WO2015174588A1 - 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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biomass
culture
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민성란
안준우
임종민
황보권
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한국생명공학연구원
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a microalgal Chlamydomonas reinhardtii variant and its use in which biomass, starch and lipids are enhanced by gamma irradiation, and more specifically, biomass, starch and Chlamydomonas reinhardtii CrM001 (KCTC12584BP) variant with enhanced lipid content, biomass comprising the variant or its culture medium as an active ingredient, microbial preparation for starch and lipid preparation, and culturing the variant bioenergy It relates to a method for producing starch and lipids required for production, and a method for producing bioethanol and biodiesel using starch and lipids produced by culturing the above variants.
  • bioethanol is an alcohol produced by fermenting carbohydrates made from sugar or starch and used as ethanol fuel or gasoline additive.
  • the second form of biodiesel is produced through transesterification from oil or fat and used as diesel fuel or diesel additive.
  • the bioenergy source (biomass) for generating the bioenergy includes crops, wood or microalgae.
  • microalgae can overcome the limitations of using land resources, can use wastewater, and have a 5 to 10 times higher production rate than land resources (crops).
  • microalgae with high starch and lipid content per cell and excellent growth is being made.
  • Increasing the starch and lipid content of microalgae is important for reducing bioenergy production costs and improving production efficiency.
  • microalgae that accumulate lipids at high concentrations are limited to some, and it is common to accumulate lipids at optimum temperatures and specific culture conditions, but recently, techniques for improving lipid productivity by genetic improvement have been developed.
  • studies on starch yield enhancement and starch biosynthetic pathways using microalgae species with high starch content and microalgal transformation techniques have been conducted (John, RP et al., 2011, Bioresource Technology 102: 186-193). .
  • Korean Patent No. 1246523 discloses 'Cenedesmus dimorphus 6G having a lipid content increased by radiation irradiation, a production method thereof, and a method for producing biodiesel using the Genedesmus dimorphus 6G'.
  • Korean Patent Publication No. 2013-0107258 discloses a method for preparing a microalgae mutant using an electron beam, but the microalgae chlamydomonas reinhard has enhanced biomass, starch and lipid content by gamma irradiation of the present invention. There is no disclosure of TiA variants and their use.
  • the present invention is derived from the above requirements, the present invention, after irradiating gamma-rays to Chlamydomonas rain hard tia, screening microalgae variants with increased biomass, starch and lipid content, analysis of growth characteristics of the variants and The present invention was completed by confirming that the mutant microalgae usable for producing starch and lipids for bioenergy through starch and lipid content assays.
  • the present invention provides Chlamydomonas reinhardtii CrM001 (KCTC12584BP) variant of Chlamydomonas reinhardtii CrM001 with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma irradiation.
  • the present invention provides a microbial preparation for producing biomass, comprising the variant or a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a microbial preparation for preparing starch, comprising the variant or a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a microbial preparation for the preparation of lipid, comprising the variant or its culture as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for producing starch, wherein the above-mentioned culturing is carried out and the starch is separated from the culture solution.
  • the present invention also provides a method for producing lipids, which comprises culturing the above variants and separating the lipids from the culture solution.
  • the present invention also provides a method for producing bioethanol comprising culturing the variant, separating starch from the culture solution, and converting the separated starch into bioethanol.
  • the present invention also provides a method for producing biodiesel comprising culturing the variant, separating starch from the culture medium, and converting the separated lipid into biodiesel.
  • the present invention has developed a variant that accumulates high concentrations of starch and lipids by irradiating gamma rays to existing Chlamydomonas reinhardtia, and the variants are expected to be useful as microalgae suitable for producing starch and lipids for bioenergy production. do.
  • bioethanol and biodiesel using starch and lipids according to the present invention will be provided as a transport fuel or as a raw material for the production of various chemical products, thereby contributing to the production of petroleum substitute chemicals.
