CN112458036A - 一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法，一种茄子原生质体制备方法，所述方法至少包括以下步骤：1)将去除下表皮的茄子叶片置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；将步骤1)中的所述酶解混合液进行酶解终止，再进行过滤和纯化，获得茄子原生质体。一种茄子原生质体瞬时转化方法，所述转化方法至少包括：将茄子原生质体制备的混悬液与质粒液混合，再加入PEG‑Ca²⁺溶液进行混合后静置转化，终止转化，经离心获得转化后的原生质体。本发明提供的方法能够通过快速的酶解反应获得大量的原生质体，提高了茄子原生质体的产量。

Description

一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)种质资源丰富，类型多样，在世界各地均有种植。茄子中含有丰富的维生素、矿物质、蛋白质、糖类和重要的植物营养素，如酚类化合物和氟类化合物，具有良好的抗氧化活性。随着生活水平的不断提高，人们对茄子的品质提出了新的要求，选育茄子新品种尤为重要。目前，茄子已经完成基因组测序，这对科研人员及育种工作者有着重要的参考价值和实践意义，使基因组研究从结构基因组学逐渐转向了基因功能分析。

瞬时表达技术指的是在短时间内将目标基因转入到受体细胞，在受体细胞内建立起高效的表达系统，获得该目标基因短暂而高水平表达的技术。相较于稳定基因表达技术，瞬时表达技术在转化过程中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，并未与受体基因组染色体相整合，为基因－蛋白质研究提供了一种快速、方便的方法，并且对稳定遗传进行基因功能鉴定给予了重要的参考意义。

原生质体是一种良好的瞬时表达媒介，具有高效、快速、稳定的特点，为细胞水平基因功能的验证提供了便利。茄子原生质体的提取早在1981年就已完成，并采用原生质体培养技术成功得到再生植株。其后又出现了大量关于茄子种属间体细胞杂交的报道，原生质体融合技术逐渐成熟。然而，目前茄子原生质体的应用仍停留在细胞水平，且获取的原生质体产量较低。近年来，大量植物建立了原生质体瞬时表达系统，而基于茄子原生质体的瞬时表达技术还很少见，时至今日也没有正式的报道。

因此，本领域的技术人员致力于探索并建立一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法，建立适用于茄子的原生质体分离及转化体系，为茄子基因功能的研究提供良好的技术平台。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种茄子原生质体的制备方法，包括以下步骤：

1)将去除下表皮的茄子叶片置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；

2)将步骤1)中的所述酶解混合液进行酶解终止，再进行过滤和纯化，获得茄子原生质体。

本发明第二方面提供一种应用于第一方面的酶解液，所述酶解液包括以下重量份百分比或浓度的组分：1.25％(w/v)纤维素酶R-10，0.4％(w/v)离析酶R-10，0.5mol/L甘露醇，10mmol/L氯化钙，20mmol/L 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，20mmol/L氯化钾，1.5mmol氯化镁，1.5mmo/L磷酸二氢钾。

本发明第三方面提供一种茄子原生质体，所述原生质体由第一方面所述的茄子原生质体制备方法制得。

本发明第四方面提供一种茄子原生质体瞬时转化方法，所述转化方法包括以下步骤：将第三方面所述的茄子原生质体制备的混悬液和质粒液混合，再加入PEG-Ca²⁺溶液进行混合后静置转化，终止转化，经离心获得转化原生质体。

根据本发明第五方面提供一种转化茄子原生质体，所述转化茄子原生质体由第四方面所述的茄子原生质体瞬时转化方法制得。

本发明第六方面提供一种转化茄子原生质体用于外源基因表达中的用途。

如上所述，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的方法能够通过快速的酶解反应获得大量的原生质体，提高了茄子原生质体的产量；

(2)本发明提供的方法能够快速、高效、准确地转化茄子原生质体，有助于鉴定茄子基因功能，更为茄子其他部位和同科属的其它植物原生质体的制备和转化条件的探索提供了可靠的依据。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的明场通道50μm标尺下的分离得到的茄子原生质体示意图；

图2是本发明的一个较佳实施例的荧光通道50μm标尺下的茄子原生质体活力检测示意图；

图3是本发明的一个较佳实施例的荧光通道75μm标尺下YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图；

