号T9449)。为了该稀释，将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。在立即用于最小化聚合之前，对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。然后将混合物冻干在10μL体积珠(每反应2.64×1012PAA个颗粒)中，并且将1个珠放置在6个试剂孔中的每个试剂孔中。
培养物的制备：利用三到五个接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡时温育1到2小时的集落来分别生长三种不同靶病原体(大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 13883和铜绿假单胞菌ATCC 27853)的对数培养物。通过光谱仪来测量光密度，并且将生物体在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中稀释成约5×106CFU/mL。
细菌细胞标记和鉴定成像：在最终浓度为30％的经过处理的尿液中，确定了每个靶病原体在含有两种所关注的细菌(总共3个2-细菌组合)的人为多种微生物混合物中的测定信号。在10份独特的不同培养阴性临床样品(总共测试30份尿液)中测试每个多种微生物细菌组合。将103.5μL细菌靶标A(约5×105CFU/mL每反应)、103.5μL细菌靶标B(约5×105CFU/mL每反应)、360μL尿液和633μL组合成总体积为1.2mL；将1mL该混合物转移到盒样品添加端口中。然后将盒放置在仪器上，并且自动执行所有后续动作。首先将样品在真空下引导到盒顶部的6个生长孔中。然后将样品立即移动到反应孔中，从而再水合杂交缓冲液/FISH探针混合物和所冻干的磁性颗粒。然后样品继续到含有45μL脱水的“染料垫”(50mMTRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的光学窗口，在60℃下在对流烤箱中干燥3小时并在35℃下在分析仪上温育30分钟。在该温育之后，将盒重新定位到磁体站并放置在强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)顶部持续4分钟以使经过标记的和磁性颗粒相互作用的细菌细胞邻近孔的底部处的成像表面。最后，将盒移动到成像站并且使用如下文所描述的非放大CCD成像仪进行成像。简而言之，通过拍摄绿色通道中的荧光磁性微球的连续图像、所确定的聚焦平面以及在该位置处在红色通道中拍摄的对应图像来聚焦在每个单独孔上以对经过标记的细菌细胞进行成像。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM分析仪成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。分析仪可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。如果测定信号高于130，则通道中的信号被认为检测到。
结果：数据表明在单个样品中成功鉴定2个靶病原体，而没有检测到不存在的病原体(即FISH探针对非靶细菌无交叉反应性)。
图94示出了在对大肠杆菌/肺炎克雷伯菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。
图95示出了在对大肠杆菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。
图96示出了对肺炎克雷伯菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒(N＝10)。由于该盒失效，将肺炎克雷伯菌/铜绿假单胞菌盒6号从分析中去除以产生有效结果。另外，在大肠杆菌/铜绿假单胞菌盒9号的A3中观察到伪影，该伪影使孔中的信号看起来异常地高，因此该单个复制品被消除。该排除点(孔A4)的复制品没有该伪影，因此将肺炎克雷伯菌仍然分类为未检测到。尽管测定信号在不同的盒中有所不同，在除了那些已经描述的情况之外的所有情况中，检测到添加到培养阴性尿液中的两种细菌，而在含有没有被添加的细菌的探针的孔中观察到非常低的信号。
结论：该实例表明，本发明的利用可消耗盒内部的稳定试剂在自动化分析仪上执行的等温FISH方法可以特异性地鉴定人为尿液样品中的多个靶细菌物种。这示出了在多种微生物感染中鉴定多种病原体的方法的潜力。实例还表明了方法的特异性，因为没有观察到跨物种检测。