  • FIG. 1 is a graph showing the growth rate of the microalgal Chlamydomonas Reinhardtia variant with enhanced starch and lipid content by gamma irradiation (cc124; control, CrM001; variant).
  • Figure 2 shows a photograph of the cells taken after 15 days incubation in TAP basal medium (cc124; control, CrM001; variant).
  • FIG. 3 shows the accumulation of lipid (L) and starch (S) in cells cultured in N-TAP medium lacking nitrogen after 5 days in TAP basal medium using a transmission electron microscope.
  • Photo cc124; control, CrM001; variant).
  • Figure 4 is a photograph comparing the degree of starch accumulation by staining cells cultured for 2 days in N-TAP medium lacking nitrogen after 7 days in TAP basal medium (cc124; control, CrM001; variant).
  • Figure 5 is a quantitative analysis of the starch accumulation of cells cultured for 2 days in N-TAP medium lacking nitrogen after 7 days in TAP basal medium (cc124; control, CrM001; variant).
  • FIG. 6 is a quantitative analysis of the total lipid content of cells further cultured for 2, 4, and 8 days in N-TAP medium lacking nitrogen after 7 days of incubation in TAP basal medium (cc124). Control, CrM001; variant).
  • the present invention provides Chlamydomonas reinhardtii CrM001 variant (KCTC12584BP) with enhanced biomass, starch and lipid content by gamma irradiation.
  • Chlamydomonas Reinhardti CrM001 variant with enhanced biomass, starch and lipid content was deposited on April 25, 2014 to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) (Accession No .: KCTC12584BP).
  • the gamma rays may be irradiated to Chlamydomonas reinhardtii such that the absorbed dose is 60 to 150 Gy (gray), and preferably the absorbed dose of gamma rays is 80 to 120 Gy, This is not restrictive.
  • the starch content may be improved by 1.5 times or more, preferably 2 times or more, compared to the starch content of Chlamydomonas reinhardtia without irradiating gamma rays.
  • the lipid content may be improved by 1.5 times or more, preferably 1.7 times or more, compared to the lipid content of Chlamydomonas reinhardtia without irradiating gamma rays.
  • the variant may have an increase in cell saturation of at least 20%, preferably at least 30%, relative to the cell saturation of Chlamydomonas reinhardtia without irradiating gamma rays.
  • Cell saturation in the present invention refers to the maximum cell density that can be reached per unit volume of culture.
  • the cell saturation is about 30% higher than that of Chlamydomonas reinhardhard without irradiating gamma rays when the variant is cultured in a nutrient-rich medium at a temperature of 25 °C, reaching the cell saturation After this, the cell number can be kept constant. Increased cell saturation indicates that the starch productivity of the variant increased about 2.6-fold and lipid productivity about 2.2-fold, compared to Chlamydomonas reinhardtia, which did not irradiate gamma rays.
  • Microalgae can be subjected to a variety of biological and abiotic stresses to enhance biomass, starch and lipid content.
  • the variant of the present invention may enhance biomass, starch and lipid content in nutrient deficient culture conditions.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the variant is cultured for 5 to 7 days until reaching the cell saturation in a nutrient rich medium at a temperature of 25 °C and then transferred to a medium lacking nitrogen cultured for 4-8 days to accumulate lipid May be maximized, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a microbial preparation for producing biomass, comprising the variant or a culture thereof as an active ingredient.
  • the microbial agent may contain Chlamydomonas reinhardtii CrM001 (KCTC12584BP) as an active ingredient, Chlamydomonas reinhardtii CrM001, and can be effectively used for mass production of biomass.
  • the present invention also provides a microbial preparation for preparing starch, comprising the variant or a culture thereof as an active ingredient.
  • the microbial agent may include Chlamydomonas reinhardtii CrM001 (KCTC12584BP) as an active ingredient, Chlamydomonas reinhardtii CrM001, can be effectively used for mass production of bioethanol.
  • the present invention provides a microbial preparation for the preparation of lipid, comprising the variant or its culture as an active ingredient.