图4是本发明的一个较佳实施例的明场通道75μm标尺下YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图；

图5是本发明的一个较佳实施例的混合场通道75μm标尺下YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图；

图6是本发明的一个较佳实施例的荧光通道25μm标尺下SmERF-118L-YFP蛋白在茄子原生质体中的亚细胞定位示意图；

图7是本发明的一个较佳实施例的明场通道25μm标尺下SmERF-118L-YFP蛋白在茄子原生质体中的亚细胞定位示意图；

图8是本发明的一个较佳实施例的混合场通道25μm标尺下SmERF-118L-YFP蛋白在茄子原生质体中的亚细胞定位示意图；

图9是本发明的一个较佳实施例的荧光通道10μm标尺下SmMYB1-YFP蛋白在茄子原生质体中的亚细胞定位示意图；

图10是本发明的一个较佳实施例的明场通道10μm标尺下SmMYB1-YFP蛋白在茄子原生质体中的亚细胞定位示意图；

图11是本发明的一个较佳实施例的混合场通道10μm标尺下SmMYB1-YFP蛋白在茄子原生质体中的亚细胞定位示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

根据本发明第一方面提供一种茄子原生质体制备方法，所述方法至少包括以下步骤：

1)将去除下表皮的茄子叶片置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；

2)将步骤1)中的所述酶解混合液进行酶解终止，再进行过滤和纯化，获得茄子原生质体。

在步骤1)中，使用胶带去除茄子叶片的下表皮，再放入提前预制的酶解液中进行酶解一定时间，获得酶解混合液。

在步骤2)中，向步骤1)中获得的酶解混合液加入酶终止液进行终止酶解，再使用尼龙膜过滤，获得过滤液，使用离心机和W5溶液进行纯化，具体为使用离心机对过滤液进行离心，去除上清获得茄子原生质体沉淀，使用W5溶液多次清洗原生质体沉淀获得茄子原生质体。

在一实施例中，所述茄子叶片为茄子幼苗的子叶和/或真叶。

优先地，所述茄子幼苗由茄子种子在MS固体培养基中播种，恒温条件24-25℃，光照3000lx条件下生长获得。

在本实施例中，MS固体培养基用于茄子发芽培养的培养基，适宜茄子种子发芽和幼苗生长；恒温条件下培养，茄子不易受到胁迫，叶片充分展开，生长健壮；3000lx光照是最适宜茄子幼苗生长的强度，光照过强不利于幼苗生长。

在一实施例中，采用酶解液将步骤1)中所述茄子叶片在温度为26℃的黑暗环境下进行酶解2-3h。

实验人员根据需求选择酶解时间，所述酶解时间可以为2-2.5h或2.5-3h。

在一实施例中，在步骤1)中，所述茄子叶片与所述酶解液中的配比为60mg所述茄子叶片：1mL所述述酶解液。

在一实施例中，所述酶解终止的方法为向所述酶解混合液加入与所述酶解混合液体积相同的W5溶液。

在一实施例中，步骤2)中，采用70μm尼龙膜进行过滤。

在一实施例中，步骤2)中，采用离心和多次清洗进行纯化。

在一实施例中，所述离心的转速为500-700rpm，所述离心时间为5min。

在本实施例中，实验人员可选择所述离心的条件，例如所述离心的转速为500-600rpm或600-700rpm。

在一实施例中，所述清洗包括向经过滤和离心后的所述酶解混合液中加入W5溶液并离心去上清，并执行多次。

在本实施例中，经过滤和离心后的所述酶解混合液中加入W5溶液，并混合均匀，再通过离心机进行离心，去除上清液，获得沉淀，完成第一次清洗，再向沉淀中加入W5溶液，并混合均匀，通过离心机进行离心，去除上清液，完成第二次清洗。经过滤和离心后的所述酶解混合液需要清洗2到4次，优选的是清洗3次，获得茄子原生质体。

根据本发明第二方面提供一种应用于第一方面的酶解液，所述酶解液包括以下重量份百分比或浓度的组分：1.25％(w/v)纤维素酶R-10，0.4％(w/v)离析酶R-10，0.5mol/L甘露醇，10mmol/L氯化钙，20mmol/L 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，20mmol/L氯化钾，1.5mmol氯化镁，1.5mmo/L磷酸二氢钾。