变型：该实例说明了该新颖FISH方法在盒上的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序以及对反应物稳定的改变(组分的冻干)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图94示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图95示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图96示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图97是示出检测到靶病原体而未检测到其它非靶病原体的表“实例14的表A”。
图98是示出在该实例14中使用的探针序列的表“实例14的表B”。
实例16：使用羧基荧光素二乙酸酯非特异性检测活细菌
概述：在该实例中，使用大区域成像来检测单独的用荧光酯酶底物染色的金黄色葡萄球菌细菌细胞靶标。底物可以扩散穿过完整活细胞的细胞膜，其中该底物在新陈代谢活性细胞中所示的酯酶作用下发荧光并带电。这些带电荧光产物不能再被动地扩散穿过细胞膜并且被俘获在完整细胞中。因此，该技术可以区分活细胞和死细胞，因为仅具有活性酯酶和完整细胞膜的细胞将适当地染色。在该实例中，利用荧光底物羧基荧光素二乙酸酯(cFDA)标记金黄色葡萄球菌细胞并使用非放大技术成像对其进行成像。
实验方法：
细菌细胞制备：
使金黄色葡萄球菌ATCC 29213在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，BD目录号211822)中过夜生长。通过将100uL过夜培养物接种到5ml的新鲜TSB培养基中并在35℃下在振荡温育箱中进一步温育2.5小时来制备金黄色葡萄球菌的对数培养物。
磁性颗粒的制备：
通过使用标准EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联化学将磁性颗粒(Ademtec，292nm)与鸡抗蛋白A抗体(子午线生物科学公司(Meridian Biosciences))偶联来制备抗体缀合的磁性颗粒。
细菌细胞的标记和捕获：
在96孔微量滴定板中执行测定，并且每个孔包含40uL金黄色葡萄球菌(含10,000个细胞的TSB)或仅TSB(无细胞对照)、5uL 10mM cFDA(生命技术公司(LifeTechnologies))和5ul抗体缀合的磁性颗粒(2e10/mL)。在室温下将反应温育15分钟。在温育之后，将40uL的反应混合物仔细地覆盖在75ul的“染料垫”(具有5mg/mL铬变素2R的15％Optiprep)上，该染料垫在黑色透明底半区微量滴定板(葛莱娜公司675096，VWR部件号82050-056)上进行预等分。将微量滴定板放置到磁场上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
细菌细胞的成像：
在磁性捕获经过标记的细胞:磁性颗粒复合物之后，将微量滴定板放置在CCD数码相机(IDS，型号UI-2250SE-M)上方的台上并用来自LED的穿过滤光片(469nm，35nm FWHM)的光照亮。通过相机检测到穿过发射滤光片(520-35nm)的荧光信号以创建荧光复合物的图像。使用枚举单独细胞的FLimage软件(第一光生物科学公司(First Light Biosciences))对图像进行分析。
结果：
图86示出金黄色葡萄球菌细胞(左图)检测为明亮荧光斑点，而没有细胞的培养基(右图)仅含有被分类为碎片的对象。在具有经过标记的金黄色葡萄球菌细胞的场中的斑点数量为约5000，并且其与输入细菌的期望数量密切相关。
图87仅示出了金黄色葡萄球菌细胞(左图)和TSB培养基(右图)。
结论：该实例表明用于非特异性地枚举细菌的方法。该方法可以用于对来自样本中的覆盖宽范围的细菌物种的混合群体进行计数。具体地，实例表明了本发明的非放大成像方法枚举少量细菌细胞的能力，该细菌细胞用羧基荧光素二乙酸酯(即非特异性地标记含有普遍存在的酯酶的活细胞的荧光底物)进行标记。
变型：存在包含核酸染色剂(如STYO和SYBR家族染色剂、碘化丙啶和DAPI)的用于非特异性细胞标记的其它染色剂。可以使用其它区分活细胞或死细胞的染色剂。例如，其它荧光底物或可能或可能不穿过完整细胞膜的DNA染色剂可以替代cFDA或FDA或与其结合使用。可以通过使用针对荧光检测的多种激发和发射波长来区分多种染色剂和染料。与对象相关联的荧光光谱可以用于确定细胞是否被计数为活的或死的。另外，对特定类型的细菌的生化活性具有特异性的荧光底物可以用于确定其存在。例如，可以通过□-半乳糖苷酶将荧光□-半乳糖苷酶底物裂解成其荧光产物，该半乳糖苷酶对大肠菌具有特异性。该方法还可以应用于大多数细菌和含有多种细菌物种的样本。方法适合于以最少处理检测许多不同临床样本类型中的细菌(例如，尿液、痰、拭子、脊髓液等)。