  • the microbial agent may contain Chlamydomonas reinhardtii CrM001 (KCTC12584BP) as an active ingredient, Chlamydomonas reinhardtii CrM001, and can be effectively used for mass production of biodiesel.
  • the present invention also provides a method for producing starch, wherein the above-mentioned culturing is carried out and the starch is separated from the culture solution.
  • the method for separating starch from the mutant culture may be any method known in the art.
  • the variant of the present invention has the advantage of minimizing the extraction and post-extraction process because it accumulates starch in the form of starch.
  • the present invention also provides a method for producing lipids, which comprises culturing the above variants and separating the lipids from the culture solution.
  • the method for separating lipids from the mutant culture may use any method known in the art.
  • the variant of the present invention has the advantage of minimizing the extraction and post-extraction process because the lipid accumulates in the form of a lipid.
  • the present invention also provides a method for producing bioethanol comprising culturing the variant, separating starch from the culture solution, and converting the separated starch into bioethanol.
  • the method for converting the separated starch into bioethanol may use any method known in the art.
  • the present invention also provides a method of producing biodiesel comprising culturing the variant, separating lipid from the culture medium, and converting the separated lipid into biodiesel.
  • the method for converting the separated lipids into biodiesel may use any method known in the art.
  • the biodiesel may be fatty acid methyl ester (FAME), fatty acid ethyl ester (FAEE), etc., but is not limited thereto.
  • Microalga Chlamydomonas reinhardtii was incubated in TAP (Tris Acetate Phosphate) medium at 25 ° C. for 5 days to prepare a sample for gamma ray treatment.
  • TAP Tris Acetate Phosphate
  • the prepared microalgal cells were collected by centrifugation, the supernatant was removed, and then exposed to gamma rays of 100 Gy total intensity for 1 hour.
  • Exposed microalgae cells were incubated in the dark for 2 days, and then plated in TAP solid medium to select pure variants that were not mixed with other variants in colony form.
  • the selected variants were transferred to nitrogen-deficient N-TAP medium, followed by addition of iodine solution to observe the color change, and starch stockpile variants were selected.
  • OD 750 was measured every 24 hours by inoculating 50 ml TAP medium with OD 750 0.1 at the control (cc124) and variant (CrM001), respectively.
  • Control (cc124) refers to Chlamydomonas Reinhardthiae that did not irradiate gamma rays. After 3 days of inoculation, the growth rate was slightly slower than that of the control. However, OD 750 1.35, which is similar to the maximum saturation level of the control group on day 4, was maintained, and then continued to grow, showing the maximum saturation OD 750 1.85 on day 6 of culture.
  • the maximum cell saturation of the control group was OD 750 1.45 on day 5 and the cell saturation was decreased after aging, but the variant showed a maximum cell saturation OD 750 1.85 on day 6 (FIG. 1).
  • the results indicate that the cell saturation of the variant is about 30% higher than that of the control, which indicates that more biomass production is possible compared to the control.
  • the cells After culturing for 15 days in TAP medium, the cells were folded into the senescence phase and observed under a microscope. For the variant, dividing cells were observed as compared to the control (FIG. 2), which means that the variant can grow at a higher density than the control.
  • control group (cc124) and the mutant (CrM001) were incubated in TAP basal medium for 5 days, and then cultured in nitrogen-deficient N-TAP medium for 2 days, and then iodine solution was added to observe the color change of the cells. It was confirmed that the color change of the variant (CrM001) is darker brown than the control (Fig. 4). This result means that the starch content of the variant is higher than that of the control.
  • a control (cc124) was incubated in TAP basal medium for 5 days, followed by TEM analysis after 4 days incubation in N-TAP medium lacking nitrogen. As a result, it was confirmed that the lipid and starch of the variant (CrM001) were significantly more than the control (Fig. 3). This result means that the lipid content in the variants as well as starch content is higher than the control.
