CN113717922B - 一种适用于拟南芥叶片组织原生质体分离的含转录抑制剂的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转录抑制剂，所述转录抑制剂包含茴香霉素、雷公藤内酯和BMH‑21。本发明还公开了一种含转录抑制剂的酶解液，其包含酶解液和所述的转录抑制剂。本发明还公开了一种含转录抑制剂的试剂盒，所述试剂盒包括含转录抑制剂的酶解液、含转录抑制剂的W5缓冲液和含转录抑制剂的WI缓冲液。本发明还公开了所述转录抑制剂/含转录抑制剂的酶解液/试剂盒在酶解拟南芥细胞中的应用。本发明公开的试剂盒在解离过程中抑制人为或外界因素所导致的转录变化，使植物样本在解离过程中转录模式不会发生变化，结果更加准确可靠，保证测序结果真实稳定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种酶解及转录抑制技术，具体涉及一种适用于拟南芥叶片组织的含转录抑制剂的试剂盒，及其在单细胞转录组测序中的应用。
背景技术
单细胞测序技术通过解析单个细胞转录组，来构建组织的细胞相互作用网络，是生命科学研究的基础技术手段，用以揭示组织或器官中细胞的多样性和复杂性，解答细胞异质性问题。在植物研究中，由于细胞壁等因素限制，植物组织需要解离为原生质体才能开展单细胞测序，而植物细胞在解离过程中会由于机械离心、温度改变、失去细胞壁支撑等因素，引起转录组在解离过程中发生较大变化，从而造成“解离偏好”，结果的真实性和准确性受到很大影响。
目前在动物组织解离过程中，可以通过在酶解液中添加转录抑制剂来消除“解离偏好”，保证结果真实、准确、可靠，如《Single Cell Sequencing Reveals Glial SpecificResponses to Tissue Processing&Enzymatic Dissociation in Mice and Humans》一文对该方案进行了检验，证明这一方法可以消除人为偏好，增强实验结果的真实性和准确性。但添加转录抑制剂的方法目前尚未在植物组织中得到应用和验证，亟需开发一种适用于植物组织原生质体单细胞测序的转录抑制剂操作方法和流程。
发明内容
现有技术中只有针对动物细胞进行转录抑制的方法，虽然植物和动物都是生物组织，但在物种生理特性、理化特性上都有极大的差异，适用于动物细胞的方法并不能简单适用于植物原生质体。为了解决现有技术存在的不足，本发明在大量深入研究和实验的基础上，提供了一种适用于拟南芥叶片组织原生质体分离的含转录抑制剂的试剂盒，并在单细胞测序中予以应用。
本发明提供了一种转录抑制剂，所述转录抑制剂包含茴香霉素、雷公藤内酯和BMH-21。
其中，所述转录抑制剂的配方为：15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21；优选地，所述转录抑制剂的配方为：15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μMBMH-21。
本发明还提供了一种含转录抑制剂的酶解液，其包含酶解液和如上所述的转录抑制剂。
其中，在所述茴香霉素终浓度为15～20μg/mL、雷公藤内酯终浓度为5～7.5μM、BMH-21终浓度为5～7μM的条件下，每1mL酶解液中添加茴香霉素量为1.5～2.0μL、雷公藤内酯量为1.8～2.8μL、BMH-21量为1.8～2.6μL。
其中，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21；优选地，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21。
本发明还提供了一种含转录抑制剂的试剂盒，所述试剂盒包括含转录抑制剂的酶解液，含转录抑制剂的W5缓冲液和含转录抑制剂的W1缓冲液。
其中，在所述茴香霉素终浓度为15～20μg/mL、雷公藤内酯终浓度为5～7.5μM、BMH-21终浓度为5～7μM的条件下，每1mL的W5分别及WI分别中添加茴香霉素量分别为1.5～2.0μL、雷公藤内酯的量分别为1.8～2.8μL、BMH-21的量分别为1.8～2.6μL。
其中，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21；优选地，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21。
其中，所述含转录抑制剂的W5缓冲液的配方为：0.15M NaCl、0.12M KCl、5mMCaCl2、2mM MES、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21；优选地，所述含转录抑制剂的W5缓冲液的配方为：0.15M NaCl、0.12M KCl、5mM CaCl2、2mM MES、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21。
其中，所述含转录抑制剂的W1缓冲液的配方为：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21；优选地，所述含转录抑制剂的W1缓冲液的配方为：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21。
本发明还提供了所述转录抑制剂或含转录抑制剂的酶解液或含转录抑制剂的试剂盒在酶解拟南芥叶片组织中的应用。
本发明还提供了所述转录抑制剂或含转录抑制剂的酶解液或含转录抑制剂的试剂盒在单细胞转录组测序中的应用。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒酶解拟南芥细胞的方法，包括如下具体步骤：
步骤(1)、准备试剂：配制含转录抑制剂的酶解液、含转录抑制剂的W5缓冲液、含转录抑制剂的WI缓冲液；
步骤(2)、制备解离样品：选取拟南芥幼苗茎生叶，剪下洗净、切成碎块；
步骤(3)、组织酶解：向所述步骤(2)中获得的碎片中加入所述的含转录抑制剂的酶解液，静置、混匀、消化酶解；
步骤(4)、消化液浑浊后在显微镜下镜检，估算原生质体得率；
步骤(5)、消化液过筛：先用含转录抑制剂的W5缓冲液润洗组装于离心管上的筛网；然后向所述步骤(4)的消化液中加入所述含转录抑制剂的W5缓冲液，吸取上清过筛；
步骤(6)、原生质体富集：将所述步骤(5)过筛后的滤液离心，富集原生质体；
步骤(7)、原生质体洗涤：向所述步骤(6)富集的原生质体中加入含转录抑制剂的WI缓冲液悬起混匀并离心洗涤，再将洗涤后的原生质体沉淀用适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起，镜检计数。