本发明制备的酶解液适用于制备茄子原生质体，且酶解速度快，不会破坏茄子原生质体。

优选地，所述2-(N-吗啉基)乙磺酸的pH为5.7。pH为5.7的2-(N-吗啉基)乙磺酸适应于本发明中的所述酶解液。

优先地，所述酶解液的pH为5.5-5.6。当pH＜5.5时，会破坏植物细胞，无法获得相应的植物原生质体。当pH>5.6时，会影响纤维素酶R-10和离析酶R-10的活性。

在一实施例中，所述酶解液经过50℃水浴10min预处理。有利于激发酶活性，使酶活性达到最大。

根据本发明第三方面提供一种茄子原生质体，所述原生质体由第一方面所述的茄子原生质体制备方法制得。

根据本发明第四方面提供一种茄子原生质体瞬时转化方法，所述转化方法包括：将第三方面所述的茄子原生质体制备的混悬液和质粒液混合，再加入PEG-Ca²⁺溶液进行混合后静置转化，终止转化，经离心获得转化原生质体。

在一实施例中，所述混悬液的溶剂为MMG溶液。

在一实施例中，所述茄子原生质体在MMG溶液中的细胞浓度约为10⁶个/mL。

在一实施例中，所述混悬液与质粒液体积比是10:1-2。

在本实施例中，混悬液由第三方面所述的茄子原生质与MMG溶液混合获得，部分混悬液用于备存，待下次使用，另一部分混悬液用于转化，用于转化的混悬液才会与质粒液混合。

在一实施例中，所述质粒液中含有的质粒浓度为0.5-0.9μg/μL。

在本实施例中，实验人员根据所述混悬液的体积选择所述质粒液中含有的质粒浓度，例如可以是0.5-0.6μg/μL、0.6-0.7μg/μL、0.7-0.8μg/μL或0.8-0.9μg/μL。

在一实施例中，所述转化时间为5-10min。

在一实施例中，所述混悬液与所述质粒液的体积之和与所述PEG-Ca²⁺溶液的体积相等。

优选地，所述PEG-Ca²⁺溶液中的PEG种类为PEG4000。

在本实施中，所述PEG为常规的市场可购买的PEG，可从德国Sigma公司(CAS：25322-68-3)购买。

在一实施例中，所述终止转化方法为静置转化后再加入0.5-1.5mL的W5溶液。

优选地，所述终止转化方法为静置转化后再加入1mL的W5溶液。

在本实施例中，所述茄子原生质体制备的混悬液和质粒液混合，再加入PEG-Ca²⁺溶液进行混合后静置5至10min，完成转化，再加入1mL的W5溶液，混合均匀，完成终止转化。

优先地，所述质粒液中的质粒选自13508bp PHB-YFP、SmERF-118L和SmMYB1-YFP中的一个或多个组合。

在本实施例中，所述13508bp PHB-YFP为实验室长期保存的质粒，具体相关信息可参考文献：10.1111/pce.13074。

所述质粒SmERF-118L-YFP中SmERF-118L的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：ATGCCTAAGCCTGTGTCATCAAAATTTGAGAAACTAGGTAGAAACATGAAGAACAAAGTTGATACAAACAGACCAGTGAGGAAAATTAGGATTGTTTGTTATGATCCTGATGCTACTGATGATTCCTCGGACGATGAGGGGATCGATGATTCGAGGTGTAAGCGTTTCGTTAGAGAGATTAAGTTGCAAATTGGCAACTCTTTTGATCCTCCCAAAGGCTCTGAAACTGAATGTTCATTTCAAGATAGTAACAATGGAGAGAAAAAAACTGAGGAGGAGGGTTTAGTATTGAAATACAAAGGTGTTCGTCAACGAAAATGGGGGAAATGGGATGCTGAAATTCGTGATCCGTTTAAAGGTAGACGGGTCTGGTTGGGTACTTATAAAACTGCTGTAGAGGCTTCTCGAGCTTACGAAATGAAACGCCTTGAATTTGAAAGTATGGCGAAGAATAGTAGCACAAATGTGTCGGAGGAGAGTTCTGGTTCGATGGTCTCTGAGCACCAACATCAAAGCCAAAATGTAGCTAGTGGTGTCTCAGAGGACTCTGTAGAAAGCTCTTATTTGCGTACTTCACACTCGTCATCTTCAGCAGCTCTTGAATTAGACACTTTAACTTCTGTATCTATCTCTGCTCCAAGTTTAGGACTCAATGGCCTAAACGGTAATGAAAAGATGAGTAATGTTGCTTTCGAGGCTAATGCTGTCAA。