  • the cells were dried for 2 days after incubation in N-TAP medium lacking nitrogen after 5 days in TAP basal medium. Quantitative analysis using Starch assay kit (Sigma, USA) is used to analyze starch content of organisms. Therefore, in this Example, the starch assay kit (Sigma, USA) was used to analyze the starch content of the high starch variants. A total of 20 mg of dry samples were used for starch separation and extraction was performed using a user manual provided by the manufacturer of the Starch assay kit. Starch amount of the variant was about 32% of the dry weight was observed about 2 times higher than the control (Fig. 5). This result means that the variant (CrM001) can be used to produce starch for bioethanol.

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Abstract

본 발명은 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 의해 바이오에너지 생산성이 높아진 경제적인 바이오매스로 사용되기에 적합한 미세조류를 제공하며, 상기 미세조류는 바이오디젤용 지질 생산 및 바이오에탄올용 전분 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티 변이체 및 이의 용도
본 발명은 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii) 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP), 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 바이오매스, 전분 및 지질 제조용 미생물 제제, 상기 변이체를 배양하여 바이오에너지 생산에 필요한 전분 및 지질 제조 방법 및 상기 변이체를 배양하여 생산된 전분 및 지질을 이용한 바이오에탄올 및 바이오디젤 제조 방법에 관한 것이다.
화석 연료 고갈과 화석 연료에 의해 발생하는 지구온난화 및 환경 파괴 등의 전 세계적인 문제가 발생하면서 화석 연료의 대안으로서의 바이오에너지, 생물 자원으로부터 얻어지는 재생 가능한 에너지 연구가 활발히 진행되고 있다.
바이오에너지가 사용되는 것은 크게 두 가지 형태를 띤다. 첫 번째 형태로, 바이오에탄올은 설탕 또는 전분에서 만들어진 탄수화물을 발효시켜 생성된 알코올로, 에탄올 연료 또는 휘발유 첨가제로 사용된다. 두 번째 형태의 바이오디젤은 오일 또는 지방으로부터 트랜스에스테르화(transesterification) 과정을 통해 생성되어, 디젤 연료 또는 디젤 첨가제로 사용된다.
상기 바이오에너지를 생성하는 바이오에너지원(바이오매스)은 농작물, 목재 또는 미세조류 등이 있다. 그 중 미세조류는 육상 자원을 이용하는 한계를 극복할 수 있고, 폐수를 이용할 수 있으며, 육상 자원(농작물)보다 작게는 5~10배 생산율이 높다는 등의 장점이 있다.
따라서 세포당 전분 및 지질 함량이 높고 생장이 우수한 미세조류 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다. 미세조류의 전분 및 지질 함량의 증가는 바이오에너지 생산 비용 절감 및 생산 효율 향상에 중요하기 때문이다. 현재까지 지질을 고농도로 축적하는 미세조류는 일부에 한정되어 있으며, 최적의 온도 및 특정 배양조건에서 지질을 축적하는 것이 일반적이나, 최근 유전적 개량에 의한 지질생산성을 높이는 기술이 개발 중에 있다. 다른 한편으로, 전분함량이 높은 미세조류 종 탐색 및 미세조류 형질전환 기술을 이용한 전분 생산량 증대 및 전분 생합성 경로에 관한 연구가 이루어지고 있다(John, R.P.등, 2011, Bioresource Technology 102:186-193).
최근에는 미세조류 자체의 유전적인 변이를 유도하는 돌연변이 육종법을 이용한 새로운 균주 개발 연구가 진행되고 있다. 상기 연구는 인공적으로 방사선을 조사하거나 화학물질을 작용시켜 고빈도로 돌연변이를 유도시켜서 원하는 미세조류를 선발하는 것이다. 아직까지는 방사선 조사 또는 화학 물질에 의한 돌연변이 미세조류 육성에 대한 연구는 초기 단계라고 할 수 있다.
