CN110452953A - 实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于光学手段实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，属于实时动态分析技术领域。本发明旨在提供一种实时监测孢子发芽过程、获知大量单个孢子发芽动态、获知孢子发芽异质性的方法。本发明的方法是采用光学成像分析单个微孢子虫孢子人工发芽的动态并通过拉曼光谱加以验证。本发明方法操作简便，无需染色，无环境污染，能够实时快速直观监测单个微孢子虫孢子的发芽过程，是一种研究微生物单细胞生理机制的简便、可行的实时监测方法。

Description

实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法
技术领域
本发明属于实时监测技术领域，具体涉及一种基于光学成像手段实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法。
背景技术
微孢子虫（Microsporidia）是一类细胞内专性寄生单细胞真核生物，目前将其归类为真菌，寄主很广泛，可以感染包括人类在内的无脊椎动物和脊椎动物，目前已发现有200多属，1400余种[1-3]。其中，家蚕微孢子虫是人类最早发现的微孢子虫，主要寄生于家蚕，引起家蚕微粒子病对家蚕具有很强的危害性，被各国列为蚕种生产唯一的检疫病害[4, 5]。近十多年来, 人们发现在免疫缺陷患者体内微孢子虫是重要的肠道致病病原, 由此在生物学和医学上“微孢子虫”已引起人们的广泛关注, 有关微孢子虫的研究和报道越来越多[6, 7]。
微孢子虫孢子分为水生型和陆栖型两种, 两类孢子发芽过程中的海藻糖代谢途径不同, 这种差异可能源自内部海藻糖酶的不同，由此推测两类孢子的发芽可能由不同的机制诱导。已有的研究显示，水生型微孢子虫孢子人工发芽的机制是碱性缓冲液的预处理改变了孢子原生质膜的选择透性, 加大了孢子壁对阴、阳离子等发芽刺激因子的通透性,使外界刺激因子通过被动或主动方式进入孢子, 与原先存在于孢子内部膜结构上起骨架支撑作用的Ca2+争夺结合位点。随着外界刺激因子在竞争中逐渐占据优势, 并最终将Ca2+置换下来, 从而引起孢子膜结构的损伤和机械紊乱，进而打破海藻糖与海藻糖酶间的隔膜, 在合适的温度、pH 值、渗透压等条件下, 酶活性被激发并进一步提高, 催化海藻糖水解为葡萄糖或果糖, 孢子内渗透质浓度上升。外界水分在渗透势差的作用下大量进入孢子，极膜层和后极泡吸水膨胀, 压迫极丝解螺旋, 并从弱化了的极帽处弹出, 完成发芽过程[8]。其中，海藻糖酶因催化海藻糖水解为葡萄糖或果糖而发挥重要作用，温度、pH 值、渗透压等各种因子有可能直接或间接地影响海藻糖酶的活性, 进而促进或抑制孢子发芽的。影响发芽的因素还包括各种阴离子与阳离子及其浓度、温度和射线、不同发芽方法及发芽培养基等[8-10]。
微孢子虫侵染寄主是以其孢子发芽为基础，已经发芽的孢子基本上没有侵染力，而孢子发芽受到很多因素的影响。因此，认识其发芽机制及其萌芽影响因子，促使孢子在体外发芽或者抑制孢子发芽是阻断或降低微孢子虫侵染寄主的极其有效的手段。然而，上面所述是水生型孢子的发芽机理, 而对于陆栖型孢子，其发芽机理还不清楚，虽然对其发芽机制与发芽条件一直在探索，但都没有获得突破性进展[11]。
另一方面，以往对孢子的研究，应用的是常规的群体分析方法，得到的是反映群体孢子平均信息的认识，掩盖了具体的单个孢子的个体信息。大量的研究显示，包括微孢子虫在内的众多微生物细胞拥有遗传或非遗传的细胞间差异化能力，这种固有的遗传和表型可塑性是微生物细胞能够适应并生存于逆境或持久生存并致病的基础[12-14]。生物细胞间表现出的这种遗传或非遗传的细胞间差异就是生物细胞的异质性（Heterogeneity）。单细胞分析技术的发展，为认识细胞间的异质性提供了可能，促进了细胞生物学研究向更深更宽的领域迈进[15]。初步实验表明，Nb孢子萌芽也存在异质性：在同样的环境条件下，部分孢子在几分钟内就发芽了，有些孢子则可能在几小时或者几天后才发芽。因此，通过单细胞分析了解微孢子虫孢子发芽的异质性及其影响因子，设法让微孢子虫孢子在基本相同的时间内发芽或者抑制其发芽，阻断或降低其侵染的机会，在农业、渔业乃至医学领域都具有特别重要的意义。
