CN113046291B - 一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，该方法包括亚洲棉种子的萌发、组织培养、酶解解离原生质体、离心收集原生质体以及显微观察鉴定等步骤。本发明从亚洲棉的根尖和叶片所解离的原生质体浓度较高(高于3000cells/μL)，且活率不低于92％，完全符合10×Genomics单细胞转录组测序的上机要求。因此本发明得出的根尖与叶片解离原生质体的方法，更好的解决了亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体解离困难以及活率低的难题，从而可以更好的研究棉花抗逆过程特定基因的表达，对于棉花的遗传发育与培育抗逆棉花的品种至关重要。

Description

一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原 生质体的解离方法

技术领域

本发明涉及一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，属于细胞生物学与普通生物学技术领域。

背景技术

植物细胞不同于动物细胞，它有细胞壁的保护。植物原生质体是指去除细胞壁的由细胞膜包裹的裸露细胞，本身具有细胞的全能性。目前植物细胞原生质体制备过程中，有两大难题，酶解时间与缓冲液渗透压。植物组织伴随着发育程度和功能的不同，具有不同的细胞壁厚度和液泡渗透压，这为不同植物组织间甚至是复杂植物组织内的单细胞分析造成了一定的障碍。

棉花是重要的经济作物，是纺织品的主要原料之一，在国民经济和人民生活中占有重要地位。亚洲棉是一个二倍体棉种，具有纤维强力高，抗逆性强等优良性状。尽管棉花是耐盐先锋作物，但耐盐能力有限，不足以对我国大环境的盐渍土壤形成耐受性。随着城镇化发展和人类活动对土壤环境的污染，可耕作土地面积逐渐减少，而粮棉争地的矛盾日益显现，培育适宜我国土壤和气候环境的耐盐和抗旱棉花品种显得尤为重要。

棉花根尖是面对非生物胁迫最先做出反应的部位，因此，研究根尖细胞的发育轨迹以及响应非生物胁迫的基因对于提高棉花耐盐与抗旱的特性至关重要。棉花叶肉细胞位于上、下表皮之间，叶肉细胞内含有大量的叶绿体，是植物进行光合作用的主要部分。

10×Genomics单细胞转录组测序是近几年在生物科研领域比较热门的技术之一。它不同于目前一般的普通转录组测序，可以很精确的研究植物细胞上的某一个部位，比如研究气孔谱系细胞的发育，研究雄性不育过程的花粉败育。而常规的转录组测序只能检测植物所有部位的平均表达量，往往解决不了细胞的异质性。

现有技术制备的棉花根尖细胞与叶肉细胞的原生质体，其数量与活率均不能满足10×Genomics单细胞转录组测序的上机要求，如何能制备出棉花根尖细胞与叶肉细胞的原生质体，使其数量与活率分别满足10×Genomics单细胞转录组测序的上机要求，从而可以更好的研究棉花抗逆过程特定表达的基因，对于棉花的遗传发育与培育抗逆棉花的品种至关重要。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，其包括如下步骤：

(1)培养获得亚洲棉的根尖和叶肉组织；

(2)将根尖与叶肉组织分别加入酶解液进行培养；

(3)向步骤(2)中处理后的酶解液中加入使原生质体释放的溶液(原生质体释放液)，之后细胞筛过滤，低速离心，弃上清；

(4)向步骤(3)中保留的溶液中加入原生质体释放液，重新悬浮原生质体，细胞筛过滤，低温低速离心，弃上清，加入原生质体释放液重新悬浮原生质体；

(5)将步骤(4)中获得的原生质体置于冰上，重新悬浮原生质体，取原生质体悬浮液加入台盼蓝染色液在载玻片上通过显微镜镜检，计算细胞数量与细胞活率。

如上所述的解离方法，优选地，在步骤(1)中，获得亚洲棉的根尖组织的方法：取饱满的亚洲棉种子，采用组织培养的方法进行萌发生长；侧根生长至2-3cm时取样，取距离根尖0.5-1cm处组织；