在一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)制备试剂：开始取材前，先分别配置含转录抑制剂酶解液、含转录抑制剂W5缓冲液及含转录抑制剂的WI缓冲液。
(2)制备样本：选取较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶，用剪刀剪下，用水冲洗干净，将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用刀片将叶片快速果断的切成碎块。
(3)组织酶解：向步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入含转录抑制剂的酶解液，在恒温混匀仪中静置一段时间，随后恒温混匀仪中进行消化酶解。
(4)消化液镜检：消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(5)消化液过筛：将筛网组装到离心管上。先用少量含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上。
(6)原生质体富集：将过筛后的滤液用水平转子离心，富集原生质体。
(7)原生质体洗涤富集：将富集的原生质体用含转录抑制剂的WI缓冲液悬起混匀后，离心洗涤一次，再将洗涤的原生质体沉淀用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起，镜检计数。
本发明的创造性主要在于酶解液中转录抑制剂的添加配方，即配方是特异性适用于抑制拟南芥叶片组织在酶解处理过程中转录组发生应激变化的，且为避免添加抑制剂后对植物原生质体造成伤害，保证原生质体状态完好，本发明在分离植物原生质体的常规步骤基础上做了调整，即用W5缓冲液进行洗涤一次后，直接用WI缓冲液25℃，200×g，离心6min进行二次洗涤，既能保证无W5缓冲液残留，又减少原生质体损失。就拟南芥叶片单细胞测序而言，本发明中涉及的各溶液配方以及操作步骤，在本发明之前均未见报道。
步骤(1)中，优选地，所述含抑制剂的酶解液包含以下成份(终浓度)：0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21。
步骤(1)中，优选地，所述含抑制剂的W5缓冲液包含以下成份(终浓度)：0.15MNaCl、0.12M KCl、5mM CaCl2、2mM MES、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21。
步骤(1)中，优选地，所述含抑制剂的WI缓冲液包含以下成份(终浓度)：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21。
步骤(1)中，所述成份分别购自MES(sigma/1266615-59-1)、KCl(sigma/P9541-500G)、BSA(美天旎/130-091-376)、CaCl2(sigma/793639-100G)、NaCl(sigma/S5150-1L)、纤维素酶R10(索莱宝/C8260-10g)、离析酶R10(多烯/9032-75-1)、甘露醇(翌圣/60327ES76)、果胶酶(Solarbio/P8181-5G)、茴香霉素(sigma/176880-10MG)、雷公藤内酯(sigma/T3652-1MG)、BMH-21(sigma/SML1183-5MG)。
步骤(2)中，所述选取生长较嫩，未发黄的拟南芥幼苗茎生叶片；优选地，为20～25天拟南芥的茎生叶。
步骤(2)中，所述将组织置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上的目的是保持水分充足避免组织失水萎蔫。
步骤(2)中，所述用水将叶片冲洗干净；优选地，为蒸馏水。
步骤(2)中，所述用刀片将组织切成碎块；优选地，为双面刀片。
步骤(2)中，所述用刀片将组织切成的碎块为0.5～1mm；优选地，为0.5mm。
步骤(3)中，加入的含转录抑制剂的酶解液为3～5mL；优选地，为5mL。
步骤(3)中，所述恒温混匀仪中静置一段时间的目的是使叶片碎块充分浸没在酶解液中，避免叶片组织漂浮在酶解液之上，摇晃时粘壁而导致的酶解不充分。
步骤(3)中，所述恒温混匀仪中静置温度为30～37℃；优选地，为37℃。
步骤(3)中，所述使组织块充分浸没在酶解液中静置时间为15min～30min；优选地，为15min。
步骤(3)中，所述恒温混匀仪中酶解温度为30～37℃；优选地，为37℃。
步骤(3)中，所述恒温混匀仪中酶解转速为100～200rpm；优选地，为200rpm。
步骤(3)中，所述恒温混匀仪中酶解时间为30min～1h；优选地，为30min。
步骤(5)中，所述润洗筛网的含转录抑制剂的W5缓冲液的量为1～2mL；优选地，为1mL；所述向组织碎块中加入的用于过筛的含转录抑制剂的W5缓冲液的量为5～7mL；优选地，为7mL；所述用于清洗筛网的含转录抑制剂的W5缓冲液的量为1～2mL；优选地，为2mL。
步骤(5)中，所述用滴管吸取上清，倾斜滴管缓缓成滴过筛的目的是避免组织沉淀过多过筛时堵塞筛孔而导致原生质体损失。
步骤(6)中，所述富集原生质体离心温度为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(6)中，所述富集原生质体离心转速为100～200×g；优选地，为100×g。
步骤(6)中，所述富集原生质体离心时间为6～7min；优选地，为7min。
步骤(7)中，所述富集原生质体离心温度为20～25℃；优选地，为25℃。
步骤(7)中，所述富集原生质体离心转速为100～200×g；优选地，为200×g。
步骤(7)中，所述富集原生质体离心时间为6～7min；优选地，为6min。
在一个具体的实施方式，本发明所述方法的具体步骤为：
(1)配置转录抑制剂、酶解液及W5缓冲液
开始取材前，先分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂含有15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21。
酶解液含有0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.45～0.55M甘露醇、0.1～1％果胶酶。
W5缓冲液含有0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES。
