CN114164115B - 一种新的淡水产油微藻物种及其培养方法和应用 - Google Patents

一种新的淡水产油微藻物种及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的淡水产油微藻物种及其培养方法和应用,该微藻藻株为Didymogenes chengda CDU‑W13,保藏时间为2021年12月3日,保藏编号是CCTCC NO:M20211536。本发明的微藻可以有效的去除废水中的氮、磷等物质,可用于处理废水,可在废水中培养,培养成本低;本发明的微藻藻株具有较高的生物质产量(36mg·L‑1day‑1)和油脂含量(46.3%dw),因而具有较高的油脂产率(16.67mg·L‑1day‑1);本发明的微藻藻株可用于生产生物柴油,还可进行大规模培养,应用于废水处理和其他有价值化合物的生产,例如生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸等。

Description

一种新的淡水产油微藻物种及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于微藻技术领域,具体涉及一种新的淡水产油微藻物种及其培养 方法和应用。
背景技术
由于能源危机和全球变暖,加之人类对环境保护问题的重视,世界被迫专 注于寻找可替代现有的化石燃料的新能源,而生物燃料作为其中一种可替代燃 料,被认为是最有前途的替代品之一。
在新能源中,微藻生物柴油被认为是最有希望的液态绿色能源之一。据研 究表明,与其他常规油脂原料相比,微藻生物质具有较高的油脂含量,因此可 通过精炼转化工艺生产先进的生物燃料。并且微藻类的生长周期短,还可以用 于废水处理和空气净化等方面。
产油微藻是最具潜力的生物能源油脂资源之一。有关微藻生物能源的技术 研究,近年来受到国内外的持续重视。微藻能源的生产是一个涉及到藻种筛选、 规模培养技术与装备、能量转化加工的全产业链复杂过程,其中微藻生物量的 规模培养是整个产业过程的核心。微藻作为生物柴油资源,具有含油量高的优 势,某些单细胞微藻可积累高达其细胞干重86%的油脂,这是其他任何油料作 物都无法比拟的。而且微藻能源的生产具有环境减排效应,可用于处理废水、 净化空气,并且具有占地面积小,不与淡水竞争等优点。然而往往具有高油脂 含量的微藻藻株通常生长速率缓慢,这导致了其单位体积油脂生产率的降低。
利用微藻来生产生物能源具有巨大的潜力和生态环境效益,但离产业化还 有很远的距离,其核心在于效率和成本。现有的培养技术中,微藻的产率不高, 远未发挥出微藻的高产潜能,导致大规模培养占地面积过大,投资成本高昂。 而为维护这一培养系统所消耗的人工和物资严重损害了微藻能源生产的经济 性。于是寻找使用废水作为生长培养基,探索具有高生长速率和高油脂含量的 微藻藻株,是实现微藻资源化利用和经济化效益的关键所在。
发明内容
针对上述现有技术,本发明提供一种新的淡水产油微藻物种及其培养方法 和应用,以提供一种具有高生长速率和高油脂含量的微藻。
为了达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:提供新的淡水产油微藻 物种,微藻命名为Didymogenes chengda CDU-W13,保藏时间为2021年12月3 日,保藏编号是CCTCC NO:M20211536。
本发明还提供了上述淡水产油微藻的培养方法,培养方法包括初始培养和 扩大培养,初始培养和扩大培养在连续光照或光暗交替条件下进行;连续光照 培养时,初始培养的光照强度为60~500μmol photons m-2s-1,温度为20℃~30℃, 扩大培养的光照强度为60~1000μmol photons m-2s-1,温度为20℃~30℃;光暗 交替培养时,光暗交替周期为12~16/12~8h,光照强度和温度与连续光照培养时 相同。
进一步,初始培养和扩大培养所用培养基为BBM培养基。
进一步,始培养时间为6~10天,所述扩大培养时间为7~14天。
进一步,初始培养和扩大培养的培养温度均为25℃。
本发明还提供了上述淡水产油微藻在生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂 肪酸或生物质中的应用。将淡水产油微藻于含粮食废水0%-20%的BBM培养基 中连续培养或批次培养2-3周,进而使微藻能够大量生产油脂、生物柴油、藻类 蛋白、脂肪酸或生物质。
本发明还提供了上述淡水产油微藻在处理含氮、磷废水中应用。
本发明的有益效果是:
1.处理废水:利用本发明的微藻可以有效的去除废水中的氮、磷等物质,可 用于处理废水,可在废水中培养,因而可有效降低培养成本。
2.应用潜力巨大:利用微藻生产生物柴油具有巨大的潜力,本发明的微藻藻 株具有较高的生物质产量(36mg·L-1day-1)和油脂含量(46.3%dw),因而具 有较高的油脂产率(16.67mg·L-1day-1)。
3.本发明的微藻藻株可用于生产生物柴油,还可进行大规模培养,应用于废 水处理和其他有价值化合物的生产,例如生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂 肪酸等。
序列表
<110> 成都大学
<120> 一种淡水产油微藻及其培养方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaaggatca ttgaatcgat cgaatccact ttggtaacca aacgtcaccc tcgtgtgggg 60
cgggctcgtc ccgcccccca gcgagcgccg gtcccctggc tggggtcttc aggccgcagt 120
tcaggtccgg cgggcgtctc tccacgcttc ttttcgggcg tggagttggc gtcggtaatt 180
tatcttaacc aactcaacac accccaaacc tcaactcact ctgaagcaat tgtggcagcc 240
ggctccgccg cctgtccact caaaccaaag acaactctca acaacggata tcttggctcc 300
cgtatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtagtgt gaattgcaga attccgtgaa 360
ccatcgaatc tttgaacgca aattgcgccc gaggcttcgg ccgagggcat gtctgcctca 420
gcgtcggttt acaccctcga ccccccctct cgcctttggc gagtgttggg ggctcggacc 480
tggccctccc ggctccgttc ctctccgagg cgcgcccggg ttggctgaag ctaagaggct 540
tgagcatgga ccccgtttgc agggcaatgg cttggtaggt aggcaccccc tacgcagcct 600
gccgttgccc gaggggactt tgctggaggc cccgcaggaa tctgggcggc tttcgggccg 660
cccggagctc aaaccttcga cctgagctca ggcaagagta cccgctgaac ttaagcatat 720
附图说明
图1为本发明系统进化分析结果(基于18S rRNA序列构建的最大似然树);
图2为本发明实施例1培养所得藻株;
图3为本发明实施例3培养所得藻株。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明的具体实施方法做详细的说明。
