DE102008024567A1

DE102008024567A1 - Verfahren zur Messung einer Konzentration einer Messsubstanz in einer biologischen Probe

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Publication number: DE102008024567A1
Application number: DE200810024567
Authority: DE
Inventors: Petrus Stephan Dr. phil. nat. Salonikidis; André Dr. rer. nat. Zeug; Diethelm W. Prof. Dr. med. Richter; Fritz Dipl.-Biol. Kobe; Detlev Prof. Dr. Dr. Schild; Evgeni Prof. Dr. Ponimaskin
Original assignee: Georg August Universitaet Goettingen; Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Current assignee: Georg August Universitaet Goettingen; Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Priority date: 2008-05-21
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2009-12-03

Abstract

Verfahren zur Messung einer Konzentration einer Messsubstanz (16) in einer biologischen Probe unter Verwendung eines molekularen FRET-Biosensors (10, 12, 14), der jeweils einen Partner eines aus FRET-Donor (12) und FRET-Akzeptor (14) bestehenden FRET-Paares aufweist und mit der Messsubstanz (16) bindet, wobei der molekulare FRET-Biosensor (10, 12, 14) durch die Bindung mit der Messsubstanz (16) eine Konformationsänderung erfährt, durch die sich die relative Entfernung und/oder Ausrichtung von FRET-Donor (12) und FRET-Akzeptor (14) so ändert, dass eine Änderung der FRET-Effizienz resultiert. Die Erfindung schlägt eine neuartige Definition eines für die Konzentration der Messsubstanz (16) repräsentativen Indikatorwertes vor, der die Bestimmung absoluter Konzentrationen unabhängig von Umgebungsparametern, wie etwa einem pH-Wert, ermöglicht.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung einer Konzentration einer Messsubstanz in einer biologischen Probe unter Verwendung eines molekularen FRET-Biosensors, der jeweils einen Partner eines aus FRET-Donor und FRET-Akzeptor bestehenden FRET-Paares aufweist und mit der Messsubstanz bindet, wobei der molekulare FRET-Biosensor durch die Bindung mit der Messsubstanz eine Konformationsänderung erfährt, durch die sich die relative Entfernung und/oder Ausrichtung von FRET-Donor und FRET-Akzeptor so ändert, dass eine Änderung der FRET-Effizienz resultiert, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bestrahlen der Probe mit Anregungslicht eines Spektralbereichs, in dem der FRET-Donor eine hohe und der FRET-Akzeptor eine geringe oder keine Absorption zeigt,
b) Erfassen eines ersten Intensitätswertes von Emissionslicht der gemäß Schritt (a) angeregten Probe in einem Spektralbereich, in dem der FRET-Donor eine hohe und der FRET-Akzeptor eine geringe oder keine Emission aufweist, als Donor/Donor-Intensitätswert,
c) Erfassen eines zweiten Intensitätswertes von Emissionslicht der gemäß Schritt (a) angeregten Probe in einem Spektralbereich, in dem der FRET-Akzeptor eine hohe und der FRET-Donor eine geringe oder keine Emission aufweist, als Donor/Akzeptor-Intensitätswert,
d) Bestimmen eines wenigstens aus dem Donor/Donor-Intensitätswert und dem Donor/Akzeptor-Intensitätswert gebildeten Indikatorwertes,
e) Ermitteln der Konzentration der Messsubstanz in der Probe durch Vergleichen des Indikatorwertes mit einer als Funktion der Konzentration der Messsubstanz hinterlegten Kalibrationskurve, welcher eine Folge von analog zu dem Indikatorwert an isoliertem Biosensor bei unterschiedlichen Konzentrationen der Messsubstanz bestimmten Kalibrationswerten zugrunde liegt.

Stand der Technik
FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein 1946 von Th. Förster entdeckter, fotophysikalischer Effekt eines strahlungslosen Energietransfers von einem Donor-Fluorophor (kurz Donor) zu einem Akzeptor-Fluorophor (kurz Akzeptor). Dabei wird Energie von dem z. B. durch Absorption von Licht geeigneter Wellenlänge angeregten Donor über eine strahlungslose Dipol-Dipol-Wechselwirkung auf den Akzeptor übertragen und kann von diesem unter Aussendungen von Fluoreszenzlicht emittiert werden. Voraussetzung für FRET ist ein hinreichend großer Überlappungsbereich zwischen dem Emissionsspektrum des Donors und dem Anregungsspektrum des Akzeptors sowie geeignete relative Ausrichtung und geeigneter Abstand zwischen den Partnern des FRET-Paares. Insbesondere wegen der R^–6-Abhängigkeit der Dipol-Dipol-Wechselwirkung ist der Abstand R zwischen den FRET-Partnern eine kritische Größe, die FRET zu einer empfindlichen Messmethode für molekulare Abstände macht.
FRET-Messungen finden vielfach Anwendung zum Beispiel bei der Aufklärung molekularer Strukturen und Mechanismen. In der Regel basieren derartige Untersuchungen auf einer Konformationsänderung eines Moleküls, die eine Änderung des Abstandes und/oder der relativen Ausrichtung zweier FRET-Partner zur Folge hat. Diese Änderung führt zu einer Änderung der FRET-Effizienz, sodass der strahlungslos vom Donor auf den Akzeptor übergehende Energieanteil als Maß oder Indikator für die Konfirmationsänderung herangezogen werden kann. Zur Messung des strahlungslos übergehenden Energieanteils sind zahlreiche direkte und indirekte Messmethoden bekannt.
In jüngerer Zeit konnte sich eine weitere Anwendung von FRET etablieren, nämlich so genannte FRET-Biosensoren zur Messung einer Konzentration einer interessierenden Messsubstanz in einer Probe. Bei einem derartigen Biosensor handelt es sich um ein Biomolekül, welches einen Donor und einen Akzeptor eines FRET-Paares trägt und unter Konformationsänderung mit der Messsubstanz binden kann. Die Konformationsänderung erfolgt dabei so, dass sie eine erhebliche, d. h. messbare Änderung der FRET-Effizienz zur Folge hat. Insbesondere sind FRET-Biosensoren bekannt, bei denen im mit der Messsubstanz gebundenen Zustand Abstand und/oder Ausrichtung der FRET-Partner zueinander so groß bzw. so ungünstig sind, dass kein messbarer Energietransfer vom Donor zum Akzeptor stattfinden kann. Im ungebundenen Zustand hingegen lagert sich das Biomolekül des Biosensors so um, dass ein erheblicher Teil der Anregungsenergie des Donors auf dem strahlungslosen Wege der Dipol-Dipol-Wechselwirkung auf den Akzeptor übergehen kann. Umgekehrt sind aber auch Biosensoren bekannt, die im gebundenen Zustand eine höhere und im ungebundenen Zustand eine niedrigere FRET-Effizienz zeigen. Typischerweise handelt es sich bei der Konformationsänderung um ein 2-Zustände-System, sodass FRET je nach Bindungszustand ”angeschaltet” oder ”ausgeschaltet” ist.
