CN113272654A - 测试盒 - Google Patents

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CN113272654A CN201980080462.XA CN201980080462A CN113272654A CN 113272654 A CN113272654 A CN 113272654A CN 201980080462 A CN201980080462 A CN 201980080462A CN 113272654 A CN113272654 A CN 113272654A
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Dawning Diagnostics Co
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Abstract

本公开提供了盒，这些盒预装载有试剂以执行抗微生物剂敏感性测试(AST)和FISH测试。本公开的盒包含各种温育孔，这些温育孔装载有不同抗微生物剂以进行差异生长分析。具有物种特异性微生物探针、荧光标签、磁性颗粒和染料垫层的成像孔允许对靶微生物进行标记和成像以进行差异生长分析。

Description

测试盒
技术领域
本公开涉及可用于检测感染、鉴定感染性病原体并确定针对感染的有效抗微生物剂治疗的系统、装置和方法。
背景技术
由抗生素耐药性细菌引起的威胁生命的感染的流行加剧了全球性医疗保健危机。该问题部分地由常规诊断方法需要很多天来确定用于治疗感染的最优抗微生物剂治疗的事实驱动。由缓慢测试引起的延误导致次优治疗、不良医疗结果以及对引起抗生素耐药性扩散的强力广谱抗生素的过度使用。由于由耐药性细菌引起的感染造成的死亡率正在急剧增加。《对抗微生物剂耐药性的综述(Review on Antimicrobial Resistance)》的2014报告估计，到2050年，抗微生物剂耐药性将导致每年大于1000万死亡。
不幸的是，用于鉴定有效针对性抗生素的常规方法(被称为抗微生物剂敏感性测试(AST)方法)需要很多天来递送结果。常规抗微生物剂敏感性测试花费这么长时间的一个原因是测试需要大量——大约几百万经过纯化的病原体细胞。使用已存在130多年的集落纯化方法，需要一天或更多天通过在皮氏培养皿中培养来纯化该数目的细胞。一旦经过纯化的细胞可用，就需要一天或更多天来鉴定病原体并确定哪种抗生素将有效治疗该患者。
与此同时，“凭经验”用杀死可能引起感染的广泛范围的病原体的广谱抗生素治疗患者。尽管这些药物可以治疗广泛范围的病原体，但是这些药物通常既不是用于患者的特定病原体的最优疗法，而且也不能有效地治疗该患者。对广谱抗生素的经验使用还使抗生素耐药性扩散。这些作用广泛的药物不仅引起对致病病原体的耐药性，而且还引起对栖息于人体的上万亿个良性微生物的耐药性。进一步加剧抗生素耐药性扩散的事实是，在不存在确定哪些患者实际上患有感染的快速诊断的情况下，不必要地用引起耐药性的抗生素频繁地治疗未经感染的患者。
迅速确定有效抗微生物剂治疗不仅可以改善医疗结果，而且可以降低医疗保健成本。例如，常见的威胁生命的医院获得性感染(如外科手术部位感染和呼吸机获得性肺炎)是美国将近100亿美元医疗保健成本的原因。住院时间使可归因于这些感染的成本最大化。用更接近症状发作的最优抗微生物剂疗法治疗患者可以显著加速患者恢复并减少冗长、昂贵的住院治疗。
发明内容
快速且准确地鉴定患有感染的患者并向这些患者快速实施有效疗法可以挽救生命并减轻抗微生物剂耐药性的扩散。与当今方法所需的天数相比，本发明提供了可以在约30分钟内准确地鉴定患有感染的患者并在若干小时内确定针对患者感染的靶向疗法的盒装置。通过检测感染并鉴定更接近症状发作的有效针对性抗微生物剂，本发明可以极大地改善医疗结果并使用引起耐药性的广谱抗生素进行的经验治疗最小化。
根据本发明的盒可以用于消除用于产生大量经过纯化的细胞的常规方法所需的耗时步骤。这些盒可以预装载有试剂以进行抗微生物剂敏感性测试(AST)。
为了检测感染，本发明可以检测、定量并鉴定广泛的病原体，包含细菌、真菌、病毒和寄生虫。对于快速且准确地鉴定患有感染的患者也很有价值的是本发明能够检测并定量诊断信息性毒素、疾病特异性生物标志物、人或宿主细胞和宿主应答生物标志物。本发明可以包含单个测试中上述能力的任何组合以最有效地评估患者样本是否存在感染并确定传染剂。
诊断信息性宿主细胞包含指示对感染的炎性应答的细胞(例如，中性粒细胞)、受病原体感染的细胞(例如，病毒感染细胞)或指示患者样本的质量和解剖来源的细胞(例如，鳞状上皮细胞)。
威胁生命的感染的毒素诊断的实例包含艰难梭菌(Clostridiodes difficile)毒素B，指示艰难梭菌感染的该艰难梭菌毒素B和指示炭疽感染的炭疽杆菌(Bacillusanthracis)致死毒素(或毒素亚基致死因子)的存在指示了疾病。可以帮助鉴定受感染的患者的宿主因素包含细胞因子，如IL-4和IL-6。
在检测感染并鉴定和定量感染病原体之后，本发明的盒和相关联的本发明的方法可以确定哪种患者疗法将是最有效的。该类型的分析被称为抗微生物剂敏感性测试(AST)。本发明与当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法的不同之处在于其可以在几小时内直接从患者样本中递送准确结果而不是当前需要数天的常规方法。不像本发明的方法，该常规方法需要耗时的微生物培养步骤以获得数百万个经过纯化的病原体细胞。本发明的新颖抗微生物剂敏感性测试方法可以在没有耗时的培养步骤的情况下直接根据患者样本快速地确定有效疗法，因为该方法需要大量的细胞或细胞纯化。
本发明的新颖和潜在的医学影响能力和实用性是通过用于使用直接来自患者样本的信息生物靶标的非放大数字成像实现单个分子计数和单个细胞计数的本发明的盒和相关联的本发明的系统和方法来实现的。在没有复杂且昂贵的显微镜和光学器件的情况下使用简单且低成本的相机对微观细胞和亚微观分子进行数字计数允许通过快速、敏感且自动定量致病毒素和疾病特异性生物标志物来检测感染。用于鉴定并数字计数病原体细胞的本发明的系统和方法强调快速确定对抗微生物剂的敏感性或耐药性的能力。本发明的方法通过确定当在营养素微生物培养基中温育时该药剂是否阻止病原体正常生长(即，通过细胞分裂增加细胞数量)来确定病原体是否对抗微生物剂敏感。这可以通过对在含有抗微生物剂的培养基中温育之前和之后的病原体细胞进行计数在本发明的盒装置中进行。
盒可由仪器操作以自动且同时运行多种测试，该多种测试仅需要样本输入并提供在范围为即时到集中式医院和参考实验室的各种场所中可执行的结果。通过预装载有所有所需试剂的专用盒、直接将样本输入到盒中和所有处理和分析以使用户的动手时间最小化的完全自动化、设计用于可扩展通量的仪器的组合，此类测试成为可能。
可由自动化仪器操作以使用用于对单分子和单细胞进行计数的方法执行测试的本发明的盒可以包含：对靶分子或细胞进行荧光标记；对靶标进行磁性标记；使用磁力将荧光标记的磁性靶标沉积在装置的成像表面上；在不(或者最小)放大的情况下对靶标进行成像；以及使用成像分析对靶标进行计数。
本发明允许在盒装置中同时进行上文所概述的处理步骤。单个随机存取仪器可以同时处理含有不同类型的患者样本的不同诊断应用的多个测试盒。本发明的仪器和盒的自动化性质允许由没有重大专业培训的医疗专业人员操作。另外，被设计成与仪器一起工作的专用盒的潜在测试菜单的广度提供了减少台式空间的潜力，从而允许更节省成本地利用设施，并且当感染可能产生最大影响时使近患者诊断测试能够为接近感染发作的临床医生提供可能挽救生命的诊断信息。
专用盒可以预装载有测试试剂。优选地，盒可以在制造期间与所需测试试剂一起组装和包装并且被分配成使得用户仅需添加待测试的样本(例如，来自患者的呼吸样本)并且将该盒插入到仪器中。在一些情况下，可以预富集待测试样本，如血液样本。例如，血液样本可以在分析之前通过培养经历预富集，因为许多血液感染在不预富集的情况下由于病原体细胞浓度太低而不能直接进行测试。
盒可以预装载有荧光探针和试剂以鉴定和定量靶细胞或分子。例如，为了使用基于FISH的方法检测细胞，盒可能含有用于透化靶细胞的预装载的试剂、杂交试剂、荧光靶特异性寡核苷酸探针和靶结合性磁性颗粒。除了用于基于FISH的方法的试剂之外，AST盒可以含有微生物介质和抗微生物剂以促进差异生长，以便在差异生长之后对靶细胞进行定量。
在本发明的优选实施例中，盒用于抗微生物剂敏感性测试，并且将样本分配到含有营养生长培养基的单独部分中以促进微生物细胞复制或生长。这些部分中的一个或多个部分可以用作参考或基线部分，在促进生长的温度下温育之前对该参考或基线部分直接进行处理和分析以确定病原体细胞的数量和质量。可以在促进病原体细胞生长的温度下温育这些部分中的一个或多个部分以确定这些病原体细胞是否存活。其它部分各自另外含有在特定浓度下的一种或多种抗微生物剂并且被温育以确定抗微生物剂对病原体细胞复制的影响。
盒可以与仪器介接，该仪器可操作以操纵盒内的样本、在盒内温育并且执行所需处理和成像步骤，使得用户仅需要将样本装载到盒中并接收结果。盒可以含有针对特异性微生物特异性选择的生长培养基和抗微生物剂，使得当怀疑特异性感染(如大肠杆菌)时，用户可以选择预装载有大肠杆菌特异性试剂(例如，培养基、抗微生物剂和FISH探针)的适当盒。通过预装载有所有所需试剂的AST特异性盒、具有用于执行测定步骤的单独站的自动化仪器和仪器内对其的随机访问以及对多个盒和测定的计算机化调度和操纵，本发明的系统和方法可以自动且同时运行仅需要样本输入并在定点照护环境中提供可执行结果的各种测定。盒和相关联的仪器的自动化性质允许由没有重大专业培训的医疗专业人员操作。
可以在制造期间向盒提供所需试剂并且将盒分配到定点照护设施，使得用户仅需添加待测试的样本(例如，来自患者的血液样本)并且将该盒插入到仪器中。根据正在执行的测定，本文所描述的仪器使用各种不同站来执行定位在用于接收、储存测定专用盒并在站之间转移测定专用盒的转盘周围的不同测定步骤。
盒可以包含用于接收样本和多个预装载有不同抗微生物剂的分配孔或温育孔的样本室。盒还可以包含多个成像孔，其中每个成像孔对应于单个分配孔。成像孔可以含有必需试剂，这些必需试剂用于在存在各种药剂的情况下在温育之后对靶微生物进行处理和成像以提供其差异生长分析并确定针对感染有特异性靶微生物的患者的最有效治疗。
样本室、分配孔或温育孔以及成像孔可以通过一系列通道和阀(如安置在分配孔与成像孔之间的滑杆)彼此联接。该杆可以包含竖直通道并且可水平滑动，使得通道可以与分配孔的出口通道和对应成像孔的入口通道对准以在其间产生流体通路。当在任一方向上水平滑动时，该杆的通道可能变得不与孔对准，由此将其隔离并防止其中的流体连通。阀可以由如本文所描述的仪器在外部操纵，取决于待执行的测定步骤。
盒可以包含用于联接到气动源的气动或其它接口以在盒内施加压力梯度，以便在各个隔室之间移动样本。当结合阀操纵时，气动源可以用于打开盒内的各个隔室之间的通道并且引导样本流体穿过打开的通道。
本发明的盒可由本文所描述的仪器操作，这些仪器使用各种不同站对上文所述的本发明的盒执行不同测试步骤。根据正在执行的测试，可以将站定位在用于接收、储存专用盒并在站之间转移专用盒的转盘周围。站可以包含用于与盒介接并操纵其中的样本和试剂的流控站、用于将靶标磁性地沉积在盒的成像孔的检测表面上的磁性选择站、用于检测样本中所沉积的靶标的成像站以及用于处置用过的盒的废物站。
在优选实施例中，测试在所有步骤中使用恒定温度或循环温度或被修改成使得仪器的内部可以维持在所需温度下，并且转盘可以充当温育步骤的储存站。该温度可以是生理温度或者可以低于或高于生理温度。
操作盒的仪器可以使用转盘来访问不同站，使得测试步骤可以按照顺序并利用各种类型的测试所需的定时来执行。对仪器中的各种站的精确计算机调度和计算机控制访问用于自动执行各种测试的所有步骤，而不需要另外的用户输入。在将盒装载到仪器中之后，用户的下次交互可以在仪器处或远程接收或查看测试结果。根据测试类型，平台自动分析的所报告的结果可能指示检测到感染；检测、鉴定和定量病原体、毒素、生物标志物或诊断信息性宿主细胞；或抗微生物剂敏感性结果和特性。一些测试应用对相同仪器运行上的相同盒中的单个样本执行不同类型的测量。在这种情况下，可以报告单个测试的多种类型的结果。
可以用一个或多个条形码或其它标识符标记该盒，该一个或多个条形码或其它标识符可以由人读取或由自动化仪器自动读取以将患者、测试专用或出厂信息与盒相关联。该仪器还可以使用该输入来记录和跟踪与被测样本相关联的包含用于报告结果的患者信息的信息。该仪器还可以使用该输入来记录和跟踪与被测样本相关联的包含用于报告结果的患者信息的信息。
用于处理本发明的盒的仪器可以包含计算机，该计算机包括处理器和非暂时性有形存储器并且可操作以调度和控制在仪器内执行的测试并跟踪其中的盒。该计算机可以包含用于提示和接收来自用户的信息并显示结果和状态信息的用户接口。该计算机可以连接到网络并可操作以处理测试结果并通过网络发送到连接的装置。
被设计成操作盒的仪器可以包含用于在转盘之间移动盒的机械输送臂和用于执行所需测试步骤的各个站。在优选实施例中，转盘和站包括槽，该槽的大小被设定成接受盒并将该盒定位在站内。旋转该转盘可以将该转盘槽与相关站中的对应槽对准，并且该机械输送臂可操作以接触该盒的一侧并且沿着对准的槽滑动该盒并使其进入所选站中。该机械输送臂避免抓握该盒并减少与抓握机构相关联的堵塞。该机械输送臂可以包括两个可旋转尖头，该尖头可操作以侧接盒并向其一侧提供推动力。当盒滑动时，转盘和站槽的侧面可以提供侧向引导，从而避免需要抓握机构来移动盒。
预装载盒可以允许控制制造侧上的试剂体积和分配，并且自动化仪器控制测试步骤的执行和其定时。因此，系统和方法可以大大减少用户错误的可能性，从而允许不熟练的工作人员在没有专门培训的情况下进行各种测试并获得可靠且可执行的结果，而没有延误和专门场外测试成本。
在优选实施例中，专用盒包含在存在基于病原体的身份选择的各种抗微生物剂和微生物生长培养的情况下用于测量样本中的病原体的差异生长的微生物特异性抗微生物剂敏感性测试盒。根据本发明，在最少或无样本制备或培养的情况下直接分析患者样本，如尿液、粪便或血液。对根据本发明处理的样本进行鉴定并将其暴露于各种抗微生物剂或其它治疗模式，从而允许选择最有效的治疗。可以在数小时内鉴定微生物感染并确定适当的治疗，从而大大减少对适当靶向疗法的延误并避免用攻击性广谱抗微生物剂进行经验性治疗的需要。本发明允许卫生保健提供者在开始时开出有效的疗法以适当地治疗受感染的患者。因此，本发明提供了改善患者结果和减少抗微生物剂耐药性扩散的机会。
在很少或无样本制备步骤的情况下，盒可以被设计成直接从患者样本(如尿液、痰液或其它呼吸样本、血液、粪便、伤口样本或脑脊髓液)执行感染检测、靶标鉴定和有效治疗确定。例如，将尿液样本直接吸移到盒测试装置中以进行在数小时内完成的病原体鉴定(ID)和抗微生物剂敏感性测试(AST)。这与当前基于培养的方法形成对比，该当前方法需要一天或多天的集落纯化以产生大量纯微生物培养物以进行检测。本发明提供了能够接收和内部处理患者样本以鉴定微生物或细胞和/或确定治疗敏感性和功效的测试装置和仪器，所有这些都在盒测试装置内。可以鉴定样本中的多种靶细胞或病原体，并且可以在单个盒装置中测试对各种抗微生物剂或治疗的敏感性。本发明的测试系统和方法对于样本基质、变异接种物和样本中共生微生物的存在是稳健的。本发明的测试也为多种微生物感染递送准确的结果。
本发明的盒允许对样本进行直接处理和成像以确定本发明的盒装置中的样本中存在的靶细胞的存在和身份。如上所述，处理和成像步骤可以在盒测试装置中与样本一起进行，该盒测试装置几乎不需要盒外的样本制备。通过上述耗时的样本制备技术并使用靶特异性可区分的标记，本发明的系统和方法允许在少至三十分钟或更短时间内鉴定和枚举样本中的靶标。
盒可以用于鉴定引起感染的病原体。例如，本发明的盒可以用于在不需要基于培养的微生物预富集或核酸扩增的情况下直接在患者样本中鉴定和定量病原体。优选的方法通过使用基于荧光原位杂交(FISH)方法与磁性选择组合进行标记在单个反应混合物中枚举一个或多个靶病原体，该磁性选择可以在约30分钟内在本文所述的仪器中的微量滴定板或盒中执行。
本发明的盒可以用于诊断抗微生物剂敏感性测试(AST)，即用于确定哪种抗微生物剂可以预防患者样本中的微生物病原体生长。该信息向临床医生提供了关于应该使用哪种抗微生物剂有效治疗特定患者的感染的信息。
抗微生物剂敏感性测试可以视为是逐步过程。目标是确定一组抗微生物剂的哪些成员对引起患者感染的特定病原体菌株有效。通常，当检测到感染时，首先鉴定病原体的物种。鉴定病原体的物种对于选择抗微生物剂和通常可以用于治疗该物种的剂量是有用的。然而，因为引起该感染的特定病原体菌株可能已经对抗微生物剂中的任何抗微生物剂具有耐药性，因此必须进行抗微生物剂敏感性测试以确定该病原体实际对哪种潜在治疗敏感。
在物种鉴定之后，将来自患者样本的病原体细胞进行分配或等分到含有营养素生长培养基、不同浓度的各种抗微生物剂的一系列液体溶液中。然后，允许等分试样在有助于微生物复制的温度(通常35-37℃)下温育。如果该病原体对抗微生物剂敏感，则该病原体可以正常复制，即在不存在抗微生物剂的情况下病原体细胞的数量会增加，正如其在微生物生长培养基中进行的那样。如果该病原体对抗微生物剂敏感，则该病原体无法复制、更小程度地复制或示出指示抗微生物剂的有效性的形态异常或其它异常。最终，在各种等分试样中评估病原体细胞的复制以确定哪种抗微生物剂是有效的。将一组病原体对一系列抗微生物剂的抗微生物剂敏感性/耐药性结果称为其抗微生物剂敏感性特性。
用于抗微生物剂敏感性测试的常规方法和可以用于在本发明的盒中进行更快速测试的方法两者遵循上述步骤，但是可以由本发明使用的方法在若干个小时内确定病原体抗微生物剂敏感性特性，而常规方法需要若干天。使用本发明的方法的快速抗微生物剂敏感性测试结果产生于新方法直接测试患者样本的能力，而无需耗时的基于培养的预富集生长以实现高浓度的纯细胞。该富集和纯化最常见地在培养皿上使用集落纯化进行。
对于常规方法，首先使用生化、微生物、核酸方法或基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)对在集落纯化之后回收的细胞进行鉴定。一旦知道病原体物种的身份，就可以选择适当的抗微生物剂和浓度，该适当的抗微生物剂和浓度适于确定该物种的病原体的抗微生物剂敏感性特性。
由本发明的盒使用的方法的若干新颖方面允许直接从患者样本快速递送抗微生物剂敏感性结果。
首先，患者样本通常含有的细胞比传统抗微生物剂敏感性测试所需的细胞少几个数量级。与当前培养-预富集依赖性方法相比，盒可以通过使用非放大数字成像进行敏感单细胞计数来枚举少量的病原体细胞。此外，因为该方法枚举少量单独细胞，因此该方法可以非常迅速地-仅在几代细菌中-确定含有抗微生物剂和生长培养基的等分试样中的细胞数量是否增加。
其次，患者样本含有样品基质和与传染性病原体不相关的共生微生物。常规方法的指南(如来自临床实验室标准研究所(Clinical Laboratories Standards Institute)或欧洲抗微生物剂敏感性测试委员会(European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing)要求由集落在皮氏培养皿中在基于琼脂的生长培养基上克隆生长产生的经过纯化的培养细胞。这些细胞仅含有单个微生物物种且没有样品基质。
如上所述，必须知道病原体物种的身份以便正确解释抗微生物剂敏感性测试结果以得出有效的临床治疗选项。这是为什么常规和最新兴的抗微生物剂敏感性测试方法需要细胞的纯培养物的潜在的关键原因。
如上所述，为了确定抗微生物剂敏感性特性，常规的和最新兴的方法评估不同浓度下的不同抗微生物剂对靶病原体生长的影响。为什么这些方法需要所鉴定的纯细胞群来解释抗微生物剂敏感性测试结果的原因是这些方法使用非特异性方法(例如，光散射或显微镜检查)来评估含有抗微生物剂的等分试样的生长。考虑到如果存在多于一个物种的情况，例如为人微生物组的一部分的正常微生物的病原体和物种-这是大多数主要患者样本的情况。如果在含有抗微生物剂的等分试样中观察到生长，则使用用于检测生长的一般方法将不可能判定致病病原体或共生物种中的一种或多种是否具有耐药性和生长能力。
与常规方法和需要经过纯化的病原体细胞的其它方法相比，因为这些方法使用非特异性方法来检测病原体是否在存在抗微生物剂的情况下生长，在本发明的盒中部署的方法使用病原体特异性检测来评估抗微生物剂中的病原体的生长。因为在温育步骤之后仅枚举了致病病原体细胞(没有枚举任何共生微生物)，因此本发明的方法可以用于直接确定含有一种或多种共生微生物物种的非灭菌原始样本中的抗微生物剂敏感性。
盒装置可以用于鉴定靶细胞或微生物，并且单独地或在相同盒内测试样本中的靶标的抗微生物剂敏感性。在本发明的优选实施例中，测试装置内部将样本分为单独的部分，其中这些部分中的一些部分可以在成像之前在存在各种抗微生物剂的情况下温育以确定差异生长。可以对这些部分中的一个或多个部分直接进行处理和成像以提供基线参考，以便确定温育部分的生长、生长抑制或形态变化。通过对在各种抗微生物剂中温育的部分的生长进行定量，可以确定每种抗微生物剂在减少或预防靶标生长方面的有效性。通过观察靶细胞计数或细胞形态的变化，可以确定治疗的有效性。
本文所述的盒和操作其的仪器能够鉴定和测试药剂对不同类别的靶标(例如，病毒、人细胞、细菌细胞或真菌细胞)的功效，并且还同时在单个装置中对多个不同靶标执行此类鉴定和抗微生物剂敏感性测试，由此允许开发执行通常由设计用于不同测试应用(例如，血液、泌尿道、胃肠道和呼吸道感染)的多个测试装置执行的测试的单个仪器。因此，通过本文所述的盒和操作其的仪器提供了稳健功能。
本发明的盒用于直接从患者样本快速递送抗微生物剂敏感性结果。患者样本通常含有的细胞比传统抗微生物剂敏感性测试所需的细胞少几个数量级。与当前培养-预富集依赖性方法相比，使用本发明的盒，可以使用非放大数字成像通过敏感单细胞计数来枚举少量病原体细胞。此外，因为枚举了少量单独细胞，因此本发明可以非常迅速地-仅在几代细菌中-确定含有抗微生物剂和生长培养基的等分试样中的细胞数量是否增加。
一旦鉴定了靶标，抗微生物剂敏感性测试可以包含与该靶标相关的抗微生物剂或治疗(例如，通常在治疗中使用或已知抑制所鉴定的靶标生长的那些抗微生物剂或治疗)。如前所述，该靶细胞或微生物的鉴定对于确定适合的靶特异性疗法可能是重要的。可以使用如在本文所述的抗微生物剂敏感性测试方法中使用的相同处理和成像技术来执行鉴定，并且可以使用用于差异生长或治疗功效分析的相同类型的盒装置、仪器和方法来执行鉴定。在某些实施例中，可以在相同装置中对相同样本(被分成单独部分)执行鉴定和治疗敏感性测试。还可以使用没有落入本发明的范围内的其它技术(如利用靶特异性引物进行扩增、免疫测定、质谱法、核酸测序或寡核苷酸探针阵列分析)来执行靶标鉴定。如果鉴定是单独执行的，则本发明的盒可以用作含有适当试剂的抗微生物剂敏感性测试装置，并且可以根据本发明使用针对所鉴定的病原体的抗微生物剂。
根据靶病原体，在存在各种抗微生物剂的情况下检测差异生长可能需要不同的时间量，但是大大减少了标准抗微生物剂敏感性测试技术所需的天数。例如，可以使用本发明的技术在约4小时或更短时间之后观察尿液样本中的通常与泌尿道感染相关联的微生物的差异生长。如上所述，鉴定和定量样本中的微生物可以在三十分钟或更短时间内完成，由此允许在将该样本引入到测试装置之后的数小时内获得抗微生物剂敏感性测试结果。
在某些实施例中，盒装置的测试套件可以用于综合征感染(例如，肺炎或泌尿道感染)的鉴定(ID)和抗微生物剂敏感性测试(AST)。被称为ID/AST测试套件的此类测试套件可以包括ID盒和AST盒的感染特异性家族，这些盒中的每个盒都含有用于测试单独病原体或病原体的相关组的适当抗微生物剂。例如，泌尿道感染(UTI)测试套件可以包括UTI ID盒和UTI AST盒家族。
此类感染特异性测试套件中的ID盒可以检测感染并鉴定和定量该样本中的一种或多种传染性病原体的生物负荷或浓度。相同盒还可以同时在相同装置上测试该样本的诊断信息性标志物，该诊断信息性标志物包含宿主应答生物标志物(例如，细胞因子)和炎性细胞(例如，中性粒细胞)或样品质量的细胞标志物(例如，鳞状上皮细胞)。组合检测和定量相同样本、盒和仪器中的病原体、生物标志物和诊断信息性宿主细胞的能力是本发明的系统和方法的新颖且潜在强大的优势。
如果检测到感染并且使用ID盒(或除了本发明的方法之外的替代性鉴定方法)鉴定了病原体，则将从AST盒家族中选择AST盒以进行AST分析。选择用于分析的AST盒将含有可以用于治疗特定病原体的适当抗微生物剂和用于枚举该特定病原体的适当FISH试剂。
然后使用本发明的盒获得的抗微生物剂敏感性测试结果用于确定该传染性病原体的抗微生物剂敏感性特性并通知患者治疗决定，使得可以用有效的抗微生物剂治疗该患者。
并入本发明的盒中的用于特异性检测和定量靶细胞的可检测标记可以包含靶特异性荧光寡核苷酸探针(包含包括经过修饰的核苷酸或核苷酸类似物的探针)、荧光抗体、特异性和非特异性配体、凝集素、染色剂或与靶标结合的染料。在某些实施例中，磁性标签与该可检测标记组合使用以在磁性选择靶微生物并对这些靶微生物进行成像之前与这些靶微生物结合。分离可以在如本文所描述的测试装置内发生，并且磁场可以用于将经过标记的微生物沉积在待成像的测试装置中的检测表面上。在某些实施例中，如在通过引用并入本文中的美国专利第9,643,180号中所描述的染料垫层可以用于分离和成像步骤中，以最小化或消除用户的样本制备步骤、消除洗涤步骤并减少背景信号。如在美国专利第9,643,180号和美国专利第8,021,848号中所描述的数字、非放大成像技术可以用于对包含例如单细胞的经过标记的微生物进行定量，这些美国专利中的每一个通过引用并入本文中。
本发明的盒可以被设计成实施用于确定抗微生物剂敏感性的方法。此类方法优选地包含从疑似患有综合征感染的患者中获得样本的步骤，其中该样本类型将可能含有一种或多种传染性病原体。然后将该样本引入到盒中，分成多个等分试样。立即对一个等分试样进行分析以确定温育之前病原体细胞的基线浓度。对于该等分试样，对病原体细胞进行荧光标记、磁性标记、吸引通过该染料垫并沉积在该盒中的成像孔的该成像表面上、成像并使用图像分析进行定量。在存在生长培养基和各种抗微生物剂的情况下，将其它等分试样在35℃下温育，所有都在该盒内。在存在各种抗微生物剂的情况下差异生长之后，对病原体细胞进行荧光标记、磁性标记、吸引通过染料垫并沉积在该盒中的成像孔的成像表面上、成像并使用图像分析进行定量。将所枚举的含有抗微生物剂的等分试样中的病原体细胞的数量与最初枚举的病原体细胞的数量(温育之前)进行比较以确定抗微生物剂敏感性特性以及哪种抗微生物剂对于治疗该患者将是有效的。
本发明的方法可以包含：检测感染并在将样本引入到盒中之前检测和鉴定传染性病原体细胞；以及基于靶细胞或微生物的身份选择多种不同抗微生物剂。靶病原体的鉴定优选地包含：将来自患者的第一样本暴露于可以与第一靶标结合的磁性标签和荧光标记，使得特异性地形成包括磁性标记和荧光标记的靶标的复合物。向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以检测和定量该可检测标记，其中可检测标记的存在和浓度指示是否存在靶病原体以及存在多少该靶病原体。该检测步骤可以花费小于约30分钟。
对于被设计成用于抗微生物剂敏感性测试应用的盒，可以在如上文所述的差异生长之后对该靶病原体细胞进行检测。
本发明的盒可以使用类似策略来检测和定量亚细胞靶标(例如，毒素、生物标志物、宿主应答因素、病毒特异性分子或病毒颗粒)。靶特异性磁性标签和荧光标记优选地用于与此类靶标结合以形成复合物。本发明的系统和方法用于通过成像和图像分析将这些复合物沉积在成像表面上以进行枚举。用于检测亚细胞靶标的靶特异性磁性标签和荧光标记优选地是与靶特异性结合剂(例如，抗体、适体、受体、配体)缀合的磁性颗粒和荧光颗粒。磁性标记和荧光标记的靶复合物的特异性形成以不同方式出现。磁性标签或荧光标记可以被设计成与靶标特异性地结合。可替代地，磁性标签和荧光标记两者可以被设计成与靶标特异性地结合。在任一情况下，与磁性选择的复合物的成像组合的磁性选择导致检测和枚举样本中的特异性靶标。存在各种机构，磁性标签和荧光标记可以通过各种机构与靶标相关联。
有各种磁性标签或荧光标记可以与靶标特异性地结合的方式。例如，可以通过将磁性标签或荧光标记与和那些位点结合的部分(例如，抗体或其它蛋白结合配偶体、凝集素或配体)缀合来实现在各种类别的靶标中与保守位点结合的结合磁性标签或荧光标记。磁性标签或荧光标记还可能由于通用化学或胶体属性而非特异性地结合。例如，带正电荷的磁性颗粒或荧光标记可以非特异性地与细菌细胞结合，这些细菌细胞通常是带负电荷的。可以通过各种染料(例如，荧光增白剂(calcofluor))或荧光染料(例如，碘化丙啶、荧光素二乙酸酯)非特异性地标记细胞。经过染色的荧光颗粒可以用作荧光标记，这些荧光标记借助于其化学或胶体属性或通过将其与如上文所述的那些非特异性结合分子结合而与靶细胞非特异性地结合。