本发明提供的新分离的淡水产油微藻藻株Didymogenes chengda CDU-W13, 其中分离的微藻藻株基因组包括如SEQ ID NO 1所示的核酸序列。本发明所新 分离的藻株Didymogenes chengda CDU-W13于2021年12月3日保藏于中国典 型培养物保藏中心(保藏中心地址为:中国武汉武汉大学),保藏号CCTCC NO: M20211536。
藻株的采集、分离及纯化:使用采样瓶采取含有微藻的水样,保存在封口 袋中并带回实验室处理。取藻标本观察;将收集到的湖水接种在BBM琼脂平板 上,置于25℃,100μmolm-2s-1,光暗周期为16:8的条件下培养1周后,将单个 菌落挑取到新的BBM琼脂平板上,然后在上述条件下培养,重复该过程直到获 得无菌培养物。显微镜检测纯化后的微生物,从琼脂平板转移到50ml液体BBM 中保存。
所分离的藻株的DNA的鉴定:
DNA的提取方法,使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型),具体 步骤如下:
(1)将Spin Column置于Collection Tube中,加入250μl Buffer BL,12000 rpm/min离心1min活化硅胶膜;
(2)取样本干燥组织(不大于20mg),加入液氮充分研磨。研磨后置于 1.5ml离心管中,加入400μl Buffer gP1,涡旋振荡1min,65℃水浴10~30min, 期间可取出颠倒混匀以充分裂解;
(3)加入150μl Buffer g P2,涡旋振荡1min,冰浴5min;
(4)12000rpm/min离心5min,将上清转移至新的离心管中;
(5)加入上清等体积的无水乙醇,立即充分振荡混匀,液体全部转入Spin Column中,12000rpm/min离心30s,弃废液;
(6)向Spin Column中加入500μl Buffer Pw(使用前已加入无水乙醇),12000rpm/min离心30s,弃废液;
(7)向Spin Column中加入500μl Wash Buffer(使用前已加入无水乙醇),12000rpm/min离心30s,弃废液;
(8)重复操作步骤7;
(9)将Spin Column放回Collection Tube中,12000rpm/min离心2min, 开盖晾干1min;
(10)取出Spin Column,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中央处加 50~100μlTE Buffer(65℃预热TE Buffer),20~25℃放置2min,12000rpm/min 离心2min。
PCR扩增
真菌菌种鉴定通用引物
Figure BDA0003402995120000051
提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板,以擎科1×TSE101金牌mix 进行扩增,扩增体系各组分如下:
1×TSE101金牌mix 45ul
ITS1(10P) 2ul
ITS4(10P) 2ul
DNA模板 1ul 
以上扩增体系按以下扩增程序扩增:
Figure BDA0003402995120000052
电泳检测
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2ul样品+6ul溴酚蓝),300V 电压下12分钟,获取鉴定胶图。将准备好的PCR产物送至天昊公司测序部进行 一代测序(测序引物为ITS1/ITS4),将ITS序列输入在线BLAST软件进行序 列比对,选取一致性和相似性最高的已登记ITS序列若干进行进化树构建,结 果见图1。经鉴定本发明的CDU-W13藻株的DNA符合绿藻科的特征。
实施例1
将藻细胞接种于BBM培养基中,于恒温恒光照培养器中培养20天,培养 条件为:连续光照,光照强度为100μmol photons m-2s-1,温度为25℃。藻株培 养结果如图2所示。
实施例2
将藻细胞接种于含淘米水5wt%的BBM混合培养基中,于恒温恒光照培养 器中培养20天,培养条件为:连续光照,光照强度为150μmol photons m-2s-1, 温度为20℃。
实施例3
将藻细胞接种于含淘米水10wt%的BBM混合培养基中,于恒温恒光照培 养器中培养20天,培养条件为:连续光照,光照强度为100μmol photons m-2s-1, 温度为25℃。藻株培养结果如图3所示。
实施例4
将藻细胞接种于含淘米水15wt%的BBM混合培养基中,于恒温恒光照培 养器中培养18天,培养条件为:12/12h的光暗交替,光照强度为60μmol photons m-2s-1,温度为20℃。
实施例5
将藻细胞接种于含淘米水20wt%的BBM混合培养基中,于恒温恒光照培 养器中培养18天,培养条件为:14/10h的光暗交替,光照强度为100μmol photons m-2s-1,温度为25℃。
实施例6
将藻细胞接种于含淘米水10wt%的BBM混合培养基中,于恒温恒光照培 养器中培养15天,培养条件为:16/8h的光暗交替,光照强度为150μmol photons m-2s-1,温度为25℃。
实施例7
将藻细胞接种于含淘米水15wt%的BBM混合培养基中,于恒温恒光照培 养器中培养14天,培养条件为:连续光照,光照强度为60μmol photons m-2s-1, 温度为25℃。
上述实施例中所用BBM培养基的组成如表1所示。
表1 BBM培养基配方
化学组成 含量
<![CDATA[Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>]]> 1mL/L
<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O]]> 1mL/L
NaCl 1mL/L
<![CDATA[K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>]]> 1mL/L
<![CDATA[FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O]]> 1mL/L
<![CDATA[H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>]]> 1mL/L
<![CDATA[NaNO<sub>3</sub>]]> 1mL/L
EDTA/KOH 1mL/L
<![CDATA[CaCl<sub>2</sub>]]> 1mL/L
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]> 1mL/L
Trace metal 1mL/L 
下面对实施例中微藻藻株的油脂含量进行测量:
取20ml样品用预先称重的滤膜(0.45μm)过滤,将带有藻细胞的膜放入 105℃的烘箱中干燥过夜,然后称量。通过扣除膜本身重量计算收获的藻的生物 量(DW)。
油脂含量的测定:
取20ml实施例中所得样品进行离心(4000rpm,10min),分离藻细胞,再 加入体积比为1:2的甲醇和二氯甲烷混合试剂9ml以及60μl浓度为1M的HCl, 摇匀后放入摇床摇2小时,其后加入2ml 0.9wt%NaCl,摇匀。将样品放入离心 机中离心(200g,2min)后,将下层溶液转移到铝制杯中后放入105℃的烘箱中 干燥2小时,然后称量。通过扣除铝制杯本身重量计算收获的藻的油脂重量。
油脂计算公式:
油脂含量(mg/L·DW)=W0/DW
油脂生产效率(mg/L·day)=W0/t
W0:油脂产量,mg/L
DW:干重,g/L
T:收获时间
表1实施例中微藻藻株的油脂含量
Figure BDA0003402995120000081
虽然结合实施例对本发明的具体实施方法进行了详细地描述,但不应理解 为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内,本领域技术人 员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (7)