WI缓冲液含有0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液及转录抑制剂，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用少量含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用3mL含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，20～25℃，100～200×g离心5～7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)单细胞测序
依照10x Genomics公司说明书：Chromium Next GEM Single Cell 3’ReagentKit v3.1，CG000204REV C，进行单细胞测序操作。
本发明还提供了所述方法在酶解拟南芥叶片组织中的应用。
本发明还提供了所述方法在单细胞转录组测序中的应用。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果包括：填补了目前的技术空白：目前缺少适用于植物原生质体分离的转录抑制剂添加配方，影响了植物原生质体分离在单细胞测序中结果的真实性。本发明提供的技术方案解决了这一问题，将有力的提升植物原生质体单细胞测序数据质量。使植物样本在解离过程中转录模式不会发生变化，结果更加准确可靠，本发明提供的技术方案，采用在酶解液、W5及WI缓冲液中添加合适浓度的转录抑制剂，在解离过程中抑制人为或外界因素所导致的转录变化，保证测序结果真实稳定。
附图说明
图1～2是拟南芥叶片原生质体分离镜检图，图1为对照组S1(不添加抑制剂进行酶解制备的原生质体)，图2为实验组S2(添加抑制剂进行酶解制备原生质体)。
图3是拟南芥组织对照组S1(不添加抑制剂进行酶解制备的原生质体)与实验组S2(添加抑制剂进行酶解制备原生质体)差异基因的表达情况热图(Heatmap)。
图4～5是拟南芥组织对照组S1(不添加抑制剂进行酶解制备的原生质体)与添加转录抑制剂实验组S2(添加抑制剂进行酶解制备原生质体)单细胞测序细胞聚类对比图，图4为S1，图5为S2。
图6是对照组S1(不添加抑制剂进行酶解制备的原生质体)与实验组S2(添加抑制剂进行酶解制备原生质体)相比表达上调的应激基因。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂茴香霉素及雷公藤内酯溶于1mLDMSO的母液浓度分别为10mg/mL和1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测：依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞个数，光镜下死细胞会被染成蓝色，活细胞为透明且内含叶绿体等物质的轮廓清晰的圆(图1)。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果及分析：
结果显示，通过本发明技术方案，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表1，图1)，说明解离过程中加入转录抑制剂对原生质体的解离效果不会产生影响，本发明技术方案取得了应有的技术效果。
随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达没有明显变化，故转录抑制效果良好，本发明技术方案取得了应有的技术效果(表1)。
实施例2
本实施例除了转录抑制剂浓度有所提高，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂茴香霉素及雷公藤内酯溶于1mLDMSO的母液浓度分别为10mg/mL和1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照20μg/mL茴香霉素、7.5μM雷公藤内酯、7μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测：依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞个数，光镜下死细胞会被染成蓝色，活细胞为透明且内含叶绿体等物质的轮廓清晰的圆(图1)。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果及分析：
结果显示，通过本发明技术方案，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表1，图1)，说明解离过程中加入转录抑制剂对原生质体的解离效果不会产生影响，本发明技术方案取得了应有的技术效果。
随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达没有明显变化，故转录抑制效果良好，本发明技术方案取得了应有的技术效果(表1)。
实施例3
本发明实施例1和2结果显示添加两种浓度的转录抑制剂均可有效抑制应激基因的表达，本发明实施例1更有利于节约成本，故采用本发明实施例1的方案，进一步进行单细胞测序，以证明本发明所述技术方案适用于单细胞测序。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂茴香霉素及雷公藤内酯溶于1mLDMSO的母液浓度分别为10mg/mL和1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测：依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。原生质体计数采用0.4％的台盼蓝与原生质体悬液按1:9混匀，用移液器吸取10μl加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞个数，光镜下死细胞会被染成蓝色，活细胞为透明且内含叶绿体等物质的轮廓清晰的圆(图1)。
(11)单细胞测序
依照10x Genomics公司说明书：Chromium Next GEM Single Cell 3’ReagentKit v3.1，CG000204REV C，进行单细胞测序操作。
结果及分析：
结果显示，通过本发明技术方案，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(表1，图1)，说明解离过程中加入转录抑制剂对原生质体的解离效果不会产生影响，本发明技术方案取得了应有的技术效果。