还可以以各种方式选择磁性标签或荧光标记，使得其与靶标特异性地结合。例如，可以将磁性标签(或荧光团)与和靶特异性抗原结合的抗体缀合。为了类似的效果，可以将磁性标签或荧光团与和配体(例如，生物素)特异性结合的分子(例如，亲和素)缀合，该配体与(或可以与)此类靶特异性抗体结合。还可以通过与本身用荧光团标记的靶特异性核酸探针(或核酸类似物探针)重新关联或杂交来特异性地标记细胞。经过染色的荧光颗粒可以用作荧光标记，这些荧光标记通过将其与如针对某些实施例所述的那些靶特异性结合分子缀合而与靶细胞特异性地结合，标记和成像步骤包含：将样本部分暴露于荧光团标记的靶特异性结合分子和磁性颗粒，其中荧光团标记的靶特异性结合分子和磁性颗粒与靶标结合，从而形成复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像。荧光团标记的靶特异性结合分子可以包含与该靶细胞特异性结合的寡核苷酸探针。暴露和成像步骤可以包含荧光原位杂交(FISH)方法和分析。
盒和相关联的方法可操作以确定用于治疗患者感染的推荐抗微生物剂，该推荐抗微生物剂通常包括确定抑制靶标生长的抗微生物剂或其它治疗。确定抑制靶标生长的治疗可以在将样本引入到测试装置中之后若干个小时(例如，约4小时)内发生。人体样本可以是组织样本(例如，伤口或活检样本)或体液样本。与本发明一起使用的优选体液包含但不限于呼吸(例如，痰、气管内抽吸物、防污染样本刷、支气管-肺泡灌洗)、血液、尿液、粪便、拭子(例如，鼻拭子、口/咽拭子、外科手术部位拭子、皮肤拭子和软组织拭子、直肠拭子)和脑脊髓液。
在某些方面，本发明的盒可操作以确定样本中的靶细胞或微生物的治疗敏感性。此类盒可以接收来自患者和靶细胞或微生物的体液以及仪器或仪器的样本。该仪器优选地可操作以操纵测试装置以在该测试装置内将样本分成多个部分；在存在多种不同治疗剂的情况下在该测试装置内温育这些部分；荧光标记和磁性标记该测试装置内的经过温育的部分内的靶细胞；将磁性标记和荧光标记的靶复合物与未经结合的荧光标记分离；并且在该测试装置内对这些部分进行成像以定量靶复合物，以便确定哪种治疗抑制靶细胞复制。
系统可以包括用于微生物应用的可以用于检测感染并鉴定病原体的盒测试装置。可以将患者样本添加到装置，在该装置中，该患者样本可以被分成多个等分试样，该多个等分试样中的每个等分试样可以与磁性标签和多种类型的靶特异性可检测标记接触(例如，使分子与不同的荧光团标记结合)，使得形成了经过标记的磁性标记靶复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；并且对该检测表面进行成像以检测经过标记的复合物，其中在特定等分试样中检测到标记有特定可检测标记的复合物指示存在特定靶标。
该盒可由仪器操作以使样本等分试样与各种抗微生物剂接触以进行抗微生物剂敏感性应用；将含有样本的等分试样或部分与所选磁性标签和可检测标记接触，使得利用靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；对该检测表面进行成像；并且执行图像分析以确定测试结果。
在本发明的盒中，检测经过温育的样本中的每个样本中的所鉴定的靶细胞或微生物的数量可以包含：接触经过温育的样本磁性标签和所选可检测标记，使得利用靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向该复合物施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以确定治疗剂中的每种治疗剂对所鉴定的靶标中的每个靶标的生长的影响。
多个等分试样可以与不同浓度的相同抗微生物剂组合，该不同浓度优选地对应于该抗微生物剂的2倍系列稀释液或对应于与抗微生物剂敏感性测试的CLSI断点相对应的浓度。可以选择此类部分和浓度的抗微生物剂的数量以便递送敏感/耐药性结果、分类(敏感、中等耐药性、耐药性或SIR结果)或最小抑制浓度(MIC)结果。临床实验室标准协会(CLSI)记录了用于特异性微生物病原体物种的抗微生物剂的相关浓度。
根据本发明的盒可以用于消除用于产生大量经过纯化的细胞的常规方法所需的耗时步骤。这些盒预装载有试剂以执行抗微生物剂敏感性测试(AST)和FISH测试。与常规方法所需的天数相比，本发明的盒用于在若干个小时内检测感染、鉴定感染性病原体和有效抗微生物剂。通过检测感染并鉴定更接近症状发作的有效针对性抗微生物剂，本发明可以极大地改善医疗结果并使用引起耐药性的广谱抗生素进行的经验治疗最小化。
具体地，本发明的盒用于直接从患者样本快速递送抗微生物剂敏感性结果。患者样本通常含有的细胞比传统抗微生物剂敏感性测试所需的细胞少几个数量级。与当前培养-预富集依赖性方法相比，使用本发明的盒，可以使用非放大数字成像通过敏感单细胞计数来枚举少量病原体细胞。此外，因为枚举了少量单独细胞，因此本发明可以非常迅速地-仅在几代细菌中-确定含有抗微生物剂和生长培养基的等分试样中的细胞数量是否增加。
此外，患者样本含有样品基质和与传染性病原体不相关的共生微生物。常规方法的指南(如来自临床实验室标准研究所(Clinical Laboratories Standards Institute，CLSI)或欧洲抗微生物剂敏感性测试委员会(European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing，ECAST)要求由集落在培养皿中在基于琼脂的生长培养基上克隆生长产生的经过纯化的培养细胞。这些细胞仅含有单个微生物物种且没有样品基质。
如上所述，必须知道病原体物种的身份以便正确解释抗微生物剂敏感性测试结果以得出有效的临床治疗选项。这是为什么常规和最新兴的抗微生物剂敏感性测试方法需要细胞的纯培养物的潜在的关键原因。为了确定抗微生物剂敏感性特性，常规的和最新兴的方法评估不同浓度下的不同抗微生物剂对靶病原体生长的影响。为什么这些方法需要所鉴定的纯细胞群来解释抗微生物剂敏感性测试结果的原因是这些方法使用非特异性方法(例如，光散射或显微镜检查)来评估含有抗微生物剂的等分试样的生长。考虑到如果存在多于一个物种的情况，例如为人微生物组的一部分的正常微生物的病原体和物种-这是大多数主要患者样本的情况。如果在含有抗微生物剂的等分试样中观察到生长，则使用用于检测生长的一般方法将不可能判定致病病原体或共生物种中的一种或多种是否具有耐药性和生长能力。
与常规方法和需要经过纯化的病原体细胞的其它方法相比，因为这些方法使用非特异性方法来检测病原体是否在存在抗微生物剂的情况下生长，本发明使用病原体特异性检测来评估在存在各种抗微生物剂的情况下病原体的生长。因为在温育步骤之后仅枚举了致病病原体细胞(没有枚举任何共生微生物)，因此本发明的盒可以用于直接确定含有一种或多种共生微生物物种的非灭菌原始样本中的抗微生物剂敏感性。
根据本发明的盒可以用于病原体鉴定以确定样本是否含有足够数量的怀疑引起感染的病原体物种的细胞。根据本发明的盒可以用于抗微生物剂敏感性测试以确定一种或多种抗微生物剂中的哪种抗微生物剂可以预防怀疑引起感染的病原体在患者样本中的正常细胞复制。这种抗微生物剂可以潜在地用于有效治疗患者的感染。
盒包含各种分配孔或温育孔，这些分配孔或温育孔可以预装载有生长培养基和各种抗微生物剂，使得单个样本可以添加到盒中并在孔之间进行分配以允许在存在各种药剂的情况下温育存在于样本中的靶微生物。在温育之后，可以使用例如荧光原位杂交(FISH)对样本进行处理和成像以提供差异生长分析，以便确定靶微生物对各种抗微生物剂的敏感性。AST可以在恒定生理温度下使用FISH。使用FISH方案，盒可用于微生物鉴定测试或抗生素敏感性测试。对使用本公开的盒研究的临床样本进行温育，并且在与患者温度相匹配的温度下执行测试，因此在患者中生长的相关感染性细菌继续在盒中生长。
盒预装载有荧光探针和使微生物化学地透化的试剂，使得可以在不显著加热到高于体温的情况下对病原体细菌进行荧光标记和成像。因为FISH方案在生理温度下执行，因此不将临床样本暴露于促进临床误导细菌生长模式的热极端条件。盒被设计成在无需任何所需样本制备的情况下直接从患者样本(如粪便或尿液)进行微生物鉴定或敏感性测试。盒和相关联的读取器仪器在几小时内提供测试结果，从而向临床医生提供迅速且容易地鉴定感染原因或哪种抗生素治疗将有效的能力。
在本发明的优选实施例中，盒用于抗微生物剂敏感性测试，并且将样本分配到含有营养生长培养基的单独部分中以促进微生物细胞复制或生长。这些部分中的一个或多个部分可以用作参考或基线部分，在促进生长的温度下温育之前对该参考或基线部分直接进行处理和分析以确定病原体细胞的数量和质量。可以在促进病原体细胞生长的温度下温育这些部分中的一个或多个部分以确定这些病原体细胞是否存活。其它部分各自另外含有在特定浓度下的一种或多种抗微生物剂并且被温育以确定抗微生物剂对病原体细胞复制的影响。
盒可以与仪器介接，该仪器可操作以操纵盒内的样本、在盒内温育并且执行所需处理和成像步骤，使得用户仅需要将样本装载到盒中并接收结果。盒可以含有针对特异性微生物特异性选择的生长培养基和抗微生物剂，使得当怀疑特异性感染(如大肠杆菌)时，用户可以选择预装载有大肠杆菌特异性试剂(例如，培养基、抗微生物剂和FISH探针)的适当盒。通过预装载有所有所需试剂的AST特异性盒、具有用于执行测定步骤的单独站的自动化仪器和仪器内对其的随机访问以及对多个盒和测定的计算机化调度和操纵，本发明的系统和方法可以自动且同时运行仅需要样本输入并在定点照护环境中提供可执行结果的各种测定。盒和相关联的仪器的自动化性质允许由没有重大专业培训的医疗专业人员操作。
可以在制造期间向盒提供所需试剂并且将盒分配到定点照护设施，使得用户仅需添加待测试的样本(例如，来自患者的血液样本)并且将该盒插入到仪器中。根据正在执行的测定，本文所描述的仪器使用各种不同站来执行定位在用于接收、储存测定专用盒并在站之间转移测定专用盒的转盘周围的不同测定步骤。
盒可以包含用于接收样本和多个预装载有不同抗微生物剂的分配孔或温育孔的样本室。盒还可以包含多个成像孔，其中每个成像孔对应于单个分配孔。成像孔可以含有必需试剂，这些必需试剂用于在存在各种药剂的情况下在温育之后对靶微生物进行处理和成像以提供其差异生长分析并确定针对感染有特异性靶微生物的患者的最有效治疗。
样本室、分配孔以及成像孔可以通过一系列通道和阀(如安置在分配孔与成像孔之间的滑杆)可选择地彼此联接。该杆可以包含竖直通道并且可水平滑动，使得通道可以与分配孔的出口通道和对应成像孔的入口通道对准以在其间产生流体通路。当在任一方向上水平滑动时，该杆的通道可能变得不与孔对准，由此将其隔离并防止其中的流体连通。阀可以由如本文所描述的仪器在外部操纵，取决于待执行的测定步骤。
盒可以包含用于联接到气动源的气动或其它接口以在盒内施加压力梯度，以便在各个隔室之间移动样本。当结合阀操纵时，气动源可以用于打开盒内的各个隔室之间的通道并且引导样本流体穿过打开的通道。
用于接收和操纵盒的仪器可以使用转盘来随机访问不同站，使得可以执行多个测试。对仪器中的各种站的精确计算机调度和随机计算机控制访问用于自动执行各种测定的所有步骤，而不需要另外的用户输入。在将盒装载到仪器中之后，用户的下次交互可以是在仪器处或远程接收或查看测定结果。结果可能与从经过处理的样本获得的图像一样简单，或者可以包含自动解读，如各种抗微生物剂的微生物鉴定和敏感性评分。
站可以包含：用于与盒介接并操纵其中的样本和试剂的流控模块；用于磁性选择靶标的磁性下拉站；用于处置用过的盒的废物站；用于分析经过测定的样本的成像站；用于维持如各种测定步骤所需的盒上样本和试剂的温度的温育站；以及用于处置用过的盒的废物站。在优选实施例中，测定在所有步骤中使用恒定温度或被修改成使得仪器的内部可以维持在所需温度下，并且转盘可以充当温育步骤的储存站。
仪器可以读取盒上的代码或标签或从用户接收输入以确定待对任何给定盒执行的测定和针对该测定的所需步骤。该仪器还可以使用该输入来记录和跟踪与被测样本相关联的包含用于报告结果的患者信息的信息。
仪器可以包含计算机，该计算机包括处理器和非暂时性有形存储器并且可操作以调度和控制在仪器内执行的测定并跟踪其中的盒。该计算机可以包含用于提示和接收来自用户的信息并显示结果和状态信息的用户接口。该计算机可以连接到网络并可操作以处理测定结果并通过网络发送到连接的装置。
本发明的仪器可以包含用于在转盘之间移动盒的机械输送臂和用于执行所需测定步骤的各个站。在优选实施例中，转盘和站包括槽，该槽的大小被设定成接受盒并将该盒定位在站内。旋转该转盘可以将该转盘槽与相关站中的对应槽对准，并且该机械输送臂可操作以接触该盒的一侧并且沿着对准的槽滑动该盒并使其进入所选站中。该机械输送臂避免抓握该盒并减少与抓握机构相关联的堵塞。该机械输送臂可以包括两个可旋转尖头，该尖头可操作以侧接盒并向其一侧提供推动力。当盒滑动时，转盘和站槽的侧面可以提供侧向引导，从而避免需要抓握机构来移动盒。
预装载盒允许控制制造侧上的试剂体积和分配，并且自动化仪器控制测定步骤的执行和其定时。因此，系统和方法可以大大减少用户错误的可能性，从而允许不熟练的工作人员在没有专门培训的情况下进行各种测定并获得可靠且可执行的结果，而没有延误和专门场外测试成本。
在优选实施例中，测定特异性盒包含微生物特异性AST盒，该微生物特异性AST盒用于在存在基于样本微生物选择的各种抗微生物剂的情况下样本微生物的差异生长。所描述的技术和系统的稳健性质也允许对非微生物靶标(如癌细胞或其它细胞)进行分析。例如，本发明可用于确定治疗功效、耐药性监测(关于抗微生物剂和其它化疗剂两者)和治疗选择。根据本发明，在最少或无样本制备或培养的情况下直接分析患者样本，如尿液、粪便或血液。对根据本发明处理的样本进行鉴定并将其暴露于各种抗微生物剂或其它治疗模式(例如，针对癌细胞的化学疗法)，从而允许选择最有效的治疗。可以在数小时内鉴定微生物感染并确定适当的治疗，从而大大减少对适当靶向疗法的延误并避免用攻击性广谱抗微生物剂进行经验性治疗的需要。本发明允许卫生保健提供者在开始时开出有效的疗法以适当地治疗受感染的患者。因此，本发明提供了改善患者结果和减少抗微生物剂耐药性扩散的机会。使用本发明的系统和方法监测其治疗的癌细胞或其它细胞和治疗功效允许快速鉴定最有效的治疗并且进一步允许在开发治疗耐药性时及时干预。
在很少或无样本制备步骤的情况下，直接从患者样本(如唾液、尿液、血液、粪便、拭子或脑脊髓液)实现感染检测、靶标鉴定和有效治疗确定。例如，将尿液样本直接吸移到测试装置中以进行在数小时内完成的鉴定(ID)和抗微生物剂敏感性测试(AST)。这与当前基于培养的方法形成对比，该当前方法需要一天或多天的集落纯化以产生大量纯微生物培养物以进行检测。本发明提供了能够接收和内部处理患者样本以鉴定微生物或细胞和/或确定治疗敏感性和功效的测试装置和仪器，所有这些都在测试装置内。可以鉴定样本中的多种靶细胞或病原体，并且可以在单个装置中测试对各种抗微生物剂或治疗的敏感性。本发明的测试系统和方法对于样本基质、变异接种物和样本中共生微生物的存在是稳健的。本发明的测试也为多种微生物感染递送准确的结果。
本发明的系统和方法提供经过标记的微生物靶细胞的图像，这些图像允许跟踪差异生长、形态学或其它可观察变化以确定各种疗法的敏感性和有效性。对样本直接进行处理和成像以确定存在于样本中的靶细胞、微生物或病原体的存在和身份。如上所述，处理和成像步骤在测试装置(如盒)中与样本一起进行并且在测试装置外几乎不需要样本制备。通过上述耗时的样本制备技术并使用靶特异性可区分的标记，本发明的系统和方法允许在三十分钟或更短时间内鉴定和枚举样本中的靶标。
还可以在存在抗微生物剂或各种类型的其它治疗的情况下在成像之前在各种浓度下温育样本。温育可以在相同测试装置中发生，其中处理和成像步骤发生或在不同测试装置中。
本发明的系统和方法可以用于鉴定靶细胞或微生物，并且(单独地或在相同装置内)测试样本中的靶标的治疗功效或抗微生物剂敏感性。在本发明的优选实施例中，测试装置内部将样本分为单独的部分，其中这些部分中的一些部分可以在成像之前在存在各种抗微生物剂的情况下温育以确定差异生长。可以对这些部分中的一个或多个部分直接进行处理和成像以提供基线参考，以便确定经过温育的部分的生长、细胞毒性或形态变化。通过对在各种抗微生物剂或其它治疗剂中温育的部分的生长进行定量，可以确定每种抗微生物剂在减少或预防靶标生长方面的有效性。
如本文所述的测试装置和仪器不仅能够鉴定和测试药剂对不同类别的靶标(例如，病毒、人细胞、细菌细胞或真菌细胞)的功效，而且如通过以下描述显而易见的能够同时通过选择和操纵单个仪器中的被设计用于不同测试应用(例如，血液感染和呼吸道感染)的单个装置和多个测试装置中的多个不同靶标来执行此类鉴定和治疗测试。因此，通过本文所述的仪器和测试装置提供了稳健功能。
一旦鉴定了靶标，分析可以限于与该靶标相关的抗微生物剂或治疗(例如，通常在治疗中使用或已知抑制所鉴定的靶标生长的那些抗微生物剂或治疗)。如前所述，该靶细胞或微生物的鉴定允许选择性地暴露于靶特异性疗法。如此，在开始AST或治疗功效测试之前，初始鉴定步骤是优选的。可以使用如在本文所述的AST方法中使用的相同处理和成像技术来执行鉴定，并且可以使用用于差异生长或治疗功效分析的相同类型的装置、仪器和方法来执行鉴定。在某些实施例中，可以在相同装置中对相同样本(被分成单独部分)执行鉴定和治疗测试。还可以使用其它常规技术(如利用靶特异性引物进行扩增、免疫测定、质谱法或寡核苷酸探针阵列分析)来执行靶标鉴定。如果单独执行鉴定，则可以使用专用差异生长分析装置。与本发明的处理技术和仪器兼容的专用鉴定装置可以停止对温育步骤或储器的需求。
根据测试细胞或微生物，在存在各种抗微生物剂的情况下进行的可观察差异生长将需要不同的时间量，但是大大减少了标准AST技术所需的天数。例如，可以使用本发明的技术在约4小时或更短时间之后观察尿液样本中的通常与泌尿道感染相关联的微生物的差异生长。如上所述，鉴定和定量样本中的微生物可以在三十分钟或更短时间内完成，由此允许在将该样本引入到测试装置之后的数小时内获得AST结果。在某些实施例中，提供了含有对各种靶细胞或微生物具有特异性的抗微生物剂或其它治疗剂的子集的AST或治疗功效测试装置，使得技术人员可以选择适当的测试装置并且直接将患者样本引入其中以执行相关AST或治疗功效分析。
使用本发明的系统和方法获得的AST结果然后用于鉴定抗微生物剂耐药性并通知患者治疗决策，其中可以用发现最佳抑制AST分析中的靶标的生长或活力的抗微生物剂治疗患者。
可检测标记可以包含结合靶标的荧光寡核苷酸或抗体探针、特异性和非特异性配体、凝集素、染色剂和染料。在某些实施例中，磁性标签与该可检测标记组合使用以在磁性选择靶微生物并对这些靶微生物进行成像之前与这些靶微生物结合。分离可以发生在如本文所述的测试装置内，并且磁场可以用于将经过标记的微生物沉积在该测试装置中的检测表面上以被成像。在某些实施例中，如在通过引用并入本文中的美国专利第9,643,180号中所描述的染料垫层可以用于分离和成像步骤中，以减少背景信号并提供对经过标记的微生物的更准确定量。如在通过引用并入本文中的美国专利第9,643,180号和美国专利第8,021,848号中所描述的数字、非放大成像技术可以用于对包含例如单细胞的经过标记的微生物进行定量。
本发明的方面提供了用于确定对样本中的靶标的抗微生物剂敏感性或其它治疗的其它应答的方法。此类方法优选地包含获得怀疑含有一种或多种类型的靶标的组织或体液样本的步骤。然后将样本引入到测试装置中、分配到多个部分中并且在存在多种不同抗微生物剂的情况下进行温育，所有这些都在测试装置内。对也在测试装置内的经过温育的部分内的靶标进行标记和成像以确定哪些抗微生物剂抑制靶标的生长。
本发明的方法可以包含：在将样本引入到测试装置中之前鉴定靶细胞；以及基于靶细胞或微生物的身份选择多种不同抗微生物剂。靶细胞或微生物的鉴定优选地包含：将来自患者的第一样本暴露于可以与第一靶标结合的磁性标签和荧光标记，使得特异性地形成包括磁性标记和荧光标记的靶标的复合物。向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以检测可检测标记，其中可检测标记的存在指示存在第一靶标。该鉴定步骤可以花费小于约30分钟。
磁性标记和荧光标记的靶复合物的特异性形成以不同方式出现。磁性标签或荧光标记可以被设计成与靶标特异性地结合。可替代地，磁性标签和荧光标记两者可以被设计成与靶标特异性地结合。在任一情况下，与磁性选择的复合物的成像组合的磁性选择导致检测和枚举样本中的特异性靶标。存在各种机构，磁性标签和荧光标记可以通过各种机构与靶标相关联。
有各种磁性标签或荧光标记可以与靶标特异性地结合的方式。例如，可以通过将磁性颗粒(或荧光团)与和保守位点结合的抗体缀合来实现在各种类别的靶标(例如，肽聚糖、LPS或葡聚糖)中磁性颗粒(或荧光团)与该位点的结合。磁性标签或荧光标记还可能由于通用化学属性而非特异性地结合。例如，带正电荷的磁性颗粒或荧光团标记可以非特异性地与细菌细胞结合，这些细菌细胞通常是带负电荷的。可以通过各种染料(例如，荧光增白剂(calcofluor))或荧光染料(碘化丙啶、荧光素二乙酸酯)非特异性地标记细胞。
还可以以各种方式选择磁性标签或荧光标记，使得其与靶标特异性地结合。例如，可以将磁性标签(或荧光团)与和靶特异性抗原结合的抗体缀合。为了类似的效果，可以将磁性标签或荧光团与和配体(例如，生物素)特异性结合的分子(例如，亲和素)缀合，该配体与(或可以与)此类靶特异性抗体结合。还可以通过与本身用荧光团标记的靶特异性核酸探针(或核酸类似物探针)重新关联或杂交来特异性地标记细胞。
在某些实施例中，标记和成像步骤包含将样本部分暴露于靶特异性结合分子、磁性颗粒和可检测标记，其中靶特异性结合分子形成包括靶标、磁性颗粒和可检测标记的复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像。可检测标记可以包含荧光标志物，并且靶特异性结合分子可以包含寡核苷酸探针。暴露和成像步骤可以包含荧光原位杂交(FISH)分析。
本发明的方法可以包含确定针对该患者的推荐抗微生物剂或其它疗法，该推荐抗微生物剂或其它疗法通常包括确定抑制靶标生长的抗微生物剂或其它治疗。确定抑制靶标生长的治疗可以在将样本引入到测试装置中之后少于约4小时发生。人体样本可以是组织样本(例如，来自患者的活检样本)或体液样本。与本发明一起使用的优选体液包含但不限于呼吸(例如，痰、气管内抽吸物、防污染样本刷、支气管-肺泡灌洗)、血液、尿液、粪便、拭子(例如，鼻拭子、口/咽拭子、手术部位拭子、皮肤拭子和软组织拭子、直肠拭子)和脑脊髓液。
在某些方面，本发明提供了用于确定样本中的靶细胞或微生物的治疗敏感性的系统。优选的系统包含：测试装置，该测试装置可操作以接收来自患者和靶细胞或微生物的体液的样本；以及仪器。该仪器优选地可操作以操纵测试装置以在该测试装置内将样本分成多个部分；在存在多种不同治疗剂的情况下在该测试装置内温育这些部分；荧光标记和磁性标记该测试装置内的经过温育的部分内的靶细胞；将磁性标记和荧光标记的靶复合物与未经结合的荧光标记分离；并且在该测试装置内对这些部分进行成像以定量靶复合物，以便确定哪种治疗抑制靶细胞复制。
系统可以进一步包括第一测试装置，该第一测试装置可操作以接收来自患者的第一样本，并且该仪器可进一步操作以将来自患者的第一样本暴露于所选磁性标签和可检测标记，使得与第一靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以检测可检测标记，其中可检测标记的存在指示存在第一靶标。
该仪器可操作以将经过温育的样本部分暴露于所选磁性标签和可检测标记，使得与靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向测试装置施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像。
本发明的方面提供了用于确定样本中的靶细胞或微生物的治疗敏感性的方法。方法可以包含：使用由仪器执行的鉴定测定来鉴定来自患者的第一样本中的一种或多种靶标；基于第一样本中所鉴定的靶细胞或微生物来选择一种或多种治疗剂；在存在这些治疗剂中的每种治疗剂的情况下在仪器内单独温育来自患者的样本；使用仪器检测经过温育的样本中的每一种中的多个靶细胞、CFU、病毒载量、活靶细胞或治疗功效(或治疗影响)的其它指标；以及基于靶标的检测到的量、形态学或其它表型属性确定治疗剂(或治疗)中的每一种对所鉴定的靶标中的每种靶标的敏感性。
鉴定测定可以包含：使第一样本与所选磁性标签和可检测标记接触，使得与靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向该复合物施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以确定复合物的存在，其中复合物的存在鉴定靶标存在于样本中。
检测经过温育的样本中的每个样本中的所鉴定的靶细胞或微生物的量可以包含：接触经过温育的样本磁性标签和所选可检测标记，使得利用靶标、磁性标签和可检测标记特异性地形成复合物；向该复合物施加磁场以将该复合物吸引到检测表面；以及对该检测表面进行成像以确定治疗剂中的每种治疗剂对所鉴定的靶标中的每个靶标的生长的影响。
多个部分可以与以不同浓度存在的相同抗生素组合，优选地对应于抗微生物剂的2倍系列稀释液。以此方式，可以确定抑制靶标生长的抗生素的水平。可以选择此类部分和浓度的抗微生物剂的数量以便递送敏感/耐药性结果、分类(敏感、中等耐药性、耐药性或SIR结果)或最小抑制浓度(MIC)结果。临床实验室标准协会(CLSI)记录了用于特异性微生物病原体物种的抗微生物剂的相关浓度。
在某些方面，本发明提供了一种盒。该盒包含：温育孔；物种特异性微生物探针；以及透化剂。当将包括微生物的样本递送到混合孔中时，该透化剂促进该探针进入到微生物中，同时将该样本维持在低于约40摄氏度的温度下。该探针可以包含荧光标记的寡核苷酸，该荧光标记的寡核苷酸与特异性细菌物种的核糖体RNA的一段互补。透化剂可以包含一种或多种去垢剂(例如，CHAPSO、SB3-12、TRITON XI00)。优选地，该透化剂和该探针以冻干珠形式提供，通过将该样本递送到该温育孔中，该冻干珠被再水合和溶解。
在一些实施例中，该盒包含磁性颗粒，这些磁性颗粒与细菌细胞表面和邻近透明孔的染料垫结合。当跨所述染料垫施加磁场时，所述磁场拉动所述磁性颗粒穿过所述染料垫到达所述透明壁。该染料垫可以包含密度梯度介质(例如，碘克沙醇或聚乙烯吡咯烷酮涂覆的胶体二氧化硅颗粒)溶液(任选地干燥或冻干)，所述密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针吸收光的染料。优选地，该染料垫和透明壁设置在成像孔中，该成像孔与该温育孔流体连通。该染料垫可以以干燥或冻干状态设置在该盒内的该成像孔中，直到被样本润湿为止。磁性颗粒可以与和细菌细胞表面(例如，二乙胺乙基淀粉；葡聚糖硫酸盐；聚天冬氨酸；聚丙烯酸；聚谷氨酸；聚苯乙烯磺酸盐；或聚二烯丙基二甲胺)结合的化学基团连接，并且该盒可以进一步预装载有化合物，该化合物促进化学基团与细菌细胞表面结合。促进该化学基团与该细胞表面结合的该化合物可以包含溴化十六烷基三甲铵(cetrimide)。
该盒可以包含彼此平行的多个成对成像孔/温育孔组。该盒可以进一步包含接收储器，用户可以将所述样本吸移到所述接收储器中进入所述盒中。
在某些实施例中，该盒包含可滑动门，该可滑动门包括通道穿过的垫圈。当该门定位在第一位置处时，所述接收储器至少与第一温育孔流体连通。当该门位于第二位置时，该接收储器、该第一温育孔和第一成像孔全部彼此密封。当该门位于第三位置时，该第一温育孔和该第一成像孔彼此流体连通。该盒可以包含配件，所述配件用于与外部仪器耦接以从所述外部仪器接收气动压力，以便将所述样本从所述接收储器分配到所述温育孔中并且随后将液体从所述温育孔传递到对应的成像孔中。
在优选实施例中，该探针包括荧光标记的寡核苷酸，该荧光标记的寡核苷酸与特异性细菌物种的核糖体RNA的一段互补。任选地，该盒进一步包含至少一个辅助探针寡核苷酸，该至少一个辅助探针寡核苷酸在距离该段1到30个碱基内的定位处与该核糖体RNA结合。优选地，该荧光标记的寡核苷酸的长度介于10个与18个碱基之间并且包含至少一个构象受限的核酸。在优选实施例中，试剂组合物、该探针、该辅助探针和该化合物以冻干珠形式提供，通过将该样本递送到该盒中，该冻干珠被再水合和溶解；该染料垫包括密度梯度介质溶液，该密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针吸收光的染料；并且该垫以干燥或冻干状态设置在该盒内的该成像孔中，直到被样本润湿为止。
附图说明