1. 一种新的淡水产油微藻物种,命名为Didymogenes chengda CDU-W13,保藏时间为2021年12月3日,保藏编号是CCTCC NO:M20211536。
2. 根据权利要求1所述的淡水产油微藻物种的培养方法,其特征在于,包括初始培养和扩大培养,所述初始培养和扩大培养在连续光照或光暗交替条件下进行;连续光照培养时,初始培养的光照强度为60~500μmol photons m-2s-1,温度为20℃~30℃,扩大培养的光照强度为60~1000μmol photons m-2s-1,温度为20℃~30℃;光暗交替培养时,光暗交替周期为12~16/12~8h,光照强度和温度与连续光照培养时相同。
3.根据权利要求2所述的淡水产油微藻物种的培养方法,其特征在于:所述初始培养和扩大培养所用培养基为BBM培养基。
4.根据权利要求2所述的淡水产油微藻物种的培养方法,其特征在于,所述初始培养时间为6~10天,所述扩大培养时间为7~14天。
5.根据权利要求2所述的淡水产油微藻物种的培养方法,其特征在于,所述初始培养和扩大培养的培养温度均为25℃。
6.根据权利要求1所述的淡水产油微藻物种在生产油脂、生物柴油、藻类蛋白、脂肪酸或生物质中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:将淡水产油微藻于含粮食废水0%-20%的BBM培养基中连续培养或批次培养2-3周。
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Title
Lipid accumulation and anti-rotifer robustness of microalgal strains isolated from Eastern China;Cheng Yuan et al.;J Appl Phycol;全文 *
Polyphyletic distribution of bristle formation in Chlorellaceae: Micractinium, Diacanthos, Didymogenes and Hegewaldia gen. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta);Thomas Pröschold et al.;Phycological Research;全文 *

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CN114164115A (zh) 2022-03-11

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