实例15：使用DNA染色染料对细菌进行非特异性检测
概述：在该实例中，使用大区域成像来检测单独的活金黄色葡萄球菌细菌细胞靶标，该靶标用DNA结合性染色剂进行染色。DNA结合性染料可以扩散穿过完整的活细胞的细胞膜，其中在与细菌的DNA结合之后，该染料成为高度荧光的。一旦与DNA结合，这些染料不能再容易且被动地扩散穿过完整细胞膜并被俘获在完整细胞内。当区分活细胞和死细胞很重要时，该技术可能有用，因为与死细胞或膜受损的细胞相比，具有完整细胞膜的活细胞将用不同染料不同地染色。在该实例中，用DNA结合性荧光染料(即SyBR绿色)标记金黄色葡萄球菌，并使用非放大大区域CCD成像对其进行成像。
实验方法：
细菌细胞制备：
使金黄色葡萄球菌ATCC 29213在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，BD目录号211822)中过夜生长。通过将100uL过夜培养物接种到5ml的新鲜TSB培养基中并在35℃下在振荡温育箱中进一步温育2.5小时来制备金黄色葡萄球菌的对数培养物。
磁性颗粒的制备：
通过使用标准EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联化学将磁性颗粒(Ademtec，292nm)与鸡抗蛋白A抗体(子午线生物科学公司)偶联来制备抗体缀合的磁性颗粒。
细菌细胞的标记和捕获：
在96孔微量滴定板中执行测定，并且每孔包含40uL金黄色葡萄球菌(含10,000个细胞的TSB)或仅TSB(无细胞对照)、5uL 500倍经过稀释的SyBR绿色染料(目录号S7563，生命技术公司)和5ul抗体缀合的磁性颗粒(2e10/mL)。在室温下将反应温育15分钟。在温育之后，将40uL的反应混合物仔细地覆盖在75ul的“染料垫”(具有5mg/mL铬变素2R的15％Optiprep)上，该染料垫在黑色透明底半区微量滴定板(葛莱娜公司675096，VWR部件号82050-056)上进行预等分。将微量滴定板放置到磁场上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
细菌细胞的成像：
在磁性捕获经过标记的细胞:磁性颗粒复合物之后，将微量滴定板放置在CCD数码相机(IDS，型号UI-2250SE-M)上方的台上并用来自LED的穿过滤光片(469nm，35nm FWHM)的光照亮。通过相机检测到穿过发射滤光片(520-35nm)的荧光信号以创建荧光复合物的图像。使用枚举单独细胞的FLimage软件(第一光生物科学公司)对图像进行分析。
结果：
图86示出金黄色葡萄球菌细胞(左图)检测为明亮荧光斑点，而没有细胞的培养基(右图)仅含有被分类为碎片的对象。在具有经过标记的金黄色葡萄球菌细胞的场中的斑点数量为约5000，并且其与输入细菌的期望数量密切相关。
图87仅示出了金黄色葡萄球菌细胞(左图)和TSB培养基(右图)。
结论：该大区域、非放大成像系统能够检测并枚举用SyBR绿色(即非特异性地标记活细胞的DNA结合性染料)标记的细菌细胞。
变型：可以使用其它区分活细胞或死细胞的染料。例如，可能或不能穿过完整细胞膜的其它荧光DNA染色剂可以替代SyBR绿色或与其结合使用。可以通过使用针对荧光检测的多种激发和发射波长来区分多种染色剂和染料。与对象相关联的荧光光谱可以用于确定细胞是否被计数为活的或死的。另外，对特定类型的细菌的生化活性具有特异性的荧光底物可以用于确定其存在。例如，可以通过□-半乳糖苷酶将荧光□-半乳糖苷酶底物裂解成其荧光产物，该半乳糖苷酶对大肠菌具有特异性。该方法还可以应用于大多数细菌和含有多种细菌物种的样本。方法适合于以最少处理检测许多不同临床样本类型中的细菌(例如，尿液、痰、拭子、脊髓液等)。其它核酸染色剂可以非特异性地标记细菌细胞，该染色剂包含SYTO/SYBR家族染色剂的其它成员、碘化丙啶和DAPI。
实例17.使用本发明的系统对粪便样本中的艰难梭菌毒素进行自动化敏感检测