图1示出了本公开的盒。
图2示出了与盒一起使用的仪器。
图3示出了仪器内的硬件。
图4示出将样本转移到盒中。
图5示出了仪器的装载盘。
图6图解了用于鉴定微生物的方法。
图7示出了微生物鉴定方法的步骤。
图8展示了透化剂。
图9示出了物种特异性探针。
图10示出了rRNA的次级结构。
图11示出了微生物结合性磁性颗粒。
图12示出将结合磁性颗粒的细胞与未经结合的探针分离。
图13图解了在生理温度下进行FISH的工作流。
图14示出了所示大肠杆菌(E.coli)ATCC 19138的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为89CFU/测定，并且LoD为284CFU/测定，对应于尿液的LoD，即9,467CFU/ml。
图15示出了所示铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC 9721的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为104CFU/测定，并且LoD为506CFU/测定，对应于尿液的LoD，即16,867CFU/ml。
图16示出了所示肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 700603的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为109CFU/测定，并且LoD为319CFU/测定，对应于尿液的LoD，即10,633CFU/ml。
图17是在实例中使用的探针序列的表。
图18示出了输入细胞的百分比。
图19是给出4种另外的细菌的包容性结果的表。
图20是给出在实例中使用的探针序列的表。
图21示出了测试的细菌物种和菌株。
图22是示出在实例中使用的探针序列的表。
图23示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种挑战细菌。
图24示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种另外的挑战细菌。
图25示出了完整采集的图像的一部分。
图26是在实例4中使用的探针序列的表。
图27示出了在存在呋喃妥因(Nitrofurantoin)的情况下的BIUR0017。
图28示出了在存在头孢唑啉(Cefazolin)的情况下的BIUR047。
图29示出了在存在环丙沙星的情况下的BIUR057。
图30示出了在存在甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole)的情况下的BIUR052。
图31是在实例6中使用的探针序列的表。
图32示出了除了针对头孢他啶(CAZ)测试的细菌之外，独有丝状细菌(如用眼睛可以容易地区分，将左边(正常细菌)与右边(丝状细菌)进行比较)的存在作为即将发生细胞死亡的指示。
图33示出了方法如何可以用于产生MIC。
图34示出了测试的所有菌株的整体性能。
图35是在实例7中使用的探针序列的表。
图37示出了四种复制品的平均生长倍数。
图39示出了四种复制品的平均生长倍数。
图36示出了MulitPathTMUTI-AST盒。
图37是示出被测的抗生素浓度的表。
图38是在实例8中使用的寡核苷酸的表。
图39示出了BIUR0067结果。
图40示出了BIUR0084结果。
图41比较了用新颖AST方法获得的结果。
图42示出与标准肉汤相比，对于大肠杆菌BAA-2469的所有接种水平利用上文所描述的新颖4小时方法(实心圆圈)产生的MIC。
图41是所有生物体、抗生素和接种水平的总体基本一致性和分类一致性的汇总。
图42示出了与常规BMD方法相比，使用在此所描述的新方法产生的各种接种水平的MIC结果。
图43是产生的各种接种水平的MIC结果的汇总。
图44是在实例9中使用的探针序列的表。
图47示出了大肠杆菌BAA-2469的数据。
图48示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、极小棒状杆菌(Corynebacteriumminutissimum))的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图49示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(肺炎克雷伯菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图50是在实例10中使用的探针序列的表。
图51示出了敏感大肠杆菌菌株的MIC。
图52示出了内酰胺类抗生素美罗培南的类似结果。
图51是在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的情况下，对用于确定大肠杆菌的亚胺培南(carbapenem)MIC的新颖快速AST和BMD方法的比较。
图52示出了在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而标准BMD现在也是如此。
图53是在实例11中使用的探针序列的表。
图54示出了MIC。
图55总结了获得的所有5种抗生素的结果。使用新颖AST方法在15份培养阴性临床尿液样品中观察到与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。
图56示出了所确定的MIC。
图57示出了来自测试的结果。
图58是在实例12中使用的探针序列的表。
图59仅示出了金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞(左图)和TSB培养基(右图)。
图60示出不论是否存在第二敏感或耐药性细菌，通过新颖4.5小时AST方法确定的靶细菌的所有MIC在2倍容差范围内，被针对每种靶细菌的(在不存在第二细菌的情况下确定的)黄金标准BMD方法(称为基本一致性)所接受。
图61示出了敏感和耐药性分类确定。
图61示出了在实例中使用的环丙沙星敏感性菌株和环丙沙星耐药性菌株。
图62是在实例13中使用的探针序列表的前半部分。
图63是在实例13中使用的探针序列表的后半部分。
图64示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的基本一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的基本一致性。
图65示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的分类一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的分类一致性。
图66示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图67示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图68示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图69是示出检测到靶病原体而未检测到其它非靶病原体的表“实例14的表A”。
图70是示出在实例14中使用的探针序列的表“实例14的表B”。
具体实施方式
本发明提供了盒，这些盒用于结合自动化仪器对样本中的靶微生物执行自动执行抗微生物剂敏感性测试(AST)分析并且需要用户制备很少样本或无需制备样本。还可以使用本发明的系统和方法鉴定如癌细胞等靶细胞并评估各种治疗的治疗功效。在存在各种抗微生物剂的情况下可以分析样本中的细胞或微生物的差异生长，或者可以使用本文所描述的系统和方法来确定治疗剂对细胞活力、形态学、病毒载量、细胞功能或治疗功效的其它量度的影响。在约三十分钟内在单个测试装置内对靶细胞鉴定执行样本操纵、温育、处理和分析步骤，并且在对泌尿道感染的常见原因进行尿液分析的情况下在约四个半小时内进行AST分析。分析时间可以基于被分析的靶标(例如，根据靶标的生长速率)和被测试的治疗剂而变化。系统和方法使用非放大数字成像和图像分析来检测特异性靶标以准确且快速地对样本中的靶标进行定量。
本发明的实施例允许在不需要用户进行的细胞纯化步骤的情况下进行测试。与在常规技术的情况下的多天时间相比，在某些情况下通过减少多余的步骤并使用能够定量单细胞或集落形成单位(CFU)的成像方法和图像分析，可在几个小时内获得直接来自患者样本的靶细胞或微生物鉴定和AST分析的可执行结果。测试装置可以由仪器自动操纵以在存在不同抗微生物剂或其它治疗方法的情况下执行样本分配、培养以及对所得样本部分进行处理和成像的步骤中的每一个步骤以测量差异生长并确定被测试的抗微生物剂的有效性。
在本发明的优选实施例中，盒用于抗微生物剂敏感性测试，并且将样本分配到含有营养生长培养基的单独部分中以促进微生物细胞复制或生长。这些部分中的一个或多个部分可以用作参考或基线部分，在促进生长的温度下温育之前对该参考或基线部分直接进行处理和分析以确定病原体细胞的数量和质量。可以在促进病原体细胞生长的温度下温育这些部分中的一个或多个部分以确定这些病原体细胞是否存活。其它部分各自另外含有在特定浓度下的一种或多种抗微生物剂并且被温育以确定抗微生物剂对病原体细胞复制的影响。
本发明然后可以用于分析经过温育的部分中的病原体细胞数量和质量并将这些结果与未经温育的参考部分中的病原体细胞的数量和质量进行比较。如果病原体细胞在含有特定抗微生物剂的部分中正常复制的能力显著受损，则病原体被分析软件评分为对该部分中的一定浓度下的抗微生物剂敏感。可替代地，如果该部分中的正常生长未显著受损，则病原体被分析软件评分为对该部分中的一定浓度下的抗微生物剂敏感。
本发明可以包含评估标准，例如评估细胞复制以确定含有一种或多种抗微生物剂的部分中的病原体或微生物靶标的抗微生物剂敏感性或耐药性。这些标准可以确定参数的特定组合，这些参数包含但不限于靶微生物的物种、样本类型、抗微生物剂、生长培养基组成、温度和温育时间。
该评估标准可以优选地通过与用于抗微生物剂敏感性测试的接受的参考方法相关凭经验确定。一个标准参考方法是肉汤微稀释(BMD)并且被本领域技术人员所熟知。肉汤微稀释是一种方法，通过该方法在标准条件下评估微生物菌株对抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。在所限定的浓度下将靶微生物的经过纯化的细胞添加到含有各种抗微生物剂的系列2倍稀释液的所限定的营养生长培养基的一系列部分或等分试样中。在所限定的生长温育时间段之后，在视觉评估各个部分的浊度之后确定微生物菌株的抗微生物剂敏感性。与不含抗微生物剂的部分相比，视觉上不存在浊度或浊度显著降低的抗微生物剂的最低浓度被称为最小抑制浓度(MIC)。确定抗微生物剂敏感性测试的标准的机构(例如，CLSI或EUCAST)已经使特定微生物物种和特定抗微生物剂的组合的MIC值与临床实践中的抗微生物剂的特定治疗剂量的功效相关。MIC值通常被分为以下分类范围：敏感、中等耐药性和耐药性。这些被称为SIR或分类抗微生物剂敏感性测试结果。以此方式，特定抗微生物剂的特定物种的特定菌株的MIC可以被报告为SIR或分类结果。用于确定的其它标准方法包含-Bauer或纸片扩散和琼脂稀释。这些方法描述于CLSI和EUCAST文件中并且被本领域技术人员所熟知。
通过使用本发明评估各种浓度的特定抗微生物剂中的特定物种的各种菌株的细胞复制的程度和质量来凭经验确定用于使用本发明确定抗微生物剂敏感性测试结果的评估标准，这类似于肉汤微稀释方法。用于将抗微生物剂敏感性测试结果(通常为MIC或SIR分类结果)分配到特定抗微生物剂的特定物种的菌株的标准被选择成使得使用本发明使各种菌株的结果与参考肉汤微稀释方法的结果一致地相关。例如，可以被本发明的系统和方法使用来确定抗微生物剂敏感性测试结果的标准是在存在各种浓度的某种抗微生物剂的情况下在某一温育时间段内评估某一物种的靶微生物在某一温度下在营养生长培养基中的生长倍数(许多靶细胞的增加倍数)。在此情况下，用于确定用于评估抗微生物剂敏感性的本发明的系统和方法的有效标准的经验研究将评估各种浓度的抗微生物剂中的物种的各个菌株的生长倍数。生长倍数的阈值可以被选择成使得如果使用本发明测量的菌株的生长倍数与在存在相同抗微生物剂的情况下生长的相同菌株的肉汤微稀释的结果相关。使用靶物种的各种菌株凭经验选择阈值，使得如果菌株的生长倍数超过阈值，则该菌株被本发明分类为在存在抗微生物剂的情况下在该浓度下显著生长。如果菌株的生长倍数小于生长倍数阈值，则该菌株被本发明分类为未显著生长。因此，在此实例中，生长倍数的阈值被选择成使得参考肉汤微稀释方法和本发明的方法两者返回关于各种菌株是否在各种抗微生物剂浓度下被确定为显著生长或未显著生长的相同结果。
本发明也可以使用其它评估标准来确定抗微生物剂敏感性测试结果。例如，本发明可以包含对反映由在抗微生物剂中温育引起的正常细胞复制扰动的形态学特性进行评估。作为另一个实例，与不含抗生素的部分相比，可以在温育步骤之后评估含有抗微生物剂的部分中的生长抑制的程度。也可以协同使用多种评估标准来确定抗微生物剂在特定浓度下是否引起靶细胞的正常细胞复制显著扰动。因此，本发明可以用于直接从患者样本中检测感染，鉴定感染性病原体并确定哪些抗微生物剂对治疗将是有效的。
在不需要用户制备任何样本的情况下，将如尿液、粪便、呼吸、伤口、脑脊髓液或血液等患者样本优选地直接转移到分析盒中以进行微生物分析。因此，优选地不需要用户执行用于分离大量纯病原体细胞的集落纯化、核酸扩增或其它时间或劳动密集型样本制备方案。在不进行任何预富集或清除的情况下，将样本优选地直接装载到测试盒中以例如去除生物碎屑。盒含有用于本公开的微生物定量和鉴定以及抗微生物剂敏感性测试的试剂。步骤(如对样本中的微生物进行物种特异性标记和成像)全部发生在盒上，样本已经直接装载到该盒中。这些盒包含如荧光探针等靶细胞特异性标记，这些靶细胞特异性标记用于通过本发明的系统和方法鉴定样本中的微生物。为了鉴定微生物，仪器优选地包含用于对盒中的经过标记的微生物进行成像的成像子系统。
与需要冗长培养步骤的常规方法相比，使用本发明的系统和方法快速检测感染、鉴定病原体和确定抗微生物剂敏感性提供递送可动作结果以更快地引导有效治疗患者感染的潜力。本发明的系统和方法可以向临床医生提供在约30分钟内检测感染并鉴定感染性病原体并且通过简单地将患者样本直接转移到分析盒中并将盒装载到仪器中在若干个小时内确定抗微生物剂敏感性测试结果的能力。
在一些实施例中，本发明包含直接从患者样本中进行微生物检测并鉴定有效治疗。在某些方面，本发明提供了鉴定微生物。在无需样本制备步骤的情况下，直接从患者样本中实现微生物鉴定，这些患者样本如全血、血浆、血清、尿液、痰液、唾液、粪便、脑脊髓液、羊水、腹膜液、脓汁、淋巴液、阴道分泌物、鼻分泌物、呕吐物、汗液和组织。例如，该方法可以涉及将尿液样本直接转移到分析盒装置中以进行微生物鉴定。在一些实施例中，该方法包含将患者样本直接转移到分析盒的样品孔中以及操作该盒以便以物种特异性方式标记微生物、对经过标记的微生物进行成像并且鉴定经过标记的微生物。
在本发明的各个实施例中，用磁性颗粒标记并且用物种特异性可检测标记来标记样本中的微生物。在一些实施例中，这些可检测标记可以包括物种特异性荧光核酸探针。其它可检测标记包含靶特异性荧光抗体或适体、受体-配体对的成员、凝集素或染色剂。靶特异性核酸探针可以被选择成使得仅与靶微生物的核酸序列互补。各个实施例中使用的磁性颗粒可以与靶微生物特异性地或非特异性地结合。在一些实施例中，可以检测多个物种。
在一些实施例中，操作该盒可以包含将该盒装载到仪器中以检测感染；鉴定样本中的病原体并对其进行定量；并且确定本发明的盒装置内的抗微生物剂敏感性。本发明提供了分析盒和仪器，该分析盒和仪器能够直接接受并处理患者样本以鉴定微生物和/或确定治疗敏感性和功效，所有这些都在该盒内。
在一些优选实施例中，针对不同连续诊断功能部署单独的盒。例如，在优选实施例中，盒检测感染、鉴定病原体并且对样本中的病原体进行定量。如果检测到感染并且鉴定出病原体，则在含有抗微生物剂的盒上测试患者样本的另一部分，这些抗微生物剂是用于处理所鉴定的病原体的候选物。使用本发明的系统和方法进行抗微生物剂敏感性测试，盒可以用于确定这些抗微生物剂中的哪种抗微生物剂可以有效治疗引起患者感染的病原体的特定菌株。
本发明的盒还可以用于对生物学上重要的分子(如毒素和生物标志物)进行敏感检测。
本发明的系统和方法包含仪器或分析仪，该仪器或分析仪可以用于与分析盒相互作用以执行本发明的方法。该仪器可以包含用于执行本发明的方法的多个子系统。该分析盒可以装载到该仪器中，该仪器具有用于处理该盒内的样本的多个子系统。在优选实施例中，该多个子系统中的一个子系统可以是用于对该盒内的经过标记的微生物进行成像的成像子系统。该仪器的子系统还可以包含气动子系统、磁性子系统和废物子系统。该仪器还可以包含用于移动和操纵该仪器内的盒的转盘、推进器机构和任务调度器。该仪器能够在恒定温度下执行所有处理步骤。
包含仪器和装置的本发明的系统和方法可以执行广泛范围的诊断功能，这些诊断功能包含：检测感染；检测、鉴定和定量所有类型的病原体细胞；确定抗微生物剂敏感性；检测和定量毒素、病毒和生物标志物(包含宿主应答因子)；以及检测和定量诊断信息性人或宿主细胞。本发明的系统和方法能够单独地或组合地对单个装置(例如，分析盒)中的单个样本同时执行此类诊断功能。本发明的系统和方法包含随机存取处理的能力，使得可以同时在单个仪器上处理执行不同类型的诊断测试(例如，针对泌尿道感染、血液感染和呼吸道感染)的多个此类装置。如此，本文所描述的仪器和盒提供此类功能并且可以被操纵以相应地处理装置内的样本。
AST盒可以包含一系列预装载有测定所需的试剂的互连隔室。用户仅需要基于所期望的测定和样本的类型将来自患者的样本直接添加到该盒中，并且然后将该盒装载到仪器中以进行自动处理。该仪器可以通过用户输入或通过读取盒本身(例如，扫描其上的代码)来鉴定待运行的测定的类型。如本文所描述的仪器可以包含用于执行不同测定可能所需的各种步骤的各种站，并且可以包含用于储存多种过程中盒以及在如执行测定步骤所需的站之间转移此类盒的转盘或其它机构。
盒可以包含各种阀以及用于根据需要在其中连接不同隔室以执行期望测定的步骤的通道。例如，用于AST测定的盒可以包含一系列预装载有生长培养基和待分析的不同抗微生物剂的生长储器。盒还可以包含用于处理生长后样本并在其中标记靶标的隔室以及提供用于对经过标记的靶标进行成像的窗口的成像孔。仪器可以包含流控模块以与盒介接，以便允许外部操纵盒中的阀和压力以连接不同隔室并在其间移动如各种测定所需的样本体积。
图1示出了在本发明的各种系统和方法中使用的盒101。测试盒101包含用于接收样本的样本孔103、分配孔105、试剂孔109、成像孔111和用于在孔之间移动样本的通道113以及用于控制该移动的滑动阀107。盒101可以包含针对特定测定的试剂。例如，在试剂孔109中，盒可以包含靶特异性探针、透化试剂或其它材料，并且这些可以设置、包含在珠141(例如，冻干珠)中。
如所示出的，盒可以包含彼此平行的多个成对成像孔/温育孔组。在此，盒101被示出为包含8个平行“通道”，其中每个通道包含分配孔105、试剂孔109和成像孔111。盒的实施例可以包含穿过一个盒的2组8个通道(另外8个通道将位于八个可见通道的后面)，即16个通道。盒可以根据其尺寸(如高度h、长度l和宽度w)(其中w被测得与h和l正交)进行描述。高度h可以介于约3与10cm之间。长度l可以介于约5与12cm之间。宽度w可以介于约0.5与3cm之间。例如，在一个实施例中，h为约6cm，l为约8cm并且w为约2cm。
盒101优选地包含样本孔103，用户可以将样本吸移到该样本孔中而进入该盒中。在某些实施例中，盒101包含滑动门107，该滑动门包括通道穿过的垫圈。当滑动门107定位在第一位置处时，样本孔103至少与第一分配孔105流体连通。当滑动门107位于第二位置时，样本孔103、第一分配孔105和第一试剂孔109全部彼此密封。当滑动门107位于第三位置时，第一分配孔105和第一试剂孔109彼此流体连通。
盒101可以包含配件，该配件用于与外部仪器耦接以从该外部仪器接收气动压力，以便将该样本从样本孔103分配(因此，“分配”)到分配孔105中并且随后将液体从分配孔105传递到对应的试剂孔109中。成像孔111优选地包含染料垫115和透明窗口(例如，位于盒101的底部上)。
染料垫115是位于成像孔111的底部的材料。一旦样本的一部分被转移到成像孔111中，其就将形成液体样本层，并且染料垫115位于液体样本层之下。染料垫优选地是抵抗颗粒(例如，密度介质、凝胶等)迁移并抑制光穿过(例如，穿过包含的颜料或染料)的材料。由于染料垫115，探针在与也和磁性珠结合的靶标结合时仅被拉到检测区。染料垫115不包括来自窗口的未经结合的材料，该窗口提供检测区(因为其作为位于液体样本层下方的垫层就位)并且其抑制来自未经结合的信号传导部分的光到达检测区(因为染料垫层包含染料并且不是透明的)。
盒101可以通过气动端口117与仪器的流控模块介接。滑动阀107可以通过打开和关闭连接来控制流体在分配孔105与试剂孔109之间移动。滑动阀107可以允许样本的一个或多个部分越过分配孔105并直接行进到试剂孔109和成像孔111以例如提供AST分析的零生长参考或聚焦于鉴定靶细胞或微生物的存在并且不与AST分析相关的应用中。滑动阀107可以由仪器201的流控模块操纵。在优选实施例中，盒101包含稀释剂储器121和按钮127。按压按钮(例如，由操作者手动或在本公开的仪器内机械地)将预装载在稀释剂储器121中的稀释剂(例如，盐水)分配到分配孔105中。在本发明的其它实施例中，阀107还可以被配置成允许一个或多个部分越过分配孔105并且直接行进到一个或多个试剂孔109和成像孔111以提供AST分析的零生长参考或基线。分配孔105可以预填充有生长培养基和/或一种或多种抗微生物剂。阀107可以将样本部分保持在分配孔105中以在存在各种抗微生物剂的情况下在任何时间段内进行温育。
图2示出了用于使用盒101执行微生物鉴定和抗生素敏感性测试(AST)的仪器201(例如，分析仪)。仪器201可以用于与盒101相互作用以对样本执行靶细胞鉴定和AST分析。可以包含向上抬起装载门202以提供到装载盘的通路。
仪器201包含至少一个用户接口203(例如，触摸屏)以显示提示、结果、报告并接收命令。仪器601可以包括不同功能区域和子系统。隔室可以包含用于运输和温育分析盒的转盘205、容纳处理和温育设备的上隔室207和容纳电子器件、成像和气动设备的下隔室209。本公开的仪器201和方法可以用于鉴定并定量各种靶细胞或微生物(包含病毒、细菌、真菌、寄生虫、人细胞、动物细胞、植物细胞)。通过定制针对靶细胞或微生物的生长培养基和抗微生物剂，可以对各种靶细胞执行AST分析。
图3是仪器201的示例性顶视图。仪器201可以包含用于接受多个分析盒101并对其进行分类的输入机构303(如装载盘)。
仪器201可以包含转盘205和机械输送臂307以接受、移动并操纵仪器201内的盒101。仪器201还可以包含任务调度器。仪器201优选地由计算机控制以自动操纵分析盒、执行微生物鉴定和AST分析并且产生结果。仪器201可以包含用于执行本发明的方法的多个子系统。
仪器201的子系统可以包含气动子系统309、磁性子系统311、成像子系统313和废物子系统315。磁性子系统311可以包含例如永磁体或电磁体以提供磁场，以便将磁性颗粒和靶标的复合物沉积在分析盒的检测表面上以进行成像。成像子系统313可以是如美国专利第9,643,180号和第8,021,848号中所述的如上文所讨论的那些子系统以及用于相对于仪器201的成像模块操纵分析盒101的检测表面的台。成像子系统313可以与计算机可操作地相关联以提供图像处理、分析和显示能力。气动子系统309可操作以通过使用由气动压力或真空提供的功能操纵滑动阀107(例如，柱塞和致动器)来驱动分析盒101内的样本和试剂移动穿过。在一些实施例中，液压或机械装置还可以并入到气动子系统309中以实现样本的移动。废物子系统315可以包含用于处置使用后的盒101的接收器(例如，可拆卸箱)。
仪器201还可以包含用于在温育期间保持(或储存)分析盒以进行生长和/或测定温育的一个或多个温育区域。温育区域可以包含加热和/或冷却元件和恒温器以控制该元件将温育区域维持在靶细胞或微生物生长所期望的温度(例如，35℃)下或执行测定温育所期望的温度下。
在一些实施例中，机械输送臂307可操作以操纵仪器201内的各个子系统中的分析盒101。在本发明的一些实施例中，机械输送臂307在仪器的转盘205与各个子系统之间转移分析盒101中的的每个分析盒。机械输送臂307施加推力以将分析盒101转移到转盘205上并从该转盘上移除该分析盒。转盘205旋转以将分析盒101定位成邻近子系统中的另一个子系统，并且机械输送臂307然后施加力以将分析盒101滑动到子系统上。分析盒101优选地从不会被例如仪器201内的挤压或压缩力抓住。在仪器201内滑动或推动分析盒101减少暴露于碎片。仪器内的各种站或子系统以及转盘205可以包括槽317，该槽的大小被设定成当盒101在转盘205与各种站之间滑动时接受并引导盒。旋转转盘205用于将其上的槽317与站上的对应槽对准，使得形成导轨或轨道，盒101可以沿着该导轨或轨道通过机械输送臂307滑动。
在一些实施例中，仪器201包含用于管理分析盒101的任务调度器。任务调度器可操作以控制移动，如在多个子系统中运输并转移分析盒101中的每个分析盒。在一些实施例中，每个分析盒101在子系统中花费的时间也可以由任务调度器管理。任务调度器可以根据需要在各个子系统上储备时间以对分析盒101中的每个分析盒进行分析。在本发明的一些实施例中，任务调度器可以通过鉴定盒的内含物来管理分析盒101的移动(即，待执行的分析的步骤/参数)。调度器可以包括存储在有形的非暂时性存储器上并由处理器操作的软件。处理器可以位于仪器201和其上的各个电机和子系统或站内和/或与其通信以例如操作转盘和机械输送臂机构，并且控制成像装置以及记录如从成像子系统或站接收到的存储器中的图像。处理器和存储器可以构成计算机，该计算机还可以包含输入/输出装置203，如监测器、键盘、鼠标或触摸屏。
在一些实施例中，仪器201还可以包含读取器，该读取器可操作以分析位于分析盒101上的标识符(例如，条形码)。分析盒101的内含物和所需处理可以与分析盒101上的标识符相关联。分析盒101中的每个分析盒可以包含可由仪器201读取的标识符。仪器201可以通过读取器读取标识符并将标识符与任务调度器执行的一组特定指令相关联。
在读取标识符时，计算机处理器可以访问与该标识符相关联的测定(例如，大肠杆菌的AST分析)。处理器然后可以确定执行测定所需步骤的时间表并在开始时确定何时将需要每个站或子系统以及多久完成测定。处理器可以从其存储器访问当前在仪器中运行的其它盒的时间表并比较在所需时间各个站的可用性。某些步骤可以是灵活的(例如，温育)，并且时间表可以提供可以改变以适应其它盒上的其它调度操作的长度范围。如果在某个时间开始测试将会导致子系统或站中的任何子系统或站的不可调和的冲突，则仪器可以拒绝盒并通知用户开始并运行无冲突测定的可接受的稍后时间。在某些实施例中，仪器可以包括子系统或站中的任何子系统或站中的两个或更多个以避免此类冲突。例如，根据期望的仪器容量，如流控模块等高业务量站可以保证包含两个或更多个。
仪器201包含用户接口203以接收用户输入并显示结果、状态和其它信息。将仪器201围封以在仪器201内维持期望的温育或反应温度。仪器具有出入门，该出入门是敞开的以允许进入装载盘303，用户可以将盒装载到装载盘中以进行分析。仪器201可以读取装载盘303内的盒上的标识符，之后打开内部门并将盒带到转盘内以开始处理。那样，如果有任何错误或调度冲突，该错误或冲突可以在载入盒之前被解决。装载盘303将盒定位在相对于仪器的设置位置，从而允许仪器扫描标识符和机械输送臂机构的已知位置以与盒接合并将该盒带到转盘中。盒和装载盘可以包括非对称占用空间，使得盒仅可以以一个朝向插入到盘中以避免堵塞或错误，如标识符指向远离仪器的扫描仪。
操作仪器201和转盘205以使用盒101执行测试。使用仪器201，盒101可用于基于差异生长和物种特异性检测对多种微生物样本执行快速抗生素敏感性测试(AST)。可以在温育大约数小时后观察分配孔105中的许多靶细胞和微生物的可用于确定AST的差异生长。在各个实施例中，样本部分可以在分配孔105中温育小于约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时，之后在成像孔中进行处理和成像。基于样本中待分析的靶细胞或微生物，可以选择生长培养基和/或抗微生物剂并将其包含在盒101中。例如，可以选择已知支持经过鉴定的靶细胞或微生物的生长的生长培养基以及通常用于治疗经过鉴定的靶标的治疗剂或抗微生物剂。在各个实施例中，对于某个靶标，盒101可以预装载有生长培养基和治疗剂，使得已经鉴定样本中的靶标(例如，已经确定患者感染的来源或特异性癌症类型)的用户可以选择适当的预包装测试装置来进行靶微生物的AST分析或靶细胞的治疗功效分析。
