CN105861413A - 一种快速分离苹果果肉单细胞的方法 - Google Patents

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王永章
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Abstract

本发明一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，属于细胞分离技术领域。所述方法包括将苹果果肉切成薄片的步骤，还包括将果肉薄片放置于含0.1％(W/V)离析酶的CPW溶液中，在黑暗条件下酶解0.5h的步骤。本发明具有使用的试剂简单、过程方便并且得到的单细胞多且完整的优点并且确立了一种快速分离苹果果肉细胞的方法以及所采用的酶液组成以及酶解条件的优点。

Description

一种快速分离苹果果肉单细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞分离技术领域，具体涉及一种快速分离苹果果肉单细胞的方法。
背景技术
单个活体细胞是生命活动的基本单元和进化的基本单位，对单个活体细胞的识别、分选及分析，能够解析生命体系最“深”层次的异质性和运作机制。同时，因其不依赖于细胞的培养和扩增，单细胞技术在生物发育、生物能源、气候变化、疾病诊断、食品安全、农业生态等领域具有广阔应用前景。
分离植物精细胞用于离体培养，可以为通过离体有性繁殖途径进行植物品种改良打下基础；分离保卫细胞原生质体，使研究保卫细胞本身的生理生化特性及其与气孔功能的关系成为可能；分离维管束组织和韧皮部组织细胞，可以进行组织特异表达基因的鉴定(VanBeijnum,Rousch et al.2008)。利用棉纤维单细胞研究细胞壁和纤维素的形成过程，能帮助人们更好地提高棉纤维的质量(Haigler,Betancur et al.2012)。
目前，研究基因表达都是一群细胞的基因表达，这种表达实际上每个细胞特异表达的平均情况，但是单个细胞的基因表达分析能够提供隐藏在群体细胞中单个细胞发育的新机理(Narsinh,Ning et al.2011；Bloch and Yalovsky 2013)。细胞膜上有各种离子通道如钙离子通道、钾离子通道及钠离子通道等，这些通道调节离子进出，利用膜片钳技术可研究单个细胞的离子通道的特性等，从而深入地研究生物体信号传导、细胞渗透压、细胞营养及抗逆性等各种生理机制。李乐功等利用膜片钳等技术，发现了控制K+通道的流向转换机制，揭开了使同一离子通道的离子流向发生逆转的关键因素(Li,Liu et al.2008)。果实的发育过程就是果肉细胞发育的过程，决定着果实的硬度、甜度、营养物质的含量等，与果实贮藏时间长短、病害发生等都有关系。
发明内容
因此研究分离有活性果肉单细胞是研究苹果果实发育的基础，本发明的目的在于公开了一种快速分离苹果果肉单细胞的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，包括将苹果果肉切成薄片的步骤，其中，所述快速分离苹果果肉单细胞的方法还包括将果肉薄片放置于含0.1％(W/V)离析酶的CPW溶液中，在黑暗条件下酶解0.5h的步骤。
上述技术方案所述的一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，其中，所述CPW溶液的组成成分为101.0mg/L KNO3，27.2mg/L KH2PO4，246.0mg/L MgSO4·7H2O，1480.0mg/LCaCl2·2H2O，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.4mol/L甘露醇，4℃低温保存备用。
上述技术方案所述的一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，其中，含0.1％(W/V)离析酶的CPW是通过将离析酶溶于CPW溶液中制备而成。
上述技术方案所述的一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，其中，所述在黑暗条件下的酶解温度为27℃。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明确立了一种快速分离苹果果肉细胞的方法并确立了所采用的酶液组成以及酶解条件。
2、采用本发明的方法，使用的试剂简单、过程方便并且得到的单细胞多且完整。
附图说明：
图1为用VBL检测细胞壁完整性和用FDA检测细胞活性的结果图，其中：图1A为未分离的细胞，经FDA染色；(暗场)；图1B：VBL检测细胞的完整性；(暗场)；图1C：酶解0.5h，获得完整单细胞；图1D：FDA染色检测细胞的活性(暗场)。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种快速分离苹果果肉单细胞的方法作进一步的说明。
实施例1：一种快速分离苹果果肉单细胞的方法：
一、材料与方法：
1.1材料：从青岛农业大学教学实习基地，取成熟富士(Malus×domestica Borkh.‘Fuji’)苹果，贮藏于4℃备用。
1.2器材与试剂：
荧光显微镜(LEICA，DM2500，德国)，匀浆机，低速离心机，恒温摇床，磁力搅拌器。
1.3试验方法：
1.3.1单细胞分离：
配制CPW溶液(张宁,李威et al.2015)，101.0mg/L KNO3，27.2mg/L KH2PO4，246.0mg/L MgSO4·7H2O，1480.0mg/L CaCl2·2H2O，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.4mol/L甘露醇，4℃低温保存备用。纤维素酶，果胶酶和离析酶分别按照表1中的浓度溶于CPW溶液中，如离析酶(Macerozyme R-10)溶于CPW溶液中，浓度是0.1％(W/V：质量与体积比)。
