KR20240021527A - 이온화 방사선을 이용한 미세 조류의 생육 활성 증진 방법 - Google Patents

이온화 방사선을 이용한 미세 조류의 생육 활성 증진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세 조류에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 생육 증진 방법 또는 미세 조류의 대사산물 생산 증진 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 저선량 방사선을 단회 또는 다회 반복 조사하여 미세 조류의 유전자 돌연변이를 유발하지 않고 세포사멸을 유도하지 않으면서 미세 조류의 생육 또는 대사산물의 생산을 현저히 증진시키는 효과가 있어, 미세 조류를 활용한 다양한 산업분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이온화 방사선을 이용한 미세 조류의 생육 활성 증진 방법{Method for promoting growth activity of microalgae using ionizing radiation}
본 발명은 미세 조류의 생육 증진 방법 및 미세 조류의 대사산물 생산 증진 방법에 관한 것이다.
조류는 대기나 수중의 이산화탄소와 물을 원료로 광에너지를 이용하여 유기물질을 합성하고 산소를 생산하는 광합성 생물로써 지구상에서 육상식물과 대등한 수준의 이산화탄소를 흡수하여 전환하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 조류는 식물과 달리 형태적으로 뿌리, 줄기, 잎의 구분이 명확하지 않으며, 지구상에 약 300,000종(species) 이상이 분포하는 것으로 알려져 있고, 크기에 따라 육안관찰이 가능한 미역, 김 등의 대형 조류(Macroalgae)와 현미경으로 관찰되는 클로렐라(Chlorella), 스피룰리나(Spirulina) 등의 미세 조류(Microalgae)로 구분된다.
미세 조류는 바이오에너지 생산을 위한 주요 바이오매스이면서 동시에 특수 목적 단백질 및 대사물질의 생산 플랫폼으로 널리 연구 및 활용되고 있다. 종래 특허기술인 '방사선을 이용한 미세 조류 개량'은 돌연변이 유도 및 선발에 관한 것으로 기본적으로 고선량에 의한 DNA 손상과 회복을 통해 생육 특성이 우수하거나 전분 또는 지질 함량이 높은 신규 돌연변이 균주를 제작 및 선발하므로 많은 시간이 소요되고, 선발 기준인 목적 형질 이외의 불리한 특성을 배제할 수 없고 일반적인 연속 배양을 통한 산업 생산 공정에서는 사용할 수 없다. 또한, 논문 등을 통해 알려진 '저선량 방사선을 이용한 생육 증진 효과'는 고등 식물에 관한 것으로 일부 식물 종의 초기 생육을 증가시키지만, 성숙단계의 최종 생산 수율에 기여도가 낮거나 유의적이지 않고 개체의 생육 특성으로 인해 실내에서 방사선 조사가 어려워 산업적 활용이 제한된다.
이에 본 발명자들은 산업적 활용도가 높고 연속 배양이 가능한 미세 조류에 방사선 조사를 통해 생육 증진 효과 및 대사산물 생산 증진 효과를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1563148호
본 발명의 목적은 미세 조류에 저선량 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 생육 증진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미세 조류에 저선량 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 대사산물 생산 증진 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미세 조류에 저선량 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 생육 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 미세 조류에 저선량 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 대사산물 생산 증진 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 저선량 방사선을 단회 또는 다회 반복 조사하여 미세 조류의 유전자 돌연변이를 유발하지 않고 세포사멸을 유도하지 않으면서 미세 조류의 생육 또는 대사산물의 생산을 현저히 증진시키는 효과가 있어, 미세 조류를 활용한 다양한 산업분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 3, 6, 12, 25, 50 또는 100 Gy의 엑스선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하면서 5일 동안 세포밀도(cell density)를 측정하여 세포 생장률을 분석한 결과이다.
도 2는 기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 3, 6, 12, 25, 50 또는 100 Gy의 감마선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하면서 5일 동안 세포밀도(cell density)를 측정하여 세포 생장률을 분석한 결과이다.
도 3A는 기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 또는 50 Gy의 엑스선을 조사한 후 6, 24 및 48 시간 째에 세포를 수확하여 유세포분석기(FACS)를 통해 세포사멸을 분석한 결과이고, 3B는 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 또는 50 Gy의 엑스선을 조사한 후 고체 TAP 배지 플레이트에서 7일 동안 배양하고 세포 생존율을 분석한 결과이다.
도 4는 기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 3 또는 6 Gy의 엑스선을 2일 간격으로 2회 또는 3회 조사하여 최종 6, 12 Gy 또는 9, 18 Gy의 엑스선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하면서 엑스선 조사 후 각 2일 째에 세포 생장률을 분석한 결과이다.