在适当的温育时间段之后，可以操纵滑动阀107以将经过温育的样本部分从分配孔105转移到试剂孔109。试剂孔109可以预填充有处理试剂以对靶细胞进行标记或微生物以进行成像。可以将处理试剂冻干以进行储存并在与流体样本部分和生长培养基接触时被活化。试剂孔109例如可以含有物种特异性可检测探针和微生物结合性磁性颗粒。当样本部分穿过试剂孔109时，微生物结合性磁性颗粒与存在的所有微生物结合，同时物种特异性可检测探针与所关注的生物体结合以进行检测(例如，通过显微镜检查)。
对于一些应用，磁性颗粒或其它可检测标记可以是非特异性的，如亲和素涂覆的磁性颗粒和SYBR绿色染料。例如，生物素标记的靶特异性抗体(即，靶特异性结合分子)可以用于靶向特异性细胞或微生物，该特异性细胞或微生物然后将由亲和素磁性颗粒标记以进行特异性磁性选择。所有细胞都将由SYBR绿色标记，但只有磁性分离的(即生物素标记的)靶标将沉积在检测表面上以进行成像。
仪器201可以使用磁场将复合物拉到成像孔111的底部上的检测表面。成像孔111可以含有染料垫，该染料垫形成位于如本文所描述的成像孔中的上测定层下方的致密不透明水层。迫使经过复合的磁性颗粒穿过下染料垫层并沉积在成像孔111的检测表面上。检测表面可以是透明的以允许对经过标记的靶细胞或微生物进行光学检测。在用磁场处理和下拉之后，可以将盒101放置在成像台上以进行成像。靶特异性荧光寡核苷酸探针可以用于对靶细胞进行荧光标记，使得荧光标记的成像提供对靶细胞的定量(例如，样本中的靶细菌的细胞计数)。
盒101可以具有任何数量的生长孔或分配孔以及对应的处理孔和成像孔，但优选地具有针对零点生长参考样本的至少三个孔以及对至少两种单独治疗剂的差异生长分析。在一些实施例中，测试装置包括至少八个或甚至十六个孔。
在存在各种抗微生物剂的情况下进行差异生长之后，通过对存在于每个样本中的多个物种特异性经过标记的细胞进行计数，可以确定每种治疗剂对特异性物种的影响。通过确定哪种抗微生物剂最能抑制生长，可以确定有效疗法以治疗患者的感染。
在样本中的细菌或靶细胞未知并且大量孔和大量样本可用于允许昂贵随机测试的情况下，抗微生物剂选择可以是随机的。优选地，已经鉴定了细菌或其它靶细胞，并且已经相应地选择了各种抗微生物剂作为例如通常用于处理所鉴定的细菌的抗微生物剂。每个分配孔可以含有单一抗微生物剂或抗微生物剂的独特组合以评估对靶细胞生长的组合效果。在不同浓度下的不同抗微生物剂可以与不同分配孔中的样本部分或等分试样组合，并且一些分配孔可以用于复制用相同抗微生物剂进行的治疗以强化结果。由于非抗微生物推断或试剂不稳定性，在一些分配孔中的样本部分或等分试样可以不与抗微生物剂组合以对未经抑制的生长进行定量和/或检测生长抑制。
图4示出将样本的一部分转移到盒中101。最初，可以从仪器201中取出装载盒303并且将其设置在工作台顶部上。为了使用盒101，将样本放置在盒101的样本孔103中。这可以通过从样本收集装置(如样本收集容器、拭子等)吸取来完成。然后可以将盒101放置到装载盘303中。
图5示出用户将装载盘303装载到仪器201中以供盒101使用。优选地，将盒101装载到仪器201中以对样本进行分析。在将盒101放置在仪器中之后，可以使用气动力或类似力通过通道213将样本从样本孔103分配到分配孔105中。
样本可以在样本的引入与温育之间的任何点与盒101内的一定量的生长培养基混合。温育115步骤可以持续小于约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时或更久，但优选地是约4小时以允许可测量样本105中的靶细胞或微生物的差异生长。
温育115之后，可以将经过温育的部分117暴露于例如可以与样本部分中的特异性靶细胞形成复合物119的磁性标签和可检测标记以进行成像123。经过标记的靶标121复合物然后可以在部分中进行成像123，并且可以(手动或通过计算装置)分析图像125以定量存在于每个部分中的经过标记的靶标121的量。
通过将在存在各种抗微生物剂的情况下已经温育的部分中的靶细胞或微生物的数量进行比较，可以确定那些药剂中的哪一种抑制了生长。比较优选地包含靶细胞数量与在不进行温育的情况下已经从原始样本分配、处理和成像的“时间零点”生长参考部分的比较。
设想使用本发明的系统和方法测试的靶微生物和细胞包含病毒、细菌、或真菌细胞或人细胞(如癌细胞或β细胞)。在存在细菌靶标的情况下，例如，可以在存在各种抗菌剂的情况下温育样本，并且可以分析那些药剂对样本中的靶细菌生长的效应以确定有效性。本文所描述的系统和方法可以同样应用于测量化疗剂对癌细胞的细胞毒性效应或测量各种抗病毒剂对样本中的病毒载量的有效性。各种靶细胞和微生物可能所需的仅有变化是靶特异性结合分子(例如，细菌细胞表面特异性抗体、病毒特异性寡核苷酸探针或细胞特异性染料)、正在测试的治疗(例如，抗病毒剂、抗菌剂或癌症疗法)、温育时间以及在一些情况下在图像分析中正在分析的特性(例如，CFU定量、病毒载量或细胞数量、形态学或功能)。
可以将样本直接插入到接收孔103中。可以将气动端口117打开以施加压力或真空，以便将样本分配给盒101内的孔。首先可以将样本从样本孔103分配到分配孔105，并在温育期间由滑动阀107将该样本保持在该分配孔中并释放到试剂孔109以进行标记，并且然后释放到成像孔111以进行成像。仪器的流控模块可以与盒介接以根据特定测定的要求控制阀与样本和试剂分配协调移动。
图6图解了本发明的示例性方法601。方法601优选地包含从患者获得样本。样本可以包含来自患者的人体样本，如血液或其一部分(例如，血浆或血清)、尿液、痰液、脑脊髓液、粪便、伤口或从人体获得的任何其它样本。在某些实施例中，可以测试非医学样本，这些非医学样本包含但不限于兽医样本、环境样本、农业样本和食物样本。可以将样本递送607或直接引入到盒的收集管、孔或储器中，而不需要先前的靶细胞纯化。例如，可以将直接来自患者的尿液样本吸移到分析盒中，而不需要集落纯化或样本制备，该集落纯化或样本制备包含预先与试剂混合、靶标纯化、去除样本组分的处理、离心、生化富集或其它处理。一旦获得样本，就将样本引入607到分析盒(例如，装置)中。样本可能含有生物碎屑和其它材料。方法601包含将样本与仅与微生物的一个物种结合的标记(即对靶物种具有特异性的标记)一起温育613。任选地，可以引入透化剂以使样本中的细胞透化625。方法601进一步包含将样本中的细胞与未经结合的标记分离629以及检测635细胞中的所结合的标记以示出样本中的物种的存在。应注意的是，在一些实施例中，标记是物种特异性的，并且细胞在很大程度上与未经结合的探针分离。
本公开提供了盒，这些盒预装载有试剂以执行可以在恒定生理温度下执行的荧光原位杂交(FISH)。本公开的盒可以用于探测和检测样本内的细胞和生物体的基因内含物，而不需使样本经受热极端条件，这些热极端条件可能以其它方式裂解所关注的细胞、使蛋白质变性、过度地影响不同细胞或生物体的相对差异生长率或以其它方式对样本分析方案的化学组成和处理步骤具有不利影响。能够在恒定生理温度下执行FISH的一个重要特征是，可以对样本进行荧光探测并且在一个盒内进行成像，同时将样本装载在具有其它盒的仪器上，这些其它盒也同时用于执行在生理温度下最优的其它生理测定。本公开的盒全部包含硬件、工具作业和试剂以使用FISH在生理温度下执行微生物鉴定或抗生素敏感性测试。当测试步骤中的一些测试步骤包含促进所关注生物体生长的温育时，在不显著加热到高于生理温度的情况下同时在相同盒的其它孔内执行荧光探针杂交的能力允许以其自己时间和步伐(包含按年代地重叠或甚至同时)继续进行全部多个步骤。此外，当在装载在分析仪器内并在该分析仪器内操作的盒内的孔内执行荧光探针杂交时，仪器可以多路复用盒，从而将多个不同盒路由和调度到不同测试步骤，同时维持仪器内的恒定温度。
本公开的优选实施例提供装载试剂的盒以执行在生理温度下操作的荧光探针杂交方案。通常，生理温度是指如动物等生物体的体温。本文所公开的过程步骤、分子物种和化学试剂可用于在生理温度下使荧光探针与细胞内的核酸杂交并且对那些探针进行成像，而不会裂解细胞。样本暴露和执行步骤的温度是灵活的。本公开的方法可以有用地在波动但不超过45摄氏度并且甚至在不超过40摄氏度的温度下起作用的温度下执行。本公开的方法和组合物在例如范围为36摄氏度到39摄氏度的温度下使用时是可用且起作用的。实际上，本公开的方法可以在维持温度基本上处于人体温度或处于约人体温度(即，对于健康人，约37摄氏度；对于发烧的人，38摄氏度；或者对于一些夜间活动人温度波动模式，36摄氏度)的仪器上实施。“约”意指在小数点内左右。也就是说，36.3为约36.5，并且37.7计数为约37.5。重要的是，应理解，本文所公开的FISH方案全部可以在约生理体温(如哺乳动物，并且优选地人类)下执行。
这些方法所允许的温度范围的一个益处是，可以在接近体内条件的温度条件下研究临床样本中的微生物，因此避免热量促进一个生物体差异生长的将不以其它方式在临床上显著的效应，同时抑制出现另一个效应。例如，如果人正在遭受泌尿道感染，其中原发性潜在刺激物是奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)并且执行涉及加热尿液样本的临床测试，如果热量促进无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的在其它方面不显著的少量细胞生长，则临床测试将不向临床医生引导适当的治疗。该测试将误鉴定需要治疗的微生物。为了避免此类结果，本公开提供了允许在恒定生理温度下执行FISH的组合物、装置和方法，这些组合物、装置和方法在鉴定微生物方面具有特定效用。
图7示出如何继续进行方法601的步骤。样本可以包含细胞701与细胞701中的一种或多种靶细胞723的混合物。将细胞与探针707一起温育。优选地，透化剂用于使包含靶细胞723的细胞701透化625，从而允许标记在其中扩散。在优选实施例中，标记707与靶细胞723内的核酸715靶标特异性结合。将细胞与标记分离629，并且对包含细胞的部分进行检查以检测635标记。如本文所讨论的，标记优选地是探针，如荧光标记的寡核苷酸(例如，长度为约10到18个碱基)。可以通过使用与细胞701结合的磁性颗粒并使用磁场B拉动细胞穿过使未经结合的探针留下的密度介质来将细胞与未经结合的探针707分离629。可以通过对经过分离的细胞进行成像(例如，使用显微镜)来执行检测625。可以在密度介质内或下对细胞进行成像，并且密度介质(也被称为染料垫)可以进一步包含染料或颜料以防止来自未经结合的探针的光到达成像装置，使得图像中的任何光斑示出靶细胞723的存在，这些靶细胞具有在此与靶核酸715杂交的荧光标记的寡核苷酸探针。
图8展示了用于根据本文中的方法使细胞701透化625的透化剂801。在所描绘的实施例中，药剂801包含3-([3-胆酰氨基丙基]二甲基铵)-2-羟基-1-丙磺酸盐(以密苏里州圣路易斯密理博西格玛(Millipore Sigma)的名称CHAPSO销售)和硫代甜菜碱3-12(可作为来自密苏里州圣路易斯B生物科学公司(B-Biosciences)的SB3-12获得)的混合物。这些去垢剂使细胞701透化625，从而允许探针707与微生物靶核酸715结合。任何适合的探针可以与本文中的方法一起使用。温育步骤可以包含将细胞暴露于使细胞透化的试剂，从而允许标记进入细胞并与其中的靶标结合。
当将包括细胞701的样本递送到试剂孔109中时，透化剂801促进探针707进入到微生物(例如，靶细胞723)中，同时将该样本维持在低于约40摄氏度的温度下。探针707可以包括荧光标记的寡核苷酸901，该荧光标记的寡核苷酸与特异性细菌物种的核糖体RNA的一段互补。优选地，透化剂801包括一种或多种去垢剂(例如，CHAPSO、SB3-12、TRITON X100)。
如所示出的，探针707和透化剂801以冻干珠141形式提供，通过将该样本递送到该温育孔中，该冻干珠被再水合和溶解。
因此，该方法包含：将物种特异性标记(如与靶细胞中的RNA互补的荧光标记的寡核苷酸)引入到样本中，任选地使用药剂(如去垢剂，如3-([3-胆酰氨基丙基]二甲基铵)-2-羟基-1-丙磺酸盐(也称为CHAPSO)；硫代甜菜碱3-12(也称为sb3-12)；聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(也称为TRITON X100)；壬基苯氧基多乙氧基乙醇(也称为NP-40)；等等；或其一些组合)使细胞透化；将未经结合的标记与样本中的细胞分离；以及对细胞进行成像以检测标记。该方法可用于对包含微生物的样本(如临床样本)进行测试(例如以测试或检测UTI的致病物)。当根据本公开执行时，该方法提供可以在任何期望温度(如可变或恒定生理温度)下进行的FISH。
提出了用于应用的荧光原位杂交，如染色体畸变的基因映射和诊断。参见《自然方法(Nature Methods)》2(3):237(2005)。那些方案涉及使生物素或洋地黄毒标记的探针与变性染色体DNA杂交并使用荧光染料缀合的试剂检测这些探针。通常，那些方案需要变性步骤，在这些变性步骤中，探针本身和靶DNA在探针杂交、温育和可视化之前单独地在70到80摄氏度下变性。本公开的方法不需要该加热步骤并且不需要在约70摄氏度或甚至高于40摄氏度下加热样本或试剂的任何部分。提供本公开的方法允许的温度范围的一个重要特征涉及使用透化剂(而不是热量)将探针707递送到细胞701中。
适合于与本文中的方法一起使用的探针可以包含核酸探针，这些核酸探针包含DNA、RNA、肽核酸、经过修饰的碱基、构象受限的核酸或其组合。适合的探针可以包含抗体或抗原、结合分子(如甘露糖结合性凝集素或其它胶原凝集素)、分子或化学结构以及组合物，如聚乙二醇、染料、染色剂、嵌入染料、结晶紫、番红/石炭酸品红或可以与靶标特异性结合的任何其它组合物或结构。在优选实施例中，探针707包含寡核苷酸。
图9示出了根据优选实施例的探针707。在优选实施例中，探针707包含寡核苷酸901，该寡核苷酸的长度介于约8与22个碱基之间，长度优选地介于约10个与22个碱基之间。探针优选地包含DNA碱基以避免通过2'羟基的自由电子进行亲核攻击催化的自动催化作用(尽管可以任选地使用或包含RNA碱基)。探针优选地具有45摄氏度的熔融温度，例如介于40与50摄氏度之间。优选地用至少一个荧光团403标记每个寡核苷酸901。在优选实施例中，每个寡核苷酸901还包含一个或几个构象受限的核苷酸905(有时不同地称为锁定核酸或桥接核酸)。因此，探针707包含具有任选的构象受限的核酸905的荧光标记的DNA寡核苷酸901，并且更优选地还包含至少一个辅助探针907，同样任选地具有第二辅助探针913。
在某些实施例中，标记或探针707包括探针寡核苷酸901，这些探针寡核苷酸与微生物RNA互补。对于与微生物核糖体RNA互补的探针寡核苷酸901，寡核苷酸901的长度优选地通常介于10与18nt之间。Tm为大约45摄氏度。其通过考虑rRNA的结构设计。辅助探针破坏核糖体结构。靶向rRNA的一个原因是拷贝数非常高。每个细胞存在成千上万个拷贝，因此获得实际上的信号扩增。因此，方法101的优选实施例使用包含一种或多种去垢剂(例如，CHAPSO和SB3-12中的一种或多种)的试剂并使用探针寡核苷酸来靶向微生物核糖体RNA。具体地，探针是与所关注靶物种所独有的核糖体RNA的一段互补的荧光标记的探针寡核苷酸。优选地，该荧光标记的探针寡核苷酸的长度介于10个与18个碱基之间并且包含至少一个构象受限的核酸。还优选地，提供了探针寡核苷酸901连同至少一个辅助探针907以及任选地第二辅助探针913。
图10示出了小亚基核糖体核糖核酸(ssrRNA)215(具体地大肠杆菌16s rRNA)的次级结构。在其它细菌将不具有与大肠杆菌完全相同的16S rRNA的情况下，核糖体的次级结构是高度保守的(参见Woese和Fox,1977)，因此大多数所描绘的螺旋将具有其它细菌中可容易鉴定的同系物。16S rRNA内的优选靶标包含：h44；h27；hl6；hl7；hl8；h25；h27；h9；h10；hl3；h23；hl9；以及h43。参见Fuchs,2000,经过标记的辅助寡核苷酸增加16S rRNA对荧光标记的寡核苷酸探针的原位可接近性(Unlabeled helper oligonucleotides increase thein situ accessibility to 16S rRNA of fluorescently labeled oligonucleotideprobes),《应用与环境微生物学(Appl Environ Microbiol)》66(8):3603-7，其通过引用并入。在确定规定探针设计的情况下，可以使用在线工具(如SILVA，作为由德国生物信息基础设施网络支持的网站可获得的“高质量核糖体RNA数据库(high quality ribosomal RNAdatabases)”)测试特异性和包含性。参见Pruesse,2007,SILVA：与ARB兼容的质量检查和比对核糖体RNA序列数据的综合在线资源(SILVA:a comprehensive online resource forquality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB),《核酸研究(Nucl Acids Res)》35:7188-7196和Quast,2013,SILVA核糖体RNA基因数据库项目：经过改进的数据处理和基于web的工具(The SILVA ribosomal RNA gene databaseproject:improved data processing and web-based tools),《核酸研究》41(D1):D590-D596，这两者通过引用并入。探针寡核苷酸901优选地包含至少一个桥接或锁定核酸。对于辅助探针907、913，允许其具有比寡核苷酸901更低的特异性(参见SILVA工具)。辅助探针907、913的长度可以优选地为约20nt。
核糖体RNA的次级结构对展示探针设计和辅助探针的设计和角色的原理是有帮助的。优选地，当寡核苷酸901与微生物核糖体RNA的一段杂交时，辅助探针907和任何任选第二辅助探针913是在距离荧光标记的探针寡核苷酸所结合的该段1到30个碱基内的定位处与核糖体RNA结合的寡核苷酸。例如，辅助探针可以与紧邻所杂交的探针寡核苷酸901的上游和下游的微生物核糖体RNA杂交。在没有辅助探针907、913的情况下，靶位点不可接近性可能呈现16S rRNA与寡核苷酸杂交的问题。在此，邻近探针靶位点结合的未经标记的寡核苷酸(辅助907、913)用于增加弱探针杂交信号。辅助探针可以用于增强荧光信号。参见Fuchs,2000,经过标记的辅助寡核苷酸增加16S rRNA对荧光标记的寡核苷酸探针的原位可接近性,《应用与环境微生物学》66(8):3603-7，其通过引用并入。
挑选探针靶序列的考虑因素包含确定FISH探针的理论特异性和包含性、优化LNA碱基的定位以及为特异性探针设计辅助探针。许多病原体靶标已经具有FISH探针，这些探针已经被示出为具有可以使用的特异性(如所公开的或缩短以适应本公开的温度)。可在probeBase(即针对rRNA靶向性寡核苷酸探针的在线资源)中找到其中的一些。参见Loy,2007,probeBase-针对rRNA靶向性寡核苷酸探针的在线资源：新特征(probeBase—anonline resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes:new features)2007,《核酸研究》35:D800-D804以及Loy,2003,probeBase-针对rRNA靶向性寡核苷酸探针的在线资源,《核酸研究》31:514-516，这两者通过引用并入。应注意，FISH通常在较高温度下进行，因此可能需要针对方法101缩短或修饰来自这些来源的探针。还可以使用在线工具“DECIPHER”来输入属，并且DECIPHER工具在将对属具有特异性的16S上推荐区域。参见Wright,2014,针对rRNA靶向性荧光原位杂交的探针的自动化设计揭示使用双探针进行准确鉴定的优点(Automated Design of Probes for rRNA-Targeted Fluorescence InSitu Hybridization Reveals the Advantages of Using Dual Probes for AccurateIdentification),《应用与环境微生物学》，其通过引用并入。
不论是否以在线工具开始或手动设计探针，检查比对(例如，如通过ClustalW确定的用于16S rRNA成对序列比对的探针)并选择靶序列(优选地具有多个)匹配但其它病原体不匹配的区域可能是有价值的。检查包含性(覆盖率)和特异性可能是有价值的。Tm应高于40摄氏度(由于本公开的方法在35摄氏度下操作)。较高的熔融温度可能是优选的，但温度究竟可以多高取决于脱靶序列有多少错配。根据本公开的探针寡核苷酸的熔融温度介于40摄氏度与60摄氏度之间(例如，当长度为10到18nt时，与16S rRNA中的螺旋h17互补的DNA探针具有2或3个LNA碱基)。中央处的错配比末端处的错配更具区分力。错配强度顺序为：(最不坏到最坏)：G/T、G/G、A/G、A/A、T/T、A/C、T/C、C/C。优选地，挑选更可接近的rRNA区域。
探针707用于对特异性靶微生物进行标记。方法601的另一部分涉及将细胞701与未经结合的探针分离629。任何适合的方法或技术可以用于将细胞701与未经结合的探针分离629。用于将细胞701与未经结合的探针分离的适合技术包含离心、流式细胞术、荧光活化细胞分选、柱分离、通过一种或多种核酸酶消化未经结合的探针、等等或其组合。在优选实施例中，通过使用磁性颗粒将细胞701与未经结合的探针707分离629。例如，温育613步骤可以包含将细胞暴露于与细胞表面结合的磁性颗粒。
可以使用与细胞表面结合的任何适合的磁性颗粒，包含例如与抗体、含胶原的C型凝集素(也称为胶原凝集素，如甘露糖结合性凝集素)或结合细菌细胞的化学基团结合的磁性颗粒。在某些优选实施例中，磁性颗粒优选地包含PAA。
图11示出了包含与细菌细胞表面结合的化学基团1111的磁性颗粒1105。化学基团1111可以包含例如二乙胺乙基淀粉；葡聚糖硫酸盐；聚天冬氨酸；聚丙烯酸；聚苯乙烯磺酸盐；聚二烯丙基二甲胺；或其组合。如所示出的，磁性颗粒1105包含聚天冬氨酸化学基团1111。这种颗粒作为chemicell GmbH(德国柏林)的fluidMAG-PAA销售。fluidMAG-PAA颗粒是与细菌表面结合的聚天冬氨酸。在存在促进化学基团1111与细菌细胞表面结合的化合物1121的情况下，可以将细胞暴露于磁性颗粒1105。
为了使颗粒1105与细胞701有效结合，包含促进PAA与细胞表面结合的药剂1121可能是有帮助的。可以包含任何适合的药剂1121以促进结合。例如，在一些实施例中，药剂包含含有西曲溴铵(CTAB，也被称为溴化十六烷基三甲铵)的不同季铵盐的混合物。溴化十六烷基三甲铵促进PAA与细胞表面结合以进行磁性捕获并解决革兰氏阳性生物体的特定麻烦。可能发现革兰氏阴性生物体与fluidMAG-PAA无麻烦地结合。在所关注的靶微生物是革兰氏阳性的情况下，包含药剂1121(例如，溴化十六烷基三甲铵)可能是优选的。因此，在方法601的优选实施例中，标记包含与物种所独有的核糖体RNA215互补的荧光标记的探针寡核苷酸901；温育613步骤还包含将细胞暴露于与细菌细胞701的表面结合的磁性颗粒1105；并且分离629步骤包含向细胞701施加磁场B。
图12示出通过使用所施加的磁场B拉动细胞701穿过密度梯度介质1201将结合磁场1105的细胞701与未经结合的探针700分离629。如图所绘，密度介质1201可以供应在管或成像孔111内(并且可以包含染料以提供“染料垫115”)，使得分离629可以包含将结合磁性颗粒1105的细胞701分配在染料垫115之上并且使用磁场B拉动所结合的细胞701穿过染料垫115并到达成像表面1205上，从而使未经结合的探针700位于染料垫115的表面上。检测步骤635然后可以包含用荧光显微镜对成像表面1205进行成像，并且所有这些步骤可以在低于40摄氏度的温度下执行。优选地，这些步骤在介于约36摄氏度与39摄氏度之间的温度下执行。因此，如所示出的，温育613步骤包含将细胞暴露于与细菌细胞表面结合的磁性颗粒1105，并且分离步骤629包含使用磁场B拉动所结合的细胞远离未经结合的标记。优选地，分离步骤629包含将结合磁场的细胞分配在染料垫115的表面之上并且使用磁场拉动所结合的细胞穿过染料垫115并到达成像表面1205上，从而使未经结合的标记位于染料垫的表面上。
如所讨论的，分离629的实施例使用可以包含染料以提供染料垫的密度梯度介质1201。因此，染料垫115是包含进一步包含染料的密度梯度介质的材料。
染料垫115可以是例如密度梯度介质(如碘克沙醇或聚乙烯吡咯烷酮涂覆的胶体二氧化硅颗粒的溶液，任选地在暴露于样本之前干燥或冻干)，所述密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针700吸收光的染料。垫可以包含用于从检测区排除未经选择的反应组分的高密度材料。垫是密度通常高于反应组分的层(液体或干燥或冻干)。垫可以包含单独或组合(以及在各种浓度下)的各种密度剂，这些密度剂包含例如蔗糖、泛影酸盐、碘克沙醇(也称为OptiPrep)、NaCl、CsCl、Percoll或白蛋白。实施例还可以并入其它密度剂，如其它常用的密度剂，如碘克沙醇、泛影酸钠、钠、蔗糖和其它糖、寡核苷酸、合成聚合物(例如，Ficoll)以及盐，如氯化铯、溴化钾等。实施例可以使用染料来匹配不同信号传导特性和使用中的部分。例如，染料甲苯胺蓝O可以与荧光标记德克萨斯红(磺酰罗丹明B(sulforhodamin))一起使用。一个实施例使用65μL等分试样的染料垫试剂，该染料垫试剂是2mg/mL铬变素R2和10％v/v OptiPrep(60％w/v碘克沙醇溶液)加5％w/v吸移到测定孔中的海藻糖。染料垫可以是预等分到盒101的成像孔111中的15％OptiPrep和5mg/mL铬变素R2。
参考成像孔111，染料垫115可以通过制备碘克沙醇或聚乙烯吡咯烷酮的溶液(包含任何任选染料)以及干燥或冻干成像孔111中的溶液以形成染料垫915来形成。染料垫915然后将是基本上固体的(例如，干燥的，例如成像孔111可以以任何朝向(包含颠倒)储存直到使用为止)。当将液体样本递送到成像孔111中时，液体使染料垫115再水合。实际上，用于方法601中的贯穿本文所公开和讨论的试剂可以以干燥或冻干形式提供以稍后如在恒定生理T下用于FISH方案中。这允许将试剂干燥制备并装载到盒上，该盒然后可以被运送或储存并且稍后用于本公开的方法中。
在优选实施例中，盒101还包含：与细菌细胞表面结合的磁性颗粒1105；以及邻近提供成像表面1205的透明壁的染料垫115。当跨染料垫115施加磁场时，所述磁场拉动磁性颗粒1105穿过染料垫到达透明壁。优选地，磁性颗粒1105(以及促进结合621的任何化合物)也包含在冻干珠141中。染料垫115包括密度梯度介质1201溶液，该密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针700吸收光的染料。在所描绘的实施例中，染料垫115和透明壁1205设置在成像孔111中，该成像孔与试剂孔109流体连通。染料垫115可以以凝胶形式或以干燥或冻干状态设置在盒内的成像孔中，直到被样本润湿为止。
优选地，冻干珠141中的磁性颗粒1105包含化学基团，该化学基团与细菌细胞表面结合，并且该盒进一步包括促进化学基团与细菌细胞表面结合的化合物。促进化学基团与细胞表面结合的化合物可以是溴化十六烷基三甲铵，并且化学基团可以是例如二乙胺乙基淀粉；葡聚糖硫酸盐；聚天冬氨酸；聚丙烯酸；聚谷氨酸；聚苯乙烯磺酸盐；或者聚二烯丙基二甲胺。
探针707可以设置在冻干珠141中作为与特异性细菌物种的核糖体RNA 215的一段互补的荧光标记的寡核苷酸901，并且珠141优选地还包含至少一个辅助探针寡核苷酸，该至少一个辅助探针寡核苷酸在距离该段1到30个碱基内的定位处与核糖体RNA结合。荧光标记的寡核苷酸901的长度可以介于10与18个碱基之间并且包含用于FISH中的至少一个构象受限的核酸，该FISH如在一些实施例中在恒定生理温度下进行。