获得叶肉组织的方法：取饱满的亚洲棉种子，植入营养土中黑暗条件下萌发、正常光照下生长；生长至子叶完全平展时取样，将子叶切成0.5-1mm的细条。

如上所述的解离方法，优选地，所述正常光照下生长条件为28℃恒温，16h光照/8h黑暗。

如上所述的解离方法，优选地，在步骤(2)中，根尖组织所加入的酶解液的配方为：Cellulase R10(纤维素酶R10)1.5％、Pectolyase(果胶酶)1％、D-甘露醇0.4mol/L、KCl0.1mol/L、MES(吗啉乙磺酸)0.08mol/L、CaCl₂ 0.02mol/L、BSA 0.1％，溶剂为灭菌的ddH₂O，根尖组织加入酶解液后，先进行抽真空，之后再进行培养，抽真空的时间为30min-60min，培养为在25℃，以80-120r/min培养5-7h。

进一步，最优选地，所述抽真空的真空度要求为0.05MPa，时间为60min，以80-120r/min培养6.5h。

如上所述的解离方法，优选地，在步骤(2)中，叶肉组织所加入的酶解液的配方为Cellulase R10(纤维素酶R10)1.5％、Macerozyme(离析酶)0.75％、HemiCellulase(半纤维素酶)1％、D-甘露醇0.4mol/L、KCl 20mmol/L、MES(吗啉乙磺酸)20mmol/L、CaCl₂ 10mmol/L、BSA 0.1％，溶剂为灭菌的ddH₂O，培养为在25℃，以80-120r/min培养4～6h。

如上所述的解离方法，优选地，在步骤(3)中，根尖组织所用的原生质体释放液的配方为：KCl 0.1mol/L、BSA0.1％、MES(吗啉乙磺酸)0.08mol/L、D-甘露醇0.4mol/L，溶剂为灭菌的ddH₂O。

如上所述的解离方法，优选地，根尖组织所用的低速离心为：离心速度为300g，且加减速设为1，离心时间10min。

如上所述的解离方法，优选地，在步骤(3)中，叶肉组织所用的原生质体释放液的配方为：KCl 5mmol/L、NaCl 154mmol/L、MES(吗啉乙磺酸)20mmol/L，溶剂为灭菌的ddH₂O；MES的pH为5.7。

如上所述的解离方法，优选地，叶肉组织所用的低温低速离心为：温度为4℃，离心速度为30g，且加减速设为2，离心时间10min。

如上所述的解离方法，优选地，细胞筛的孔径为40μm。

如上所述的解离方法，优选地，步骤(5)中，所述台盼蓝染色液的质量浓度为0.4％；镜检时原生质体悬浮液与台盼蓝染色液的比例为5：1。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞原生质体的解离方法，首次实现了亚洲棉根尖原生质体的解离，解决了棉花根尖原生质体解离难的问题，且解离获得的原生质体浓度达到3300cells/μL，且活率达到95％。该结果完全满足10×Genomics单细胞转录组测序的原生质体样品理想浓度上机要求(2000cells/μL)，且活率达到85％的要求，碎片率较低，满足单细胞转录组测序的要求，为研究棉花根尖细胞的发育轨迹以及响应非生物胁迫的基因提供了重要的途径。

本发明中用于单细胞转录组测序的亚洲棉叶肉细胞原生质体的解离方法，与目前常规叶肉细胞原生质体解离方法相比，大大缩短了原生质体的解离时间，常规方法解离需要10-16h，而本发明所需时间为4-6h，从而尽可能减少解离过程中的细胞损伤；同时，获得的原生质体浓度达到3100cells/μL，且活率达到92％，原生质体悬液中背景比较干净，破碎的叶绿体比较少，而常规解离方法中往往很少计算活率，且往往解离后获得的原生质体悬液中破碎的叶绿体较多，而这些恰恰是影响单细胞上机是否成功的关键因素；因此，本发明中用于单细胞转录组测序的亚洲棉叶肉细胞原生质体的解离方法满足单细胞转录组测序的要求，为研究棉花叶肉细胞的发育提供了重要的途径。