概述：艰难梭菌引起的医院内获得性感染和患者死亡比任何其它病原体都多并且是CDC紧急威胁名单上的头号病原体。当前诊断艰难梭菌感染的两种实验室方法都不准确。对艰难梭菌感染的酶免疫测定测试缺乏临床敏感性，也就是说，其可能无法检测到患有疾病的患者。核酸扩增测试缺乏临床特异性-这些测试将未患疾病的患者误诊为感染阳性。对引起感染的艰难梭菌毒素的更敏感测试可以是高度敏感的和高度特异性的。更准确的测试将产生更好的患者预后。该实例表明本发明用于检测粪便样本中的非常低浓度的艰难梭菌毒素B。
实验方法：
材料将与艰难梭菌毒素B的互补表位结合的2个单克隆抗体附接到纳米颗粒。将荧光纳米颗粒(马塞诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))与抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体(英国卡迪夫BBI溶液公司(BBI Solutions))缀合。将聚苯乙烯羧酸盐磁性颗粒(法国佩萨克Ademtech)与抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体(马萨诸塞州阿克顿菲茨杰拉德公司(Fitzgerald))缀合。将荧光颗粒和磁性颗粒两者在缀合之后进行冻干。在组装期间，将所冻干的颗粒放置在第一光盒中。从拳头实验室(Fist Faboratories)(加拿大坎贝尔)购买从艰难梭菌纯化的天然毒素B蛋白。酪蛋白、酪蛋白水解物、
Figure BDA0003101035740000851
-HCl来自西格玛公司奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)。Poly-BSA来自罗氏公司(Roche)。蛋白酶抑制剂混合物来自宝生物工程公司(加利福尼亚州山景城)。从皮尔斯公司(Pierce)/赛默飞世尔科技公司购买旋转柱。
在MulitPath仪器上估计艰难梭菌毒素B测试的检测极限。使用合并的阴性粪便样品执行LoD测量。根据批准的临床实验室标准协会(CFSI)指南通过运行24种没有分析物的样品复制品和每种有5种不同毒素B浓度的12种复制品来确定检测极限(LoD)。合并的阴性粪便样品由14种已经通过实时PCR评分为艰难梭菌阴性的单独的粪便样品制成。合并的粪便样品以两倍稀释系列掺有艰难梭菌毒素B(0、31.2、62.5、125、250、500μg/mL)。将100μL的每种粪便样品添加到由以下组成的粪便稀释剂(900μL)中：Tris缓冲液、Poly-BSA、酪蛋白和蛋白酶抑制剂混合物。将0.95mL的每种经过稀释的样品转移到皮尔斯旋转柱并以11,700×g离心5分钟。离心之后，将700μL的上清液转移到盒中的样品添加端口并且关闭盖帽。然后将盒放置到盒输入架中并插入到仪器中。
在自动化仪器上运行盒。在将盒放置到仪器中之后，除了数据分析(使用Excel或JMP软件离线执行)之外的所有随后动作都是自动执行的。首先将经过稀释的粪便样品在真空下引导到盒内的单独反应孔中并移动到含有46uL脱水的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的成像窗口，在60℃下在对流烘箱中干燥3小时并在35℃下在仪器上温育30分钟。在该温育之后，然后将盒重新定位到磁体站并放置在强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)顶部持续4分钟以使荧光颗粒:毒素B:磁性颗粒复合物穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。最后，将盒移动到成像站中并且使用如下文所描述的非放大CCD成像仪来拍摄图像。
仪器成像系统和成像过程：MultiPath成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。对于艰难梭菌毒素测试，测试通道为470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片并在20毫秒曝光下捕获2个帧。在569/25nm激发滤光片和609/34nm激发滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在10毫秒曝光下捕获2个帧。
结果：
图99示出方法返回估计的艰难梭菌毒素B的检测极限为58pg/mL。在生物和技术复制品中的信号变异性由误差条指示(+/-1标准偏差)。
结论：该方法能够非常敏感且精确地检测艰难梭菌毒素B。毒素B的LoD被确定为58pg/mL。在技术和生物复制品中的低信号变异性指示对基质效应的稳健性。