试剂组合物、探针、辅助探针和化合物以冻干珠141形式提供，通过将样本递送到盒101中，这些冻干珠被再水合和溶解。染料垫115包括密度梯度介质1201，该密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针吸收光的染料。染料垫115可以以干燥或冻干状态设置在该盒内的成像孔中，直到被样本润湿为止。方法601和盒101可以用于执行抗生素敏感性测试。
图13图解了在生理温度下用于执行抗生素敏感性测试(AST)的FISH的工作流。将样本装载到盒101的样本孔103中。分配孔105包含抗生素，即不同抗生素或不同浓度的抗生素。一个“通道”可以包含没有抗生素作为对照或确立生长基线。盒连接到气动压力源、门开关以及荧光显微镜或类似成像仪器。门开关将滑动阀滑动到第一位置中，样本孔103与分配孔105流体连通。通过配件施加气动压力，并且在分配孔之间分配样本。在此，可以将样本与跨分配孔105分配的多种抗生素一起温育。
将滑动阀107滑动到第三位置，在该第三位置，分配孔105与试剂孔109流体连通。施加气动压力，并且将等分试样的样本从分配孔105递送到相应的试剂孔109。在每个试剂孔109中，在不超过45摄氏度的情况下，将样本等分试样与对微生物物种的靶核酸具有特异性的探针以及磁性颗粒一起温育。将滑动阀107滑动到第二位置，试剂孔在该第二位置密封。将样本递送到成像孔111，并且施加磁场以将样本中的完整细胞与未经结合的探针分离。这可以通过将盒滑动到磁体上执行。场B将细胞吸引到成像表面上。检测完整细胞内的所结合的探针以对每等分试样的样本内的物种的生长进行定量。生长或其缺乏与哪种抗生素存在于哪个分配孔105中相关。对于未检测到病原体生长(例如，荧光显微镜未示出荧光)的成像孔111，样本被示出为对存在于对应分配孔105中的抗生素敏感。
盒101的益处为其适用于与和盒101相互作用的仪器一起使用以使步骤自动化。
可检测标记可以包含荧光分子、放射性同位素、质谱的质量标签或化学发光分子。可检测标记可以包括靶特异性部分以与靶细胞或微生物优先结合。靶特异性结合分子可以包含例如靶特异性分子的抗体或抗原或与靶特异性核酸序列互补的寡核苷酸或多核苷酸探针。在优选实施例中，对微生物的可检测标记包括荧光原位杂交(FISH)。FISH分析使用包括核酸(或核酸类似物)探针部分和荧光团探针部分的荧光探针来通过与靶特异性核酸序列重新关联而结合，使得靶标然后可以被光学探测到。例如，可以使用靶向靶特异性16SrRNA的探针来选择性地标记并检测微生物。参见Volkhard等人,2000,荧光原位杂交允许快速鉴定血液培养物中的微生物,《临床微生物学杂志》,38(2):830-838，其通过引用并入本文中。对于鉴定测定，多种不同的靶特异性荧光探针可以用于独立鉴定单个样本中的多个不同类别的靶标。不同的荧光探针可以包括不同的核酸探针部分，该核酸探部分被设计成使得在测定重新关联条件下，荧光探针的核酸探针部分优选地与不同类别的靶细胞或微生物的靶特异性细胞核酸序列重新关联。可以在美国专利公开20030228599中找到探针重新关联的详细讨论，该美国专利通过引用并入本文中。
不同荧光探针上的荧光团可以具有不同光子信号，使得测定中不同类别的靶细胞或微生物的荧光信号可以由其不同光子信号区分。用于区分多种不同光子信号的成像方法是熟悉本领域的技术人员已知的。例如，可以使用对应于不同荧光团的动作光谱的不同对的激发和发射滤光片来获取多个成像。因此，可以测试在单个处理和成像孔中单个样本部分的多个特异性靶细胞或微生物的存在。
在某些实施例中，可以等温地执行用于鉴定和/或定量样本中的靶细胞或微生物的FISH分析，而没有试剂变化并且没有细胞固定，从而允许在开始反应与获得成像结果之间的约30分钟或更少时间内进行自动的、装置上处理。
如本文所描述的FISH分析可以在恒定生理温度下执行，使得可以在相同温度下维持许多盒以进行温育和FISH分析，由此仅需要仪器内部的单个温度并且避免了对在不同温度下保持的单独温育室的需求。
通常，生理温度是指如动物等生物体的体温。本文所公开的过程步骤、分子物种和化学试剂可用于在生理温度下使荧光探针与细胞内的核酸杂交并且对那些探针进行成像，而不会裂解细胞。样本暴露和执行步骤的温度是灵活的。本公开的方法可以有用地在波动但不超过45摄氏度并且甚至在不超过40摄氏度的温度下起作用的温度下执行。本公开的方法和组合物在例如范围为36摄氏度到39摄氏度的温度下使用时是可用且起作用的。实际上，本公开的方法可以在维持温度基本上处于人体温度或处于约人体温度(即，对于健康人，约37摄氏度；对于发烧的人，38摄氏度；或者对于一些夜间活动人温度波动模式，36摄氏度)的仪器上实施。“约”意指在小数点内左右。也就是说，36.3为约36.5，并且37.7计数为约37.5。重要的是，应理解，本文所公开的FISH方案全部可以在约生理体温(如哺乳动物，并且优选地人类)下执行。
这些方法所允许的温度范围的一个益处是，可以在接近体内条件的温度条件下研究临床样本中的微生物，因此避免热量促进一个生物体差异生长的将不以其它方式在临床上显著的效应，同时抑制出现另一个效应。例如，如果人正在遭受泌尿道感染，其中原发性潜在刺激物是奇异变形杆菌并且执行涉及加热尿液样本的临床测试，如果热量促进无乳链球菌的在其它方面不显著的少量细胞生长，则临床测试将不向临床医生引导适当的治疗。该测试将误鉴定需要治疗的微生物。为了避免此类结果，本公开提供了用于执行可以在恒定生理温度下执行的FISH的组合物、装置和方法，并且这些组合物、装置和方法在鉴定微生物方面具有特定效用。
可以将物种特异性标记(如与靶细胞中的RNS互补的荧光标记的寡核苷酸)引入到样本中，并且可以任选地使用药剂(如去垢剂，如3-([3-胆酰氨基丙基]二甲基铵)-2-羟基-1-丙磺酸盐(也称为CHAPSO)；硫代甜菜碱3-12(也称为sb3-12)；聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(也称为TRITON X100)；壬基苯氧基多乙氧基乙醇(也称为NP-40)；等等；或其一些组合)使细胞透化。可以将经过标记的物种与样本中的未经结合的标记分离；可以对细胞进行成像以检测标记。此类方法可用于对包含微生物的样本(如临床样本)进行测试(例如以测试或检测UTI的致病物)。当根据本公开执行时，该方法允许执行可以在任何可变温度(如在恒定生理温度)下进行的FISH。
提出了用于应用的荧光原位杂交，如染色体畸变的基因映射和诊断。参见《自然方法》2(3):237(2005)。那些方案涉及使生物素或洋地黄毒标记的探针与变性染色体DNA杂交并使用荧光染料缀合的试剂检测这些探针。通常，那些方案需要变性步骤，在这些变性步骤中，探针本身和靶DNA在探针杂交、温育和可视化之前单独地在70到80摄氏度下变性。本公开的方法不需要该加热步骤并且不需要在约70摄氏度或甚至高于40摄氏度下加热样本或试剂的任何部分。提供本公开的方法允许的温度范围的一个重要特征涉及使用透化剂(而不是热量)将探针递送到细胞中。
透化剂可以包含3-([3-胆酰氨基丙基]二甲基铵)-2-羟基-1-丙磺酸盐(以密苏里州圣路易斯密理博西格玛的名称CHAPSO销售)和硫代甜菜碱3-12(可作为来自密苏里州圣路易斯B生物科学公司(B-Biosciences)的SB3-12获得)的混合物。这些去垢剂使细胞透化，从而允许探针与微生物靶核酸结合。任何适合的探针可以与本文中的方法一起使用。
适合于与本文中的方法一起使用的探针可以包含核酸探针，这些核酸探针包含DNA、RNA、肽核酸、经过修饰的碱基、构象受限的核酸或其组合。适合的探针可以包含抗体或抗原、结合分子(如甘露糖结合性凝集素或其它胶原凝集素)、分子或化学结构以及组合物，如聚乙二醇、染料、染色剂、嵌入染料、结晶紫、番红/石炭酸品红或可以与靶标特异性结合的任何其它组合物或结构。在优选实施例中，探针707包含寡核苷酸。
探针可以包含寡核苷酸，该寡核苷酸的长度介于约8与22个碱基之间，长度优选地介于约10个与22个碱基之间。探针优选地包含DNA碱基以避免通过2'羟基的自由电子进行亲核攻击催化的自动催化作用(尽管可以任选地使用或包含RNA碱基)。探针优选地具有45摄氏度的熔融温度，例如介于40与50摄氏度之间。优选地用至少一个荧光团标记每个寡核苷酸。在优选实施例中，每个寡核苷酸还包含一个或几个构象受限的核苷酸(有时不同地称为锁定核酸或桥接核酸)。因此，探针包含具有任选的构象受限的核酸的荧光标记的DNA寡核苷酸，并且更优选地还包含至少一个辅助探针，同样任选地具有第二辅助探针。
在某些实施例中，标记或探针包括探针寡核苷酸，这些探针寡核苷酸与微生物RNA互补。对于与微生物核糖体RNA互补的探针寡核苷酸，寡核苷酸的长度优选地通常介于10与18nt之间。Tm为大约45摄氏度。辅助探针可以用于破坏核糖体结构。靶向rRNA的一个原因是相对于信使拷贝数非常高并且在细菌细胞内转移RNA。每个细胞存在成千上万个拷贝，因此在单个细胞中存在成千上万个靶标的情况下，将信号传导分子(如荧光团)与rRNA靶向性探针连接引起实际上的信号扩增。考虑到由靶细菌细胞中的此类高浓度的标记提供的信噪比，在随后荧光成像中挑选出单一细胞因此更容易。因此，方法的优选实施例使用包含一种或多种去垢剂(例如，CHAPSO和SB3-12中的一种或多种)的试剂并使用探针寡核苷酸来靶向微生物核糖体RNA。具体地，探针可以是与所关注靶物种所独有的核糖体RNA的一段互补的荧光标记的探针寡核苷酸。优选地，该荧光标记的探针寡核苷酸的长度介于10个与18个碱基之间并且包含至少一个构象受限的核酸。还优选地，提供了探针寡核苷酸连同至少一个辅助探针以及任选地第二辅助探针。
优选地，当寡核苷酸与微生物核糖体RNA的一段杂交时，辅助探针和任何任选第二辅助探针是在距离荧光标记的探针寡核苷酸所结合的该段1到30个碱基内的定位处与核糖体RNA结合的寡核苷酸。例如，辅助探针可以与紧邻所杂交的探针寡核苷酸的上游和下游的微生物核糖体RNA杂交。在没有辅助探针的情况下，靶位点不可接近性可能呈现16S rRNA与寡核苷酸杂交的问题。在某些实施例中，邻近探针靶位点结合的未经标记的寡核苷酸用于增加弱探针杂交信号。辅助探针可以用于增强荧光信号。参见Fuchs,2000,经过标记的辅助寡核苷酸增加16S rRNA对荧光标记的寡核苷酸探针的原位可接近性,《应用与环境微生物学》66(8):3603-7，其通过引用并入。挑选探针靶序列的考虑因素包含确定FISH探针的理论特异性和包含性、优化LNA碱基的定位以及为特异性探针设计辅助探针。许多病原体靶标已经具有FISH探针，这些探针已经被示出为具有可以使用的特异性(如所公开的或缩短以适应本公开的温度)。可以在probeBase(即针对rRNA靶向性寡核苷酸探针的在线资源)中找到其中的一些。参见Loy,2007,probeBase-针对rRNA靶向性寡核苷酸探针的在线资源：新特征,2007,《核酸研究》35:D800-D804以及Loy,2003,probeBase-针对rRNA靶向性寡核苷酸探针的在线资源,《核酸研究》31:514-516，这两者通过引用并入。应注意，传统FISH反应通常在比优选的恒定生理温度方法中使用的温度较高的温度下进行。相应地，可能需要缩短或修饰来自传统来源的探针以用于当前描述的方法中。还可以使用在线工具“DECIPHER”来输入属，并且DECIPHER工具在将对属具有特异性的16S上推荐区域。参见Wright,2014,针对rRNA靶向性荧光原位杂交的探针的自动化设计揭示使用双探针进行准确鉴定的优点,《应用与环境微生物学》，其通过引用并入。不论是否以在线工具开始或手动设计探针，检查比对(例如，如通过ClustalW确定的用于16S rRNA成对序列比对的探针)并选择靶序列(优选地具有多个)匹配但其它病原体不匹配的区域可能是有价值的。检查包含性(覆盖率)和特异性可能是有价值的。Tm应高于40摄氏度(由于本公开的方法在35摄氏度下操作)。较高的熔融温度可能是优选的，但温度究竟可以多高取决于脱靶序列有多少错配。根据本公开的探针寡核苷酸的熔融温度介于40摄氏度与60摄氏度之间(例如，当长度为10到18nt时，与16S rRNA中的螺旋h17互补的DNA探针具有2或3个LNA碱基)。中央处的错配比末端处的错配更具区分力。错配强度顺序为：(最不坏到最坏)：G/T、G/G、A/G、A/A、T/T、A/C、T/C、C/C。优选地，挑选更可接近的rRNA区域。
在确定规定探针设计的情况下，可以使用在线工具(如SILVA，作为由德国生物信息基础设施网络支持的网站可获得的“高质量核糖体RNA数据库”)测试特异性和包含性。参见Pruesse,2007,SILVA：与ARB兼容的质量检查和比对核糖体RNA序列数据的综合在线资源,《核酸研究》35:7188-7196和Quast,2013,SILVA核糖体RNA基因数据库项目：经过改进的数据处理和基于web的工具,《核酸研究》41(D1):D590-D596，这两者通过引用并入。探针寡核苷酸优选地包含至少一个桥接或锁定核酸。对于辅助探针，允许其具有比寡核苷酸更低的特异性(参见SILVA工具)。辅助探针的长度可以优选地为约20nt。
在已经标记靶细胞之后，本文所描述的盒和仪器可操作以将经过标记的细胞与未经结合的标记分离以进行成像，以便减少背景信号。任何适合的方法或技术可以用于将细胞与未经结合的探针分离。用于将细胞与未经结合的探针分离的适合技术包含离心、流式细胞术、荧光活化细胞分选、柱分离、通过一种或多种核酸酶消化未经结合的探针、等等或其组合。由于这些方法在闭合的盒内进行，所以用于去除未经结合的标记的常规洗涤步骤是不切实际的。在优选实施例中，通过使用磁性颗粒将细胞与未经结合的探针分离。例如，温育步骤可以包含将细胞暴露于与细胞表面结合的磁性颗粒。
磁性颗粒可以包含与细菌细胞表面结合的化学基团。化学基团可以包含例如二乙胺乙基淀粉；葡聚糖硫酸盐；聚天冬氨酸；聚丙烯酸；聚苯乙烯磺酸盐；聚二烯丙基二甲胺；或其组合。此类颗粒例如作为chemicell GmbH(德国柏林)的fluidMAG-PAA销售。fluidMAG-PAA颗粒是与细菌表面结合的聚天冬氨酸。在存在促进化学基团与细菌细胞表面结合的情况下，可以将细胞暴露于磁性颗粒。
为了使颗粒与细胞有效结合，包含促进PAA与细胞表面结合的药剂可能是有帮助的。可以包含任何适合的药剂以促进结合。例如，在一些实施例中，药剂包含含有西曲溴铵(CTAB，也被称为溴化十六烷基三甲铵)的不同季铵盐的混合物。溴化十六烷基三甲铵促进PAA与细胞表面结合以进行磁性捕获并解决革兰氏阳性生物体的特定麻烦。可能发现革兰氏阴性生物体与fluidMAG-PAA无麻烦地结合。在所关注的靶微生物是革兰氏阳性的情况下，包含药剂(例如，溴化十六烷基三甲铵)可能是优选的。因此，在方法的优选实施例中，标记包含与物种所独有的核糖体RNA互补的荧光标记的探针寡核苷酸；温育步骤还包含将细胞暴露于与细菌细胞的表面结合的磁性颗粒；并且分离步骤包含向细胞施加磁场B。
通过使用所施加的如由仪器内的磁性子系统或站提供的磁场拉动细胞穿过密度梯度介质，可以将结合磁性颗粒的细胞与未经结合的探针分离。密度介质可以供应在管或孔内(并且可以包含染料以提供“染料垫”)，使得分离可以包含将结合磁性颗粒的细胞分配在染料垫之上并且使用磁场拉动所结合的细胞穿过染料垫并到达成像或检测表面上，从而使未经结合的探针位于染料垫的表面上。检测步骤然后可以包含用荧光显微镜对成像表面进行成像，并且所有这些步骤可以在低于40摄氏度的温度下执行。优选地，这些步骤在介于约36摄氏度与39摄氏度之间的温度下执行。
如所讨论的，分离的实施例使用可以包含染料以提供染料垫的密度梯度介质。因此，染料垫是包含进一步包含染料的密度梯度介质的材料。
染料垫可以是例如密度梯度介质(如碘克沙醇或聚乙烯吡咯烷酮涂覆的胶体二氧化硅颗粒的溶液，任选地在暴露于样本之前干燥或冻干)，所述密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针吸收光的染料。垫可以包含用于从检测区排除未经选择的反应组分的高密度材料。垫是密度通常高于反应组分的层(液体或干燥或冻干)。垫可以包含单独或组合(以及在各种浓度下)的各种密度剂，这些密度剂包含例如蔗糖、泛影酸盐、碘克沙醇(也称为OptiPrep)、NaCl、CsCl、Percoll或白蛋白。实施例还可以并入其它密度剂，这些其它密度剂包含其它常用的密度剂，如碘克沙醇、泛影酸钠、钠、蔗糖和其它糖、寡核苷酸、合成聚合物(例如，Ficoll)以及盐，如氯化铯、溴化钾等。实施例可以使用染料来匹配不同信号传导特性和使用中的部分。例如，染料甲苯胺蓝O可以与荧光标记德克萨斯红(磺酰罗丹明)一起使用。
可以通过制备碘克沙醇或聚乙烯吡咯烷酮的溶液(包含任何任选染料)以及干燥或冻干盒的成像孔中的溶液来形成染料垫。染料垫然后将是基本上固体的(例如，干燥的，例如孔可以以任何朝向(包含颠倒)储存直到使用为止)。当将液体样本递送到孔中时，液体使染料垫再水合。实际上，用于方法中的贯穿本文所公开和讨论的试剂可以以干燥或冻干形式提供以稍后用于在恒定生理温度或循环温度下进行的FISH方案中，该循环温度可以低于或超过生理温度。这允许将试剂干燥制备并装载到盒上，该盒然后可以被运送或储存并且稍后用于本公开的方法中。
磁性颗粒、可检测标记和靶特异性结合分子优选地与样本中存在的任何靶标形成复合物。磁性颗粒和施加的磁场可以用于物理分离溶液中已经结合的可检测标记与未经结合的可检测标记，无需洗涤步骤。如美国专利第9,643,180中所描述的染料垫层可以与磁性颗粒和磁场结合使用以拉动所结合的靶细胞或微生物穿过致密染料层并将其沉积在测试装置的孔中的检测表面上以进行成像分析。优选地选择染料垫层中的染料以吸收仪器所使用的激发和发射的光以进行成像。因此，来自测定层中的未经结合的标记部分的信号不会显著干扰检测来自磁性沉积在检测表面上的经过标记的靶细胞或微生物复合物的信号。类似地，使用染料垫防止来自样本基质的任何自发荧光(也包含在测定层中)显著干扰检测来自所沉积的经过标记的靶细胞复合物的信号。染料垫的这些属性可以使检测靶细胞或微生物成为可能，而不需要用户制备样本并且也不需要从测试装置中去除未经结合的标记的洗涤步骤。
经过标记的靶细胞或微生物的数字成像可以使用数字成像仪实现。在优选荧光标记的情况下，可以使用各种透镜、照明源、激发光源和滤光片。成像模块可以包含能够产生溶液中或被拉到孔或测试装置中的检测表面的可检测标记的靶细胞或微生物的数字图像的任何装置。成像模块可以包含例如CCD相机、CMOS相机、线扫描相机、CMOS雪崩光电二极管(APD)、光电二极管阵列、光电倍增管阵列或其它类型的数字成像检测器。
成像可以在单组条件下执行，或者光源、滤光片和/或透镜可以在图像之间变化以检测不同的光学可区分的标记(例如，对应于不同靶细胞或微生物的不同荧光探针)。在美国专利第9,643,180号和第8,021,848号中所描述的成像技术和仪器可以允许鉴定并枚举单独细菌或其它靶细胞。
本发明的系统和方法可以包含计算机，该计算机可操作以控制仪器和测试装置和/或以处理成像结果。计算机可以包括耦接到非暂时性存储器装置的处理器。存储器优选地存储处理器可执行的指令以使系统操纵仪器内的测试装置并获得和处理经过标记的靶细胞的图像。
处理器是指执行处理操作的任何装置或装置的系统。处理器将通常包含用于提供中央处理单元(CPU)的芯片，如单核或多核芯片。可以由来自英特尔公司(Intel)或AMD公司的芯片提供处理。处理器可以是任何合适的处理器，如英特尔公司(加利福尼亚州圣克拉拉)以XEON E7商标销售的微处理器或AMD公司(加利福尼亚州桑尼维尔)以OPTERON 6200商标销售的微处理器。
存储器是指以机器可读格式存储数据或指令的装置或装置的系统。存储器可以包含一组或多组指令(例如，软件)，当由所公开的计算机的处理器中的一个或多个处理器执行时，该一组或多组指令可以完成本文所描述的方法或功能中的一些或全部。优选地，计算机包含非暂时性存储器，如固态驱动器、闪存驱动器、磁盘驱动器、硬盘驱动器、订户身份模块(SIM)卡、安全数字卡(SD卡)、微型SD卡或固态驱动器(SSD)、光学和磁性介质等或其组合。
输入/输出装置是用于向计算机输入或输出数据的机构或系统。示例性输入/输出装置包含视频显示单元(例如，液晶显示器(LCD)或阴极射线管(CRT))、字母数字输入装置(例如，键盘)、光标控制装置(例如，鼠标)、磁盘驱动单元、信号生成装置(例如，扬声器)、触摸屏、加速度计、麦克风、蜂窝射频天线和网络接口装置，该网络接口装置可以是例如网络接口卡(NIC)、Wi-Fi卡或蜂窝调制解调器。输入/输出装置可以用于允许用户控制仪器并接收由仪器从测试装置获得的数据。
分析盒101具有标识符(如条形码贴纸)，当由仪器或仪器中的读取器分析或读取时，该标识符将盒与一组指令相关联以在仪器内进行处理，并且可以包含关于与某个患者相关联的测定结果的样本来源的信息。
实例
实例
实例1.使用新颖、快速荧光原位杂交测定的革兰氏阴性细菌的检测极限(LoD)
概述：以下实例表明可以使用新颖等温荧光原位杂交方法检测非常低浓度的细胞。示出了三种常见人泌尿道感染(UTI)病原体的检测极限。
实验方法：
细菌细胞制备：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司(Hardy Diagnostics)，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得大肠杆菌ATCC19138、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和铜绿假单胞菌ATCC 9721的细菌培养物。在细胞在600nm处达到0.15-0.30的光密度读数之后，在稀释前将细胞放置在冰上持续至少15分钟。冷却之后，将细胞稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司(Teknova)，目录号M5860)中达到待测定的浓度(大约19200、9600、4800、2400、1200、600、300和150个集落形成单位(CFU)/反应)。对于更准确的细胞浓度，使用集落计数对这些估计的细菌输入进行调整。通过将对数期培养物在MHBII中稀释到约500CFU/mL，将100μL平板接种于TSA平板上并在35℃下生长16到24小时之后对集落进行计数来确定板计数。使用平均板计数，计算了每个被测浓度中存在的实际CFU。
磁性颗粒的制备：聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)和羧基涂覆的铁含量高的磁性颗粒(羧基磁性颗粒，Spherotech，目录号CM-025-10H)用于非特异性地捕获细菌细胞。将每个颗粒以1:40稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中，其中聚天冬氨酸性颗粒的最终浓度为大约1.38×109个颗粒每反应，并且羧基颗粒的最终浓度为大约3.46×109个颗粒每反应。将含有绿色染料(深绿色荧光微球(Dragon GreenFluorescent Microspheres)，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。
FISH探针的制备：将大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的两组物种特异性DNA低聚物与铜绿假单胞菌的一组物种特异性DNA低聚物在介于80到85℃之间的水浴中加热10分钟并且然后放置在冰上以减少聚合。DNA低聚物组含有在寡核苷酸和2-6辅助寡核苷酸的5'端或5'和3'端两者上用荧光染料(Alexa647N，赛默飞世尔公司(Thermo Fischer))标记的物种特异性DNA寡核苷酸，这些辅助寡核苷酸邻近或靠近特异性探针结合并被设计成破坏核糖体亚单位的局部次级结构，并且允许经过标记的特异性探针对靶rRNA具有更大的杂交效率。图17中的表A中示出了此实例中使用的探针序列。
干燥杂交缓冲液板的制备：制备了10X SSC(1.5M NaCl、0.15M柠檬酸钠，西格玛公司(Sigma)，目录号S6639)、2.6％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、2.4％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.43M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)和0.6％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)的混合物。将30uL的该混合物添加到96孔板的每个孔中。将板放置到50℃下的对流烘箱中并允许干燥过夜。当将100uL的液体添加到这些孔中，实现了3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)和0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)的正确杂交缓冲液浓度。
检测极限(LoD)测定程序：将适合于所关注细菌的DNA寡核苷酸组的混合物与尿液和浓阳离子调整的米勒海顿储备液(MHBII)组合以制备含有1X MHBII和30％合并人尿液(创新研究公司(Innovative Research)，目录号IRHUURE500ML)的最终溶液。探针浓度在不同的细菌物种之间变化，但经过标记的寡核苷酸的范围为0.2-0.6μM，并且对应的辅助探针的范围为1.5-6μm。将90uL的该混合物放置在适当干燥的杂交缓冲板中。添加10uL的磁性颗粒混合物，然后添加10uL适当的细胞稀释液。评估被测的每个靶细菌的每种细胞浓度的十二个复制品和空白(不含细菌的培养基)的24个复制品。将100μL的最终反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方(Orient)，目录号191L)的微量滴定板，并在35℃下温育30分钟以允许同时再水合“染料垫”，标记细菌细胞并将磁性颗粒与细菌细胞表面结合。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：在每个细胞浓度下，确定了检测到的荧光对象的数量。将来自所有八个细胞浓度的数据拟合为线性回归线，并且最低3个细胞输入的斜率、截距和标准偏差用于确定被测的每种细菌的空白极限(LoB)和检测极限(LoD)。
结果：
被测的所有三种细菌都示出了低检测极限。图14、图15和图16示出了利用用于计算LoB和LoD的线性拟合产生的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的数据。可在单个反应孔中检测到的CFU中指示了LoB和LoD。
结论：在该实例中描述的新颖且快速的FISH方法示出为使用最少处理的尿液基质，每次反应的检测极限为约500CFU或更少的敏感方法。
变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图14示出了所示大肠杆菌ATCC 19138的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为89CFU/测定，并且LoD为284CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即9,467CFU/ml。
图15示出了所示铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)ATCC 9721的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为104CFU/测定，并且LoD为506CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即16,867CFU/ml。
图16示出了所示肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)ATCC 700603的检测极限(LoD)。空白极限(LoB)为109CFU/测定，并且LoD为319CFU/测定。这对应于尿液的LoD，即10,633CFU/ml。
图17是在该实例中使用的探针序列的表。
实例2.包容性：使用本发明的快速FISH方法检测并鉴定细菌物种的不同菌株
概述.该实例表明使用本发明来检测靶向细菌物种的不同菌株。呈现了11种不同大肠杆菌菌株的原始数据，并且总结了肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和肠球菌的数据。使用等温荧光原位杂交(FISH)在30分钟内对细菌细胞靶标进行标记并在MultiPathTM基于CCD相机的检测系统上进行检测。
实验方法.