Bei FRET-basierten Konzentrationsmessungen wird Biosensor in geeigneter Menge einer Probe mit einer unbekannten Konzentration der Messsubstanz zugeführt, sodass ein der Konzentration der Messsubstanz entsprechender Anteil des Biosensors mit der Messsubstanz bindet. Wird nun der Donor energetisch in einer Weise angeregt, die nicht oder nur in vernachlässigbarem Maße auch zu einer direkten Anregung des Akzeptors führt, kann die Intensität der Akzeptorfluoreszenz, die in diesem Fall nur auf Anregung des Akzeptors durch strahlungslosen Energietransfer beruhen kann, als Maß für den Anteil gebundenen Biosensors und somit als Maß für die Konzentration der Messsubstanz dienen. Da die absolute Fluoreszenzintensität u. a. auch von der Intensität der Donor-Anregung abhängig ist, wird üblicherweise ein ratiometrisches Messverfahren angewendet. Insbesondere wird der Donor angeregt und einerseits die Fluoreszenz des Donors selbst und andererseits die Fluoreszenz des Akzeptors gemessen.
Zur sprachlichen Vereinfachung wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung folgende Terminologie verwendet: Unter ”Anregung des Donors” sei hier die Bestrahlung der Probe mit Licht einer Wellenlänge verstanden, die vom Donor in hohem Maße absorbiert wird, was zu einer energetischen Anregung des Donors führt, und die vom Akzeptor nicht oder in einem nur geringen Maße absorbiert wird, sodass eine energetische Direktanregung des Akzeptors gering oder nicht vorhanden ist. Unter Erfassung der ”Donor-Fluoreszenz” sei hier die Messung einer Emissionsintensität in einem Wellenlängenbereich verstanden, in dem der Donor eine hohe Fluoreszenz-Emission zeigt und der Akzeptor nur eine geringe oder keine Fluoreszenz-Emission zeigt. Analog sei unter Erfassung der ”Akzeptor-Fluoreszenz” die Messung einer Emissionsintensität in einem Wellenlängenbereich, in dem der Akzeptor eine hohe Fluoreszenz-Emission zeigt und der Donor nur eine geringe oder keine Fluoreszenz-Emission zeigt. Als ”Donor/Donor-Intensitätswert” wird hier ein Intensitätswert der Donor-Fluoreszenz verstanden, der nach Anregung des Donors gemessen wird. Als Donor/Akzeptor-Intensitätswert wird hier ein Intensitätswert der Akzeptor-Fluoreszenz verstanden, der nach Anregung des Donors gemessen wird. Der weiter unten verwendete Begriff der ”Anregung des Akezeptors” bedeutet hier analog die Bestrahlung der Probe mit Licht einer Wellenlänge verstanden, die vom Akzeptor in hohem Maße absorbiert wird, was zu einer energetischen Anregung des Akzeptors führt, und die vom Donor nicht oder in einem nur geringen Maße absorbiert wird, sodass eine energetische Direktanregung des Donors gering oder nicht vorhanden ist. Der ebenfalls weiter unten verwendete Begriff des Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswertes bezeichnet hier analog einen Intensitätswert der Akzeptor-Fluoreszenz verstanden, der nach Anregung des Akzeptors gemessen wird.
Bei dem oben erwähnten, ratiometrischen Messverfahren wird ein Quotient des Donor/Akzeptor-Intensitätswertes mit dem Donor/Donor-Intensitätswert als Indikatorwert für den strahlungslos übertragenen Energieanteil und somit für die Konzentration der Messsubstanz verwendet. Außer in bestimmten Ausnahmefällen ist dieses Verfahren jedoch nur zur Bestimmung relativer Konzentrationsänderungen der Messsubstanz in derselben Probe geeignet. Zwar ist es bekannt, aus einem Vergleich des Indikatorwertes mit einer hinterlegten Kalibrationskurve auf die absolute Konzentration der Messsubstanz zu schließen. Zur Erzeugung der Kalibrationskurve wird eine Folge von Kalibrationswerten an isoliertem Biosensor bei unterschiedlichen (bekannten) Konzentrationen der Messsubstanz aufgenommen. Jeder Kalibrationswert wird dabei wie der entsprechende Indikatorwert gebildet, d. h. bei dem diskutierten Beispiel aus dem Stand der Technik insbesondere durch Erfassung und Quotientenbildung von Donor/Akzeptor-Intensitätswert und Donor/Donor-Intensitätswert. Dieses Vorgehen setzt jedoch bislang voraus, dass sämtliche Umgebungsparameter, wie beispielsweise Temperatur und ph-Wert bei der Aufnahme der Kalibrationswerte identisch mit den Umgebungsparametern während der eigentlichen Messung, d. h. der Aufnahme des Indikatorwertes, sind. Dies kann jedoch nur ausnahmsweise gewährleistet sein. Insbesondere bei komplexen biologischen Proben, wie beispielsweise lebenden Zellen, sind relevante Umgebungsparameter wie etwa der ph-Wert zumindest in ihrer lokalen Verteilung unbekannt. Absolute Konzentrationsmessungen der Messsubstanz sind daher mit dem bekannten Verfahren nicht möglich.
Aufgabenstellung
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gattungsgemäßes Messverfahren derart weiterzubilden, dass absolute Konzentrationen der Messsubstanz erfassbar werden, ohne dass Umgebungsparameter der Probe, wie etwa der ph-Wert detailliert bekannt sein müssen.