附图说明

图1为本发明中组织培养条件下获得的根尖侵入酶解液中制备原生质体；

图2为组织培养条件下获得的根尖酶解过滤后原生质体溶液；

图3为本发明中10×视野下根尖所制备的原生质体计数；

图4为10×视野下原生质体悬浮液与台盼蓝混合液下的细胞活力结果；

图5为本发明中10×视野下原生质体悬浮液与0.02％FDA染液混合液下的细胞活力结果；

图6为20×视野下原生质体悬浮液与0.02％FDA染液混合液下的细胞活力结果；

图7为本发明中非真空处理下10×视野下根尖所制备的原生质体计数；

图8为非真空处理下10×视野下原生质体悬浮液与台盼蓝混合液下的细胞活力结果；

图9为本发明中正常光照生长下获得的子叶侵入酶解液中制备原生质体；

图10为正常生长条件下获得的子叶酶解过滤后原生质体溶液；

图11为本发明中10×视野下子叶所制备的原生质体计数；

图12为10×视野下子叶所制备的原生质体悬浮液与台盼蓝混合液下的细胞活力结果；

图13为正常生长条件下常规解离方法中10×视野下子叶所制备的原生质体计数。

具体实施方式

采用现有技术进行原生质体的获得，获得单细胞的活率不够，且因溶液中有Ca²⁺或Mg²⁺离子的干扰，为了解决这些技术问题，本发明为了能够获得单细胞转录组测序要求送样的棉尖细胞和叶肉细胞的原生质体，进行了大量的实验，采用不同酶的组合，最后研究发现对于棉尖组织或叶肉组织不进行质壁分离，直接用优化后的酶解液进行解离，并且在各种酶浓度的配合使用下，结合采用原生质体释放液才能获得满足单细胞转录组测序要求的原生质体。本发明经过的大量实验，为了节省篇幅结果就不全部例出，仅是对于是否进行抽真空及真空度的大小及时间的结果例出。

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述，下面实施例中所用的百分比浓度均为质量百分比浓度。

实施例1

(1)选取50粒饱满的经浓硫酸脱绒、去种壳获得的亚洲棉种子，在超净工作台中经0.1％HgCl消毒15min后，用灭菌水清洗3次，每次清洗5min，然后放入MS培养基(MS培养基的配方如表1所示)中，第二天扶苗；所用组织培养方法的生长条件为28℃恒温，16h光照/8h黑暗。大约生长至5天即侧根生长至2-3cm时取样。

表1 MS培养基配方

(2)原生质体制备前的准备工作：将锋利的刀片、细胞培养板、培养皿，吸水纸、镊子、锥形瓶、离心管(50mL、2mL)、40μm的细胞筛、剪去顶端的1mL蓝枪头和100μL黄枪头、量筒、烧杯等实验耗材进行灭菌处理，并将超纯水进行高压蒸汽灭菌。

(3)用50mL无菌离心管配置酶解液(酶解液的配方如表2所示)，定容后于超净工作台中用0.22μm滤器过滤除菌，酶解液要现用现配。

表2酶解液配方

(4)原生质体的制备。在超净工作台中打开无菌培养基，用镊子小心的将棉花幼苗取出放在盛有已灭菌的吸水纸的培养皿上，用锋利的剃须刀将幼苗侧根根尖0.5-1.0cm处切下，用镊子将根尖约1g快速放入含有10mL酶解液的细胞培养板中，如图1所示，0.05MPa抽真空1h，使酶解液快速进入根尖中，整个过程在冰上操作。

(5)原生质体的解离与释放。将上步中酶解的根尖放入25℃摇床，以90r/min培养6.5h。

(6)培养期间配置Wb溶液(Wb溶液的配方如表3所示)。

表3 Wb溶液的配方

(7)过滤原生质体。沿细胞培养板壁加入10mL冰上预冷10min的Wb溶液后轻轻摇晃，从而减少原生质体的的损伤，使解离终止并充分释放原生质体。将孔径为40μm的细胞筛放在已灭菌50mL圆底离心管上，先用Wb溶液润洗细胞筛，再将加入Wb溶液后的酶解混合液过滤至50mL圆底离心管中，如图2所示。

(8)收集原生质体。低速水平离心，以300g速度，加减速档为1，离心10min；用剪去顶端的枪头将上清液弃掉(注意操作过程中要轻柔，防止原生质体受到外力破裂)，用预冷的Wb溶液重新悬浮原生质体，将40μm的细胞筛放在已灭菌2mL离心管上，先用预冷的Wb溶液润洗细胞筛，再将Wb溶液重新悬浮后的原生质体溶液过滤至2mL离心管中并以300g速度，加减速档为1，离心3min收集原生质体，弃上清，加入500μL的预冷的Wb溶液重新悬浮原生质体。