细菌细胞制备：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得不同菌株的细菌培养物。使用600nm处的光密度来估计细胞浓度，将细胞稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到每个反应大约600个CFU和3000个CFU。对于更准确的细胞检测计算百分比，使用集落计数对这些估计的细菌输入进行调整。通过将对数期培养物在MHBII中稀释到约500CFU/mL，将100μL平板接种于TSA平板上并在35℃下生长16到24小时之后对集落进行计数来确定板计数。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
细菌细胞的标记：通过将经过稀释的细胞、等温杂交缓冲液(0.9X MHBII、3X SSC(1.5M NaCl、0.15M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)、靶向16S或23S细菌rRNA的物种特异性Alexa647N标记的DNA或含LNA的DNA探针(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)，IDT)、促进有效杂交(IDT)的辅助探针和30μL的合并人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)组合来制备100μL标记反应。图20中的表示出了探针序列。
根据制造商的说明书，通过Zeba 7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893或89892，取决于尿液量)首先对尿液进行处理。然后，将10μL的磁性颗粒制剂添加到该混合物中。将最终反应混合物转移到含有50μL(先前干燥的)“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板，在35℃下温育30分钟以允许同时再水合“染料垫”、标记细菌细胞并且将磁性颗粒与细菌细胞表面结合。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：经过标记的细菌细胞位于MultiPath实验室成像系统上，该实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：对于每种细菌，确定荧光对象的数量(测定信号)。如果在无细胞条件下检测到的信号高于信号的三个标准偏差，则认为检测到细菌菌株。
结果.图105示出了11个大肠杆菌菌株的测定信号。检测到所有11个菌株高于细胞输入为大约600个CFU每测定时的背景“无细胞”条件。图18示出了表示为检测到的细胞百分比(细胞输入孔中的总测定信号-背景测定信号/总细胞输入*100)的数据。尽管检测效率在菌株与菌株之间稍微有所变化，但这没有抑制测定检测11个不同大肠杆菌菌株中的每个菌株的能力。
图19中的表总结了以与大肠杆菌相同的方式分析的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和肠球菌的包容性结果。被测的肺炎克雷伯菌菌株是ATCC13833、CDC80、CDC44、CDC87、CDC47、CDC43、BAA2470、CDC34、CDC39、ATCC 700603和BAA-2472。被测的铜绿假单胞菌菌株是CDC263、CDC242、9721、CDC236、27853、BAA-2110、CDC233、15692、CDC234、CDC246和CDC261。被测的奇异变形杆菌菌株是CDC155、CDC29、CDC159、CDC59、ATCC 7002和CDC156。被测的肠球菌菌株包含ATCC 19433、ATCC 29212、ATCC 33186、ATCC 51575、ATCC 51299和BAA-2128。
结论.在该实例中描述的新颖FISH方法检测了引起患有UTI的患者的临床症状的主要病原体中的5种不同细菌物种的被测的所有菌株。
变型.该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图105示出针对输入细胞浓度为大约600个CFU/测定(浅灰色条)和3000个CFU/测定(深灰色条)的11个大肠杆菌菌株绘制的平均信号(n＝3在图的左侧示出了源自无细胞对照(空白)的信号。误差条表示1标准偏差。
图18示出针对11个大肠杆菌菌株中的每个菌株示出的检测到的(如通过板计数所确定的)输入细胞的百分比。每个条表示6种确定方式的平均值，3种来自两个不同输入细胞水平中的每一个。细胞检测百分比计算为[(测定信号-背景信号)/输入细胞]*100。
图19是给出4种另外的细菌的包容性结果的表。
图20是给出在该实例中使用的探针序列的表。
实例3.使用快速等温FISH进行靶细菌的特异性检测
概述.该实例表明新颖等温FISH方法特异性地检测到靶细菌，而甚至在非常高的浓度下没有检测到相关非靶细菌。该实例呈现了特异性地检测到大肠杆菌但没有检测到也引起泌尿道感染(UTI)、具有类似rRNA序列或为共生生物的16种其它细菌的测定条件。
实验方法.
细菌细胞制备：16种脱靶细菌(列于表1中)的细菌培养物和大肠杆菌菌株ATCC25922由选自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的单集落生长而来，接种到胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下生长过夜将50-80μL的过夜培养物添加到新鲜TSB中并生长1.5-2小时，直到光密度在600nm处达到0.15-0.3为止。然后将每种细菌稀释于阳离子调整的米勒海顿(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到大约1×108个细胞每毫升。
选择待评估的细菌靶标：选择细菌病原体以测试特异性，因为这些细菌病原体的rRNA序列类似于靶细菌rRNA序列或者因为这些细菌病原体是泌尿道感染(疾病靶标)中常见的病原体，并且因此与这些生物的交叉反应性将最有可能有问题。图21中的表示出了被测的细菌物种和菌株。
FISH探针的制备：将一组大肠杆菌的DNA探针在介于80到85℃之间的水浴中加热10分钟并且然后放置在冰上以减少聚合。图22中的表示出了该DNA探针组。该组含有用荧光染料(Alexa647N，赛默飞世尔公司)标记的物种特异性DNA寡核苷酸和辅助寡核苷酸，这些辅助寡核苷酸邻近或靠近特异性探针结合并被设计成破坏核糖体亚单位的局部次级结构，并且允许经过标记的特异性探针对靶rRNA具有更大的杂交效率。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。
细菌细胞的标记：通过将经过稀释的细胞、等温杂交缓冲液(0.9X MHBII(天惠华公司，目录号M5860)、3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)、靶向16S或23S细菌rRNA的物种特异性Alexa647N标记的探针(集成DNA技术公司，IDT)、促进有效杂交(IDT)的辅助探针和30μL的合并人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)组合来制备100μL标记反应。图22中的表示出了被测的特异性探针组。根据制造商的说明书，通过Zeba 7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893或89892，取决于尿液量)首先对尿液进行处理。然后将10μL磁性颗粒制剂添加到该混合物中。将最终反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板，并在35℃下温育30分钟以允许同时再水合“染料垫”、标记细菌细胞并将磁性颗粒与细菌细胞表面结合。在最终浓度为1×106个细胞每反应时对每种细菌进行测试。该浓度比确定的大肠杆菌的检测极限高大约3000倍。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：对于每种细菌，确定荧光对象的数量(测定信号)。如果在空白(未添加细菌)中的信号的三个标准偏差内检测到信号，则认为细菌具有交叉反应性。
结果.
图23和图24示出快速新颖FISH方法仅检测到大肠杆菌但没有检测到其它16种不同的挑战细菌。图1和图2各自示出在对大肠杆菌靶向细菌产生高测定信号的相同测定条件下没有检测到非常高浓度(每个反应1×106个细胞)的8种临床相关挑战细菌。两个条表示被设计成对大肠杆菌具有特异性的两种不同探针组(参见图22中的表)。16种挑战细菌中的每种挑战细菌的测定信号比无细胞对照加上三个标准偏差(125)更小。
结论.通过设计，该实例中描述的新颖快速FISH方法特异性地检测到大肠杆菌而没有检测到16种临床相关潜在交叉反应性细菌。这表明方法对靶UTI病原体的鉴定具有高特异性，该高特异性对感染的临床治疗非常重要。
变型.该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。测定也已经被设计成表明对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和粪肠球菌具有高特异性。
图21是示出测试检测大肠杆菌的特异性的挑战细菌的表。
图22是示出在该实例中使用的探针序列的表。
图23示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种挑战细菌。
图24示出了大肠杆菌的特异性检测和未检测到8种另外的挑战细菌。
实例4.同时鉴定4种不同微生物的多重FISH方法
概述.该实例表明使用对每种细菌rRNA具有特异性的荧光标记的探针，在单个反应中使用本发明同时检测到大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和产酸克雷伯菌。通过使用4种不同荧光团——每种荧光团针对每个细菌物种——在混合物中特异性地检测到每个病原体，这些荧光团具有不同的激发/发射光谱特性。
实验方法.细菌细胞生长：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在37℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC13883、铜绿假单胞菌ATCC 27853和产酸克雷伯菌ATCC 8724的细菌培养物。然后将每种培养物稀释于阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到在600nm处光密度为0.15，该光密度为每毫升大约1.0×108个集落形成单位(CFU)。
磁性颗粒的制备：聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)和羧基涂覆的磁性颗粒(羧基磁性颗粒，Spherotech，目录号CM-025-10H)用于非特异性地捕获细菌细胞。将每个颗粒以1:40稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中，其中聚天冬氨酸性颗粒的最终浓度为大约1.38×109个颗粒每反应，并且羧基颗粒的最终浓度为大约3.46×109。
细菌细胞的标记：通过将所有四种细菌的经过稀释的细胞、等温杂交缓冲液(0.9XMHBII、3X SSC(1.5M NaCl、0.15M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、0.77％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％w/v SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号M7365)、靶向16S或23S细菌rRNA的物种特异性DNA探针(集成DNA技术公司，IDT)、促进有效杂交(IDT)的辅助探针和30μL的合并人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)组合来制备100μL标记反应。然后，将10μL的磁性颗粒制剂添加到该混合物中。图26中的表中示出了探针序列及其染料修饰的定位。
将细胞/杂交混合物(1mL)转移到盒中。将盒放置到分析仪(如下文所描述)上，该分析仪自动操作剩余的测定步骤和图像采集和分析。简而言之，分析仪的流体系统将反应混合物移动到每孔(先前干燥的)含有46μL染料垫(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的光学窗口中。将盒在分析仪内在35℃下温育30分钟。在该温育之后，将盒移动到磁体站(德克斯特磁站公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过再水合的“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。磁体站之后，将盒移动到分析仪内的成像站并在四个颜色通道中的每个通道中拍摄一系列图像(红色(激发635/25nm，发射680/40nm)、黄色(激发530/20nm，发射572/23nm)、绿色(激发470/40nm，发射520/40nm)、橙色(激发569/25nm，发射609/34nm))。
经过标记的细胞的成像：MultiPath分析仪成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该分析仪可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。对于红色通道，使用635/25nm激发滤光片和680/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。对于橙色通道，使用569/25nm激发滤光片和609/34nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获24个帧。对于黄色通道，使用530/20nm激发滤光片和572/23nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获48个帧。对于绿色通道，使用470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获32个帧。在该实例中实验地确定了对经过标记的细胞进行成像的聚焦平面。
结果.
图25示出了完整采集的图像的一部分，在该完整采集的图像中，在4个颜色通道中的每个通道中检测到荧光，每个通道对4种输入细菌中的一种输入细菌具有特异性。每个斑点对应于单细胞或细胞群。算法用于鉴定不同于伪影(例如，碎片)的有意义的对象并将那些对象计数为细胞。如每种细菌的插入物中所示，检测到如所预期的类似数量的细胞，因为输入细胞浓度大约相同。当被覆盖时，如所预期的具有4种不同细菌靶标的这些斑点不对应，这指示在每个通道中观察到不同的对象。
结论.该方法允许单一快速FISH方法以同时检测并定量盒的单个孔中的四种不同的细菌。
变型：
该实例说明了该新颖FISH方法的多重能力并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)和替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌和非细菌病原体。
图25是示出使用CCD成像方法和4种不同荧光团(每个荧光团针对每种细菌)在4个不同颜色通道中拍摄的相同视场的图像。可以在单个孔中检测到所有四种细菌。
图26是在该实例4中使用的探针序列的表。
实例6.对仪器上的盒中的临床尿液样本中的大肠杆菌进行自动化快速AST
概述：该实例表明使用本发明的系统、装置和方法在无需细胞纯化的情况下在4小时内确定靶向细菌病原体(在该实例中的大肠杆菌)的抗微生物剂敏感性。在差异生长之后，使用非放大数字成像，实例使用协同FISH方法来标记和磁性选择并定量特异性靶细胞该新方法与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法具有相当的性能。
实验方法：
尿液样本：从贝斯以色列医院(Beth Israel Hospital)(马萨诸塞州，波士顿)的Kirby博士实验室接收从患有泌尿道感染(UTI)的患者中收集并且已知含有大肠杆菌的48份剩余的未经鉴定的尿液样本。样品在收集之后1到5天收到并且含有用于限制细胞活力损失的尿液防腐剂。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，执行常规尿液培养以确定存在的细菌的近似CFU/mL并确认如由Kirby博士实验室所报告的单个或混合细菌形态。简而言之，将经过校准的1μL环放置到充分混合的尿液样品中，并且将1μL均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA，BD目录号221185)板上并在35℃的温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行处理和测定，如下文所述。
尿液处理：在测试之前，使用尺寸排阻色谱法去除尿液防腐剂和其它潜在干扰化合物。根据制造商的说明书，将每份2.5mL的临床阳性尿液样品应用于预洗涤ZebaTM7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893)并进行离心。对该经过处理的样品重复如上文所描述的尿液培养以检查处理之后的细菌损失。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前的时间零点(TO)的针对每份临床尿液样本的测定信号。将每份30μL的经过处理的尿液添加到含有物种特异性Alexa647N标记的DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针的70μL 1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)中。在表A中示出了所使用的探针序列。然后将100μL的混合物添加到含有脱水的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277))的微量滴定板的孔中。然后将所制备的10μL的磁性颗粒混合物添加到孔中。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/vOptiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼(Sony)IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
抗生素板的制备：以比预期最小抑制浓度(MIC)高10倍的浓度开始，按2倍系列稀释制备含有六种浓度的每种抗生素的微量滴定板。所使用的抗生素是头孢唑啉、环丙沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑。通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证抗生素稀释液处于适当耐受性内。选择用于测试跨越CLSI报道的大肠杆菌抗生素断点的每种抗生素的浓度。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，含有水或稀释剂的八个孔包含在板中以允许无抗生素阳性和阴性生长对照。
四小时生长：当存在时间零点细胞定量时，将32.4μL经过处理的临床尿液和75.6μL1.43X MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到抗生素板(已经含有12μL抗生素)的每个孔中。允许样品在35℃下在标准温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有所有6种浓度的每种抗生素的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果.
图27到图30示出了表明该方法如何可以用于在与黄金标准肉汤微稀释方法相匹配的三种单独的尿液中产生MIC的三个来自较大数据集的实例。
图27示出了针对单一药物(呋喃妥因)的单个临床尿液样品(BIUR0017)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
图28示出了针对单一药物(头孢唑啉)的单个临床尿液样品(BIUR0047)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
图29示出了针对单一药物(环丙沙星)的单个临床尿液样品(BIUR0057)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
图30示出了针对单一药物(甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑)的单个临床尿液样品(BIUR0052)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。肉汤微稀释的MIC与通过生长倍数阈值所确定的MIC精确匹配。
结论.该新颖方法示出可以用仅4个小时的最少处理的尿液临床样本的差异生长得到准确的AST结果(MIC确定)，特别是没有冗长的集落纯化步骤。不管是否报告为MIC分类抗生素敏感性结果，AST结果与黄金标准肉汤微稀释方法相比是有利的。
变型.该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它抗生素、生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图27示出了在存在呋喃妥因的情况下的BIUR0017。
图28示出了在存在头孢唑啉的情况下的BIUR047。
图29示出了在存在环丙沙星的情况下的BIUR057。
图30示出了在存在甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑的情况下的BIUR052。
图31是在该实例6中使用的探针序列的表。
实例7.对尿液样品中的细菌进行快速且准确的抗微生物剂敏感性测试
概述.该实例表明在将已知抗生素敏感性特性添加到不含细菌的尿液中情况下利用本发明来准确地确定病原体的抗微生物剂敏感性。在含有抗微生物剂的微生物培养基中进行差异生长，然后评估生长，使用本发明的协同FISH方法在仅4.5小时内进行所需的靶特异性细胞定量。该新方法与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法具有相当的性能。
实验方法.
细菌细胞制备：从ATCC或从CDC抗生素耐药性库(AR库)收集具有已知耐药性特性的50个细菌菌株并在表A中示出。通过用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得这些中的每一个的细菌培养物。使用600nm处的光密度来估计细胞浓度，将每种培养物稀释于阳离子调整的米勒海顿II(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中达到大约5×106个集落形成单位(CFU)/mL。
尿液处理：测试之前，根据制造商的说明书，将合并的人尿液(创新研究公司，目录号IRHUURE500ML)按4mL尿液与一个预洗涤的10mL旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893)的比率应用于预洗涤的ZebaTM7K MWCO旋转柱中并进行离心。
磁性颗粒的制备：将用于非特异性地捕获细菌细胞的聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中直到2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前的时间零点(TO)的针对每种细菌的测定信号。制备了反应混合物，该反应混合物由以下组成：30μL经过处理的尿液、10μL 5×106CFU/mL的细菌稀释液、60μL MHBII(100μL中的1X最终浓度)和适当的物种特异性Alexa647N标记的DNA寡核苷酸FISH探针和其用于靶向细菌物种的相关未经标记的DNA辅助探针。图35中的表中示出了所使用的探针序列。然后将100μL的混合物添加到含有脱水的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277))的微量滴定板的孔中。然后将所制备的10μL的磁性颗粒混合物添加到孔中。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPath实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
抗生素板的制备：按2倍系列稀释制备了含有六种浓度的每种抗生素的微量滴定板。在最终肉汤微稀释中以比期望的浓度高10倍的浓度制备了2倍稀释系列，使得添加细胞/尿液/培养基混合物将产生正确的抗生素范围。然后将12uL的每种抗生素稀释液等分到96孔板的适当的孔中。测试了针对不同细菌的不同抗生素。通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证抗生素稀释液处于适当耐受性内。选择用于测试跨越CLSI报道的适当细菌物种的抗生素断点的每种抗生素的浓度，使得(敏感/中等/耐药性)分类确定可以根据该数据得出。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，还包含含有水或其它稀释剂的若干孔用于无抗生素阳性生长和阴性生长(无细胞)对照。将抗生素板在-80℃下冷冻并在使用之前完全解冻。
四小时生长：当发生时间零点细胞定量时，将12μL制备的细菌培养物、如测定时间零点所做经过处理的36uL合并的人尿液、60uL 2X MHB II(天惠华公司，目录号M5860)和2uL水添加到制备的抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在标准温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有所有浓度的每种抗生素的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种细菌样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将结果与通过ATCC或CDC报告的MIC值和分类调用进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保将活细菌添加到每个样品中或当计算抑制倍数时使用。
图32示出了除了针对头孢他啶(CAZ)测试的细菌之外，独有丝状细菌(如用眼睛可以容易地区分，将左边(正常细菌)与右边(丝状细菌)进行比较)的存在作为在该抗生素浓度中即将发生细胞死亡的指示，并且在适当的时候对MIC浓度相应地进行。在针对甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)测试的细菌的情况下，阈值是基于抑制倍数而产生的(含有细菌但不含抗生素的孔中的测定信号被含有抗生素和细菌两者的孔分开)。
结果.
图33示出该方法如何可以在存在与CDC或CLSI公布的MIC相匹配的尿液基质的情况下用于在单独的细菌上产生MIC。实例示出了针对单一药物(环丙沙星)的单一细菌(肺炎克雷伯菌CDC0126)在不同抗生素浓度下的生长倍数结果。公布的MIC(>0.25μg/mL)与通过本发明所述的新颖快速AST方法确定的MIC精确匹配。通过水平灰线示出了生长倍数的阈值(在该实例中为20)。
图34中的表示出了被测的所有菌株中的整体性能。如果通过新颖AST方法确定的MIC精确匹配或是在公布的值的2倍稀释内，则被测的MIC基本上一致。除了两种情况外，所有细菌/抗生素组合具有100％的基本一致性。
结论.该新颖方法示出在样品基质的上下文中用仅4个小时可以作出与具有多种药物耐药性机制的细菌的高度表征菌株的公布的值相匹配的MIC确定。
变型.该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它抗生素、生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌。
图32是正常细菌(左图)与丝状细菌(右图)的视觉比较。
图33示出了在0.25μg/mL下调用通过本发明中描述的新颖快速AST方法产生的MIC。
Figure BDA0003100857730000711
Figure BDA0003100857730000721
图34是在该实例中测试的所有细菌和抗生素的AST结果的表。
图35是在该实例7中使用的探针序列的表。
实例8.在不使用细胞纯化的情况下临床尿液样本的快速且准确的自动化AST结果
概述.该实例表明使用本发明的系统和方法在4小时内自动确定临床尿液样品中的病原体的AST结果，无需冗长的细胞纯化步骤。自动化仪器执行含有试剂的盒中所需的步骤以在恒定的生理温度下确定抗微生物剂敏感性。温度与微生物生长和用于检测并定量靶细胞的本发明的方法两者相兼容。使用基于FISH的标记、磁性颗粒和非放大数字成像对本发明的系统执行后一种方法。
使用仪器的气动子系统自动地将盒中的样本分配到含有各种浓度的各种抗微生物剂加上微生物培养基的部分或等分试样中。这些部分中的一部分用于定量生长温育之前的病原体细胞。系统温育盒持续4小时，并且然后对含有抗微生物剂的孔中的靶细胞的数量进行定量。将含有抗微生物剂的温育部分中的细胞的数量与在温育之前测量的细胞的数量进行比较用于确定各种抗体中的病原体的抗微生物剂敏感性。
实例示出了使用本发明的自动化系统、装置和方法直接在来自尿液中具有大肠杆菌的医院患者的临床样本中进行快速且自动化抗微生物剂敏感性测试的结果。与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法相比，本发明在仅4小时内递送准确的性能。
实验方法.
尿液样本：从贝斯以色列医院(马萨诸塞州，波士顿)的Kirby博士实验室接收从患有泌尿道感染(UTI)的患者中收集并且已知含有大肠杆菌的剩余的未经鉴定的尿液样本。样品在收集之后1到5天收到并且含有用于限制细胞活力损失的尿液防腐剂。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，执行常规尿液培养以确定存在的细菌的近似CFU/mL并确认如由Kirby博士实验室所报告的单个或混合细菌形态。简而言之，将经过校准的1μL环放置到充分混合的尿液样品中，并且将1μL均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上并在35℃的温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行处理和测定，如下文所述。
AST盒-培养基和抗微生物剂的制备：
通过将25uL 4X MHB II(天惠华公司，目录号101320-356)分配到8个单独的生长孔中的每个生长孔中(参见图1中的盒示意图)来制备盒之前的天数。生长孔1和2用于时间零点测量(参见下文的描述)，因此仅生长培养基包含在生长孔中。生长孔3和4也仅包含培养基。这些孔充当阳性对照以确保超过四个小时观察到生长。将2种浓度的抗生素添加到生长孔5和6以及7和8中。为此，将比以微克每毫升为单位的目标浓度更浓22.2倍的4.5μL抗生素沉积到适当的生长孔中。盒含有2种浓度的环丙沙星(CIP)和呋喃妥因(NIT)两者或头孢唑啉(CFZ)和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)。对于盒中的每种抗生素的最终浓度，参见表1。然后将培养基和抗生素在40℃的对流烘箱中干燥16到20小时。
AST盒-杂交试剂的制备：
制备了含有以下的杂交缓冲液：3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠，pH 7.5)(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％w/v溴化十六烷基三甲铵、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)和0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)。将海藻糖(西格玛公司，目录号T9449)溶解在该混合物中直到最终浓度为10％w/v。将该杂交缓冲液-海藻糖混合物冻干在8.3μL体积珠中。将两个8.3uL珠放置到8个试剂孔中的每个试剂孔中(关于盒上的定位，参见图1)。
AST盒-磁性颗粒的制备：
将聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中直到浓度为2.75×1014个颗粒/mL，最终浓度为10％w/v海藻糖(西格玛，目录号T9449)。为了该稀释，将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。在立即用于最小化聚合之前，对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。然后将混合物冻干在10μL体积珠(2.64×1012个颗粒每反应)中。将一个磁性颗粒冻干珠与2个杂交混合珠放置在8个试剂孔中的每个试剂孔中。
将样品放置到盒中的程序-尿液处理
在测试之前，使用尺寸排阻色谱法去除尿液防腐剂和其它潜在干扰化合物。根据制造商的说明书，将2.5mL的每种临床阳性尿液样品应用于预洗涤ZebaTM7K MWCO旋转柱(赛默飞世尔公司，目录号89893)并
进行离心。对该经过处理的样品重复如上文所描述的尿液培养以检查处理之后的细菌损失。
将样品放置到盒中的程序-将样品放在盒上
将每份750μL经过处理的尿液样品与1705μL的水和45μL物种特异性DNA寡核苷酸荧光原位杂交(FISH)探针和未经标记的DNA辅助探针进行组合以制备含有30％尿液v/v最终浓度的溶液。可以在图2中找到用于每种细菌的寡核苷酸的浓度和染料标记。将1mL的混合物添加到盒的样品罐中并将盒放置到分析仪上。
在自动化分析仪上运行AST盒
在然后将盒放置在仪器上之后，除了数据分析之外的所有随后动作都是自动执行的。首先将尿液/水/FISH探针混合物(样品)在真空下引导到盒顶部的8个生长孔中。然后将前两个生长孔中的样品立即重新定位到反应孔中，从而再水合杂交缓冲液/FISH探针混合物和所冻干的磁性颗粒。然后样品继续到含有46μL脱水的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的成像窗口，在60℃下在对流烤箱中干燥3小时并在35℃下在分析仪上温育30分钟。在该温育之后，然后将盒重新定位到磁体站并放置在强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)顶部持续4分钟以使经过标记的和磁性颗粒相互作用的细菌细胞邻近成像表面。最后，将盒移动到成像站并且使用下文所描述的非放大CCD成像仪进行成像。
将剩余的六个生长孔中的样品保持在该定位中，并且在存在或不存在抗生素的情况下允许细菌在35℃下在再水合的培养基中生长4小时。在生长之后，将细胞悬浮液如时间零点测定一样重新定位到试剂孔中，并且如上文所描述的执行完全相同的杂交反应、磁性下拉和成像。
分析仪成像系统和成像过程
MultiPath分析仪成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。分析仪可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有两种浓度的每种抗生素的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。将生长倍数与在符合CLSI肉汤微稀释中的对应孔中观察的生长进行比较，选择生长倍数截止值的阈值以最大化与肉汤微稀释结果的一致性。在细胞在存在抗生素的情况下生长的条件下(并且因此在该浓度下具有耐药性)，生长倍数将会高，并且在细胞在染色的过程中的条件下(并且因此在该浓度下敏感)，生长倍数将会低。在这些盒中，如果抗生素的两种浓度基于其生长倍数示出无生长，则在该尿液样品中的细菌被称为敏感的。如果在较低浓度下有生长但在较高浓度下没有生长，则尿液样品中的细菌在环丙沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑的情况下是中等的，并且在头孢唑啉的情况下是耐药性的。如果抗生素的两种浓度基于其生长倍数阈值示出了生长，则在该尿液样品中的细菌被称为耐药性的。将所有敏感/耐药性调用与通过在符合CLSI的标准BMD中的MIC确定做出的敏感/耐药性调用进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果.