Darlegung der Erfindung
Diese Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 gelöst durch die weiteren Schritte:

f) Bestrahlen der Probe mit Anregungslicht eines Spektralbereichs, in dem der FRET-Akzeptor eine hohe und der FRET-Donor eine geringe oder keine Absorption aufweist,
g) Erfassen eines dritten Intensitätswertes von Emissionslicht der gemäß Schritt (f) angeregten Probe in einem Spektralbereich, in dem der FRET-Akzeptor eine hohe und der FRET-Donor eine geringe oder keine Emission aufweist, als Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert,

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Kern der Erfindung ist eine neuartige Wahl des Indikatorwertes. Anstelle des reinen Quotienten aus dem Donor/Akzeptor-Intensitätswert mit dem Donor/Donor-Intensitätswert fließt erfindungsgemäß ein weiterer Intensitätswert, nämlich der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert in den Indikatorwert ein. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es somit erforderlich, außer dem Bestrahlungsschritt zur Donor-Anregung einen zusätzlichen, separaten Bestrahlungsschritt zur Akzeptor-Anregung durchzuführen. Analoges gilt auch für die Aufnahme der Kalibrationswerte zur Bildung der Kalibrationskurve. Mathematisch ausgedrückt hat der erfindungsgemäße Indikatorwert die Form:
Dabei ist FPDD der Donor/Donor-Intensitätswert, FPDA der Donor/Akzeptor-Intensitätswert und FPAA der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert, jeweils gemessen an der interessierenden Probe, symbolisiert durch den oberen Index P. Die Faktoren α und β sind Modifikationsfaktoren, die weiter unten detaillierter diskutiert werden sollen.
Es hat sich herausgestellt, dass sich bei Verwendung dieser Form des Indikatorwertes Abhängigkeiten von Umgebungsparametern, wie etwa einem ph-Wert, aufheben, wenn auch die zum Aufbau der Kalibrationskurve herangezogenen Kalibrationswerte eine analog gestaltete Form haben. D. h. mathematisch hat jeder Kalibrationswert die Form
wobei der obere Index K anzeigt, dass der entsprechende Intensitätswert an isoliertem Biosensor gemessen wurde. Der Begriff des isolierten Biosensors ist hier weit zu verstehen und ist nicht auf eine reine Biosensorlösung beschränkt. Typischerweise handelt es sich bei dem Biosensor nämlich um ein mit fluoreszenten Proteinen, wie beispielsweise CFP (Cyan Fluorescent Protein) oder YFP (Yellow Fluorescent Protein) versehen, z. B. enzymatisch wirkende Proteine, die von entsprechend manipulierten Zellen produziert werden. In solchen Fällen wird die Messung der Intensitätswerte zur Bestimmung der Kalibrationswerte bevorzugt an Lösungen lysierter, den Biosensor expremierender Zellen durchgeführt.
Nach Erkenntnis der Erfinder zeigt insbesondere die Akzeptor-Fluoreszenz eine starke Umgebungsabhängigkeit, insbesondere ph-Abhängigkeit. Diese hat Einfluss sowohl auf den Donor/Akzeptor-Intensitätswert als auch auf den Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert. Letzterer ist jedoch von der FRET-Effizienz nicht betroffen, da zu seiner Messung keine Donor-Anregung erfolgt. Deshalb lässt sich, eine fixe, insbesondere 1:1-Stöchiometrie von Donor und Akzeptor bei den betrachteten FRET-Biosensoren vorausgesetzt, der Einfluss der Umgebungsparameter, insbesondere des pH-Wertes, durch die erfindungsgemäße Wahl des Indikatorwertes und der Kalibrationswerte eliminieren. Die Aufnahme der Kalibrationswerte für die Kalibrationskurve muss daher bei Anwendung der erfindungsgemäßen Form des Indikatorwertes und bei Wahl der analogen Form der Kalibrationswerte nicht unter den exakt gleichen Umgebungsbedingungen, z. B. bei exakt gleichem pH-Wert erfolgen wie die tatsächliche Messung der Probe. Gleichwohl ist es sinnvoll, die Aufnahme der Kalibrationswerte unter Verwendung von Umgebungsparametern durchzuführen, die den in der Probe vermuteten zumindest ähnlich sind.
Die Kalibrationsmessung kann im gleichen optischen Aufbau wie die eigentliche Konzentrationsmessung durchgeführt werden. Bevorzugt, weil einfacher, wird die Kalibrationsmessung jedoch in einem herkömmlichen Küvetten-Spektrometer durchgeführt. Wesentlich ist dabei die Verwendung gleicher oder zumindest sehr ähnlicher Spektralbereiche für die Anregung und Emissionsmessung wie bei der eigentlichen Messung.
Vorteilhaft für die vorliegende Erfindung ist eine geeignete Wahl der Modifikationsfaktoren α und β. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Donor/Donor-Intensitätswert modifiziert um einen Modifikationsfaktor β, der einem Quotienten aus einem an isoliertem FRET-Donor gemessenen Donor/Akzeptor-Intensitätswert mit einem ebenfalls an isoliertem FRET-Donor gemessenen Donor/Donor-Intensitätswert entspricht. Der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert wird vorzugsweise mit einem Modifikationsfaktor α modifiziert, der einem Quotienten aus einem an isoliertem FRET-Akzeptor gemessenen Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert mit einem ebenfalls an isoliertem FRET-Akzeptor gemessenen Donor/Akzeptor-Intensitätswert entspricht. Mathematisch ausgedrückt bedeutet dies, dass die Modifikationsfaktoren α und β bei bevorzugten Ausführungsformen folgende Form aufweisen:
wobei die oberen Indizes A und D darauf hinweisen, das die entsprechenden Intensitätswerte an isoliertem Akzeptor bzw. an isoliertem Donor aufgenommen wurden. Der Begriff des isolierten Donors bzw. Akzeptors ist hier jeweils weit zu verstehen und ist nicht auf reine Donor- bzw. Akzeptorlösungen beschränkt. Häufig handelt es sich bei Donor- und Akzeptor nämlich fluoreszente Proteine, wie beispielsweise CFP (Cyan Fluorescent Protein) oder YFP (Yellow Fluorescent Protein), die von entsprechend manipulierten Zellen produziert werden. In solchen Fällen wir die Messung der Intensitätswerte zur Bestimmung der Modifikationsfaktoren bevorzugt an Lösungen lysierter, den Farbstoff expremierender Zellen durchgeführt.
Die zur Bestimmung der Modifikationsfaktoren α und β erforderlichen Messungen werden vorzugsweise mit dem gleichen optischen Aufbau durchgeführt wie die Messungen der jeweils modifizierten Intensitätswerte. Die Messung der für die Bestimmung des Indikatorwertes verwendeten Modifikationsfaktoren erfolgt somit bevorzugt mit dem gleichen optischen Aufbau, mit dem auch die eigentliche Messung vorgenommen wird. Die Messung der für die Bestimmung der Kalibrationswerte verwendeten Modifikationsfaktoren erfolgt entsprechend bevorzugt mit dem gleichen optischen Aufbau, mit dem auch die Kalibrationswertmessung vorgenommen wird. Dies ist eine Folge aus der Erkenntnis, dass die Modifikationsfaktoren α und β durchaus eine nicht vernachlässigbare Abhängigkeit vom jeweiligen optischen Aufbau aufweisen können. Das bedeutet, dass die zur Bestimmung des Indikatorwertes verwendeten Modifikationsfaktoren durchaus numerisch verschieden von den zur Bestimmung der Kalibrationswerte verwendeten sein können. Alternativ ist es jedoch grundsätzlich auch möglich, die Modifikationsfaktoren separat zu ermitteln. Wesentlich ist in jedem Fall jedoch die gleiche oder zumindest sehr ähnliche Wahl der Anregungs- und Emissionswellenlängen im Vergleich zu der Wahl der entsprechenden Wellenlängen bei der Aufnahme der jeweils modifizierten Intensitätswerte.