变型：该实例说明了本发明的方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同的荧光颗粒、替代性测定化学(不同的缓冲液、pH、温度、反应时间、成分浓度)、不同量的粪便以及处理粪便样本的不同手段。另外，可以使用对艰难梭菌(例如，毒素A)具有特异性的替代性生物标志物。该新颖技术还可以清楚地扩展到其它靶分子以及可以鉴定到特异性生物标志物的各种细菌病原体和非细菌病原体。
通过引用并入
贯穿本公开已经参考和引用了其它文献，如专利、专利申请、专利出版物、杂志、书籍、论文、网络内容。出于所有目的将所有此类文献特此通过全文引用的方式并入本文中。
等效物
根据本文档的全部内容，包含对本文所引用的科学专利文献的参考，除了那些在本文中示出并且描述的内容之外，本发明的各种修改及其许多另外实施例对于本领域技术人员将变得显而易见。本文的主题包含重要信息、例证以及指导，它们可以适合于在本发明的不同的实施例及其等效物中实践本发明。

Claims (20)

1.一种仪器，其包括：
输送系统，所述输送系统能操作以将含有样本的盒移动到所述仪器内的模块；
磁性模块，所述磁性模块将所述盒内的磁性颗粒拉动到所述盒中的成像表面上；
成像模块，所述成像模块具有传感器，所述传感器从所述成像表面接收光；以及
控制模块，所述控制模块检测并计数与所述磁性颗粒结合的经过标记的分子或细胞的量。
2.根据权利要求1所述的仪器，其中所述控制模块和所述成像模块能够在不放大的情况下检测并计数所述成像表面上的荧光标记的单独细胞或分子。
3.根据权利要求1所述的仪器，其中所述成像模块包含XYZ台，所述XYZ台能操作以在成像期间在x、y和z方向上移动所述盒进行放置。
4.根据权利要求1所述的仪器，其中所述控制模块操作所述XYZ台以对所述盒内的一系列不同成像孔中的单独细胞进行计数。
5.根据权利要求1所述的仪器，其中所述成像模块包含安装在隔板下方的光学组合件，所述隔板支撑所述光学组合件之上的所述盒，其中所述光学组合件包含所述传感器、光源、透镜和滤光片轮中的一个或多个。
6.根据权利要求1所述的仪器，其进一步包括流控模块，所述流控模块使用压力将来自所述盒上的输入孔的所述样本分到所述盒中的分离孔中。
7.根据权利要求1所述的仪器，其进一步包括至少一个加热块，所述至少一个加热块位于所述隔板上，所述至少一个加热块能将盒维持在受控温度下。
8.根据权利要求1所述的仪器，其中所述磁性模块具有安置在盒槽的底表面上的磁体。
9.根据权利要求1所述的仪器，其中所述机械输送系统包含转盘和在所述转盘与所述模块之间转移盒的机械臂。
10.根据权利要求1所述的仪器，其中所述控制模块从所述盒读取代码并分析所计数的经过标记的分子或细胞以提供对应于所述代码的测试结果。
11.根据权利要求10所述的仪器，其中所述测试是微生物鉴定测试。
12.根据权利要求10所述的仪器，其中所述测试是抗微生物剂敏感性测试，并且所述控制模块对所述盒的孔中的差异生长进行分析。
13.根据权利要求12所述的仪器，其中所述盒包括多个孔，所述多个孔包括不同抗微生物剂或不同浓度的一种或多种抗微生物剂。
14.根据权利要求1所述的仪器，其进一步包括温育站，所述温育站能操作以当所述盒定位在其中时将盒内含物维持在期望的温育温度下。
15.根据权利要求1所述的仪器，其进一步包括废物模块，在执行测试步骤之后，所述废物模块用于盒处置。
16.根据权利要求9所述的仪器，其中所述转盘是围封的，并且所述仪器能操作以将所述转盘维持在执行测试步骤所需的温育温度下。
17.根据权利要求9所述的仪器，其中所述转盘和所述模块包括槽，所述槽的大小被设定成容纳所述盒，
其中旋转将所述转盘的槽与模块槽对准，并且
其中所述机械臂能操作以在所述转盘与所述模块槽之间推动所述盒。
18.根据权利要求1所述的仪器，其中所述控制模块包括处理器，所述处理器耦接到非暂时性有形存储器并且能操作以接收指定待对所述盒中的所述样本执行的测试的输入并控制所述仪器以执行所述测试。
19.根据权利要求18所述的仪器，其中执行所述测试包含：
从与所述待执行的测试相对应的所述非暂时性有形存储器访问测试步骤的例程；
访问已经在所述仪器内执行的盒测试的现有调度例程；
调度待对所述盒执行的所述测试的所述测试步骤的例程，避免与所述现有调度例程发生冲突；以及
通过旋转所述转盘并在与所述测试步骤的例程相对应的所述多个站中的一个或多个站之间转移所述盒来对所述仪器内的所述盒执行所述测试步骤的例程。
20.根据权利要求18所述的仪器，其中从扫描装置接收指定所述待执行的测试的输入指定，所述扫描装置与所述处理器通信并且能操作以读取指示所述待执行的测试的所述盒上的标签。
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