所述质粒SmMYB1-YFP中SmMYB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为基因序列：

ATGAATAATCCTCCTATAATCTGTACGTCTGTGCGAGTGAGGAAAGGTTCATGGACTGAAGAAGAAGATTTACTCTTGAGGAAATGTATGGAAAAATATGGTGAAGGCAAGTGGCATCTTGTTCCTGCTAGAGCAGGTAAACTAATTTTCGATCTCATGTTATGTGATATTTATAATAAAAAAATAATATATATTTTTTTGAAAATTCACATGAAAATGTGCAGGTCTGAATAGATGCAGAAAAAGTTGTAGGCTGAGGTGGTTGAATTATTTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGCTTCGGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGCAACAGGTGCACAAAACAACAAAAACAATTTTTAGTCTCAATAAACATGCATATTAAGAAAAAGTGTTAATTAAAGCTTTTACTGGCATTTGATCCAATATTGTTATAAGTTTTATTGATATTTATAAAACGTGTTAAAATGCATTAATTATCACTAAGCTAGTAATTGTCTCCACAATAATATATTTAGCGAAATTAAGTTGCTATCGTTAATTAATTACATTTAAAGATCATTTTTGGTGCAATGATGACGCTCACAATTCATTCAAAAGTTTATGGTCGATATTAGTGATAACACTTAATATGACATGATGCCATGCATGCTGAATATATAAATGTGTGATTATTTCAACTAAAAGTTATATTATTTTGTGTAGATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCGGGAAGGACCG305CAAACGATGTAAAGAACTACTGG327AACACTAACCTTCTAAGGAAGTTCACTATTGCTCCTCAAAAGATTAATAATACATGCAAAGACATCATTAGTACGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAAATACTTGTCAAGCATAAAGAAGAATAATTTGACAAACAATAATGTAATTGTAGACAAGGAAGAACGCTGCAAAGAAATAACAAGTGACAA522GCAAACTACCGATGCATCGATGG544ATAACGGAGATCAATGGTGGAAAAGTTTACTGGAAAATTTCAATGACGACGCTGTTGAAGGAGAAGAAGAAGCTGTAACTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTATTACATGAGGAAATATCATCACCACCATTAAATGGTGGAGGCAACTCCATGCAACAAGAACAATGTGATAATTGGGATGATTTTTCTGCTGATATTGATTTATGGAATCTACTTGATTAA。

根据本发明第五方面提供一种转化茄子原生质体，所述转化茄子原生质体由第四方面所述的茄子原生质体转化方法制得。

本发明中的转化茄子原生质体通过PEG-Ca²⁺介导的转化引入外源基因，且外源基因可稳定表达。

本发明第六方面提供一种转化茄子原生质体用于外源基因表达中的用途。

转化茄子原生质中的外源基因主要定位于茄子原生质的细胞核中，可检测到外源基因对应的蛋白，转化茄子原生质体可用于外源基因的表达。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

以下实施例中使用的试剂及其组成如下：

W5溶液：154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，2mM MES(pH5.7)，2mM葡萄糖，氢氧化钾调节pH至5.65-5.70。

MMG溶液：0.45M甘露醇，15mM氯化镁，4mM MES(pH 5.7)，氢氧化钾调节pH至5.70。

PEG-Ca²⁺溶液：40％(w/v)PEG4000，0.2M甘露醇，0.1M氯化钙。

WI溶液：0.5M甘露醇，20mM氯化钾，4mM MES(pH 5.7)，氢氧化钾调节pH至5.70。

FDA用丙酮制备成0.5％的贮备液，4℃保存。

质粒提取用TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒，操作稍有改动，具体操作如下：

1)向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

2)取100mL过夜培养的菌液倒入50mL离心管，室温8000rpm离心2min去上清收集菌液；

3)向留有菌体沉淀的离心管中加入8mL溶液P1(检查是否已加入RNase A)，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；