Wie erwähnt liegt der Vorteil der Erfindung in der Unabhängigkeit der Konzentrationsmessungen von Umgebungsparametern, wie z. B. dem pH-Wert. Dies erlaubt die Messung von räumlichen Konzentrationsverteilungen in biologischen Proben, in denen beispielsweise die Verteilung des pH-Wertes nicht im Detail bekannt ist. Ein günstiges Anwendungsgebiet ist z. B. die Messung von Konzentrationsverteilungen in biologischen Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Dies bedeutet, dass die oben genannten Schritte (b), (c) und (g) des Erfassens von Intensitätswerten von Emissionslicht der Probe bildgebend erfolgen und dass für eine Mehrzahl von Pixeln oder Pixelgruppen jeweils ein Indikatorwert berechnet wird. Mit anderen Worten werden drei Intensitätswertbilder unter den genannten spektroskopischen Bedingungen aufgenommen und pixelweise oder pixelgruppenweise zur Berechnung je eines Indikatorwertes für jeden Pixel bzw. jede Pixelgruppe kombiniert.
Die in diese Berechnung bevorzugt einfließenden Modifikationsfaktoren können, müssen jedoch nicht, ebenfalls pixelweise gemessen bzw. berechnet worden sein. Dies kann zu pixelweise oder pixelgruppenweise numerisch unterschiedlichen Modifikationsfaktoren führen. Alternativ können globale, d. h. für sämtliche Pixel bzw. Pixelgruppen gültige Modifikationsfaktoren verwendet werden. Diese können z. B. aus Messungen an isoliertem Donor bzw. isoliertem Akzeptor in dem bildgebenden optischen Aufbau resultieren, wobei ein Integrationswert über alle oder einige Pixel als globaler Modifikationsfaktor verwendet wird. Alternativ können die globalen Modifikationsfaktoren auch in einem separaten Küvettenexperiment ermittelt werden.
Wie erläutert ist es die Funktion der Kalibrationswerte, durch Vergleich der gemessenen Indikatorwerte mit einer Kalibrationskurve die absolute Konzentration der Messsubstanz zu bestimmen. Hierzu wird aus einer Folge von Kalibrationswerten, die an dem isolierten Biosensor bei unterschiedlichen Konzentrationen der Messsubstanz gemessen werden, eine Kalibrationskurve erzeugt, die für jeden gemessenen Indikatorwert einen eindeutigen Konzentrationswert liefert. Hierzu kann eine einfache Interpolation zwischen den gemessenen Kalibrationswerten, z. B. eine lineare Interpolation oder eine Polynom-Anpassung dienen. Bevorzugt wir die Kalibrationskurve jedoch durch Anpassung eines geschlossenen Ausdrucks an die gemessenen Kalibrationswerte erzeugt, besonders bevorzugt durch Anpassung einer modifizierten Hill-Gleichung
mit der der Indikatorwert X gleichgesetzt wird,. Die Hill-Gleichung
ist dem Fachmann aus der Beschreibung des Bindungsverhaltens von Enzymen bekannt und beschreibt das Bindungsgleichgewicht. n_H ist dabei der Hill-Koeffizient, der unter besonderen Voraussetzungen die Anzahl der Bindungsstellen des Biosensors für die Messsubstanz anzeigt. Θ ist der Anteil des gebundenen Enzyms. Die Modifikatoren der Hill-Geichung p_max und p₀ sind dabei die maximalen bzw. Offset-Amplitudenparameter. EC50 ist diejenige Konzentration der Messsubstanz, bei der 50% der Bindungsstellen besetzt sind. Gelingt eine derartige Anpassung, kann der Vergleich gemäß obigem Schritt (e) unmittelbar durch Einsetzen des gemessenen Indikatorwertes in die nach der gesuchten Konzentration aufgelöste Hill-Gleichung erfolgen.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden, speziellen Beschreibung und den Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1: eine schematische Illustration der Wirkungsweise eines FRET-Biosensors am Beispiel des EPAC-Biosensors zur Bestimmung der Konzentration von cAMP in einer Probe,
2: eine schematische Darstellung der Anregungs- und Emissionsspektren der FRET-Partner eCFP und eYFP des EPAC-Biosensors,
3: eine schematische Darstellung eines bevorzugten optischen Aufbaus zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung soll nachfolgend am Beispiel eines hier als EPAC-Biosensor bezeichneten Sensors zur Messung von Konzentrationen von cAMP (cyclic AMP) näher beschrieben werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diesen konkreten Anwendungsfall beschränkt.
Dem Fachmann ist bekannt, dass cAMP ein wichtiger, sekundärer Botenstoff in Zellen ist. Weiter ist bekannt, dass cAMP in der Lage ist, das EPAC-Protein (exchange Protein directly activated by cAMP) zu aktivieren. Dieser Effekt wurde als Grundlage zur Konstruktion des EPAC-Biosensors genutzt, indem das EPAC-Protein mit zwei fluoreszenten Proteinen, nämlich eCFP (enhanced cyan fluorescent Protein) als Donor und eYFP (enhanced yellow fluorescent Protein) als Akzeptor in einer Weise versehen wurde, dass eine Bindung von cAMP an das EPAC-Protein eine Konformationsänderung des Biosensors verursacht, sodass die FRET-Effizienz zwischen eCFP und eYFP eine wesentliche Änderung erfährt. Insbesondere ist die FRET-Effizienz im ungebundenen Fall wesentlich höher als im gebundenen Fall, in dem sie praktisch gleich null ist. 1 illustriert schematisch den EPAC-Biosensor und seine Wirkung. An dem EPAC-Protein 10 sind der Donor 12, der in 1 mit ”C” für eCFP bezeichnet ist, und der Akzeptor 14, der in 1 mit Y für eYFP bezeichnet ist, angebracht. Im ungebundenen Zustand liegen Donor 12 und Akzeptor 14 eng beieinander, sodass bei Anregung des Donors 12 mit einer diesen elektronisch anregenden Wellenlänge von z. B. 432 nm ein erheblicher Teil der Anregungsenergie mittels FRET auf den Akzeptor 14 übertragen wird, der daraufhin im Spektralbereich um 525 nm emittiert. Im gebundenen Zustand, d. h. wenn die Messsubstanz 16, hier cAMP, an die Bindungsstelle des EPAC-Proteins 10 gebunden ist, ändert sich das räumliche Verhältnis zwischen Donor 12 und Akzeptor 14 so, dass praktisch kein FRET zwischen Donor 12 und Akzeptor 14 auftritt. Entsprechend wird ein wesentlich größerer Teil der Anregungsenergie für den Donor 12 direkt von diesem als Fluoreszenzlicht im Spektralbereich um dessen Emissionsmaximum von 475 Nanometern emittiert.