单细胞测序细胞类型鉴定结果tSNE聚类图显示，对照组S1共鉴定出15个细胞类群，添加转录抑制剂的实验组S2共鉴定出8个细胞类群(图2)，细胞类群有明显减少。对S1和S2进行差异基因分析发现S1与S2比较共鉴定出349个上调基因，表达差异较大的前25个基因均为与应激机制相关的应激基因如与热激反应相关基因HSP70-5、CLPB1、HSP90-1等，抗氧化相关基因如GPX6、NADP-ME2等，鉴定出422个下调基因，表达差异较大的前25个基因均为代谢相关基因，如叶绿素结合蛋白LHCB1.1.1、LHCB2.2等(图3)，说明在酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中加入转录抑制剂进行植物原生质体分离，可以有效抑制在解离过程由于人为及外界环境因素所导致的细胞转录组变化，从而保证测序结果真实稳定，本发明技术方案取得了应有的技术效果。
对比实施例1
本对比实施例添加了茴香霉素、雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、放线菌素D、BMH-21五种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、α-鹅膏菌素1mg/mL、放线菌素D 2mg/mL，BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21、10μg/mLα-鹅膏菌素、2.5μg/ml放线菌素D的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率较低，且碎片率较高，未能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，无法进行后续实验，故添加茴香霉素、雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、放线菌素D、BMH-21五种转录抑制剂对原生质体损伤较大(表1)。
对比实施例2
本对比实施例转录抑制剂成分只添加茴香霉素，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂茴香霉素溶于1mLDMSO的母液浓度为10mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1ml含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅使用茴香霉素一种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例3
本对比实施例转录抑制剂成分只添加雷公藤内酯，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂雷公藤内酯溶于1mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照5μM雷公藤内酯的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，故转录抑制效果不佳，故仅使用雷公藤内酯一种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例4
本对比实施例转录抑制剂成分只添加BMH-21，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂BMH-21溶于1mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照5μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅使用BMH-21一种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例5
本对比实施例转录抑制剂成分只添加α-鹅膏菌素，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂α-鹅膏菌素溶于1mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照10μg/mLα-鹅膏菌素的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用少量含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用3mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅使用α-鹅膏菌素一种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例6
本对比实施例转录抑制剂成分只添加放线菌素D，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂放线菌素D溶于1mLDMSO的母液浓度为2mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照2.5μg/ml放线菌素D的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅使用放线菌素D一种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例7
本对比实施例添加了茴香霉素、雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、BMH-21四种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、α-鹅膏菌素1mg/mL，BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21、10μg/mLα-鹅膏菌素的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率较低，且碎片率较高，未能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，无法进行后续实验，故添加茴香霉素、雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、BMH-21四种转录抑制剂对原生质体损伤较大(表1)。
对比实施例8
本对比实施例添加了茴香霉素、雷公藤内酯、BMH-21、放线菌素D四种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、放线菌素D 2mg/mL，BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21、2.5μg/ml放线菌素D的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率较低，且碎片率较高，未能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，无法进行后续实验，添加了茴香霉素、雷公藤内酯、BMH-21、放线菌素D四种转录抑制剂对原生质体损伤较大(表1)。