한국등록특허 제1246723호에는 '방사선 조사에 의해 지질 함량이 증가된 세네데스무스 디모르푸스 6G, 이의 생산 방법 및 상기 세네데스무스 디모르푸스 6G를 이용한 바이오 디젤의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0107258호에는 '전자빔을 이용한 미세조류의 돌연변이체 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이 변이체 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 클라미도모나스 레인하드티아이에 감마선을 조사한 후 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증가된 미세조류 변이체를 선발하고, 변이체의 생장특성 분석 및 전분 및 지질 함량 검정을 통해 바이오에너지용 전분 및 지질 생산에 사용 가능한 변이 미세조류임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 바이오매스 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 전분 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 지질 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 전분을 분리하는 것을 특징으로 하는 전분의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계 및 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계 및 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 기존의 클라미도모나스 레인하드티아이에 감마선을 조사하여 전분과 지질을 고농도로 축적하는 변이체를 개발하였으며, 상기 변이체는 바이오에너지 생산용 전분 및 지질 생산에 적합한 미세조류로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따른 전분 및 지질을 이용한 바이오에탄올 및 바이오디젤은 수송용 연료로 제공되거나 여러 가지 화학 제품 생산의 원료물질로 제공되어 석유 대체 화학물질 생산에 기여할 것이다.
도 1은 감마선 조사에 의해 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티아이 변이체의 생장 속도를 나타내는 그래프이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 2는 TAP 기본 배지에서 15일간 배양한 후 찍은 세포의 사진을 나타낸 것이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 3은 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 4일간 배양한 세포 내부의 지질체(L) 및 전분체(S) 축적 정도를 투과전자현미경을 이용하여 비교한 사진이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 4는 TAP 기본 배지에서 7일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양한 세포를 요오드 용액으로 염색하여 전분 축적 정도를 비교한 사진이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 5는 TAP 기본 배지에서 7일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양한 세포의 전분 축적량을 정량적으로 분석한 것이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
도 6은 TAP 기본 배지에서 7일간 배양 후, 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2, 4, 8일간 각각 추가 배양한 세포의 총 지질 함량을 가스크로마토그래피를 사용하여 정량적으로 분석한 것이다(cc124; 대조구, CrM001; 변이체).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 제공한다.
상기 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001 변이체를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2014년 4월 25일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC12584BP).
상기 감마선은 흡수선량이 60~150 Gy(gray)가 되도록 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)에 조사할 수 있으며, 바람직하게는 감마선의 흡수선량이 80~120 Gy가 되도록 조사할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 전분 함량은 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 전분 함량에 비해 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상 증진될 수 있다.
상기 지질 함량은 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 지질 함량에 비해 1.5배 이상, 바람직하게는 1.7배 이상 증진될 수 있다.
상기 변이체는 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 세포 포화도에 비해 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상 세포 포화도가 증가될 수 있다. 본 발명에서 세포 포화도는 배양액 단위용적당 도달할 수 있는 최대의 세포밀도를 가리킨다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변이체를 25℃의 온도에서 영양이 풍부한 배지에서 배양하였을 때 세포 포화도는 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이에 비해 약 30% 정도 높으며, 세포 포화도에 도달한 이후에도 세포 수가 일정하게 유지될 수 있다. 증가된 세포포화도는 상기 변이체의 전분 생산성이 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이와 비교하여 약 2.6배, 지질 생산성은 약 2.2배 증가하였음을 나타낸다.
미세조류는 바이오매스, 전분 및 지질 함량을 증진시키기 위해서 다양한 생물적 및 무생물적 스트레스를 가할 수 있다.