(9)将获得的原生质体置于冰上，用安装上枪头的移液枪枪头轻轻吹打原生质体悬液进行重新悬浮原生质体，取原生质体悬浮液50μL加入10μL质量浓度为0.4％台盼蓝染色液中，慢慢混匀，在细胞计数板上通过普通光学显微镜镜检，分别观察原生质体悬浮液非染色下的显微结果，如图3所示，染色下的显微结果如图4所示，计算细胞数量与细胞活率。取浓度0.02％FDA溶液10μL，加10μL原生质体悬浮液慢慢混合均匀，室温静止5～10min。取混合液滴于载玻片上，在荧光显微镜(Leica，DMIRB，Germany)下检查，10倍视野下原生质体悬浮液与0.02％FDA染液混合液下的细胞活力结果如图5所示，20倍视野下原生质体悬浮液与0.02％FDA染液混合液下的细胞活力结果如图6所示；活力高的原生质体具有黄绿色荧光。

(10)原生质体计数方法。本实施例采用的细胞计数方法为红细胞计数法，血球细胞计数板为25×16格，计算公式为：原生质体数/mL＝80个小格内原生质体个数÷80×400×10000×稀释倍数；活原生质体率(％)＝(原生质体总数－死原生质体数)÷细胞总数×100％。最终获得的亚洲棉根尖细胞原生质体的浓度为3.375×10⁶个/mL，原生质体的活率为95％。

对比例1

本发明进行了非真空处理下根尖的解离(其它条件同上，仅是步骤(4)中没有进行抽真空)，通过对比发现真空处理0min后，根尖解离所需时间为27h左右，获得的原生质体活率为30％，结果如图7所示；分别采用0.025MPa、0.1MPa、0.5MPa与1MPa真空处理时，解离获得的原生质体的活率均低于80％；而当0.05MPa真空处理10min后，根尖解离所需时间为19h左右，获得的原生质体活率为35％；0.05MPa真空处理20min后，根尖解离所需时间为18h左右，获得的原生质体活率为45％；0.05MPa真空处理30min后，根尖解离所需时间为8h左右，获得的原生质体活率为73％；0.05MPa真空处理40min后，根尖解离所需时间为7h左右，获得的原生质体活率为80％；0.05MPa真空处理50min后，根尖解离所需时间为7h左右，获得的原生质体活率为84％；0.05MPa真空处理60min后，根尖解离所需时间为6.5h左右，获得的原生质体活率为95％；0.05MPa真空处理90min后，根尖解离所需时间为6.3h左右，获得的原生质体活率为82％；0.05MPa真空处理120min后，根尖解离所需时间为3h左右，获得的原生质体活率为83％。综合分析，当0.05MPa真空处理60min时，解离获得的原生质体活率满足单细胞转录组测序的要求，其根尖解离时间为6.5h左右，根尖解离获得的原生质体的活率能够达到95％(如图4所示)，而非真空处理下根尖解离获得的原生质体的活率为30％以下，且解离获得的碎片较多(如图8所示)。

此外，本发明还通过大量的实验分别验证了不同Cellulase R10(纤维素酶R10)浓度(1％-2.5％)、不同Pectolyase(果胶酶)浓度下(0.2％-1.5％)、不同的真空处理下(0.025MPa-1MPa)以及不同的真空处理时间下(0min-120min)解离获得的原生质体的数量与活率，结果发现只有当Cellulase R10(纤维素酶R10)浓度为1.5％，Pectolyase(果胶酶)浓度为1％，真空压强为0.05MPa以及真空处理时间为1h时，满足10×Genomics单细胞转录组测序的要求。同时10×Genomics单细胞转录组测序要求缓冲液不能含有Ca²⁺与Mg²⁺离子等影响酶活性的物质，因此本发明中Wb缓冲液中不含有CaCl₂与MgCl₂等成分。

实施例2

(1)选取50粒饱满的亚洲棉种子，植入营养土中，正常光照下培养，所用组织培养方法的生长条件为28℃恒温，16h光照/8h黑暗。大约生长5-10天，子叶完全平展时取样。

(2)原生质体制备前的准备工作：将锋利的刀片、培养皿，吸水纸、镊子、锥形瓶、离心管(50mL、2mL)、40μm的细胞筛、减去顶端的1mL蓝枪头和100μL黄枪头、量筒、烧杯等实验耗材进行灭菌处理，并将超纯水进行高压蒸汽灭菌。