对比实施例9
本对比实施例添加了茴香霉素、雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、放线菌素D四种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、α-鹅膏菌素1mg/mL、放线菌素D 2mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、10μg/mLα-鹅膏菌素、2.5μg/ml放线菌素D的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率较低，且碎片率较高，未能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，无法进行后续实验，故添加茴香霉素、雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、放线菌素D四种转录抑制剂对原生质体损伤较大(表1)。
对比实施例10
本对比实施例添加了茴香霉素、α-鹅膏菌素、放线菌素D、BMH-21四种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、α-鹅膏菌素1mg/mL、放线菌素D 2mg/mL，BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM BMH-21、10μg/mLα-鹅膏菌素、2.5μg/ml放线菌素D的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率较低，且碎片率较高，未能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，无法进行后续实验，故添加茴香霉素、α-鹅膏菌素、放线菌素D、BMH-21四种转录抑制剂对原生质体损伤较大(表1)。
对比实施例11
本对比实施例添加了雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、放线菌素D、BMH-21四种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为雷公藤内酯1mg/mL、α-鹅膏菌素1mg/mL、放线菌素D 2mg/mL，BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21、10μg/mLα-鹅膏菌素、2.5μg/ml放线菌素D的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率较低，且碎片率较高，未能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，无法进行后续实验，故添加雷公藤内酯、α-鹅膏菌素、放线菌素D、BMH-21四种转录抑制剂对原生质体损伤较大(表1)。
对比实施例12
本对比实施例添加了茴香霉素、雷公藤内酯两种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅使用茴香霉素和雷公藤内酯两种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例13
本对比实施例添加了茴香霉素、BMH-21两种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅使用茴香霉素和BMH-21两种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例14
本对比实施例添加了雷公藤内酯、BMH-21两种转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为雷公藤内酯1mg/mL，BMH-21溶于5mLDMSO母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅使用雷公藤内酯和BMH-21两种抑制剂并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例15
本对比实施例除了将本发明实施例1中的转录抑制剂添加浓度减半之外，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照7.5μg/mL茴香霉素、2.5μM雷公藤内酯、2.5μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故将茴香霉素、雷公藤内酯、BMH-21三种抑制剂浓度减半后添加并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例16
本对比实施例除了将本发明实施例1中的转录抑制剂添加浓度加倍之外，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照30μg/mL茴香霉素、10μM雷公藤内酯、10μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率较低，且碎片率较高，未能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，无法进行后续实验，故将三种转录抑制剂浓度加倍添加后对原生质体损伤较大(表1)。
对比实施例17
本对比实施例改变了转录抑制剂的成分配比，终浓度分别为30μg/mL茴香霉素、10μM雷公藤内酯、5μM BMH-21其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照30μg/mL茴香霉素、10μM雷公藤内酯、5μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含有转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含有转录抑制剂的W5溶液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含有转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率基本能达到10xGenomics公司单细胞测序要求，但各项指标均较实施例1差，开展后续实验有一定风险(表1)。