然而，微孢子虫是专性寄生的微生物，虽然也能通过昆虫细胞系进行繁殖，但还无法像其它微生物细胞那样通过分子生物学手段来认识其孢子发芽的分子机制和机能。现代光学技术的进步，突破了以往受物质低浓度的影响，可以获得灵敏的检测信号，为在生命科学领域的应用开启了新的机遇。新发展起来的光学新技术与单细胞分析方法，能够以高清晰分辨率来实时同步分析多个单一细胞的生化变化，能够通过单个细胞变化的细节发现生命活动的规律和机制，具备了分析生命活动途经并阐释其功能和分子机制的能力，满足生命科学与物理科学交叉学科研究中对阐释细胞基本生命活动途经的研究要求。
现有的观测微孢子虫孢子发芽的方法是通过相差显微镜，观察相差显微镜下孢子的图像由明亮转为暗色来判定其已经发芽。观测者每隔一定时间记录，在显微镜下统计已经变暗的孢子的数量[16]。或者通过分光光度计监测折光率间接判断孢子的发芽率[17]。这些方法比较耗时，而且只能得到群体孢子的统计信息，不知道具体的单个孢子在何时发芽、需要多少时间，不同的孢子间有什么差异。针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种实时监测孢子发芽过程、获知大量单个孢子发芽动态、获知孢子发芽异质性的方法。
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发明内容
现有的观测微孢子虫孢子发芽的方法是通过相差显微镜，观察相差显微镜下孢子的图像由明亮转为暗色来判定其已经发芽。观测者每隔一定时间取样记录，在显微镜下统计已经变暗的孢子的数量。或者通过分光光度计监测折光率间接判断孢子的发芽率。这些方法比较耗时，更主要的不足是只能得到群体孢子的统计信息，不知道具体的单个孢子在何时发芽，需要多少时间，各个孢子间有什么差异。针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种实时监测孢子发芽过程、获知大量单个孢子发芽动态、获知孢子发芽异质性的方法。
具体的，本发明的技术方案是：
一种基于光学手段实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态的方法，包括以下步骤：
（1）孢子繁殖、纯化；
（2）孢子稀释为～105个孢子/mL；
（3）样品槽用高分子材料聚赖氨酸溶液覆盖，风干；
（4）孢子发芽前预处理；
（5）取预处理的孢子滴加到已经风干的样品槽中，室温（25oC）下静止5 min，吸去上清液；
（6）样品槽置于显微镜下，滴加刺激发芽的发芽液，同时打开高速相机（CCD）开始记录，曝光时间20 ms，时间间隔180 ms；
（7）发芽过程结束，自编程软件读取单个孢子的亮度变化曲线；
（8）通过780 nm激光俘获单个微孢子虫孢子，由同一束激光激发被俘孢子的拉曼信号，采集其发芽过程的拉曼光谱，建立单个孢子发芽过程特征峰强度（孢内物质含量）-时间曲线；
（9）比对发芽过程孢子亮度变化动态与拉曼特征峰强度（孢内物质含量）的对应关系。
微孢子虫孢子由于富含海藻糖溶液，在相差显微镜由于光的折射，形成明亮的图像，一旦发芽，孢子马上转为暗黑色。上述变化过程与单细胞拉曼光谱监测到的胞内主要物质（海藻糖、蛋白质和核酸等）的变化过程对应。本发明中，就是利用孢子发芽过程的图像亮度的变化来表征孢子的发芽过程。通过高分子材料将预处理后的孢子固定在载玻片的表面，添加发芽刺激液后，在高倍显微镜物镜下，同一视野可以记录多达200个以上孢子的发芽过程。大量孢子的发芽过程既反映了孢子发芽的群体动态，更重要的是反映了大量单个孢子的发芽动态。
作为本发明方法的进一步说明，所述的基于光学手段的实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态的方法，显微镜要锚定采集速度达到每秒30帧的高速相机来记录孢子人工发芽过程。
作为本发明方法的进一步说明，高速相机记录孢子发芽过程的图像，通过Matlab自编程序读取，并绘制孢子发芽过程孢子亮度-时间曲线。
作为本发明方法的进一步说明，通过高速相机记录、绘制的发芽曲线，经过实时单细胞拉曼光谱验证，建立了发芽过程孢子亮度变化动态与拉曼特征峰强度（孢内物质含量）的对应关系。
本发明的有益效果是：
（1）本发明方法操作简便，无需染色，孢子具有生理活性。
（2）本发明方法能够高通量实时监测大量单个孢子的发芽进程；
（3）本发明方法得到的是大量单个孢子的信息。
（4）孢子内部物质变化得到实时拉曼光谱的定量和验证。
附图说明
附图1是实时监测实验装置。
附图2是单个孢子发芽过程的动态曲线，以及孢子在不同时间点的图像。
附图3是拉曼光谱实时监测单个家蚕微孢子虫孢子的发芽进程。
附图4是相差成像实时监测家蚕微孢子虫孢子在不同萌发条件下的发芽。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，本实施例仅是对本发明作更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