图37示出了含有临床尿液样品BIUR0067的两个盒中的四种复制品的平均生长倍数，该临床尿液样品含有大肠杆菌菌株。图示出了在2个不同盒中的4种复制品中的环丙沙星和呋喃妥因中的每一种在2个浓度中的每个浓度下的平均生长倍数。使用生长倍数值为2的两种抗生素，MulitPath测定将两种环丙沙星(CIP)浓度调用为生长并且将两种呋喃妥因(NIT)浓度调用为未生长。因此，通过MulitPath，BIUR0067对环丙沙星具有耐药性并且对呋喃妥因敏感。将大肠杆菌从该尿液中分离出来并在与这些敏感/耐药性调用相匹配的CLSI标准肉汤微稀释中进行测试。
图39出了含有临床尿液样品BIUR0084的两个盒中的四种复制品的平均生长倍数，该临床尿液样品含有肺炎克雷伯菌菌株。图示出了在2个不同盒中的4种复制品中的头孢唑啉和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑中的每一种在2个浓度中的每个浓度下的平均生长倍数。使用生长倍数值为2的两种抗生素，MulitPath测定将头孢唑啉和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑两者的所有抗生素浓度调用为生长。因此，肺炎克雷伯菌的该菌株对两种抗生素具有耐药性。这与在内部进行的CLSI标准肉汤微稀释相匹配。
结论.实例示出了使用本发明的自动化系统、装置和方法直接在来自尿液中具有大肠杆菌的医院患者的临床样本中进行快速且自动化抗微生物剂敏感性测试的结果。与黄金标准CLSI肉汤微稀释(BMD)方法相比，本发明在仅4小时内递送准确的性能。
变型.该实例说明了该新颖AST方法在盒上的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序以及对反应物和抗微生物剂稳定、不同细菌靶标、不同抗微生物剂的改变等。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图36示出了MulitPathTMUTI-AST盒。
图37是示出被测抗生素浓度的表。
图38是在该实例8中使用的寡核苷酸的表。
图39示出了BIUR0067结果。
图40示出了BIUR0084结果。
实例9.直接用于尿液样本的快速AST方法对病原体变化是稳健的
概述.对可变接种物浓度的稳健性对快速AST方法很重要，因为当直接从样本中测试样本时，靶细胞浓度是未知的。该实例表明，当针对覆盖宽范围的靶细胞浓度的人为样本时，使用本发明直接从尿液样本提供准确且一致的结果。该实例表明，与用于AST的肉汤微稀释(BMD)黄金标准相比，在存在10％尿液的情况下大肠杆菌BAA-2469、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和肺炎克雷伯菌CDC-0043的可变细胞输入递送准确的AST结果。
实验程序.
抗生素板的制备：通过以比期望的最终浓度高10倍的浓度将10μL分配到96孔板的孔中来以2倍系列稀释制备含有任一浓度的三到五种抗生素的抗生素板。选择用于测试跨越被测的细菌菌株的CLSI报道的MIC的每种抗生素的浓度。利用以下抗生素中的全部或子集制备板：头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，含有水的四个孔允许阳性(在不存在抗生素的情况下细菌生长)和阴性(无细菌细胞)对照。
培养物的制备：通过利用来自新鲜胰蛋白酶大豆琼脂板(TSA，BD目录号221185)的3到5个集落接种胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)并在35℃下生长1.5到3个小时以实现对数期生长来获得大肠杆菌BAA-2469、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和肺炎克雷伯菌CDC-0043的细菌培养物。将细胞在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中稀释成各种接种物(2×103CFU/mL-1×107CFU/mL)。对于更准确的细胞浓度，使用集落计数对这些估计的细菌输入进行调整。通过将对数期培养物在MHBII中稀释到约500CFU/mL，将100μL平板接种于TSA平板上并在35℃下生长16到24小时之后对集落进行计数来确定板计数。使用平均板计数，计算了每个被测浓度中存在的实际CFU。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对每种生物体和接种物的测定信号。将10μL的每种样品添加到80μL的杂交缓冲液中以得到最终浓度为3X SSC(0.45M NaCl，0.045M柠檬酸钠，西格玛公司，目录号S6639)、1％CHAPS(西格玛公司，目录号C3023)、1％NOG(西格玛公司，目录号08001)、1X阳离子调整的米勒-海顿(MHBII)、物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针。表B中示出了所使用的寡核苷酸探针。通过将10μL的合并尿液(内部收集和过滤)直接添加到混合物中来获得最终浓度为10％的尿液。然后将如上文所描述制备的10μL磁性颗粒混合物直接添加到该混合物中。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/vOptiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)(染料垫板)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：当存在时间零点细胞定量时，将10μL的每种生物体接种物、10μL的合并尿液和70μL IX MHBII添加到抗生素板(已经含有10μL抗生素)的适当孔中。允许样品在35℃下在标准空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将10μL经过温育的样品-抗生素板(10％)转移到微量滴定板并以与上文所述相同的方式与100μL杂交缓冲液、FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将使用在此所描述的新颖AST方法的结果与根据CLSI M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有所有浓度的每种抗生素的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种样品接种物/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果.
下面的图示出当与黄金标准肉汤微稀释方法匹配时，该方法如何对不同接种水平而言是稳健的。
图41将用新颖AST方法获得的结果与在单一浓度下执行的针对被测的所有药物的标准BMD的结果进行比较。列3将通过新颖AST方法和黄金标准BMD获得的MIC进行比较。所有MIC调用均在符合CLSI的BMD的2倍稀释(基本一致性)内。列4将基于MIC(分类一致性)的分类抗生素敏感性结果(S＝敏感性，I＝中等，R＝耐药性)进行比较。尽管在肉汤微稀释中的克雷伯菌属浓度的子集给出了不同于MIC的分类调用，但是通过标准AST方法将所有这些仅分类为微小的错误。
图42示出与标准肉汤微稀释方法(24小时BMD，虚线)相比，对于大肠杆菌BAA-2469的所有接种水平利用上文所描述的新颖4小时方法(实心圆圈)产生的MIC。利用该新颖方法确定的所有MIC都基本一致(阴影区域)。图43示出了图42的原始数据。
结论.在此呈现的快速4小时AST方法对超过宽范围的靶细胞浓度的初始细胞浓度而言是稳健的。对可变接种物浓度的稳健性对快速AST方法很重要，因为当直接从样本中测试样本时，靶细胞浓度是未知的。
变型.该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和特异性探针可以设计用于的其它细菌和非细菌病原体以及其它抗微生物剂或化学剂。
图41是所有生物体、抗生素和接种水平的总体基本一致性和分类一致性的汇总。
图42示出了与常规BMD方法相比，使用在此所描述的新方法产生的各种接种水平的MIC结果。
图43是产生的各种接种水平的MIC结果的汇总。
图44是在该实例9中使用的探针序列的表。
实例10.在不进行细胞纯化的情况下，在含有多种细菌物种的尿液临床样本中对 靶病原体进行快速抗微生物剂敏感性测试
概述.当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含其它微生物的靶病原体群。通常方法(即集落纯化)需要2到5天递送结果。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。
当前方法需要冗长的细胞纯化过程，因为这些方法使用非特异性检测方法，如增加浊度以确定哪些抗微生物剂抑制微生物培养基中的靶病原体的生长。当使用细胞复制品的非特异性测量时，仅可以在仅含有靶病原体的细胞的情况下知道所示生长是由于靶病原体引起的。当前抗微生物剂敏感性测试方法必须经历细胞纯化，因为大多数医学样本是非无菌的。样本通常含有构成人微生物组的微生物、填充人身体的良性正常细菌群。
相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需集落纯化步骤。该方法与当前方法的不同之处在于，其特异性地评估靶病原体在含有抗微生物剂的微生物培养基中的生长。
该实例表明，在包括15份不同培养阴性尿液样品的尿液基质(10％)的人为样品中，快速抗微生物剂敏感性测试方法准确地确定了大肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)。在此示出，使用新方法(即抗微生物剂敏感性测试结果)是准确的并且不会受到含有高浓度的其它微生物物种的尿液样品中的脱靶细菌的显著影响。
实验程序.
抗生素板的制备：在启动实验程序之前，通过以比期望浓度高10倍的浓度分配10μL来以2倍系列稀释系列制备含有五种浓度的板。选择用于测试跨越CLSI报道的大肠杆菌抗生素断点的每种抗生素的浓度。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，含有水的四个孔包含在板中以允许阳性和阴性对照。
培养物的制备：分别将大肠杆菌BAA-2469的三到五个集落以及八个其它脱靶物种(金黄色葡萄球菌ATCC 25923、弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864、鲍氏不动杆菌ATCC 19606、表皮葡萄球菌ATCC 12228、藤黄微球菌(M.luteus)(环境分离物)、极小棒状杆菌ATCC 23348-BAA 949、肺炎克雷伯菌CDC 0043、肺炎克雷伯菌CDC 0141)各自接种到5mL的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下温育1到2个小时。通过分光光度计来测量光密度，并且将生物体稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中。将大肠杆菌稀释成大约5×106CFU/mL(最终测定浓度为5×105CFU/m)，而将其它脱靶物种稀释成各种接种物(范围为l×105到5×108CFU/mL)。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对大肠杆菌的每个物种的测定信号。将10μL的每种样品添加到80μL的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)(西格玛公司，目录号S6639)、1％CHAPS(西格玛公司，目录号C3023)、1％SB3-12(西格玛公司，目录号08001)、1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)、大肠杆菌特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针))中。图50中的表中示出了探针序列。通过将10μL的合并尿液(内部收集和过滤)直接添加到混合物中来获得最终浓度为9.1％的尿液。将如上文所描述制备的10μL磁性颗粒混合物直接添加到该混合物中。将现在含有杂交混合物、尿液和磁性颗粒的100μL样品转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：在存在表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、极小棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的情况下，测试大肠杆菌BAA 2469对以下3种抗微生物剂的敏感性：环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)和呋喃妥因(NIT)。在存在肺炎克雷伯菌的情况下，针对以下5种抗微生物剂对大肠杆菌BAA 2469进行测试：头孢唑啉(CFZ)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、呋喃妥因(NIT)和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SXT)。根据上文所描述的方法制备含有这些抗微生物剂的抗生素板。当存在时间零点细胞定量时，将10μL的大肠杆菌物种(5×106CFU/mL)、10μL脱靶物种(l×105到5×108CFU/mL)、10μL的合并尿液和60μL MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到已经含有10μL抗生素的抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将10μL经过温育的样品-抗生素板(10％)转移到含有干燥“染料垫”的微量滴定板并如上文所述与100μL杂交缓冲液、FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒的混合物进行组合以测定时间零点。
比较方法：将在此所描述的新颖测定方法的结果与根据M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有所有浓度的每种抗生素的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种细菌样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。
结果.
示出的数据表明上文所描述的4小时AST方法对于非无菌样品是稳健的，而对其中存在额外细菌的CLSI BMD方法则不稳健。
图47示出在存在呋喃妥因的情况下并且在金黄色葡萄球菌ATCC 25923浓度增加最多超过100倍时大肠杆菌BAA-2469的数据。CLSI样肉汤微稀释方法中的大肠杆菌MIC受到添加金黄色葡萄球菌菌株(在图中以X标记)的影响，其中MIC从不存在金黄色葡萄球菌时的8增加到黄色葡萄球菌过量100倍时的32。相比之下，不论金黄色葡萄球菌细胞的量如何，本发明所述的新颖4小时AST测定(MulitPath，圆圈)具有相同的MIC(8)(虚线)。
图47到图49示出与仅存在大肠杆菌BAA-2469的CLSI肉汤微稀释相比，使用该新颖方法(MulitPath)确定的原始MIC值。图46中的表示出在存在增加的脱靶细菌的情况下大肠杆菌的总体基本一致性。仅1e7弗氏柠檬酸杆菌与呋喃妥因的单一条件导致缺乏基本一致性，但这没有改变在所有抗生素和所有脱靶细菌中有100％一致性的分类敏感/中等/耐药性确定。
结论.实例表明，使用本发明的抗微生物剂敏感性测试，在含有甚至大量的其它物种的其它微生物的样品中实现靶病原体的准确抗微生物剂敏感性测试结果不需要细胞纯化。
变型：该实例说明了该新颖FISH方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液浓度和尿液处理程序。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图45示出在存在金黄色葡萄球菌的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而BMD的MIC随着金黄色葡萄球菌的增加而增加。
图46示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性的汇总。
图47示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和弗氏柠檬酸杆菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图48示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(藤黄微球菌、鲍氏不动杆菌、极小棒状杆菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图49示出了在存在不同接种水平的脱靶微生物(肺炎克雷伯菌)的情况下的大肠杆菌与标准BMD的一致性。
图50是在该实例10中使用的探针序列的表。
实例11.在存在表达β-内酰胺酶的细菌的情况下快速抗微生物剂敏感性测试对内 酰胺抗生素而言是准确的
概述.当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含其它微生物的靶病原体群。通常方法(即集落纯化)需要2到5天递送结果。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。
一个原因是，当前方法需要冗长的细胞纯化过程，因为这些方法使用非特异性检测方法，如增加浊度以确定哪些抗微生物剂抑制微生物培养基中的靶病原体的生长。当使用细胞复制品的非特异性测量时，仅可以在仅含有靶病原体的细胞的情况下知道所示生长是由于靶病原体引起的。
相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需集落纯化步骤。该方法与当前方法的不同之处在于，其特异性地评估靶病原体在含有抗微生物剂的微生物培养基中的生长。在另一个实例中表明，在存在大量来自脱靶物种的细胞的情况下，本发明的方法是准确的。
在该实例中，通过在存在脱靶物种的情况下执行靶病原体的抗微生物剂敏感性测试来解决可能引起的另一个挑战。
在此表明，在含有大量的使已知的酶分解正在测试的抗微生物剂的脱靶物种的人为尿液样本中，本发明的方法递送靶病原体的准确抗微生物剂敏感性测试结果。理论上，这可以潜在地显著改变抗微生物剂的浓度以改变抗微生物剂敏感性测试结果。
在该实例中，表明在存在大量的产生分解该类型的抗微生物剂的酶的脱靶病原体的情况下，快速抗微生物剂敏感性测试实现了两种碳青霉烯抗生素(美罗培南和亚胺培南)的准确抗微生物剂敏感性测试结果。
实验程序.抗生素板的制备：在非无菌样品对靶MIC的影响的实例中如所描述的制备抗生素板。
培养物的制备：分别将大肠杆菌ATCC 25922的三到五种集落、对大多数抗生素和肺炎克雷伯菌CDC 0141敏感的细菌菌株、在许多其它耐药性基因中表达β-乳糖酶OXA-181的菌株各自接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下温育1到2小时。通过光谱仪来测量光密度，并且将生物体稀释于1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中。将大肠杆菌稀释成5×105CFU/mL(CLSI标准浓度)，而将肺炎克雷伯菌稀释成各种接种物(范围为1×106和5×108CFU/mL)。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成3.75×106个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在立即用于最小化聚合之前，对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前的时间零点(TO)的针对每份临床尿液样本的测定信号。将每份30μL的经过处理的尿液添加到含有物种特异性Alexa647N标记的DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针的70μL 1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)中。在表A中示出了所使用的探针序列。然后将100μL的混合物添加到含有脱水的杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、0.18％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、0.77％CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、0.72％SB3-12(西格玛公司，目录号D0431)、0.13M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277))的微量滴定板的孔中。然后将所制备的10μL的磁性颗粒混合物添加到孔中。将100μL的该反应混合物转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(西格玛公司，目录号T1075)、7.5％v/vOptiprep(西格玛公司，目录号D1556)、50mg/mL直接黑19(东方，目录号191L)的微量滴定板并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：在存在肺炎克雷伯菌-OXA的不同接种物的情况下，测试大肠杆菌对以下2种抗微生物剂的敏感性：亚胺培南和美罗培南。当存在时间零点细胞定量时，将10μL的大肠杆菌物种(5×106CFU/mL)、10μL肺炎克雷伯菌(l×106到1×108CFU/mL)或10μL培养基(对照)、10μL的合并尿液和60μL MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到已经含有10μL抗生素的抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有所有6种浓度的每种抗生素的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果.
图51示出了在存在通过产生使亚胺培南抗生素降解的β-内酰胺酶而对亚胺培南抗生素具有耐药性的肺炎克雷伯菌菌株的量增加的情况下，对亚胺培南敏感的大肠杆菌菌株的MIC。将本发明的新颖快速AST方法与BMD方法进行比较。新颖4.5小时AST方法不受甚至高浓度的β-内酰胺酶存在的影响，该β-内酰胺酶产生MIC始终小于1μg/mL亚胺培南的肺炎克雷伯菌。相比之下，BMD方法在16到24小时生长之后示出敏感大肠杆菌菌株的MIC随着肺炎克雷伯菌水平的增加而增加，该菌株将被错误地确定为对该抗生素具有耐药性。
图52示出了内酰胺类抗生素美罗培南的类似结果。
结论.本发明的新颖4.5小时AST方法示出，即使在存在表达使抗生素降解的碳青霉烯酶的高浓度耐药性细菌的情况下，对碳青霉烯抗微生物剂敏感的细菌的MIC确定是准确的。
变型.该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度等)、尿液的浓度和尿液处理程序。该方法还可以扩展到另外的内酰胺敏感配对和表达细菌的β-内酰胺酶。
图51是在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的情况下，对用于确定大肠杆菌的亚胺培南MIC的新颖快速AST和BMD方法的比较。
图52示出了在存在水解肺炎克雷伯菌的B-内酰胺酶菌株的耐药性碳青霉烯的不同接种物的情况下与上文所述的方法保持一致的大肠杆菌的MIC，而标准BMD现在也是如此。
图53是在该实例11中使用的探针序列的表。
实例12.在不进行基于培养的细胞纯化的情况下对尿液中的细菌进行准确快速抗 微生物剂敏感性测试
概述：当前用于抗微生物剂敏感性测试的方法需要冗长的基于培养的集落纯化以确保纯的不含样本本身的仅病原体细胞群。因此，指示哪种抗生素对杀死引起感染的病原体最佳的抗微生物剂敏感性测试结果在2到5天内尚不可用。与此同时，利用对杀死引起感染的病原体可能不是最佳并且甚至可能完全无效的强力广谱抗生素凭经验治疗患者。而且，利用广谱抗生素的经验治疗使抗生素耐药性扩散。
相比之下，本发明的方法可以直接从样本递送准确的抗微生物剂敏感性测试结果，而无需冗长的集落纯化步骤。在此示出当在没有集落纯化的情况下测试尿液样品中的细菌时，新抗微生物剂敏感性测试结果没有受到显著影响。该实例表明，在包括15份不同培养阴性尿液样品的尿液基质(10％)的人为样品中，快速抗微生物剂敏感性测试方法准确地确定了大肠杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)。
实验程序.尿液样本：从发现生命科学公司(Discovery Life Sciences)购买十五份培养阴性临床尿液样品(剩余的)。在收集之后>7天接收样品并将其储存在-80℃下直到使用为止。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，对尿液执行常规尿液培养以确定样品是培养阴性的。简而言之，将经过校准的1μL环放置到充分混合的尿液样品中，并且均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上并在35℃的空气温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行测定，如下文所述。
抗生素板的制备：以比预期最小抑制浓度(MIC)高10倍的浓度开始，按2倍系列稀释制备含有六种浓度的每种抗生素的微量滴定板。所使用的抗生素是头孢唑啉、环丙沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑。通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证抗生素稀释液处于适当耐受性内。选择用于测试跨越CLSI报道的大肠杆菌抗生素断点的每种抗生素的浓度。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，含有水或稀释剂的八个孔包含在板中以允许无抗生素阳性和阴性生长对照。
培养物的制备：使用三到五个接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡下温育1到2小时的集落来生长大肠杆菌(BAA-2469)的对数培养物。通过分光光度计来测量光密度，并且将生物体在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中稀释成5×106CFU/mL(在每个100μL的反应中，最终浓度为5×105CFU/mL)。
磁性颗粒的制备：将2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对每种尿液样品的测定信号。将10μL经过稀释的大肠杆菌添加到70μL杂交缓冲液中：最终浓度：3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)缓冲液(西格玛公司，目录号S6639)、1％CHAPS(西格玛公司，目录号C3023)、1％NOG(西格玛公司，目录号08001)、1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)(来自2X储备液)(天惠华公司，目录号M5866)和非特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针(关于探针标记、序列和浓度，参见表A)。通过将10μL的每种单独尿液直接添加到混合物中来获得最终浓度为10％的尿液。将如上文所描述制备的10μL磁性颗粒混合物直接添加到该混合物中。将现在含有杂交混合物、尿液和磁性颗粒的100μL样品转移到每孔(先前干燥的)含有50μL的“染料垫”(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222))的微量滴定板，在60℃下在对流烘箱中干燥3小时并在35℃下温育30分钟。温育之后，将微量滴定板放置到磁场(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个微量滴定板孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼(Sony)IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：测试掺有培养阴性临床UTI尿液样品对以下5种抗微生物剂的敏感性：头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲噁唑。根据上文所描述的方法制备含有这些抗微生物剂的抗生素板。同时，当发生时间零点细胞定量时，将10μL大肠杆菌、10μL尿液和70μL IX MHB II(天惠华公司，目录号M5860)添加到抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立空气温育箱中生长4小时。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将每孔100μL经过温育的样品-抗生素板转移到脱水缓冲液板的对应孔，并以与上文所述相同的方式与FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将MulitPathTM测定的结果与根据CLSI方法M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有所有6种浓度的每种抗生素的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种尿液样品/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。结果被相应地分配成对每种抗生素敏感、中等或具有耐药性的种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。在不存在抗生素的情况下四小时生长是对照条件以确保活细菌存在于经过处理的尿液样品中。
结果.下面的图示出基质对AST结果几乎没有影响。
图54示出了通过新颖AST方法(黑色圆圈)确定的大肠杆菌BAA-2469的MIC与在不存在针对左氧氟沙星的尿液的情况下(虚线)通过黄金标准CLSI BMD方法确定的MIC的比较。阴影区域是基本一致性区域，该区域通常被认为是在符合CLSI的BMD过程的可接受误差范围内。使用与CLSI方法精确匹配的新颖AST方法确定针对大肠杆菌BAA-2469的大多数左氧氟沙星的MIC，并且剩余两个落在2倍基本一致性区的范围内。
图55总结了获得的所有5种抗生素的结果。使用新颖AST方法在15份培养阴性临床尿液样品中观察到与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。
图56示出使用新颖AST方法确定的掺有大肠杆菌的15份培养阴性临床尿液样品的MIC与在被测的5种抗生素中的符合CLSI的BMD过程中观察到的MIC的比较。图示出了左氧氟沙星与15份掺入标准BMD中的培养阴性临床UTI尿液样品中的每份的100％基本一致性。
结论.本发明的方法准确地确定了(在相对于黄金标准BMD方法的基本一致性区内)在所有15种不同的尿液基质中测试的所有5种抗生素的UTI病原体(大肠杆菌)的MIC。因此，该新颖4小时抗微生物剂敏感性测试有能力提供直接来自尿液样本的准确结果，而不需冗长的基于生长的集落纯化，从而节省大量时间。通过允许快速启动正确、有效的抗生素治疗并避免加剧抗生素耐药性扩散，快速AST结果可以改善患者护理。
变型.该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)和尿液浓度。该方法还可以清楚地应用于其它细菌和非细菌病原体以及尿液之外的最少处理的临床基质。
图54示出了15份尿液的基本一致性。
图55示出了15份掺有培养阴性临床UTI尿液样品中的每份与标准BMD的100％基本一致性和100％分类一致性。
*头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑。
图56示出了与标准BMD方法(“符合CLSI”)相比，掺有如通过新颖AST方法所确定的大肠杆菌的15份尿液样品的MIC。浓度以μg/ml为单位。
图58是在该实例12中使用的探针序列的表。
实例13.对多种微生物中的多种靶标进行快速且准确的AST
概述.多种微生物感染在包含伤口的许多类型的感染中很常见。对于此类可能威胁生命的感染，确定哪些抗微生物剂可能对每种传染性病原体有效是至关重要的。当前的抗微生物剂敏感性测试方法需要2到5天来纯化多种微生物感染中的大量的每种传染性病原体，之后对该传染性病原体进行分析。
该实例表明本发明的系统和方法在仅4.5小时内直接从患者样本中产生快速AST结果，而无需冗长的集落纯化的潜力。与肉汤微稀释参考标准结果相比，该方法在人为的2种靶多种微生物混合物中实现了针对每个靶物种的AST结果(MIC值)。
实验程序.
抗生素板的制备：制备了含有6个环丙沙星浓度的2倍系列稀释系列的微量滴定板。在最终肉汤微稀释中以比期望的浓度高10倍的浓度制备了2倍稀释系列，使得添加细胞/尿液/培养基混合物将产生正确的抗生素范围。然后将每份10uL的抗生素稀释液等分到96孔板的适当的孔中。通过确认至少两个CLSI QC菌株的MIC落入CLSI文件M100Ed29E-2019中报告的QC范围内，验证抗生素稀释液处于适当耐受性内。除了含有抗微生物剂稀释系列的孔之外，包含含有水或其它稀释剂的足够的孔用于无抗生素阳性生长对照。将抗生素板在-80℃下冷冻并在使用之前完全解冻。
培养物的制备：选择针对四种不同生物体(大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌BAA-2469、肺炎克雷伯菌CDC 0076、肺炎克雷伯菌CDC 0043、铜绿假单胞菌CDC 0233、铜绿假单胞菌CDC 0236、粪肠球菌ATCC 29212和屎肠球菌ATCC 19434)的敏感菌株和耐药性菌株两者。表A中示出了菌株和其对每种被测的抗生素的耐药性。利用三到五个接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)并在35℃下在振荡时温育1到2小时的集落来分别生长每个菌株。通过光谱仪来测量光密度，并且将生物体在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHB II)(天惠华公司，目录号M5860)中稀释成1×107CFU/mL。
磁性颗粒的制备：将聚天冬氨酸缀合磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)的溶液以1:20在pH为8.2的50mM EPPS缓冲液中稀释成2.75×1012个颗粒/mL。将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。这些颗粒使光学系统能够聚焦在正确的板上。在用于最小化聚合之前，立即对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。制备了单独的磁性颗粒悬浮液用于下文所描述的时间零点测定和时间四小时测定。利用2种羟丙基三甲基氯化铵涂覆的二氧化硅磁性颗粒(SiMag-Q，Chemicell，目录号1206-5)进行相同的程序。
在AST时间零点进行细菌细胞标记：确定了在存在或不存在抗生素的情况下在开始细菌生长之前(时间零点或TO)针对每个物种和菌株的测定信号。将5μL靶标A与5μL靶标B或5μL MHB II组合以达到最终浓度5×106CFU/mL每生物体，将其添加到80μL杂交缓冲液(最终浓度：3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠pH 7)(西格玛公司，目录号S6639)、0.25M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号503-84-0)、5％PEG MW 3350(西格玛公司，目录号P-3640)、7.5％Igepal CA-630(西格玛公司，目录号13021)、0.2％溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII)、物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针(在表B中找到序列和浓度))。通过将10μL的合并尿液(创新研究公司，目录号IR100007P-24203)直接添加到100μL总反应的混合物中来获得最终浓度为10％的尿液。将如上文所描述制备的10μL SiMag-Q磁性颗粒混合物(针对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌菌株正被标记的条件)或Fluidmag-PAA磁性颗粒混合物(针对肠球菌被标记的条件)直接添加到该混合物中。将现在含有杂交混合物、尿液和磁性颗粒的100μL样品转移到含有50μL的染料垫(50mM TRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的微量滴定板，在60℃下进行干燥(干垫板)并在35℃下温育30分钟。在该温育之后，将微量滴定板放置到强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)上持续4分钟以使经过标记的和磁性颗粒相互作用的细菌细胞极其邻近成像表面。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM实验室成像系统是能够从微量滴定板的所选孔中自动捕获图像数据的定制仪器和软件。使用来自前科学公司(马萨诸塞州洛克兰郡)的高精度线性台将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。该仪器可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量12位的3.1MP索尼(Sony)IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
四小时生长：测试含有两个物种的多种微生物样品对以下1种抗微生物剂的敏感性：环丙沙星。根据上文所描述的方法制备含有这些抗微生物剂的抗生素板。同时，当发生时间零点细胞定量时，将5μL待标记和检测到的物种和5μL可能存在于多种微生物UTI感染(但将不标记)或MHB II中作为对照的细菌物种、10μL合并尿液和70μL MHB II添加到抗生素板的每个孔中。允许样品在35℃下在站立空气温育箱中生长4小时。在该实例中的每个菌株在一种情况下充当经过标记的靶标物种，并且在另一个情况下充当多种微生物对的未经标记的成员。
在AST时间四小时生长时标记细菌细胞：在存在和不存在抗生素的情况下在已经温育样品四小时(T4)之后，对细胞进行标记并定量以确定发生多少生长(如果有的话)。将10μL经过温育的样品-抗生素板(10％)转移到微量滴定板并以与上文所述相同的方式与100μL杂交缓冲液、FISH探针、辅助探针、磁性颗粒和聚焦颗粒进行组合以测定时间零点。
比较方法：将使用在此所描述的新颖AST方法的结果与根据CLSI M07-Edl3E 2018执行的肉汤微稀释(BMD)进行比较。
数据分析和阈值生成：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。在时间零点以及在没有抗生素和有所有6种浓度的环丙沙星的情况下的时间四小时生成基于该检测算法的细胞的数量。对于每种样品接种物/药物浓度，生长倍数计算为生长之后(时间四)含有抗生素的孔中的信号:生长之前(时间零点)尿液样品中的信号。使用生长倍数并观察在符合CLSI的肉汤微稀释中对应孔中的生长，逻辑回归模型用于生成阈值以确定生长倍数截止值高于在存在抗生素的情况下生长的细胞(并且因此在那个浓度下具有耐药性)并且低于在染色过程中的细胞(并且因此在那个浓度下具有敏感性)。生长倍数降到低于所确定的阈值的点是由测定产生的MIC值。基于CLSI M100Ed282018指南，将MIC结果对应地分配到敏感、中等或耐药性种类。然后将所有数据与CLSI标准BMD进行比较。
结果.