对比实施例18
本对比实施例改变了转录抑制剂的成分配比，终浓度分别为15μg/mL茴香霉素、10μM雷公藤内酯、10μM BMH-21其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、10μM雷公藤内酯、10μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含转录抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率基本能达到10xGenomics公司单细胞测序要求，但各项指标均较实施例1差，开展后续实验有一定风险(表1)。
对比实施例19
本对比实施例改变了转录抑制剂的成分配比，终浓度分别为30μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、10μM BMH-21其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液含有0.2M MES、2M KCl、10％(v/v)BSA、1M CaCl2、纤维素酶R101g、离析酶R100.2g、甘露醇3.64g、果胶酶0.5g，加水至50mL于50mL离心管中。
W5缓冲液含有5M NaCl、2M KCl、1MCaCl2、0.2M MES补水至50mL于50mL离心管中。
WI缓冲液含有0.2M MES、2M KCl、甘露醇补水至50mL于50mL离心管中。
将抑制剂按照30μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、10μM BMH-21的终浓度加入酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mL含转录抑制剂的W5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满含转录抑制剂的W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mL含转录抑制剂的W5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl含转录抑制剂的WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加含转录抑制剂的WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率基本能达到10xGenomics公司单细胞测序要求，但各项指标均较实施例1差，开展后续实验有一定风险(表1)。
对比实施例20
本对比实施例仅将转录抑制剂添加至酶解液中，W5及WI缓冲液中未添加转录抑制剂，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂、酶解液、W5及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21的终浓度加入酶解液中。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)浸泡及自然沉降
向30mm培养皿中加入5mL含转录抑制剂的酶解液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入酶解液中，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(5)组织酶解
将浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(6)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(7)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mLW5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mLW5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(8)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(9)原生质体洗涤
用200μl WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(10)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故仅将转录抑制剂添加至酶解液中，而W5及WI缓冲液中未添加转录抑制剂，并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
对比实施例21
本对比实施例在酶解前先将组织碎块置于同本发明实施例1成分浓度相同的转录抑制剂溶液中孵育30min，后续用不含转录抑制剂的酶解液、W5及WI缓冲液按正常步骤分离原生质体，其余试剂成分、浓度、操作步骤等与本发明实施例1完全一致。
(1)配置转录抑制剂溶液、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液
开始取材前，按如下配方成份分别配置转录抑制剂溶液、酶解液、W5缓冲液及WI缓冲液。
转录抑制剂溶于1mLDMSO的母液浓度分别为茴香霉素10mg/mL、雷公藤内酯1mg/mL、BMH-21溶于5mLDMSO的母液浓度为1mg/mL。
酶解液中含有终浓度为0.02M MES、0.02M KCl、0.1％BSA、0.01M CaCl2、2％纤维素酶R10、0.4％离析酶R10、0.5M甘露醇、1％果胶酶，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
W5缓冲液含有终浓度为0.15M NaCl、0.12M KCl、0.005M CaCl2、0.002M MES，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
WI缓冲液含有终浓度为0.004M MES、0.02M KCl、0.5M甘露醇，用水补至50mL体系于50mL离心管中。
将抑制剂按照15μg/mL茴香霉素、5μM雷公藤内酯、5μM BMH-21的终浓度用HBSS补体积至5mL。
(2)清洗样本
选取生长20～25d较嫩、未发黄的拟南芥幼苗茎生叶4～5片，用剪刀剪下，在蒸馏水中冲洗3次，冲洗掉表面灰尘。
(3)切碎样本
将叶片置于平铺于培养皿中润湿的滤纸上，在镊子的辅助下用双面刀片将叶片迅速果断的切成约0.5mm宽的碎块。