2 zeigt schematisch normalisierte Anregungsspektren 18, 19 und Emissionsspektren 18', 19' von eCFP (18, 18') und eYFP (19, 19'). Auf der Abszisse ist die Wellenlänge in Nanometer aufgetragen; auf der Ordinate ist die auf das jeweilige Maximum normierte Absorption bzw. Emission aufgetragen. Die Anregungsspektren 18, 19 sind dabei jeweils gestrichelt dargestellt; die Emissionsspektren 18', 19' sind als durchgezogene Linien dargestellt. Die Spektren 18, 18' des Donors eCFP im kürzerwelligen Spektralbereich sind als stärkere Linien dargestellt, während die Spektren 19, 19' des Akzeptors eYFP im längerwelligen Spektralbereich als dünnere Linien dargestellt sind. Als schraffierte Flächen sind in 2 Spektralbereiche gekennzeichnet, die für Fluoreszenzexperimente günstige Filterkonstellationen repräsentieren. Die breit schraffierten Felder repräsentieren dabei günstige Anregungs-Spektralbereiche; die eng schraffierten Felder repräsentieren günstige Emissions- bzw. Detektions-Spektralbereiche. Schraffur von links oben nach rechts unten bezieht sich auf den Donor; Schraffur von links unten nach recht oben bezieht sich auf den Akzeptor.
3 zeigt schematisch einen experimentellen Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei das Schema von 3 zwei unterschiedliche Aufbauten, nämlich einen bildgebenden und einen nicht-bildgebenden, die alternativ oder gemeinsam verwendet werden können, integriert. Bei tatsächlichen Ausführungsformen sind unterschiedliche Geräte jedoch typischerweise räumlich separat und für die jeweilige Anwendung optimiert aufgebaut. In 3 ist auf der linken Seite der bildgebende und auf der rechten Seite der nicht-bildgebende Aufbau dargestellt, wobei gleiche Bezugszeichen einander entsprechende Elemente bezeichnen und im nicht-bildgebenden Teil gestrichen dargestellt sind.
Eine umschaltbare Lichtquelle 20, 20' liefert Anregungslicht in einem von zwei Anregungs-Spektralbereichen, die beim vorliegenden Ausführungsbeispiel als schmalbandige, vorzugsweise monochromatische Bereiche um 420 nm bzw. 500 nm gewählt sind. Die Lichtquelle 20, 20' kann ein Monochromator, eine Laser-Lichtquelle oder eine andere geeignete Lichtquelle sein. Das Anregungslicht wird auf die Probe 24, 24' geleitet. Im bildgebenden Fall, der typischerweise einen Mikroskop-Aufbau umfasst, werden ein Farbteilerspiegel 21 und ein Mikroskopobjektiv 22 zwischengeschaltet. Beim gezeigten Ausführungsbeispiel liegt die Trennlinie des Farbteilerspiegels 21 abgestimmt auf die Anregungswellenlänge bei 455 nm bzw. 515 nm. Das von der Probe 24, 24' ausgesandte Fluoreszenzlicht fällt auf einen Farbteiler 26, 26', dessen Trennlinie im gezeigten Ausführungsbeispiel bei 515 nm liegt. Man beachte, dass der Farbteiler 26 im bildgebenden Fall als Bildteiler arbeitet und daher keine räumlichen Verzerrungen zwischen den beiden geteilten Bildern erzeugen darf. Das vom Farbteiler 26, 26' geteilte Signal läuft über geeignete Bandpassfilter 27, 27', 28, 28', die bei der gezeigten Ausführungsform als 30 nm-Bandpassfilter um 470 nm bzw. 535 nm gewählt sind, auf Detektoren 29, 29', 30, 30'. Die Detektoren 29, 30 des bildgebenden Teils sind als bildgebende Detektoren, z. B. verstärkte oder nicht-verstärkte CCD-Kameras ausgebildet. Die Detektoren 29', 30' im nicht-bildgebenden Teil des Aufbaus sind typischerweise als so genannte Fotomultiplyer ausgebildet. Derartige Fluoreszenz-Messaufbauten sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Die Wahl der Filterkonstellation wird der Fachmann in Anbetracht des jeweiligen Einzelfalls, insbesondere im Hinblick auf die Spektren der beteiligten Farbstoffe individuell wählen. Er wird dabei stets den Kompromiss zwischen optimaler Trennschärfe zwischen Anregungslicht und Emissionslicht, Trennschärfe zwischen den beteiligten Farbstoffen und maximaler Lichtausbeute treffen. Die oben angegebene, spezielle Filterkonstellation hat sich für das hier beschriebene Beispiel bewährt.
Nachfolgend soll ein Beispiel einer bildgebenden Messung mit dem oben angegebenen, experimentellen System beschrieben werden.
Gegenstand der Messung sind Maus-N1E-115-Neuroblastomazellen, die durch Einschleusung geeigneter Vektoren den EPAC-Biosensor expremieren. Zur Messung der Kalibrationswerte werden ebensolche Zellen verwendet. Zur Bestimmung der Modifikationsfaktoren werden Zellen vom gleichen Typ herangezogen, die jedoch nur eCFP bzw. nur eYFP expremieren.
Ziel des Experimentes ist die Messung der cAMP-Konzentration innerhalb von Zellen und insbesondere die Messung der interzellulären, räumlichen Konzentrationsverteilung von cAMP. Mehrere hintereinander durchgeführte, gleichartige Messungen können zudem zeitliche Änderungen der Konzentrationsverteilungen erkennbar machen.