4)向离心管中加入8mL溶液P2，立即温和上下翻转10-15次，使菌体充分裂解，室温放置5min；

5)向离心管中加入8mL溶液P4，立即温和上下翻转20次左右，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀，然后室温放置10min左右；

6)9000rpm离心10min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，缓慢推动柄过滤，滤液收集在干净的50mL管中；

7)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)；

8)室温8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中；

9)向吸附柱中CP6中加入10mL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

10)重复操作步骤9)；

11)向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液；

12)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；

13)将吸附柱CP6开盖，置于室温放置1小时左右，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

14)将吸附柱CP6置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜中间部位悬空滴加1mL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温9000rpm离心5min；

15)将收集管中收集到的溶液重新加入到吸附柱中，重复操作步骤13；

16)将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃保存。

实施例1

本实施例涉及一种茄子原生质体的分离方法，包括以下步骤：

原生质体的制备：

(1)首先配置酶解液。先将0.5mol/L甘露醇，10mmol/L氯化钙，20mmol/L MES(pH5.7)，20mmol/L氯化钾，1.5mmol氯化镁，1.5mmo/L磷酸二氢钾混合，用1mol/L KOH调节酶解液的pH至5.5-5.6。再加入1.25％纤维素酶R-10，0.4％(w/v)离析酶R-10，置于50℃水浴锅中10min(激发酶活性并增加酶液的溶解性)，降至室温后用0.225μm的过滤器过滤至EP管中。

(2)选取2-3周生长状态良好的茄子幼苗，此时每株小苗有2-4片叶子，用胶带撕去叶子的下表皮放入10mL EP管(管中有酶液5mL)中，大约放入0.3g叶子。黑暗下酶解2-3小时，每半小时轻摇EP管8-10次。

(3)向酶解液中加入与酶解液等体积的W5溶液终止酶解，然后将上述液体经70μm的尼龙膜过滤至50mL离心管中，600rpm左右离心5min，弃上清。

(4)向步骤(3)中的沉淀加入10mL的W5清洗原生质体，600rpm离心5min，弃上清，如果杂质过多，再用10mL的W5重复清洗一次，得到纯净的茄子原生质体。

(5)将(4)收集到的原生质体吸入2mL离心管中，加入1mL MMG溶液重悬。

原生质体的计数：

将步骤(5)中的原生质体轻轻摇匀，用移液枪吸取50μL滴于血球计数板上，盖上盖玻片，待原生质体充满计数室，在显微镜下观察并计数，重复计数三次，原生质体密度可达到4.6×10⁶个细胞/mL，每克茄子叶片原生质体产量(个/g FW)为1.1×10⁷个/g FW。显微镜观察下，50μm标尺下原生质体示意图如图1所示。

原生质体活力的检测：

取步骤(4)中0.5mL纯化好的原生质体，加入10uL FDA使FDA终浓度为0.01％。混匀后置于室温下2min，在荧光显微镜下观察原生质体，黄绿色的为有活力的细胞，有活性的细胞占总细胞的90％以上。

荧光通道50μm标尺下的原生质体活力检测示意图如图2所示。

实施例2

本实施例涉及一种以PEG-Ca²⁺介导的茄子原生质体瞬时转化的方法，包括以下步骤：

(1)表达载体质粒准备：所用载体为13508bp PHB-YFP，为本实验室长期保存的载体，质粒提取用TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒；