表1 酶液组成(W/V)
将苹果表皮以下的果肉用手术刀切成边长0.5cm的小方块，再徒手切成薄片。将切好的苹果薄片分别置于50ml的溶有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ酶液组成的CPW溶液中(酶液的组成见表1)，于70r/min摇床中在27℃、黑暗条件振荡酶解0.5h、1h和2h。
静置后，用CPW溶液清洗3次，以洗去酶液，再移到50ml烧杯，在磁力搅拌器上搅拌1h后，在显微镜上检测，比较各个酶液在不同处理时间的获取单细胞结果。
1.3.2采用VBL检测细胞壁完整性：
VBL与植物细胞壁中的纤维素有强烈的亲和力，在紫外光下，产生荧光，利用这个特性，常被用于检测细胞的完整性(Huang and Yan 1980)。
采用黄祥辉和颜季琼的方法，配制VBL(4,4’-bis(4-anilino-6-hydroxyethyl-amine-S-triazin-2-ylamino)-2,2’-stilbene disulfonicacid)细胞壁染色液(Huang and Yan 1980)。先配制0.5mol/L甘露醇，调pH为7.0(Tris)。再用甘露醇溶液配制VBL，使VBL终浓度为0.1％。避光，4℃备用。
染色步骤：第一步，吸取1ml细胞悬浮液到1.5ml离心管，吸取10μL，滴加于载玻片上，在显微镜下观察。第二步，吸取400μL细胞悬浮液至新的离心管，加20μL上述0.1％的VBL，避光，染色5min。第三步，染色后，用CPW重复漂洗三次，以除去背景中的荧光。第四步，漂洗后，悬浮于CPW中，避光，荧光显微镜下观察。VBL的激发波长为345nm，发射波长为430nm。
1.3.3FDA检测细胞活性：
FDA是一种非荧光的化合物，渗入活细胞后才释放出荧光素，在蓝色光激发下显示出绿色荧光(张先杰and李铎2000)。
FDA常用于动植物细胞生活力的鉴定的染料(Yang 1986；Boyd,Cholewa et al.2008)，当活细胞具有完整细胞膜时，细胞内FDA经水解产生的荧光素在胞内积累，在蓝光下产生绿色荧光，而死细胞，细胞膜使去了选择透性，荧光素无法在胞内积累，而不产生荧光(Saruyama,Sakakura et al.2013)。
配制5ml 5mg/L FDA：先配0.65mol/L的甘露醇，再称取25mg双醋酸荧光素FDA，溶于1ml丙酮，完全溶解之后，再加入上述甘露醇溶液4ml。避光，4℃保存。取细胞悬浮液0.5ml于1.5ml离心管，加入FDA染色液，使其终浓度为0.01％，室温下静置5min，荧光显微镜下观察，FDA的最大激发波长为493nm，发射波长为510nm。发绿色荧光的为活细胞，不发荧光的为死细胞。
2结果：
不同酶液组合、酶解时间对苹果果肉单细胞分离的影响见表2所示：
表2 不同酶液组合、酶解时间对苹果果肉单细胞分离的影响
用0.1％(W/V：质量与体积比)离析酶分离苹果果肉细胞，酶解时间为0.5h，得到11个/10μL单细胞，而且几乎没有碎片。
用VBL检测细胞壁完整性和用FDA检测细胞活性的结果见图1所示，其中：图1A为未分离的细胞，经FDA染色成为绿色，说明果肉细胞具有活性；(暗场)；图1B：VBL检测细胞的完整性；(暗场)；图1C：酶解0.5h，获得完整单细胞；图1D：FDA染色检测细胞的活性(暗场)。
分离苹果果肉单细胞过程中，在没有酶的情况下，不能分离出果肉单细胞，用FDA染色液染色，能够看到堆叠的有活性的细胞群(图1A)；当酶液中含有0.1％纤维素酶或0.05％果胶酶时，获得单细胞少，有大量碎片存在，如表2中酶液Ⅰ和酶液Ⅱ，但是当酶液中只含有0.1％离析酶时，处理时间只有0.5h时，单细胞产量多且完整(图1C)，当处理时间是1h和2h时，虽有较多的单细胞，但是碎片较多，因此，酶液Ⅲ是分离果肉单细胞的最佳酶液，适宜酶解时间为0.5h(表2)。
离析酶分离得到的苹果果肉单细胞经VBL染色后，细胞周围有明显的荧光(图1B)，这个结果说明，经离析酶处理果肉可以获得完整的果肉单细胞。
分离得到的单细胞经FDA染色五分钟后，细胞内充满了荧光物质(图1D)，这个结果表明，分离得到的果肉单细胞具有活性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，包括将苹果果肉切成薄片的步骤，其特征在于：所述快速分离苹果果肉单细胞的方法还包括将果肉薄片放置于含0.1％(W/V)离析酶的CPW溶液中，在黑暗条件下酶解0.5h的步骤。
2.根据权利要求1所述的一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，其特征在于：所述CPW溶液的组成成分为101.0mg/L KNO3，27.2mg/L KH2PO4，246.0mg/L MgSO4·7H2O，1480.0mg/L CaCl2·2H2O，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.4mol/L甘露醇，4℃低温保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，其特征在于：含0.1％(W/V)离析酶的CPW是通过将离析酶溶于CPW溶液中制备而成。
4.根据权利要求1所述的一种快速分离苹果果肉单细胞的方法，其特征在于：所述在黑暗条件下的酶解温度为27℃。
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