(3)用50mL无菌离心管配置酶解液，配方如表4所示，溶剂为灭菌的ddH₂O，4℃保存；定容后于超净工作台中用0.22μm滤器过滤除菌，酶解液要现用现配。

(4)在暗光下进行原生质体的制备。用经酒精消毒的刀片将子叶从子叶基部切下。选取长势较好的叶片放在吸水纸上，左手轻轻按住，右手用锋利的刀片切成0.5-1mm左右的细条，将切下的细条1g放入装有含有10mL酶解液的无菌锥形瓶中(避光，用锡箔纸包裹)，并用镊子将细条完全浸入酶解液，如图9所示，整个过程冰上操作。

(5)原生质体的解离与释放。将上步中酶解的子叶细丝放入25℃摇床，以90r/min避光培养5h。

表4酶解液配方

(6)培养期间配置W5溶液(如表5所示)。

表5 W5溶液的配方

(7)过滤原生质体。沿锥形瓶壁加入10mL冰上预冷10min的W5溶液后轻轻摇晃，从而减少原生质体的的损伤，使解离终止并充分释放原生质体。将40μm的细胞筛放在已灭菌锥形瓶上，先用W5溶液润洗细胞筛，再将加入W5溶液后的酶解混合液过滤至锥形瓶中(如图10所示)。

(8)收集原生质体。将锥形瓶中的含有原生质体的酶解液转移到50mL无菌圆底离心管中，低温低速离心，以4℃低温、30g速度、加减速档为2，离心10min；用剪过顶端的枪头将上清液弃掉(注意操作过程中要轻柔，防止原生质体受到外力破裂)，用预冷的W5溶液重新悬浮原生质体，将40μm的细胞筛放在已灭菌2mL离心管上，先用预冷的W5溶液润洗细胞筛，再将W5溶液重新悬浮后的原生质体溶液过滤至2mL离心管中并以30g速度，离心3min收集原生质体，弃上清，加入适量的预冷的W5溶液重新悬浮原生质体。

(9)将获得的原生质体置于冰上，重新悬浮原生质体，取原生质体悬浮液50μL加入10μL质量浓度为0.4％台盼蓝染色液中，慢慢混匀，在载玻片上通过普通光学显微镜镜检，分别观察原生质体悬浮液，非染色下的显微结果如图11所示，染色下的显微结果如图12所示，活力高的原生质体不被染色，活力较低的原生质体被染成蓝色，从而计算原生质体活率。

(10)原生质体计数方法。本实施例采用的细胞计数方法为红细胞计数法，血球细胞计数板为25×16格，计算公式为：原生质体数/mL＝80个小格内原生质体个数÷80×400×10000×稀释倍数；活原生质体率(％)＝(原生质体总数－死原生质体数)÷细胞总数×100％。最终获得的亚洲棉叶肉细胞原生质体的浓度为3.125×10⁶个/mL，原生质体的活率为92％。

本发明还通过大量的实验分别验证了不同Cellulase R10(纤维素酶R10)浓度(1％-3％)、不同的Macerozyme(离析酶)浓度下(0.2％-1％)、不同的真空处理下(0.05MPa-1MPa)解离获得的原生质体的数量与活率，同时加入HemiCellulase(半纤维素酶)，并验证了不同的HemiCellulase(半纤维素酶)浓度下(0.2％-1.5％)的解离效果，结果发现只有当Cellulase R10(纤维素酶R10)浓度为1.5％，Macerozyme(离析酶)浓度为0.75％，HemiCellulase(半纤维素酶)浓度为1％时，解离获得的原生质体满足10×Genomics单细胞转录组测序的要求。同时10×Genomics单细胞转录组测序要求缓冲液不能含有Ca²⁺与Mg²⁺离子等影响酶活性的物质，因此本发明中W5缓冲液中不含有CaCl₂与MgCl₂等成分。

对比例2

采用常规的亚洲棉子叶的叶肉细胞原生质体的解离方法，(其中，酶解液的配方为Cellulase R10(纤维素酶R10)1.5％、Macerozyme(离析酶)0.75％、D-甘露醇0.6mol/L、β-巯基乙醇0.05％、KCl 20mmol/L、MES(吗啉乙磺酸)20mmol/L、CaCl₂ 10mmol/L、BSA 0.1％，溶剂为灭菌的ddH₂O，培养为在25℃，以50r/min进行培养。培养5h时，解离获得原生质体浓度为150个/μL，难以满足单细胞转录组测序上机要求(2000个/μL)；当培养16h时，解离获得的原生质体的活率为75％，同样难以满足单细胞转录组测序上机要求(活率为85％以上)，同时，碎片率较高，如图13所示。