一、单个家蚕微孢子虫孢子人工发芽过程的实时监测
1、实验材料
菌株：分离自感染微粒子病的家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，简称Nb）菌株。
2、实验系统
搭建如附图1所示的实验系统：
在倒置显微镜（Olympus IX73）上通过接入Andor iXon X3 CCD建立了相差显微成像系统，Nb孢子自然沉降在自制的样品槽内，成像光路经分光镜后一路导入CCD，通过自编程序控制图像采集；另一路导入监视器，监视孢子的发芽动态（附图1左侧示意）。Nb孢子在40倍相差物镜下用很强的折光性，形成明亮的图像，发芽后图像显著变暗。同样，在倒置显微镜引入激光，建立激光镊子拉曼光谱系统（附图1右侧所示）。简单地说，就是将一束波长为785nm的半导体激光导入倒置显微镜，由油浸物镜（NA 1.30）形成光阱，捕获并激发单个孢子的拉曼散射信号。拉曼信号导入LS785光谱仪，并成像在－70℃的电荷耦合器件（CCD）上。系统的分辨率为6 cm-1，用直径为2 μm的聚苯乙烯微球于校正系统。
3、实验方法
3.1 Nb孢子繁殖与分离
将供试的微孢子虫孢子液稀释成浓度为1×107 mL-1的悬浮液，取微孢子悬浮液涂抹于桑叶表面，饲喂3龄起蚕，待蚕儿吃尽带毒桑叶后，改饲正常无毒桑叶。
取感染死亡的蚕体，解剖出的家蚕中肠用研钵研碎，经过过滤去掉大的组织块，取滤液在离心机上差速离心纯化，获得家蚕微孢子虫孢子，放4oC冰箱保存备用。
3.2 孢子预处理
冰箱保存的Nb孢子在发芽前一天取出来，35oC过夜。
3.3 孢子发芽
Nb孢子悬浮液放置于特制的样品槽内（样品槽的盖玻片在使用前用0.1%聚赖氨酸均匀涂抹，干燥），孢子自然粘附在盖玻片上，吸去上层水。样品槽固定在倒置显微镜上，加入25oC预热的0.1M K2CO3和0.1M KHCO3混合液，开始采集图像。每隔0.1秒采集一帧图像，直到孢子发芽后10-20 分钟。
同样的，以K2CO3-KHCO3法进行人工发芽。Nb孢子悬浮液和发芽液混合，置于样品槽中，光镊随机俘获单个孢子，连续采集孢子的拉曼光谱，激光功率30 mW，光谱采集时间为1s。
3.4 数据处理方法
用自编成像提取每隔孢子的图像亮度，绘制时间函数曲线。以刚加入发芽液为时间零点T0，孢子亮度为1，孢子发芽后亮度稳定后的亮度为0。
光谱数据先进行背景扣除和响应曲线的校正，其算法为Sact(v)=[Sacq(v)- Sbg(v)]/R(v) [其中Sact(v)为样品的实际光谱，Sacq(v)为带背景的光谱，Sbg(v)为背景光谱，R(v)为实验系统的响应曲线]；采用vb 编程对数据进行平滑去噪，其算法是9 点Savitzky-Golay 卷积平滑法。以线性本底法( 总峰面积法) 计算的峰面积作为特征峰的信号强度。以加入K2CO3和KHCO3混合液的初始时刻为0时，绘制特征峰强度随时间的变化动态。
3、结果分析
3.1相差成像实时监测单个Nb孢子的发芽
Nb孢子由于孢内高浓度的海藻糖形成强折光率，在相差显微镜下形成非常明亮的图像，一旦发芽，图像变暗（图1）。我们以孢子的相差图像相对亮度变化来表征孢子的发芽过程，孢子的发芽动态呈现三相态：相对稳定的发芽前态、强度减弱的发芽瞬间及发芽后低强度的稳定态。定义孢子接触发芽缓冲液的时刻为T0，孢子相对亮度开始降低的时刻为孢子发芽的开始（Tlag），孢子发芽后亮度接近稳定的时间点为完全发芽的时间（Tgerm），则发芽完成所需时间（弹射时间）为ΔTgerm（ΔTgerm＝Tgerm－Tlag）。
3.2 拉曼光谱监测单个Nb孢子的发芽进程
上述方法得到的仅是孢子发芽过程亮度变化的动态，无法获知孢内物质的实际变化。因此，我们采用单细胞拉曼光谱监测孢子的发芽过程。附图3-A是是发芽过程单个孢子的实时拉曼光谱，主要特征峰来自海藻糖（439，539、849、914、1081、1127、1268和1343 cm-1等峰）、蛋白质（1004、1658 cm-1）和核酸（782 cm-1）等。发芽前的孢子的拉曼曲线保持基本不变，发芽后拉曼信号显著降低并稳定不变。主要物质的特征峰强度变化动态显示（附图3-B），孢子与发芽液接触后，海藻糖（539 cm-1）、蛋白质（1658 cm-1）和核酸物质（785 cm-1）的特征峰强度一直处于基本不变的状态，发芽后突然降低，其中539 cm-1峰强度几乎为0，而蛋白质则降到原来的20%左右。上述变化动态与相差成像监测的结果吻合。
二、应用实施例