Zur Durchführung der hier als eigentliche Messung bezeichneten, bildgebenden Erfassung von Probenmesswerten werden die zu vermessenden, den EPAC-Biosensor expremierenden Zellen in üblicher Weise unter dem Objektiv 22 des Fluoreszenzmikroskops platziert. Die Filterkonstellation wird zunächst auf Donor-Anregung eingestellt. Dies bedeutet, dass die Lichtquelle 20 bei 420 nm betrieben wird und als Farbteiler 21 ein Farbteilerspiegel mit Trennlinie bei 455 nm verwendet wird. Diese erste Messung liefert zwei Bilder unterschiedlicher Emissions-Spektralbereiche an den bildgebenden Detektoren 29 und 30, die denselben räumlichen Probenbereich darstellen. Die hier als Bilder bezeichneten Messergebnisse repräsentieren pixelweise die räumliche Verteilung von Donor/Donor-Intensitätswerten (am Detektor 29) bzw. Donor/Akzeptor-Intensitätwerten (am Detektor 30).
Für eine weitere Messung, die zeitlich auch vor der oben beschriebenen durchgeführt werden kann, wird der Aufbau auf Akzeptor-Anregung umgeschaltet. Dies bedeutet, dass die Lichtquelle 20 bei 500 nm betrieben wird und als Farbteiler 21 ein Farbteilerspiegel mit Trennlinie bei 515 nm verwendet wird. Bei dieser Einstellung liefert lediglich der Detektor 30 ein sinnvolles und verwendbares Messergebnis. Das resultierende Bild repräsentiert eine räumliche Verteilung der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswerte. Selbstverständlich sind auch dem Fachmann bekannte, komplexere Farbteiler mit zwei Bandpassbereichen einsetzbar, sodass in solchen Fällen ein mechanischer Austausch des Farbteilers bei der Umschaltung verzichtbar ist.
Die eigentliche Messung liefert also drei Bilder der Probe, welche die Verteilung der Donor/Donor-Intensitätswerte, der Donor/Akzeptor-Intensitätswerte und der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswerte repräsentieren.
Zeitlich unabhängig von der eigentlichen Messung wird eine Kalibrationsmessung durchgeführt, die es nach geeigneter Datenverarbeitung erlauben soll, aus den Intensitätswerten der eigentlichen Messung auf absolute Konzentrationen von cAMP in der Probe zu schließen. Die Kalibrationsmessung wird analog der eigentlichen Messung durchgeführt. Das bedeutet, dass im Wesentlichen dieselben oder sehr ähnliche Filterkonstellationen gewählt werden. Es ist nicht erforderlich, dass die Kalibrationsmessung im selben apparativen Aufbau durchgeführt wird, wie die eigentliche Messung. Im Gegenteil wird die Durchführung der Kalibrationsmessung an einem optisch optimierten Küvetten-Spektrometer bevorzugt.
Zur Gewinnung der für die Kalibrationsmessung zu untersuchenden Kalibrationsprobe werden Zellen, welche den EPAC-Biosensor expremieren, vorzugsweise vom selben Zelltyp wie bei der eigentlichen Messung, lysiert, homogenisiert und zentrifugiert. Der Überstand wird direkt in eine Quarzküvette gegeben, welche in einem nicht-bildgebenden Fluoreszenzspektrometer positioniert wird. Analog der eigentlichen Messung werden von der Probe 24' Intensitätswerte einerseits bei Filterkonstellation für Donor-Anregung und andererseits bei Filterkonstellation für Akzeptor-Anregung erfasst. Für die Donor-Anregung wird die Lichtquelle 20' auf 420 nm eingestellt. Durch die Farbteilung bei 515 Nanometern am Farbteiler 26' und die Bandpassfilterung bei 470 nm bzw. 535 nm an den Bandpassfiltern 27' und 28' entstehen an den nicht-bildgebenden Detektoren 29' und 30' der Donor/Donor-Intensitätswert und der Donor/Akzeptor-Intensitätswert der Kalibrationsmessung. Vor oder nach dieser Messung wird das Spektrometer auf Akzeptor-Anregung eingestellt, d. h. die Lichtquelle 20' wird bei 500 nm betrieben. Bei dieser Einstellung liefert lediglich der Detektor 30' im längerwelligen Detektionspfad einen sinnvollen und weiterverwertbaren Intensitätswert, nämlich den Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert der Kalibrationsmessung.
Die Erfassung dieser drei Intensitätswerte der Kalibrationsmessung wird bei unterschiedlichen cAMP-Konzentrationen in der Küvette wiederholt. Besonders bevorzugt wird eine Titration mit engen Konzentrationsabständen durchgeführt, wobei die vorgenannten drei Intensitätswerte der Kalibrationsmessung für jede Konzentrationsstufe aufgenommen werden.
Damit sind die wesentlichen Werte, die für die Konzentrationsbestimmung in den untersuchten Zellen erforderlich sind, erfasst. Zur Auswertung werden die drei Intensitätswert-Bilder der eigentlichen Messung pixelweise auf eine vorbestimmte Weise miteinander verarbeitet. Auf dieselbe Weise werden die jeweils drei Intensitätswerte der Kalibrationsmessung (für jede cAMP-Konzentration) miteinander verarbeitet. Vergleich der Verarbeitungsergebnisse liefert die cAMP-Konzentration in jedem Pixel, was die Konzentration in jedem Probenpunkt repräsentiert.
Nachfolgend soll die bevorzugte Verarbeitung beschrieben werden, der die Intensitätswert-Bilder der eigentlichen Messung einerseits und die Intensitätswerte der Kalibrationsmessung für jede cAMP-Konzentration andererseits unterworfen werden. Die bevorzugte Verarbeitung der Intensitätswert-Bilder der eigentlichen Messung lässt sich mathematisch durch die oben angegebene Formel (1) darstellen.
X ist darin der für die cAMP-Konzentration in einem Probenpunkt repräsentative Indikatorwert, der einem dem Probenpunkt entsprechenden Pixel oder einer Pixelgruppe zugeordnet ist. FPDA ist der Donor/Akzeptor-Intensitätswert im entsprechenden Pixel bzw. der entsprechenden Pixelgruppe. FPAA ist der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert des entsprechenden Pixels bzw. der entsprechenden Pixelgruppe. FPDD ist der Donor/Donor-Intensitätswert des entsprechenden Pixels bzw. der entsprechenden Pixelgruppe. α und β sind Modifikationsfaktoren, deren Ermittlung weiter unten erläutert werden soll.
Die Verarbeitung der Intensitätswerte der Kalibrationsmessung für jede cAMP-Konzentration lässt sich mathematisch gemäß der oben angegebenen Formel (2) darstellen.