本发明经大量实验发现通过加入HemiCellulase(半纤维素酶)来观察解离后的效果，通过对比，发现本发明的解离时间缩短了大约4-10h，获得的原生质体不易破碎且活率较高，达到了92％，如图12所示；在加入HemiCellulase(半纤维素酶)后，本发明还进行了0.05MPa与1MPa真空处理，结果显示两种压强真空处理后获得的子叶原生质体活率均低于70％，且碎片率高于30％。

本发明中所选择的预冷处理是为了减少解离获得的原生质体的损伤。采用现有技术中其它细胞的酶解液并不能解离出亚洲棉根尖原生质体，本发明中实施例1中采用的酶解液方法为目前唯一能够解离出亚洲棉根尖原生质体的方法，且符合单细胞转录组测序要求。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，其特征在于，

其包括如下步骤：

(1)分别培养获得亚洲棉的根尖和叶肉组织；

(2)将根尖与叶肉组织分别加入酶解液进行培养；

(3)向步骤(2)中处理后的酶解液中加入原生质体释放液，之后细胞筛过滤，低速离心，弃上清；

(4)向步骤(3)中保留的溶液中加入原生质体释放液，重新悬浮原生质体，细胞筛过滤，低温低速离心，弃上清，加入原生质体释放液重新悬浮原生质体；

(5)将步骤(4)中获得的原生质体置于冰上，重新悬浮原生质体，取原生质体悬浮液加入台盼蓝染色液在载玻片上通过显微镜镜检，计算细胞数量与细胞活率；

在步骤(2)中，根尖组织所加入的酶解液的配方为：Cellulase R10 1.5％、Pectolyase1％、D-甘露醇0.4mol/L、KCl 0.1mol/L、MES0.08mol/L、CaCl₂ 0.02mol/L、BSA 0.1％，溶剂为灭菌的ddH₂O，根尖组织加入酶解液后，先进行抽真空，之后再进行培养，抽真空的时间为30min-1h，培养为在25℃，以80-120r/min培养5-7h；

在步骤(2)中，叶肉组织所加入的酶解液的配方为Cellulase R10 1.5％、Macerozyme0.75％、HemiCellulase 1％、D-甘露醇0.4mol/L、KCl 20mmol/L、MES20mmol/L、CaCl₂ 10mmol/L、BSA 0.1％，溶剂为灭菌的ddH₂O，培养为在25℃，以80-120r/min培养4-6h；

在步骤(3)中，根尖组织所用的原生质体释放液的配方为：KCl0.1mol/L、BSA 0.1％、MES 0.08mol/L、D-甘露醇0.4mol/L，溶剂为灭菌的ddH₂O；叶肉组织所用的原生质体释放液的配方为：KCl5mmol/L、NaCl154mmol/L、MES 20mmol/L，溶剂为灭菌的ddH₂O；MES的pH值为5.7。

2.如权利要求1所述的解离方法，其特征在于，

在步骤(1)中，获得亚洲棉的根尖组织的方法：取饱满的亚洲棉种子，采用组织培养的方法进行萌发生长；侧根生长至2-3cm时取样，取距离根尖0.5-1cm处组织；

获得叶肉组织的方法：取饱满的亚洲棉种子，植入营养土中黑暗条件下萌发、正常光照下生长；生长至子叶完全平展时取样，将子叶切成0.5-1mm的细条。

3.如权利要求2所述的解离方法，其特征在于，

所述正常光照下生长条件为28℃恒温，16h光照/8h黑暗。

4.如权利要求1所述的解离方法，其特征在于，

根尖组织所用的低速离心为：离心速度为300g，且加减速设为1，离心时间10min。

5.如权利要求1所述的解离方法，其特征在于，

叶肉组织所用的低温低速离心为：温度为4℃，离心速度为30g，且加减速设为2，离心时间10min。

6.如权利要求1所述的解离方法，其特征在于，

细胞筛的孔径为40μm；

步骤(5)中，所述台盼蓝染色液的质量浓度为0.4％；镜检时原生质体悬浮液与台盼蓝染色液的比例为5：1。

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