(4)转录抑制剂预处理
向30mm培养皿中加入5mL转录抑制剂溶液，再将步骤(2)得到的拟南芥叶片组织碎块中加入转录抑制剂溶液中，静置30min使组织块在转录抑制剂溶液中充分孵育。
(5)浸泡及自然沉降
将转录抑制剂溶液替换为不含转录抑制剂的酶解液，在恒温混匀仪中37℃静置15min使组织块充分浸没自然沉降在酶解液中。
(6)组织酶解
浸泡在酶解液中的组织置于恒温混匀仪中37℃，200rpm酶解30min。
(7)组织消化液镜检
当组织酶解至消化液呈现浑浊状则在显微镜下进行抽检，估算原生质体得率。
(8)消化液过筛
将40μm筛网组装到50mL离心管上，先用1mLW5缓冲液润筛，再向盛有组织的培养皿中补加满W5缓冲液，总体积约7mL，用滴管慢慢搅拌混匀。待组织沉入底部，将培养皿中上清吸出(尽量不要吸到组织)，倾斜滴管，缓缓成滴过筛。再用2mLW5缓冲液清洗一遍培养皿，操作同上，过筛后总体系约在10mL，用2个15mL离心管平分，每管5mL。
(9)原生质体富集
将过筛后的2管滤液用水平转子，25℃，100×g离心7min，富集原生质体。
(10)原生质体洗涤
用200μl WI缓冲液将两管原生质体沉淀悬起合并混匀后，镜检，再补加WI缓冲液至5mL，使用水平转子，25℃，200×g，离心6min洗涤。小心的将上清全部吸出，尽可能不要留有残余上清液。
(11)原生质体活性检测
依据洗涤离心后剩余的沉淀量，用预估适合上机的WI缓冲液悬起沉淀，轻轻抽打混匀，用台盼蓝染色，计算原生质体浓度、活率、碎片率等指标。台盼蓝染色按照其染色规则进行操作。
(11)荧光定量PCR
依照荧光定量PCR协议进行操作，并进行数据分析。
结果与分析：
结果显示，解离后原生质体活率、原生质体浓度及碎片率均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求，随后利用荧光定量PCR技术分析来源于不同信号通路的6个应激基因的表达量，以不进行酶解的叶片组织作为对照样本，计算添加转录抑制剂进行酶解后原生质体细胞中相应基因的Ct值变化(△△Ct)。结果显示应激基因表达有明显上调，转录抑制效果不佳，故将组织碎块先置于转录抑制剂溶液中孵育30min，再用不含转录抑制剂的酶解液、W5及WI缓冲液按正常步骤分离原生质体并不能有效起到转录抑制的作用(表1)。
为了使转录抑制剂在植物原生质体解离过程中达到最佳转录抑制效果，本发明尝试了不同的转录抑制剂成分、添加浓度及添加方式，进行了一系列对比实验，以原生质体细胞活率等上机指标来评估是否能够进行单细胞测序，以不同信号通路中应激基因的荧光定量PCR结果来评估抑制效果(对照样本为不进行酶解的同类型的叶片组织)，方法及结果如下表1中对比实施例1～21所示。对比实施例1～14是对抑制剂添加成分进行验证。对比实施例1结果显示，添加了茴香霉素、雷公藤甲酯、α-鹅膏菌素、放线菌素D、BMH-21五种转录抑制剂，原生质体解离效果较差，无法满足后续单细胞测序要求。对比实施例2～6结果显示，仅添加一种转录抑制剂，虽然细胞量等指标能够满足单细胞测序要求，但其转录抑制效果均不理想：与“不进行酶解的同类型叶片组织样本”相比，“仅添加一种转录抑制剂进行酶解得到的原生质体”中各个应激基因被明显上调(即显示△△Ct为负值)。对比实施例7～11结果显示，任意添加四种抑制剂，原生质体解离效果与对比实施例1相似，细胞活率等指标无法满足单细胞测序要求，可能是由于α-鹅膏菌素及放线菌素D均具有一定毒性，会对原生质体细胞造成损伤。对比实施例12～14是除α-鹅膏菌素及放线菌素D之外，其它三种抑制剂之间两两组合，结果显示转录抑制效果均不全面，不同组合可能有部分应激信号通路仍被激活，效果不如三种抑制剂同时添加(如实施例1～3结果)。已知茴香霉素是一种有效的蛋白合成抑制剂，它通过抑制肽基转移酶或80s核酸系统干扰蛋白质和DNA合成；雷公藤内酯主要通过促进RNA聚合酶Ⅱ中最大最主要的功能亚基Rpb1磷酸化，以及随后的Rpb1的泛素化降解，还可以诱导DNA损伤，激活P-TEFb，造成Rpb1降解，从而抑制基因的转录；BMH-21是一种新型DNA嵌入剂，能够结合rDNA并抑制RNA聚合酶Ⅰ的转录，三种抑制剂可以从不同方面有效的对基因转录进行抑制。综上所述，由实验结果来看三种抑制剂存在配伍关系，需同时添加茴香霉素、雷公藤内酯、BMH-21三种成份，才能达到较为理想的抑制效果。
对比实施例15、16中，尝试了两种不同的转录抑制剂浓度，对比实施例15显示终浓度为7.5μg/mL茴香霉素、2.5μM雷公藤内酯、2.5μM的BMH-21转录抑制剂，经荧光定量PCR对目的应激基因表达进行分析，发现应激基因仍上调表达，故转录抑制效果不佳。对比实施例16显示终浓度为30μg/mL茴香霉素、10μM雷公藤内酯、10μM BMH-21的转录抑制剂进行解离，碎片增多，活细胞比例较低，开展单细胞测序实验有较高风险。对比实施例17～19尝试了三种抑制剂不同浓度配比条件下的转录抑制情况，原生质体浓度、碎片率、活率等指标均不理想，进行单细胞测序风险较大。结合实施例1～3结果，转录抑制剂添加浓度应为15～20μg/mL茴香霉素、5～7.5μM雷公藤内酯、5～7μM BMH-21。
对比实施例20～21尝试了在实施例1的抑制剂浓度下对转录抑制剂添加方式进行验证，对比实施例20显示仅在酶解液中添加抑制剂时，抑制效果不理想，部分基因仍被上调。对比实施例21是先将组织碎块置于含有转录抑制剂的HBSS中孵育30min后，按常规程序解离(即不含有抑制剂的酶解液和W5缓冲液)，抑制效果同样不理想。综上，转录抑制剂需添加至酶解液、W5及WI缓冲液中，才能达到相应的抑制效果。
在一系列对比实施例的基础上，本发明最终确定的转录抑制剂成分和浓度是：茴香霉素15～20μg/mL、雷公藤内酯5～7.5μM、BMH-215～7μM，且抑制剂应在酶解操作所有缓冲液中添加，包括酶解液、W5缓冲液和WI缓冲液，结果如本发明实施例1～3所示。本发明实施例1表明三种转录抑制剂的最低浓度范围为：茴香霉素15μg/mL、雷公藤内酯5μM、BMH-215μM，在此条件下解离，能达到10x Genomics单细胞测序实验各项质量指标的要求，可以顺利完成拟南芥叶片组织的单细胞测序实验，且在此浓度下利用荧光定量PCR技术分析应激基因在添加转录抑制剂后解离出的原生质体中的表达情况，结果显示转录抑制效果良好：与“同样的叶片组织不进行酶解的样本”相比，各个应激基因均未被上调。本发明实施例2说明，在茴香霉素20μg/mL、雷公藤内酯7.5μM、BMH-217μM的条件下，各应激基因的表达被抑制，同时细胞活率、碎片比率等指标满足10x单细胞测序的要求。本发明实施例3进一步在实施例1的基础上对解离的原生质体样品进行单细胞测序，经生信分析显示添加抑制剂的对照组S1(不添加抑制剂进行酶解制备的原生质体)较实验组S2(添加抑制剂进行酶解制备原生质体)的细胞聚类数与应激基因表达均有升高(图4～图6)。由于tSNE是根据每个细胞中的基因表达情况进行分类，即若两个细胞中的每个表达基因的类型及表达趋势均相同，则这两个细胞被归为是同一类细胞。对照组S1细胞类群较实验组S2多，是由于未添加抑制剂的S1样本中，因受到各种应激，众多基因的表达量被改变，造成“解离偏好”，从而导致细胞类群更多，造成假阳性。而S2样本则因为转录被抑制而未出现这样的情况，说明在解离原生质体的过程中添加转录抑制剂，可以抑制由外界刺激导致的原生质体的转录组变化。由于添加抑制剂后可能会对植物原生质体造成伤害，为保证原生质体状态完好且减少损失量，本发明在分离植物原生质体的常规步骤基础上做了调整，尽量减少后续洗涤次数，即用W5缓冲液进行洗涤一次后，直接用WI缓冲液25℃，200×g，离心6min进行二次洗涤，既能保证无W5缓冲液残留，又减少原生质体损失。