K ist ein Kalibrationswert, der separat für unterschiedliche cAMP-Konzentrationen aufgenommen wird. FKDA ist der Donor/Akzeptor-Intensitätswert der Kalibrationsmessung. FKAA ist der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert der Kalibrationsmessung. FKDD ist der Donor/Donor-Intensitätswert der Kalibrationsmessung. α und β sind Modifikationsfaktoren der Kalibrationsmessung, deren Erfassung nachfolgend erläutert werden soll.
Die Modifikationsfaktoren α und β der eigentlichen Messung und der Kalibrationsmessung werden grundsätzlich in analoger Weise aufgenommen. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Faktoren eine starke Geräteabhängigkeit aufweisen können. Sie werden daher bevorzugt in der selben Apparatur wie die zugehörigen Messwerte, d. h. die durch sie zu modifizierenden Intensitätswerte erfasst. Dies kann dazu führen, dass die Modifikationsfaktoren, die zur Ermittlung des Indikatorwertes X verwendet werden, numerisch verschieden sind von den Modifikationsfaktoren, die zur Ermittlung der Kalibrationswerte K verwendet werden. Für das nachfolgend beschriebene Verfahren zur Ermittlung der Modifikationsfaktoren ist dies jedoch nicht von Belang. Mathematisch lassen sich die Modifikationsfaktoren mittels der oben angegebenen Formel (3) beschreiben.
Analog der oben verwendeten Terminologie bezeichnet F_AA einen Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert, F_DA einen Donor/Akzeptor-Intensitätswert und F_DD einen Donor/Donor-Intensitätswert. Der obere Index A bzw. D bezieht sich auf den Gegenstand der jeweiligen Messung. Die Messwerte zur Bestimmung des Modifikationsfaktors α werden nämlich an isoliertem Akzeptor durchgeführt (oberer Index A), während die Messungen zur Bestimmungen des Modifikationsfaktors β an isoliertem Donor (oberer Index D) durchgeführt werden. Hierzu werden bevorzugt Zellen verwendet, welche lediglich den Donor eCFP bzw. lediglich den Akzeptor eYFP expremieren. Bevorzugt werden hierzu dieselben Zelltypen verwendet, wie sie auch für die eigentliche Messung und die Kalibrationsmessung Anwendung finden. Die Probenpräperation erfolgt vorzugsweise durch Lysieren, Homogenisieren und Zentrifugieren der entsprechenden Zellen, wobei der Überstand der Messung unterworfen wird. Die Messung der Intensitätswerte erfolgt dann wie oben im Zusammenhang mit der Kalibrationsmessung beschrieben, wobei jedoch keine Wiederholung der Messung bei unterschiedlichen cAMP-Konzentrationen erforderlich ist. Günstiger Weise werden jedoch wegen der möglichen Geräteabhängigkeit getrennte Messungen für die Modifikationswerte für den Indikatorwert X und die Kalibrationswerte K in den jeweiligen optischen Apparaturen, d. h. beim beschriebenen Beispiel in dem mikroskopischen Aufbau einerseits und in dem Küvetten-Spektrometer andererseits, durchgeführt.
Die gemessenen Intensitätswerte werden dann in die oben angegebene Formel (3) für die Modifikationsfaktoren α und β eingesetzt. Die Modifikationsfaktoren α und β werden dann in die oben angegebenen Formeln (1) bzw. (2) für den Indikatorwert X bzw. die Kalibrationswerte K eingesetzt, wobei α und β ggf. mit unterschiedlichen numerischen Werten in die Formel (1) für den Indikatorwert X und die Formel (2) für die Kalibrationswerte K eingesetzt werden.
Da im bildgebenden Fall für jedes Pixel bzw. jede Pixelgruppe ein Indikatorwert berechnet werden kann, ergibt sich ein Bild, welches die räumliche Verteilung der Indikatorwerte in der Probe repräsentiert. Um hieraus ein Bild der Verteilung der Konzentration von cAMP zu gewinnen, wird pixelweise bzw. pixelgruppenweise jeder ermittelte Indikatorwert mit einer aus den Kalibrationswerten aufgebauten Kalibrationskurve verglichen. Die Ausbildung der Kalibrationskurve kann im einfachsten Fall durch z. B. lineare oder anders geartete Interpolation zwischen den einzelnen Kalibrationswerten, die bei unterschiedlichen cAMP-Konzentrationen gemessen wurden, erfolgen. Günstiger ist es jedoch einen geschlossenen Ausdruck, z. B. ein Polynom an die Folge von Kalibrationswerten anzupassen. Besonders bevorzugt ist es, ein biologisch sinnvolles Modell in Form eines geschlossenen Ausdrucks an die Kalibrationswerte anzupassen. Hierzu eignet sich insbesondere die im allgemeinen Teil der Beschreibung bereits diskutierte Hill-Gleichung. [c] entspräche in diesem Fall der cAMP-Konzentration [cAMP]; die Parameter n_H, p_max, p₀, EC50 ergeben sich aus Kenntnis des molekularen Aufbaus des Biosensors und der Kalibrationswerte. Die Verwendung eines geschlossenen Ausdrucks für die Kalibrationskurve ermöglicht es grundsätzlich, den Vergleich der Indikatorwerte mit der Kalibrationskurve durch direkte Auflösung des Ausdrucks nach der gesuchten Konzentration [cAMP] unter Einsetzen des Indikatorwertes durchzuführen. Die Verwendung eines biologisch sinnvollen Modells, wie der Hill-Gleichung, erlaubt zudem eine Plausibilitätsprüfung der Ergebnisse.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist der einfachen Messung des Akzeptor/Donor-Quotienten, der den Donor/Akzeptor-Intensitätswert zu dem Donor/Donor-Intensitätswert ins Verhältnis setzt, deutlich überlegen, da sich Einflüsse wesentlicher Umgebungsparameter, wie z. B. des pH-Wertes, ”herausrechnen”.