图60示出不论是否存在第二敏感或耐药性细菌，通过新颖4.5小时AST方法确定的靶细菌的所有MIC在2倍容差范围内，被针对每种靶细菌的(在不存在第二细菌的情况下确定的)黄金标准BMD方法(称为基本一致性)所接受。
图61示出通过新AST方法对每种靶细菌的敏感和耐药性确定不受这些成对组合的影响并且与BMD确定100％一致。
结论.本发明的AST方法可以在4.5小时内准确地确定多种微生物样品中的每个物种的抗生素敏感性，而无需当前方法所需的耗时的集落纯化。结果示出本发明确定抗微生物剂可以在仅数小时内而不是当今方法所需的数天内有效地治疗威胁生命的多种微生物感染的潜力。
变型.该实例说明了该新颖AST方法的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)和替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本、其它细菌和其它抗生素。
图61示出了在该实例中使用的环丙沙星敏感性菌株和环丙沙星耐药性菌株。
图62是在该实例13中使用的探针序列表的前半部分。
图63是在该实例13中使用的探针序列表的后半部分。
图64示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的基本一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的基本一致性。
图65示出了在存在2种靶生物体的情况下的多种微生物感染的分类一致性。如下文所示，上文所描述的AST方法产生了与标准BMD 100％的分类一致性。
实例14.对自动化仪器上的盒中的单个样本中的多个靶病原体的快速且准确检测
概述.多种微生物感染(即由多于一个细菌物种引起的感染)是常见的。当前用于鉴定病原体的基于培养和基于MALDI-TOF的方法需要冗长的集落纯化步骤以单独纯化每个靶标物种的大量细胞。该实例表明，本发明的FISH方法用于在30分钟内在含有所有测定试剂的一次性消耗盒内部的自动化分析仪上检测并鉴定人为尿液样品中存在的靶病原体的多个物种。实例示出了本发明的系统和方法快速并特异性地鉴定多种微生物感染中的多种靶病原体的潜力。
实验程序.
尿液样本：从发现生命科学公司购买十份培养阴性临床尿液样品(剩余的)。在收集之后>7天接收样品并将其储存在-80℃下直到使用为止。对于每一份样品，记录尿液颜色、pH和微粒的存在。在接收时，对尿液执行常规尿液培养以确定样品是培养阴性的。简而言之，将经过校准的1uL环放置到充分混合的尿液样品中，并且均匀地遍布在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA，BD目录号221185)板上并在35℃的空气温育箱中温育18到24小时。对剩余的尿液样品进行处理和测定，如下文所述。
尿液处理：在执行鉴定(ID)之前，使用尺寸排阻色谱法去除尿液防腐剂和其它潜在干扰化合物。将2.5mL的每种临床阴性尿液样品应用于预洗涤的ZebaTM旋转脱盐柱，7KMWCO(赛默飞世尔公司，目录号89893)。如制造商所描述的，通过离心使样品穿过柱。
盒中脱水试剂的制备：在执行鉴定(ID)之前，将45μL 2.2X浓杂交缓冲液(6.7XSSC(1M NaCl、0.1M柠檬酸钠、(西格玛公司，目录号S6639)、0.4％w/v溴化十六烷基三甲铵(西格玛公司，目录号H9151)、1.71％w/v CHAPSO(西格玛公司，目录号C3649)、1.6％SB3-12w/v(西格玛公司，目录号D0431)和0.29M硫氰酸胍(西格玛公司，目录号G9277)分配到盒的6个试剂孔中。一旦通过分析仪处理之后在最终100μL体积中再水合，就将产生正常的1X杂交缓冲液(3X SSC(0.45M NaCl、0.045M柠檬酸钠)、0.18％溴化十六烷基三甲铵、0.77％CHAPSO、0.72％Sb3-12和0.13M硫氰酸胍)。将1.8μL的每种靶标物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针和未经标记的DNA辅助探针混合物添加到8个试剂孔中的2个试剂孔中(对于1个盒中的每个靶标，N＝2)。将大肠杆菌FISH寡核苷酸探针集添加到对应于盒定位A1和A2的试剂孔中，将肺炎克雷伯菌探针集添加到对应于盒定位A3和A4的试剂孔中，并且将铜绿假单胞菌探针集添加到对应于盒定位A5和A6的试剂孔中。然后，将含有杂交缓冲液和特异性探针的这些盒孔在50℃的对流烘箱中温育16到20小时以使材料脱水。
磁性颗粒的制备：将聚天冬氨酸缀合的磁性颗粒(Fluidmag-PAA，Chemicell，目录号4108)以1:20稀释于pH为8.2的50mM Epps缓冲液中直到浓度为2.75×1012个颗粒/mL，最终浓度为10％w/v海藻糖(西格玛，目录号T9449)。为了该稀释，将含有绿色染料(深绿色荧光微球，BANGS实验室，目录号MEDG001)的荧光磁性微球添加到悬浮液中，最终浓度为3×106个颗粒/mL。在立即用于最小化聚合之前，对磁性颗粒混合物进行超声处理持续1分钟。然后将混合物冻干在10μL体积珠(每反应2.64×1012PAA个颗粒)中，并且将1个珠放置在6个试剂孔中的每个试剂孔中。
培养物的制备：利用三到五个接种到5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，哈迪诊断公司，目录号U65)中并在35℃下在振荡时温育1到2小时的集落来分别生长三种不同靶病原体(大肠杆菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 13883和铜绿假单胞菌ATCC 27853)的对数培养物。通过光谱仪来测量光密度，并且将生物体在1X阳离子调整的米勒-海顿肉汤(MHBII，天惠华公司，目录号M5860)中稀释成约5×106CFU/mL。
细菌细胞标记和鉴定成像：在最终浓度为30％的经过处理的尿液中，确定了每个靶病原体在含有两种所关注的细菌(总共3个2-细菌组合)的人为多种微生物混合物中的测定信号。在10份独特的不同培养阴性临床样品(总共测试30份尿液)中测试每个多种微生物细菌组合。将103.5μL细菌靶标A(约5×105CFU/mL每反应)、103.5μL细菌靶标B(约5×105CFU/mL每反应)、360μL尿液和633μL组合成总体积为1.2mL；将1mL该混合物转移到盒样品添加端口中。然后将盒放置在仪器上，并且自动执行所有后续动作。首先将样品在真空下引导到盒顶部的6个生长孔中。然后将样品立即移动到反应孔中，从而再水合杂交缓冲液/FISH探针混合物和所冻干的磁性颗粒。然后样品继续到含有45μL脱水的“染料垫”(50mMTRIS pH 7.5(天惠华公司，目录号T5075)、7.5％v/v Optiprep(西格玛公司，目录号D1556)、5mg/mL直接黑-19(东方，目录号3222)的光学窗口，在60℃下在对流烤箱中干燥3小时并在35℃下在分析仪上温育30分钟。在该温育之后，将盒重新定位到磁体站并放置在强大的永磁体(德克斯特磁技术公司，目录号54170260)顶部持续4分钟以使经过标记的和磁性颗粒相互作用的细菌细胞邻近孔的底部处的成像表面。最后，将盒移动到成像站并且使用如下文所描述的非放大CCD成像仪进行成像。简而言之，通过拍摄绿色通道中的荧光磁性微球的连续图像、所确定的聚焦平面以及在该定位处在红色通道中拍摄的对应图像来聚焦在每个单独孔上以对经过标记的细菌细胞进行成像。
经过标记的细胞的成像：MultiPathTM分析仪成像系统是能够从MultiPath盒的所选孔中自动捕获图像数据作为完全自动化测试的定制仪器和软件。使用定制设计的精度3轴定位系统将每个孔定位在基于荧光的图像采集子系统之上。分析仪可以以4个独立的颜色通道成像，并使用物镜、照明LED、荧光滤光片组和相机。物镜的视场被设计成捕获整个盒成像孔的图像。照明模块光源由每个颜色通道2个高功率LED组成。使用每像素定量为12位的3.1MP索尼IMX265黑白传感器，利用相机捕获一系列荧光图像帧。然后通过对多个帧进行求和来形成每个孔的最终图像。使用635/25nm激发滤光片和667/30nm发射滤光片在100毫秒曝光下捕获16个帧。在470/40nm激发滤光片和520/40nm发射滤光片处对聚焦颗粒进行成像并在20毫秒曝光下捕获2个帧。
数据分析：使用由CCD相机捕获的图像，通过研究视场中对象的数量和对象强度两者的算法来估计检测到的细胞。如果测定信号高于130，则通道中的信号被认为检测到。
结果.数据表明在单个样品中成功鉴定2个靶病原体，而没有检测到不存在的病原体(即FISH探针对非靶细菌无交叉反应性)。
图66示出了在对大肠杆菌/肺炎克雷伯菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。
图66示出了在对大肠杆菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒运行(N＝10)。
图68示出了对肺炎克雷伯菌/铜绿假单胞菌混合的样品进行测试的盒(N＝10)。由于该盒失效，将肺炎克雷伯菌/铜绿假单胞菌盒6号从分析中去除以产生有效结果。另外，在大肠杆菌/铜绿假单胞菌盒9号的A3中观察到伪影，该伪影使孔中的信号看起来异常地高，因此该单个复制品被消除。该排除点(孔A4)的复制品没有该伪影，因此将肺炎克雷伯菌仍然分类为未检测到。尽管测定信号在不同的盒中有所不同，在除了那些已经描述的情况之外的所有情况中，检测到添加到培养阴性尿液中的两种细菌，而在含有没有被添加的细菌的探针的孔中观察到非常低的信号。
结论.该实例表明，本发明的利用可消耗盒内部的稳定试剂在自动化分析仪上执行的等温FISH方法可以特异性地鉴定人为尿液样品中的多个靶细菌物种。这示出了在多种微生物感染中鉴定多种病原体的方法的潜力。实例还表明了方法的特异性，因为没有观察到跨物种检测。
变型.该实例说明了该新颖FISH方法在盒上的执行并且不限于描述中包含的具体细节。本领域的技术人员将容易理解许多变型因此是可能的，该变型包含使用不同探针序列和核酸结构(PNA、LNA等)、替代性测定化学(不同的去垢剂、离液剂、荧光团、缓冲液、pH、温度、反应时间、组分浓度)、尿液的浓度和尿液处理程序以及对反应物稳定的改变(组分的冻干)。该方法还可以清楚地扩展到其它生物样本和其它细菌和非细菌病原体。
图66示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图67示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图68示出了靶病原体仅在含有其物种特异性DNA寡核苷酸FISH探针的孔中被检测到。
图69是示出检测到靶病原体而未检测到其它非靶病原体的表“实例14的表A”。
图70是示出在该实例14中使用的探针序列的表“实例14的表B”。
实例16：使用羧基荧光素二乙酸酯非特异性检测活细菌
概述.在该实例中，使用大区域成像来检测单独的用荧光酯酶底物染色的金黄色葡萄球菌细菌细胞靶标。底物可以扩散穿过完整活细胞的细胞膜，其中该底物在新陈代谢活性细胞中所示的酯酶作用下发荧光并带电。这些带电荧光产物不能再被动地扩散穿过细胞膜并且被俘获在完整细胞中。因此，该技术可以区分活细胞和死细胞，因为仅具有活性酯酶和完整细胞膜的细胞将适当地染色。在该实例中，利用荧光底物羧基荧光素二乙酸酯(cFDA)标记金黄色葡萄球菌细胞并使用非放大技术成像对其进行成像。
实验方法.
细菌细胞制备：
使金黄色葡萄球菌ATCC 29213在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，BD目录号211822)中过夜生长。通过将100uL过夜培养物接种到5ml的新鲜TSB培养基中并在35℃下在振荡温育箱中进一步温育2.5小时来制备金黄色葡萄球菌的对数培养物。
磁性颗粒的制备：
通过使用标准EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联化学将磁性颗粒(Ademtec，292nm)与鸡抗蛋白A抗体(子午线生物科学公司(Meridian Biosciences))偶联来制备抗体缀合的磁性颗粒。
细菌细胞的标记和捕获：
在96孔微量滴定板中执行测定，并且每个孔包含40uL金黄色葡萄球菌(含10,000个细胞的TSB)或仅TSB(无细胞对照)、5uL 10mM cFDA(生命技术公司(LifeTechnologies))和5ul抗体缀合的磁性颗粒(2e10/mL)。在室温下将反应温育15分钟。在温育之后，将40uL的反应混合物仔细地覆盖在75ul的“染料垫”(具有5mg/mL铬变素2R的15％Optiprep)上，该染料垫在黑色透明底半区微量滴定板(葛莱娜公司675096，VWR部件号82050-056)上进行预等分。将微量滴定板放置到磁场上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
细菌细胞的成像：
在磁性捕获经过标记的细胞:磁性颗粒复合物之后，将微量滴定板放置在CCD数码相机(IDS，型号UI-2250SE-M)上方的台上并用来自LED的穿过滤光片(469nm，35nm FWHM)的光照亮。通过相机检测到穿过发射滤光片(520-35nm)的荧光信号以创建荧光复合物的图像。使用枚举单独细胞的FLimage软件(第一光生物科学公司(First Light Biosciences))对图像进行分析。
结果.
图146示出金黄色葡萄球菌细胞(左图)检测为明亮荧光斑点，而没有细胞的培养基(右图)仅含有被分类为碎片的对象。在具有经过标记的金黄色葡萄球菌细胞的场中的斑点数量为约5000，并且其与输入细菌的期望数量密切相关。
结论.该实例表明用于非特异性地枚举细菌的方法。该方法可以用于对来自样本中的覆盖宽范围的细菌物种的混合群体进行计数。具体地，实例表明了本发明的非放大成像方法枚举少量细菌细胞的能力，该细菌细胞用羧基荧光素二乙酸酯(即非特异性地标记含有普遍存在的酯酶的活细胞的荧光底物)进行标记。
变型.存在包含核酸染色剂(如STYO和SYBR家族染色剂、碘化丙啶和DAPI)的用于非特异性细胞标记的其它染色剂。可以使用其它区分活细胞或死细胞的染色剂。例如，其它荧光底物或可能或可能不穿过完整细胞膜的DNA染色剂可以替代cFDA或FDA或与其结合使用。可以通过使用针对荧光检测的多种激发和发射波长来区分多种染色剂和染料。与对象相关联的荧光光谱可以用于确定细胞是否被计数为活的或死的。另外，对特定类型的细菌的生化活性具有特异性的荧光底物可以用于确定其存在。例如，可以通过□-半乳糖苷酶将荧光□-半乳糖苷酶底物裂解成其荧光产物，该半乳糖苷酶对大肠菌具有特异性。该方法还可以应用于大多数细菌和含有多种细菌物种的样本。方法适合于以最少处理检测许多不同临床样本类型中的细菌(例如，尿液、痰、拭子、脊髓液等)。
实例15：使用DNA染色染料对细菌进行非特异性检测
概述.在该实例中，使用大区域成像来检测单独的活金黄色葡萄球菌细菌细胞靶标，该靶标用DNA结合性染色剂进行染色。DNA结合性染料可以扩散穿过完整的活细胞的细胞膜，其中在与细菌的DNA结合之后，该染料成为高度荧光的。一旦与DNA结合，这些染料不能再容易且被动地扩散穿过完整细胞膜并被俘获在完整细胞内。当区分活细胞和死细胞很重要时，该技术可能有用，因为与死细胞或膜受损的细胞相比，具有完整细胞膜的活细胞将用不同染料不同地染色。在该实例中，用DNA结合性荧光染料(即SyBR绿色)标记金黄色葡萄球菌，并使用非放大大区域CCD成像对其进行成像。
实验方法：
细菌细胞制备：
使金黄色葡萄球菌ATCC 29213在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，BD目录号211822)中过夜生长。通过将100uL过夜培养物接种到5ml的新鲜TSB培养基中并在35℃下在振荡温育箱中进一步温育2.5小时来制备金黄色葡萄球菌的对数培养物。
磁性颗粒的制备：
通过使用标准EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联化学将磁性颗粒(Ademtec，292nm)与鸡抗蛋白A抗体(子午线生物科学公司(Meridian Biosciences))偶联来制备抗体缀合的磁性颗粒。
细菌细胞的标记和捕获：
在96孔微量滴定板中执行测定，并且每孔包含40uL金黄色葡萄球菌(含10,000个细胞的TSB)或仅TSB(无细胞对照)、5uL 500倍经过稀释的SyBR绿色染料(目录号S7563，生命技术公司)和5ul抗体缀合的磁性颗粒(2e10/mL)。在室温下将反应温育15分钟。在温育之后，将40uL的反应混合物仔细地覆盖在75ul的“染料垫”(具有5mg/mL铬变素2R的15％Optiprep)上，该染料垫在黑色透明底半区微量滴定板(葛莱娜公司675096，VWR部件号82050-056)上进行预等分。将微量滴定板放置到磁场上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
细菌细胞的成像：
在磁性捕获经过标记的细胞:磁性颗粒复合物之后，将微量滴定板放置在CCD数码相机(IDS，型号UI-2250SE-M)上方的台上并用来自LED的穿过滤光片(469nm，35nm FWHM)的光照亮。通过相机检测到穿过发射滤光片(520-35nm)的荧光信号以创建荧光复合物的图像。使用枚举单独细胞的FLimage软件(第一光生物科学公司(First Light Biosciences))对图像进行分析。
结果.
图146示出金黄色葡萄球菌细胞(左图)检测为明亮荧光斑点，而没有细胞的培养基(右图)仅含有被分类为碎片的对象。在具有经过标记的金黄色葡萄球菌细胞的场中的斑点数量为约5000，并且其与输入细菌的期望数量密切相关。
图59仅示出了金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞(左图)和TSB培养基(右图)。
结论.该大区域、非放大成像系统能够检测并枚举用SyBR绿色(即非特异性地标记活细胞的DNA结合性染料)标记的细菌细胞。
变型.可以使用其它区分活细胞或死细胞的染料。例如，可能或不能穿过完整细胞膜的其它荧光DNA染色剂可以替代SyBR绿色或与其结合使用。可以通过使用针对荧光检测的多种激发和发射波长来区分多种染色剂和染料。与对象相关联的荧光光谱可以用于确定细胞是否被计数为活的或死的。另外，对特定类型的细菌的生化活性具有特异性的荧光底物可以用于确定其存在。例如，可以通过□-半乳糖苷酶将荧光□-半乳糖苷酶底物裂解成其荧光产物，该半乳糖苷酶对大肠菌具有特异性。该方法还可以应用于大多数细菌和含有多种细菌物种的样本。方法适合于以最少处理检测许多不同临床样本类型中的细菌(例如，尿液、痰、拭子、脊髓液等)。其它核酸染色剂可以非特异性地标记细菌细胞，该染色剂包含SYTO/SYBR家族染色剂的其它成员、碘化丙啶和DAPI。
实例5：使用抗体涂覆的磁性颗粒和荧光标记的抗体特异性地检测多形核中性粒 细胞(PMN)
概述.多形核中性粒细胞(PMN)的存在和数量可以为检测感染提供诊断信息。例如，尿液样品中的数量少的中性粒细胞帮助排除泌尿道感染。在该实例中，非放大数字成像用于枚举用荧光标记的抗体染色的多形核中性粒细胞(PMN)靶标。在该实例中，已经使用抗CD15和抗CD16抗体来捕获和检测，这些抗体是存在于多形核中性粒细胞(PMN)的表面上的特异性分子。在一个实施例中，抗CD15抗体与磁性颗粒缀合，这些磁性颗粒用于PMN捕获和荧光标记的抗CD16抗体以使用非放大数字成像进行检测。
实验方法.
血液样品
从研究血液组分公司(Research Blood Components)(马萨诸塞州波士顿)获得来自健康供体的新鲜血液样品并将其用作PMN的来源。
磁性颗粒的制备：
通过使用标准ED AC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)偶联化学将磁性颗粒(Ademtec，292nm)与小鼠抗CD15抗体(百进生技公司(Biolegend))偶联来制备抗体缀合的磁性颗粒。
检测抗体
将Alexa
Figure BDA0003100857730001021
488抗人CD16抗体(百进生技公司)用作检测抗体。
PMN的标记和捕获：
在96孔微量滴定板中执行测定。每个孔包含38ul磷酸盐缓冲盐水(PBS)、2uL新鲜血液样品或2uL PBS(无PMN对照)、5uL Alexa-488标记的抗CD16抗体(1ug)和5ul抗体缀合的磁性颗粒(2elO/mL)。在室温下将反应温育15分钟。在温育之后，将40uL的反应混合物仔细地覆盖在75ul的“染料垫”(具有5mg/mL铬变素2R的15％Optiprep)上，该染料垫在黑色透明底半区微量滴定板(葛莱娜公司675096，VWR部件号82050-056)上进行预等分。将微量滴定板放置到磁场上持续4分钟以使部分含有经过标记的细胞的磁性颗粒穿过“染料垫”并邻近孔的底部处的成像表面。
PMN的成像：
磁性捕获经过标记的PMN之后：磁性颗粒复合物之后，将微量滴定板放置在CCD数码相机(IDS，型号UI-2250SE-M)上方的台上并用来自LED的穿过滤光片(469nm，35nm FWHM)的光照亮。通过相机检测到穿过发射滤光片(520-35nm)的荧光信号以创建荧光复合物的图像。使用枚举单独细胞的FLimage软件(第一光生物科学公司(First Light Biosciences))对图像进行分析。
结果.
图60示出了指示特异性地检测在血液样品中存在的PMN的MultiPath测定的结果，而没有血液样品的缓冲液具有非常低的可检测荧光信号。
结论.该大区域、非放大成像系统能够检测并枚举来自用针对细胞表面标志物的荧光标记的抗体标记的血液样品的PMN。结果示出了用于枚举诊断信息性人细胞或宿主细胞的本发明的系统和方法的潜力。
变型.使用其它细胞特异性抗体，可以检测各种生物样品中的不同细胞。例如，其它细胞表面标志物抗体可以识别不同的诊断信息性细胞。例如，定量鳞状上皮细胞对评估肺炎诊断中的呼吸道样品质量很重要。可以使用多种抗体/细胞表面标志物，并且可以通过使用多种用于荧光检测的激发和发射波长来区分经过标记的细胞。与对象相关联的荧光光谱可以用于确定是否为特定类型的细胞的信号。
通过引用并入
贯穿本公开已经参考和引用了其它文献，如专利、专利申请、专利出版物、杂志、书籍、论文、网络内容。出于所有目的将所有此类文献特此通过全文引用的方式并入本文中。
等效物
根据本文档的全部内容，包含对本文所引用的科学专利文献的参考，除了那些在本文中示出并且描述的内容之外，本发明的各种修改及其许多另外实施例对于本领域技术人员将变得显而易见。本文的主题包含重要信息、例证以及指导，它们可以适合于在本发明的不同的实施例及其等效物中实践本发明。

Claims (27)

1.一种用于抗微生物剂敏感性测试(AST)的盒，所述盒包括：
样本室；
多个分配孔，所述多个分配孔与所述样本室可选择地流体连通并且包括一种或多种抗微生物剂；以及
多个试剂孔，所述多个试剂孔与所述分配孔可选择地流体连通，每个试剂孔包括微生物结合性磁性颗粒和物种特异性微生物探针。
2.根据权利要求1所述的盒，其进一步包括可滑动阀，所述可滑动阀能从所述盒的外部操作以打开和关闭所述样本室、所述多个分配孔与所述多个试剂孔之间的流体连通通道。
3.根据权利要求2所述的盒，其中所述可滑动阀包括通道，当所述可滑动阀位于第一位置时，所述通道提供所述样本室与所述分配孔之间的直接流体连通，并且当所述可滑动阀位于第二位置时，所述通道提供从所述分配孔中的每个分配孔到所述试剂孔中的对应试剂孔的连接。
4.根据权利要求1所述的盒，其中每个物种特异性微生物探针包括荧光标记的寡核苷酸，所述荧光标记的寡核苷酸与特异性细菌物种的核糖体RNA的一段互补。
5.根据权利要求4所述的盒，其中所述微生物结合性磁性颗粒不是物种特异性的。
6.根据权利要求5所述的盒，其中所述磁性颗粒与细菌细胞表面结合。
7.根据权利要求1所述的盒，其进一步包括一个或多个成像孔，所述一个或多个成像孔各自与所述试剂孔中的对应试剂孔可选择地流体连通。
8.根据权利要求7所述的盒，其中每个成像孔包括检测表面和染料垫。
9.根据权利要求8所述的盒，其中所述染料垫包括密度梯度介质和邻近所述检测表面的染料，其中当跨所述染料垫施加磁场时，所述磁性颗粒和所结合的细菌被拉动穿过所述染料垫到达所述检测表面。
10.根据权利要求1所述的盒，其中所述微生物结合性磁性颗粒和所述物种特异性微生物探针以冻干珠形式提供，通过将所述样本递送到所述盒中，所述冻干珠被再水合和溶解。
11.一种盒，其包括：
温育孔；
物种特异性微生物探针；以及
透化剂，其中当将包括微生物的样本递送到混合孔中时，所述透化剂促进所述探针进入到微生物中，同时将所述样本维持在低于约40℃的温度下。
12.根据权利要求11所述的盒，其中所述探针包括荧光标记的寡核苷酸，所述荧光标记的寡核苷酸与特异性细菌物种的核糖体RNA的一段互补。
13.根据权利要求11所述的盒，其中所述透化剂包括一种或多种去垢剂。
14.根据权利要求13所述的盒，其中所述透化剂和所述探针以冻干珠形式提供，通过将所述样本递送到所述温育孔中，所述冻干珠被再水合和溶解。
15.根据权利要求11所述的盒，其进一步包括:
磁性颗粒，所述磁性颗粒与细菌细胞表面结合；以及
染料垫，所述染料垫邻近透明壁，其中当跨所述染料垫施加磁场时，所述磁场拉动所述磁性颗粒穿过所述染料垫到达所述透明壁。
16.根据权利要求15所述的盒，其中所述染料垫包括密度梯度介质溶液，所述密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针吸收光的染料。
17.根据权利要求15所述的盒，其中所述染料垫和所述透明壁设置在成像孔中，所述成像孔与所述温育孔流体连通。
18.根据权利要求17所述的盒，其中所述染料垫以干燥或冻干状态设置在所述盒内的所述成像孔中，直到被样本润湿为止。
19.根据权利要求17所述的盒，其进一步包括彼此平行的多个成对成像孔/温育孔组。
20.根据权利要求19所述的盒，其进一步包括接收储器，用户能将所述样本吸移到所述接收储器中进入所述盒中。
21.根据权利要求20所述的盒，其进一步包括可滑动门，所述可滑动门包括通道穿过的垫圈，其中当所述门定位在第一位置处时，所述接收储器至少与第一温育孔流体连通；当所述门位于第二位置时，所述接收储器、所述第一温育孔和第一成像孔全部彼此密封，并且当所述门位于第三位置时，所述第一温育孔和所述第一成像孔彼此流体连通。
22.根据权利要求21所述的盒，其进一步包括配件，所述配件用于与外部仪器耦接以从所述外部仪器接收气动压力，以便将所述样本从所述接收储器分配到所述温育孔中并且随后将液体从所述温育孔传递到对应的成像孔中。
23.根据权利要求15所述的盒，其中所述磁性颗粒包含化学基团，所述化学基团与所述细菌细胞表面结合，并且所述盒进一步包括促进所述化学基团与所述细菌细胞表面结合的化合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中促进所述化学基团与所述细胞表面结合的所述化合物包括溴化十六烷基三甲铵(cetrimide)，并且
所述化学基团包括选自由以下组成的组的化学基团：二乙胺乙基淀粉；葡聚糖硫酸盐；聚天冬氨酸；聚丙烯酸；聚谷氨酸；聚苯乙烯磺酸盐；以及聚二烯丙基二甲胺。
25.根据权利要求25所述的盒，其中所述探针包括荧光标记的寡核苷酸，所述荧光标记的寡核苷酸与特异性细菌物种的核糖体RNA的一段互补，并且所述盒进一步包括至少一个辅助探针寡核苷酸，所述至少一个辅助探针寡核苷酸在距离所述段1到30个碱基内的定位处与所述核糖体RNA结合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述荧光标记的寡核苷酸的长度介于10个与18个碱基之间并且包含至少一个构象受限的核酸。
27.根据权利要求26所述的盒，其中试剂组合物、所述探针、所述辅助探针和所述化合物以冻干珠形式提供，通过将所述样本递送到所述盒中，所述冻干珠被再水合和溶解，
其中所述染料垫包括密度梯度介质溶液，所述密度梯度介质进一步包含从未经结合的探针吸收光的染料，并且
其中所述垫以干燥或冻干状态设置在所述盒内的所述成像孔中，直到被样本润湿为止。
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