综上所述，本发明所述的转录抑制剂添加配方能够高效地从拟南芥叶片组织中解离得到原生质体悬液，得到的原生质体悬液能够达到10x Genomics公司单细胞测序各项指标，且能有效抑制解离过程中由外界刺激导致的原生质体的转录组变化。
此外，本发明用于拟南芥叶片组织单细胞测序的方法中用到的转录抑制剂成分之间是一一对应的关系，即存在配伍关系，如本发明实施例1～3提到的转录抑制剂的三种成分需同时按要求浓度使用，才能有效的保证植物原生质体解离不受影响能够达到单细胞测序的相关要求，且能有效发挥转录抑制作用。此外，本发明还证实抑制剂的添加方式也存在配伍关系，必须按照本发明所述的添加方式，才能够达到相应的技术效果。
本发明所述的植物原生质体转录抑制剂添加配方，能够高效地从拟南芥组织中解离得到原生质体悬液，且得到的原生质体悬液能够达到10x Genomics公司单细胞测序各项指标。本发明所述的植物原生质体转录抑制剂添加配方可有效用于拟南芥组织解离，操作简单，重复性高并具有长期稳定性。
表1不同转录抑制剂配方转录抑制效果的比较
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (7)
1.一种用于拟南芥叶片组织原生质体单细胞转录组测序的转录抑制剂，其特征在于，所述转录抑制剂由茴香霉素、雷公藤内酯和BMH-21组成；其中，所述转录抑制剂的组成及配方为：15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。
2.一种含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液，其特征在于，所述含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液的组成及配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1%BSA、0.01M CaCl2、2% 纤维素酶R10、0.4% 离析酶R10、0.5M 甘露醇、1% 果胶酶、15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。
3.一种含转录抑制剂的适用于单细胞转录组测序的拟南芥叶片组织原生质体解离试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由含转录抑制剂的W5缓冲液、含转录抑制剂的WI缓冲液和如权利要求2所述的含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液组成；
所述含转录抑制剂的W5缓冲液的配方为：0.15M NaCl、0.12M KCl、5mM CaCl2、2mM MES、15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM 雷公藤内酯、5~7μM BMH-21；
所述含转录抑制剂的WI缓冲液的配方为：4mM MES、20mM KCl、0.5M甘露醇、15~20μg/mL茴香霉素、5~7.5μM 雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述含转录抑制剂的酶解液的配方为：0.02M MES、0.02M KCl、0.1% BSA、0.01M CaCl2、2% 纤维素酶R10、0.4% 离析酶R10、0.5M甘露醇、1% 果胶酶、15~20μg/mL 茴香霉素、5~7.5μM雷公藤内酯、5~7μM BMH-21。
5.一种利用如权利要求3或4所述的含转录抑制剂的试剂盒酶解拟南芥叶片组织原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤（1）、准备试剂：配制含转录抑制剂的酶解液、含转录抑制剂的W5缓冲液、含转录抑制剂的WI缓冲液；
步骤（2）、制备解离样品：选取拟南芥幼苗茎生叶，剪下洗净、切成碎块；
步骤（3）、组织酶解：向所述步骤（2）中获得的碎片中加入所述的含转录抑制剂的酶解液，静置、混匀、消化酶解；
步骤（4）、消化液浑浊后在显微镜下镜检，估算原生质体得率；
步骤（5）、消化液过筛：先用含转录抑制剂的W5缓冲液润洗组装于离心管上的筛网；然后向所述步骤（4）的消化液中加入所述含转录抑制剂的W5缓冲液，吸取上清过筛；
步骤（6）、原生质体富集：将所述步骤（5）过筛后的滤液离心，富集原生质体；
步骤（7）、原生质体洗涤：向所述步骤（6）富集的原生质体中加入含转录抑制剂的WI缓冲液悬起混匀并离心洗涤，再将洗涤后的原生质体沉淀用适合上机的含转录抑制剂的WI缓冲液悬起，镜检计数。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述拟南芥幼苗茎生叶为20-25天的茎生叶；所述切成的碎块的大小为0.5mm；
和/或，步骤（3）中，所述加入的含转录抑制剂的酶解液的量为5mL；所述静置的温度为37℃；所述静置的时间为15min；所述酶解的温度为37℃；所述酶解的转速为200rpm；所述酶解的时间为30min；
和/或，步骤（5）中，所述润洗筛网的含转录抑制剂的W5缓冲液的量为1mL；
和/或，步骤（6）中，所述离心的温度为25℃；所述离心的转速为100×g；所述离心的时间为7min；
和/或，步骤（7）中，所述离心的温度为25℃；所述离心的转速为200×g；所述离心的时间为6min。
7.如权利要求1所述的转录抑制剂、或如权利要求2所述的含转录抑制剂的拟南芥叶片组织原生质体酶解液、或如权利要求3所述的含转录抑制剂的适用于单细胞转录组测序的拟南芥叶片组织原生质体解离试剂盒在酶解拟南芥叶片组织原生质体单细胞转录组测序中的应用。
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