应用显微成像方法实时监测家蚕微孢子虫（Nb）孢子人工发芽过程。
人工培养Nb孢子，上述方法繁殖、纯化孢子，并人工发芽。
在上述实验基础上，应用相差成像实时监测了大量Nb在不同发芽条件下的发芽过程。具体的人工诱导发芽方法分别是：（a）K2CO3+ KHCO3法，（b）KCl +H2O2法，（c）K2HPO4，（d）KOH法，（e）EDTA法，（f）KCl法及（g）CaCl2法。在同一视野下同时监测并记录50 ~ 100 个芽孢的发芽过程，监测时间为90 min。每隔2.5-5 min 统计一次已经萌发的芽孢数，得到的群体曲线见附图4-A，同时参考附图2的方法统计单个孢子的发芽参数（附图4B、C）。图中显示，不同的发芽方法孢子发芽的速度和最终的发芽率均有所不同。孢子的Tlag值差异极其显著，而ΔTgerm值基本相同，没有明显差异。说明不同的发芽条件影响孢子的发芽速度和发芽率，但对孢子弹射时间没有影响。
上述结果表明，Nb孢子发芽的过程具有明显的异质性，多数孢子发芽很快，部分孢子发芽很慢，甚至在观察期内不发芽，因此在同一孢子群体中，孢子间Tlag和Tgerm值明显不同；而ΔTgerm值非常接近，大约1.5 s左右，这是孢子发芽过程的同质性。
应用单细胞拉曼光谱实时监测单个Nb孢子的发芽，统计显示，Tlag、Tgerm和ΔTgerm等参数也与相差成像监测的结果吻合。孢子在不同的发芽处理下均呈现基本相同的发芽动态，ΔTgerm值也基本相同，发芽后孢子壳的拉曼光谱曲线几乎一样，有所不同的是Tlag值。而且，（1）发芽过程海藻糖浓度和组成没有发生变化，和文献报道的结果一致；（2）孢子发芽后孢内大量物质同步排出孢外，海藻糖和核酸物质几乎完全排空。因此既可以通过实时拉曼光谱可以监测Nb孢子的发芽动态，也可以用相差成像方法实时监测单个Nb孢子的发芽动态。

Claims (6)

1.一种实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
（1）步骤一：采用倒置显微镜成像，附加相差附件；
（2）步骤二：采用高分子材料将大量单个孢子固定；
（3）步骤三：人工方法刺激孢子发芽并实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程。
2.根据权利要求1所述实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，其特征在于，
显微镜锚定高速相机。
3.根据权利要求所述实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，其特征在于，
孢子人工发芽过程被高速相机实时记录，记录速度为每秒5~30帧。
4.根据权利要求3所述实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，其特征在于，
发芽过程记录的大量单个孢子亮度变化，通过Matlab自编程序读取灰度值，并绘制亮度-时间曲线。
5.根据权利要求4所述实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，其特征在于，
发芽过程孢子亮度变化动态经过单细胞拉曼光谱实时监测验证。
6.根据权利要求5所述实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，其特征在于，
通过780 nm激光俘获单个微孢子虫孢子，俘获的孢子的拉曼信号由同一束激光激发；
采集俘获孢子的发芽过程的拉曼光谱，建立单个孢子发芽过程特征峰强度（孢内物质含量）-时间曲线；
建立发芽过程孢子亮度变化动态与拉曼特征峰强度（孢内物质含量）的对应关系。
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CN106770149A (zh) * 2016-05-19 2017-05-31 王桂文 一种快速检测微孢子虫孢子的方法
CN106770150A (zh) * 2016-05-19 2017-05-31 王桂文 一种快速定量单个微孢子虫孢子海藻糖浓度的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (2)

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Title
王桂文: "家蚕微孢子虫孢子的异质性研究：基于单细胞拉曼光谱的分析", 《蚕业科学》 *
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