Natürlich stellen die in den Figuren gezeigten und im Rahmen der speziellen Beschreibung diskutierten Ausführungsformen nur illustrative Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung dar. Dem Fachmann ist im Lichte der hiesigen Offenbarung ein breites Spektrum an Variationsmöglichkeiten anhand gegeben. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf den diskutierten EPAC-Biosensor im Zusammenhang mit der Messung von cAMP-Konzentrationen beschränkt. Das Verfahren lässt sich vielmehr auf jeden FRET-Biosensor anwenden, der eine fixe Stöchiometrie seiner FRET-Partner aufweist. Die Erfindung ist nicht auf die hier beispielhaft diskutierte 1:1-Stöchiometrie beschränkt. Auch wird der Fachmann je nach Notwendigkeit zusätzliche, der Verständlichkeit halber hier nicht im Einzelnen diskutierte Korrekturen seiner Messwerte vornehmen. Beispielsweise kann es günstig sein, die Intensitätswert-Bilder gegen die Einflüsse einer ungleichmäßigen Beleuchtung im Mikroskop und/oder ein Hintergrundsignal, das geräte- oder probenbedingt sein kann, zu korrigieren. Dem Fachmann sind entsprechende Korrekturmechanismen bekannt. Auch ist das beschriebene Verfahren nicht auf die bildgebende Aufnahme der Indikatorwerte beschränkt. Vielmehr ist das Verfahren auch für nicht-bildgebende Einzelwertmessungen einsetzbar. Umgekehrt ist es nicht zwingend erforderlich, die Kalibrationswerte nicht-bildgebend zu erfassen. Wie erwähnt ist bei der Aufnahme der Intensitätswerte zur Berechnung der Modifikationsfaktoren die Verwendung der gleichen Apparatur und Einstellung wie bei der Erfassung der eigentlichen Messwerte günstig. Zwingend erforderlich ist dies jedoch nicht, wenn der sich hierdurch einstellende Fehler unterhalb der experimentell gewünschten Toleranzen bleibt. Insbesondere im bildgebenden Fall hat der Fachmann die Wahl zwischen einer ebenfalls bildgebenden, d. h. pixelweisen bzw. pixelgruppenweisen Messung und Berechnung der Modifikationsfaktoren und einer integrierenden Messung und Berechnung. Im erstgenannten Fall ist es denkbar, dass die unterschiedlichen Pixeln oder Pixelgruppen zugeordneten Modifikationsfaktoren numerisch unterschiedlich sind.

Claims

Verfahren zur Messung einer Konzentration einer Messsubstanz (16) in einer biologischen Probe unter Verwendung eines molekularen FRET-Biosensors (10, 12, 14), der jeweils einen Partner eines aus FRET-Donor (12) und FRET-Akzeptor (14) bestehenden FRET-Paares aufweist und mit der Messsubstanz (16) bindet, wobei der molekulare FRET-Biosensor (10, 12, 14) durch die Bindung mit der Messsubstanz (16) eine Konformationsänderung erfährt, durch die sich die relative Entfernung und/oder Ausrichtung von FRET-Donor (12) und FRET-Akzeptor (14) so ändert, dass eine Änderung der FRET-Effizienz resultiert, umfassend die folgenden Schritte: a) Bestrahlen der Probe mit Anregungslicht eines Spektralbereichs, in dem der FRET-Donor eine hohe und der FRET-Akzeptor eine geringe oder keine Absorption zeigt, b) Erfassen eines ersten Intensitätswertes von Emissionslicht der gemäß Schritt (a) angeregten Probe in einem Spektralbereich, in dem der FRET-Donor eine hohe und der FRET-Akzeptor eine geringe oder keine Emission aufweist, als Donor/Donor-Intensitätswert, c) Erfassen eines zweiten Intensitätswertes von Emissionslicht der gemäß Schritt (a) angeregten Probe in einem Spektralbereich, in dem der FRET-Akzeptor eine hohe und der FRET-Donor eine geringe oder keine Emission aufweist, als Donor/Akzeptor-Intensitätswert, d) Bestimmen eines wenigstens aus dem Donor/Donor-Intensitätswert und dem Donor/Akzeptor-Intensitätswert gebildeten Indikatorwertes, e) Ermitteln der Konzentration der Messsubstanz in der Probe durch Vergleichen des Indikatorwertes mit einer als Funktion der Konzentration der Messsubstanz hinterlegten Kalibrationskurve, welcher eine Folge von analog zu dem Indikatorwert an isoliertem Biosensor bei unterschiedlichen Konzentrationen der Messsubstanz bestimmten Kalibrationswerten zugrunde liegt, gekennzeichnet durch die weiteren Schritte: f) Bestrahlen der Probe mit Anregungslicht eines Spektralbereichs, in dem der FRET-Akzeptor eine hohe und der FRET-Donor eine geringe oder keine Absorption aufweist, g) Erfassen eines dritten Intensitätswertes von Emissionslicht der gemäß Schritt (f) angeregten Probe in einem Spektralbereich, in dem der FRET-Akzeptor eine hohe und der FRET-Donor eine geringe oder keine Emission aufweist, als Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert, wobei der Indikatorwert als ein Quotient aus einer aus Donor/Akzeptor-Intensitätswert, Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert und Donor/Donor-Intensitätswert gebildeten Differenz mit dem Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert berechnet wird, wobei wenigstens einige der Intensitätswerte um einen Modifikationsfaktor modifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Donor/Donor-Intensitätswert modifiziert wird um einen Modifikationsfaktor, der einem Quotienten aus einem an isoliertem FRET-Donor gemessenen Donor/Akzeptor-Intensitätswert mit einem ebenfalls an isoliertem FRET-Donor gemessenen Donor/Donor-Intensitätswert entspricht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert modifiziert wird um einen Modifikationsfaktor, der einem Quotienten aus einem an isoliertem FRET-Akzeptor gemessenen Akzeptor/Akzeptor-Intensitätswert und einem ebenfalls an isoliertem FRET-Akzeptor gemessenen Donor/Akzeptor-Intensitätswert entspricht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (b), (c) und (g) des Erfassens von Intensitätswerten von Emissionslicht der Probe bildgebend erfolgen und dass für eine Mehrzahl von Pixeln oder Pixelgruppen jeweils ein Indikatorwert berechnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Intensitätswerte zur Berechnung eines Modifikationsfaktors nicht-bildgebend erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Berechnung der Indikatorwerte für unterschiedliche Pixel oder Pixelgruppen dieselben Modifikationsfaktoren verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Kalibrationswerte nicht-bildgebend erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Ermittlung der Konzentration der Messsubstanz für unterschiedliche Pixel oder Pixelgruppen dieselbe Kalibrationskurve verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein zur Bestimmung der Kalibrationswerte herangezogenen Modifikationsfaktor numerisch verschieden von dem entsprechenden, zur Bestimmung des Indikatorwertes herangezogenen Modifikationsfaktor ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Modifikationsfaktor auf Basis von Messungen bestimmt wird, die in demselben optischen Aufbau wie die Erfassung des jeweils zu modifizierenden Intensitätswertes durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibrationskurve durch Anpassung einer Hill-Gleichung an die Folge von Kalibrationswerten bestimmt wird.