도 5는 기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 Gy의 엑스선을 2일 간격으로 3회 조사하여 최종 18 Gy의 엑스선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하고, 동일한 세포수를 기준으로 엽록소 및 단백질 함량을 분석한 결과이다.
도 6은 기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 Gy의 엑스선을 1회 조사한 후 탄소원인 5 mM 또는 10 mM의 탄산수소나트륨(NaHCO3)이 포함된 TAP 배지를 이용하여 세포를 5일 동안 배양하면서 세포 생장률을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 미세 조류에 저선량 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 생육 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 용어, "미세 조류"는 육안으로 볼 수 없는 미세한 조류를 의미하며, 약 50 μm 이하의 단세포 조류이다. 일반적으로 담수 및 해양 시스템에서 발견되는 식물성 플랑크톤으로 수주와 퇴적물 모두에 서식하고, 자연계의 먹이사슬에서 최하위에 위치하여 광합성 색소를 가지며, 광합성을 통해 유기물을 생산하는 독립영양생물이다.
상기 미세 조류는 클라미도모나스 속(Chlamydomonas), 클로렐라 속(Chlorella), 이소크리시스 속(Isochrysis), 패오닥트리움 속(Phaeodactylum), 세네데스무스 속(Scenedesmus), 탈라시오시라 속(Thalassiosira), 아르트로스피라 속(Arthrospira), 크립테코디늄 속(Crypthecodinium), 헤마토코쿠스 속(Haematococcus), 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis), 노스톡 속(Nostoc), 스피룰리나 속(Spirulina), 테트라셀미스 속(Tetraselmis), 스키조키트리움 속(Schizochytrium), 아나베나 속(Anabaena), 아파니조메논 속(Aphanizomenon), 마이크로시스티스 속(Microsystis), 오실라토리아 속(Oscillatoria), 토리포스릭스 속(Tolypothrix) 및 올로시라 속(Aulosira) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 미세 조류는 회분식 배양(batch culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 및 연속식 배양(continuous culture)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 배양된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 용어, "회분식 배양(batch culture)"은 기질의 공급 방식에 따른 액체배양의 일종으로서, 처음 공급한 원료기질이 모두 소비될 때까지 배양을 계속하는 방식이다.
상기 용어, "유가식 배양(fed-batch culture)"은 배지를 간헐적으로 공급하는 배양법으로서 배양액 중의 기질농도를 임의로 제어하면서 배양하는 방식이다.
상기 용어, "연속식 배양(continuous culture)"은 신선한 배지를 일정한 속도로 공급하면서 동시에 같은 양의 배양액을 배출시켜 배양액을 항상 일정하게 유지하는 배양법이다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선은 이온화 방사선인 것일 수 있고, 상기 이온화 방사선은 엑스선, 감마선, 알파선, 베타선(전자선) 및 중성자선으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90 또는 세슘(Cs)-137 등의 방사선 동위원소로부터 방출되는 감마선을 사용하여 조사하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "저선량" 방사선은 독성학의 선량(농도)-독성반응 커브를 그릴 때 전형적인 1차 선형회귀 모델을 따르는 대신에 대조구와 유의적인 독성의 차이를 보이지 않는 특정 선량 범위를 의미한다. 저선량의 범위는 독성 및 생물체의 유형뿐 아니라 독성반응을 어떤 지표를 사용해 해석하느냐에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에서는 "생장률"을 독성반응의 1차 지표로 사용하고, "세포사멸"과 "생존율"을 독성반응의 2차 지표로 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선은 10 Gy 이하의 방사선을 조사하는 것일 수 있고, 바람직하게는 6 Gy 이하의 방사선을 조사하는 것일 수 있다. 방사선 조사 범위에 있어, 상한에는 특별한 기술적 의미가 있으나, 하한에 대해서는 특별히 한정에 대한 기술적 의의가 없다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선은 3 내지 6 Gy의 방사선을 조사하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선은 5회 이하로 반복 조사하는 것일 수 있고, 바람직하게는 2회 또는 3회 반복 조사하는 것일 수 있다. 3회 이상에서는 효과의 차이가 크게 나타나지 않으므로, 2회의 방사선 조사가 가장 효율적일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 6 Gy 이하의 방사선을 5 회 이하로 반복 조사하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 3 내지 6 Gy의 방사선을 2회 또는 3회 반복 조사하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 3 내지 6 Gy의 방사선을 2회 반복 조사하는 것일 수 있다.