본 발명의 상기 변이체는 영양 결핍 배양 조건에서 바이오매스, 전분 및 지질 함량을 증진할 수 있다. 바람직하게는 질소 결핍 배지에서 바이오매스, 전분 및 지질 함량을 증진할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변이체를 25℃의 온도에서 영양소가 풍부한 배지에서 세포 포화도에 도달할 때까지 5~7일간 배양한 후 질소가 결핍된 배지로 옮겨서 2일간 배양하여 전분 축적을 최대화시킬 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변이체를 25℃의 온도에서 영양소가 풍부한 배지에서 세포 포화도에 도달할 때까지 5~7일간 배양한 후 질소가 결핍된 배지로 옮겨서 4~8일간 배양하여 지질 축적을 최대화시킬 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 바이오매스 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오매스의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 전분 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오에탄올의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 지질 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP)를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오디젤의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 전분을 분리하는 것을 특징으로 하는 전분의 제조 방법을 제공한다. 상기 변이체 배양액으로부터 전분을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 변이체는 전분체 형태로 전분을 축적하므로 추출 및 추출 후 공정을 최소화할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다. 상기 변이체 배양액으로부터 지질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 변이체는 지질체 형태로 지질을 축적하므로 추출 및 추출 후 공정을 최소화할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계 및 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조 방법을 제공한다. 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변이체를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계 및 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다. 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 상기 바이오디젤은 지방산메틸에스테르(FAME), 지방산에틸에스테르(FAEE) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 감마선 조사 미세조류 변이체 선발
미세조류인 클라미도모나스 레인하드티아이(Chlamydomonas reinhardtii)를 5일간 25℃의 TAP(Tris Acetate Phosphate) 배지에서 배양하여 감마선을 처리할 샘플을 준비하였다. 준비된 미세조류 세포를 원심분리기로 수집 후 상등액을 제거한 다음 1시간 동안 100 Gy 총 세기의 감마선에 노출시켰다. 노출된 미세조류 세포를 2일간 암 상태로 정치 배양한 후, TAP 고체 배지에 도말하여 다른 변이체들이 섞이지 않은 순수 변이체를 콜로니 형태로 선발하였다. 선발된 변이체를 질소가 결핍된 N-TAP 배지에 옮긴 후, 요오드용액을 가하여 색 변화를 관찰 후 전분 고축적 변이체를 선발하였다.
실시예 2. 미세조류 변이체 생장 특성 및 세포 형태 분석
50ml TAP 배지에 OD750 0.1로 대조구(cc124) 및 변이체(CrM001)를 각각 접종하여 매 24시간마다 OD750을 측정하였다. 대조구(cc124)는 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이를 가리킨다. 접종 후 배양 3일째까지 대조구와 비교하여 다소 느린 성장속도를 보였다. 그러나 배양 4일째 대조구의 최대 포화도 수준과 비슷한 OD750 1.35를 보였으며, 이후 계속 생장을 유지하여 배양 6일째 최대 포화도 OD750 1.85를 나타내었다. 대조구의 최대 세포포화도는 5일째 OD750 1.45를 나타내고 이후 노화로 인하여 세포포화도가 감소하는 것이 관찰되었으나, 변이체는 6일째 최대 세포포화도 OD750 1.85를 나타내었다(도 1). 이 결과는 변이체의 세포포화도가 대조구보다 약 30% 정도 높으며, 이러한 결과는 대조구와 비교하여 더 많은 바이오매스 생산이 가능하다는 것을 나타낸다.
TAP 배지에서 15일간 배양하여 세포가 노화기로 접어든 상태의 세포를 현미경으로 관찰하였다. 변이체의 경우 대조구에 비교하여 분열중인 세포가 관찰되었으며(도 2), 이러한 결과는 변이체가 대조구에 비하여 고밀도로 증식할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 3. 요오드용액 반응을 통한 전분 과축적 변이체의 전분 축적 확인
대조구(cc124) 및 변이체(CrM001)를 각각 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양 후 요오드용액을 첨가하여 세포의 색 변화를 관찰하였다. 변이체(CrM001)의 색 변화가 대조구보다 진한 갈색을 나타내는 것을 확인하였다(도 4). 이 결과는 변이체의 전분함량이 대조구보다 높다는 것을 의미한다.