(2)原生质体的分离：与实施例1中原生质体分离的方法相同；

(3)取步骤(2)中的原生质体，用MMG溶液调节细胞浓度在10⁶个/mL左右；

(4)取干净的2mL离心管，加入100μL原生质体混悬液。将10-20μL质粒DNA(约10μg)加入到原生质体中，轻弹管底混匀；

(5)再加入110μL的PEG-Ca²⁺溶液，轻弹管底混匀，室温下放置5-10min；

(6)加1mL的W5溶液终止转化，轻弹管底混匀；

(7)700rpm离心3min，弃上清，再加入1mL的W5溶液重悬原生质体，600rpm离心3min，小心吸去上清液，彻底洗去PEG；

(8)将收集到的细胞(0.2mL左右)转入干净的离心管中，加入1mL WI溶液培养；

(9)25℃下，弱光培养16-24小时后，800rpm离心收集细胞，用于检测。

(10)荧光蛋白的检测：用激光共聚焦显微镜进行观察，YFP蛋白成功在茄子原生质体中表达，转化率在40％以上。

荧光通道75μm标尺下YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图3所示，明场通道75μm标尺下YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图4所示，混合场通道75μm标尺下YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图5所示。

实施例3

本实施例涉及一种以PEG-Ca²⁺介导的茄子原生质体瞬时转化的方法，用于SmERF-118L基因的亚细胞定位，包括以下步骤：

(1)表达载体质粒准备：所用载体为SmERF-118L-YFP，YFP载体同实施例2，SmERF-118L是茄子中合成乙烯的相关基因，质粒提取用TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒；

(2)原生质体的分离：与实施例1中原生质体分离的方法相同；

(3)取步骤(2)中的原生质体，用MMG溶液调节细胞浓度在10⁶个/mL左右；

(4)取干净的2mL离心管，加入100μL原生质体混悬液。将10-20μL的SmERF-118L-YFP质粒DNA(约10μg)加入到原生质体中，轻弹管底混匀；

(5)再加入110μL的PEG-Ca²⁺溶液，轻弹管底混匀，室温下放置5-10min；

(6)加1mL的W5溶液终止转化，轻弹管底混匀；

(7)700rpm离心3min，弃上清，再加入1mL的W5溶液重悬原生质体，600rpm离心3min，小心吸去上清液，彻底洗去PEG；

(8)将收集到的细胞(0.2mL左右)转入干净的离心管中，加入1mL WI溶液培养；

(9)25℃下，弱光培养16-24小时后，800rpm离心收集细胞，用于检测。

(10)荧光蛋白的检测：用激光共聚焦显微镜进行观察，SmERF-118L-YFP蛋白成功在茄子原生质体中表达，SmERF-118L基因主要定位于细胞核。

荧光通道25μm标尺下SmERF-118L-YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图6所示，明场通道25μm标尺下SmERF-118L-YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图7所示，混合场通道25μm标尺下SmERF-118L-YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图8所示。

实施例4

本实施例涉及一种以PEG-Ca²⁺介导的茄子原生质体瞬时转化的方法，用于SmMYB1基因的亚细胞定位，包括以下步骤：

(1)表达载体质粒准备：所用载体为SmMYB1-YFP，YFP载体同实施例2，SmMYB1是调控茄子花青素合成的相关基因，质粒提取用TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒；

(2)原生质体的分离：与实施例1中原生质体分离的方法相同；

(3)取步骤(2)中的原生质体，用MMG溶液调节细胞浓度在10⁶个/mL左右；

(4)取干净的2mL离心管，加入100μL原生质体混悬液。将10-20μL的SmMYB1-YFP质粒DNA(15μg)加入到原生质体中，轻弹管底混匀；

(5)再加入110μL的PEG-Ca²⁺溶液，轻弹管底混匀，室温下放置5-10min；

(6)加1mL的W5溶液终止转化，轻弹管底混匀；

(7)700rpm离心3min，弃上清，再加入1mL的W5溶液重悬原生质体，600rpm离心3min，小心吸去上清液，彻底洗去PEG；

(8)将收集到的细胞(0.2mL左右)转入干净的离心管中，加入1mL WI溶液培养；

(9)25℃下，弱光培养16-24小时后，800rpm离心收集细胞，用于检测。

(10)荧光蛋白的检测：用激光共聚焦显微镜进行观察，SmMYB1-YFP蛋白成功在茄子原生质体中表达，且SmMYB1-YFP基因定位于细胞核。

荧光通道10μm标尺下SmMYB1-YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图9所示，明场通道10μm标尺下SmMYB1-YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图10所示，混合场通道10μm标尺下SmMYB1-YFP在茄子原生质体中的瞬时表达示意图如图11所示。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcctaagc ctgtgtcatc aaaatttgag aaactaggta gaaacatgaa gaacaaagtt 60