실시예 4. 투과전자현미경(TEM)을 이용한 세포 내부 전분체 및 지질체 축적 정도 및 세포 형태 관찰
대조구(cc124)를 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 4일간 배양 후 TEM 분석을 수행하였다. 그 결과 변이체(CrM001)의 지질체 및 전분체가 대조구와 비교하여 월등히 많다는 것을 확인하였다(도 3). 이 결과는 변이체에서 전분 함량뿐만 아니라 지질 축적도 대조구보다 높다는 것을 의미한다.
실시예 5. 미세조류 변이체의 전분 축적량의 정량적 분석
대조구(cc124)와 변이체(CrM001)의 전분 축적량을 분석하기 위하여 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 2일간 배양 후 세포를 건조시켜 분석을 수행하였다. 생물체의 전분함량 분석을 위하여 Starch assay kit (시그마, 미국)을 이용한 정량적 분석방법이 사용되고 있다. 따라서 본 실시예에서는 고전분 변이체의 전분함량을 측정하기 위하여 Starch assay kit (시그마, 미국)을 사용하여 분석을 수행하였다. 전분 분리를 위하여 총 20 mg의 건조 샘플을 사용하여 수행하였고 추출법은 Starch assay kit의 제조사가 제공하는 사용자매뉴얼을 사용하였다. 변이체의 전분량은 건조중량의 약 32%로 대조구에 비교하여 약 2배 높게 관찰되었다(도 5). 이 결과는 변이체(CrM001)가 바이오에탄올용 전분생산에 활용 가능하다는 것을 의미한다.
실시예 6. 미세조류 변이체의 지방산 분석
대조구(cc124)와 변이체(CrM001)의 지질 축적량을 분석하기 위하여 TAP 기본 배지에서 5일간 배양 후 질소가 결핍된 N-TAP 배지에서 배양하여 2일, 4일, 8일간 배양 후 세포를 건조시켜 분석을 수행하였다. 지방산은 Sasser(Sasser, 1990, Methods in Phytobacteriology;199-210) 방법에 따라 전체 지질을 분리하고 GC로 분석하였다. 그 결과 지방산 함량이 대조구에서는 초기 13%에서 증가하여 2일째에 약 20%까지 증가한 후 유지되었다. 그러나 변이체는 초기 약 15%에서 8일째까지 계속 증가하였으며 최고 30%까지 축적되었다(도 6). 이 결과는 변이체는 대조구에 비해 지방산 함량이 약 1.7배 증가하였음을 의미한다.

Claims (14)

  1. 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 클라미도모나스 레인하드티아이 CrM001(Chlamydomonas reinhardtii CrM001) 변이체(KCTC12584BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 감마선의 조사는 흡수선량이 60~150 Gy(gray)인 것을 특징으로 하는 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전분 함량은 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 전분 함량에 비해 1.5배 이상 증진된 것을 특징으로 하는 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지질 함량은 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 지질 함량에 비해 1.5배 이상 증진된 것을 특징으로 하는 변이체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 감마선을 조사하지 않은 클라미도모나스 레인하드티아이의 세포 포화도에 비해 20% 이상 세포 포화도가 증가된 것을 특징으로 하는 변이체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 영양 결핍 배양 조건에서 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 영양 결핍은 질소 결핍인 것을 특징으로 하는 변이체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 바이오매스 제조용 미생물 제제.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 전분 제조용 미생물 제제.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변이체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 지질 제조용 미생물 제제.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 전분을 분리하는 것을 특징으로 하는 전분의 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변이체를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법.
  13. (1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변이체를 배양하는 단계;
    (2) 상기 배양액으로부터 전분을 분리하는 단계; 및
    (3) 상기 분리된 전분을 바이오에탄올로 전환하는 단계를 포함하는 바이오에탄올의 제조 방법.
  14. (1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 변이체를 배양하는 단계;
    (2) 상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및
    (3) 상기 분리된 지질을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법.
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