gatacaaaca gaccagtgag gaaaattagg attgtttgtt atgatcctga tgctactgat 120

gattcctcgg acgatgaggg gatcgatgat tcgaggtgta agcgtttcgt tagagagatt 180

aagttgcaaa ttggcaactc ttttgatcct cccaaaggct ctgaaactga atgttcattt 240

caagatagta acaatggaga gaaaaaaact gaggaggagg gtttagtatt gaaatacaaa 300

ggtgttcgtc aacgaaaatg ggggaaatgg gatgctgaaa ttcgtgatcc gtttaaaggt 360

agacgggtct ggttgggtac ttataaaact gctgtagagg cttctcgagc ttacgaaatg 420

aaacgccttg aatttgaaag tatggcgaag aatagtagca caaatgtgtc ggaggagagt 480

tctggttcga tggtctctga gcaccaacat caaagccaaa atgtagctag tggtgtctca 540

gaggactctg tagaaagctc ttatttgcgt acttcacact cgtcatcttc agcagctctt 600

gaattagaca ctttaacttc tgtatctatc tctgctccaa gtttaggact caatggccta 660

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<210> 2

<211> 710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcctaagc ctgtgtcatc aaaatttgag aaactaggta gaaacatgaa gaacaaagtt 60

gatacaaaca gaccagtgag gaaaattagg attgtttgtt atgatcctga tgctactgat 120

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gaattagaca ctttaacttc tgtatctatc tctgctccaa gtttaggact caatggccta 660

aacggtaatg aaaagatgag taatgttgct ttcgaggcta atgctgtcaa 710

Claims (10)

1.一种茄子原生质体制备方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

1)将去除下表皮的茄子叶片置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；

2)将步骤1)中的所述酶解混合液进行酶解终止，再进行过滤和纯化，获得茄子原生质体。

2.根据权利要求1所述的一种茄子原生质体制备方法，其特征在于：采用酶解液将步骤1)中所述茄子叶片在温度为26℃的黑暗环境下进行酶解2-3h。

3.根据权利要求1所述的一种茄子原生质体制备方法，其特征在于：包括以下特征中的一项或多项：

所述茄子叶片为茄子幼苗的子叶和/或真叶；

在步骤1)中，所述茄子叶片与所述酶解液中的配比为60mg所述茄子叶片：1mL所述述酶解液。

4.一种应用于权要求要求1至3项所述方法的酶解液，其特征在于：所述酶解液包括以下重量份百分比或浓度的组分：1.25％(w/v)纤维素酶R-10，0.4％(w/v)离析酶R-10，0.5mol/L甘露醇，10mmol/L氯化钙，20mmol/L 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，20mmol/L氯化钾，1.5mmol氯化镁，1.5mmo/L磷酸二氢钾。

5.根据权利要求4所述的酶解液，其特征在于：所述酶解液的pH为5.5-5.6。

6.一种茄子原生质体，所述茄子原生质体由权要求要求1至5项所述的方法制得。

7.一种茄子原生质体瞬时转化方法，其特征在于，所述转化方法至少包括：将权利要求6所述的茄子原生质体制备的混悬液与质粒液混合，再加入PEG-Ca²⁺溶液进行混合后静置转化，终止转化，经离心获得转化后的原生质体。

8.根据权利要求7所述的茄子原生质体瞬时转化方法，其特征在于，包括以下特征中的一项或多项：

所述混悬液的溶剂为MMG溶液；

所述混悬液与质粒液体积比是10:1-2；

所述混悬液与所述质粒液的体积之和与所述PEG-Ca²⁺溶液的体积相等；

所述质粒液中的质粒选自13508bp PHB-YFP、SmERF-118L和SmMYB1-YFP中的一个或多个组合。

9.一种转化茄子原生质体，其特征在于：所述转化茄子原生质体由权利要求7或8所述的茄子原生质体瞬时转化方法制得。

10.一种权利要求9所述的转化茄子原生质体用于外源基因表达中的用途。

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