상기 반복 조사는 1일 내지 수일 내에 반복 조사하는 것일 수 있고, 바람직하게는 1일 내지 5일 이내에 반복 조사하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 2일 내지 4일 이내에 반복 조사하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선 조사는 방사선을 조사하지 않은 경우에 비해 미세 조류의 생육을 10% 이상 증진시킬 수 있고, 바람직하게는 15% 이상 증진시킬 수 있고, 더욱 바람직하게는 20% 이상 증진시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선은 미세 조류의 유전자 돌연변이를 유발하지 않는 것일 수 있고, 미세 조류의 세포사멸을 유도하지 않는 것일 수 있다. 본 발명의 미세 조류는 야생형의 미세 조류이며, 방사선 조사 후에도 유전자 돌연변이가 유발되지 않은 야생형의 미세 조류인 것일 수 있다. 본 발명의 미세 조류는 세포사멸이 유도되지 않아, 회분식 배양(batch culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 및 연속식 배양(continuous culture)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 배양될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미세 조류는 기본 영양배지에 탄소원이 추가된 배지에서 배양되는 것일 수 있고, 상기 탄소원은 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산수소칼륨(KHCO3), 탄산수소칼슘(Ca(HCO3)2), 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산칼슘(CaCO3) 및 탄산수소염(HCO3 -)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 미세 조류에 10 Gy 이하의 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 대사산물 생산 증진 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 대사산물은 광합성 색소, 단백질, 지질 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 상기 광합성 색소는 엽록소 a, 엽록소 b, 카로티노이드 및 피코빌린으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선 조사는 방사선을 조사하지 않은 경우에 비해 대사산물의 생산을 10% 이상 증진시킬 수 있고, 바람직하게는 15% 이상 증진시킬 수 있고, 더욱 바람직하게는 20% 이상 증진시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험방법
1.1. 미세 조류 균주 및 배양 조건
단세포 녹조류(single-cell green alga)인 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 균주 CC-125 세포(1.5 x 106)는 250 ml 플라스크에서 50ml 액체 TAP(tris-acetate-phosphate) 배지를 이용하여 90~100 μmol photons/m2/s의 일정한 백색광 조건 하에 25 ℃, 140 rpm으로 진탕 배양하였다. 이후, 세포를 800 × g에서 수득한 후, 엑스선(X-irradiation) 또는 감마선(γ-irradiation)을 하기의 방법으로 조사하였다. 방사선 조사 후 후속되는 세포의 배양은 750 nm에서 초기 O.D. (optical density, 이하 "OD750")가 0.05인 세포에 대하여 15 ml 코니칼튜브에서 10 ml 새로운 TAP 배지를 이용하여 동일 조건 하에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)을 수행하였다. 세포 성장에 관한 엑스선 및 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)의 시너지 효과에 대한 분석에서는 기본 TAP 배지에 5 또는 10 mM 탄산수소나트륨을 첨가하여 수행하였다.
1.2. 방사선 조사
250 ml 플라스크에서의 50 ml 배양물(culture) 또는 50 ml 코니칼튜브에서의 10 ml 배양물(culture)에서 대략 0.6 OD750를 나타내는 중간-지수 생장기(mid-exponential growth phase)의 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포를 수확한 후, 1.8 ml의 TAP 배지로 재부유시키고 3개의 1.5 ml EP(Eppendorf Tube) 튜브에 나누었다. 각 샘플에는 cabinet type X-ray machine (CP-160, Faxitron X-ray LLC, Lincolnshire, IL, USA)를 이용하여 160 kV 및 1 mA에서 11.1, 22.2, 44.4, 66.6 분 동안 3, 6, 12 또는 18 Gy의 엑스선을 조사하거나, 160 kV and 10 mA에서 4.05, 8.1, 16.2 분 동안 25, 50, 또는 100 Gy의 엑스선을 조사하였다. 반복적인 방사선 조사의 경우에는 2일 간격으로 2회 또는 3회 수행하였다.
또한, 250 ml 플라스크에서의 50 ml 배양물(culture)에서 중간-지수 생장기(mid-exponential growth phase)의 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포를 수확한 후 농축없이 2개의 50 ml 코니칼튜브로 동일하게 나누고, 첨단방사선연구소(전라북도)에서 3 kCi 60Co source로부터 생산된 감마선을 1 시간 동안 3, 6, 12, 25, 50, 또는 100 Gy로 조사하였다. 각 샘플에 대한 흡수선량은 기존에 기재된 바와 같이 5 mm-diameter alanine dosimeter (Bruker Instruments, Rheinstetten, Germany)를 이용하여 결정하였다 (Song et al., A comparative study. Food Chem 200, 293-300, 2016).
1.3. 세포 생장률(cell growth rate) 및 생존율(survival rate)의 측정
세포 밀도(cell density)는 방사선이 조사된 세포 및 조사되지 않은 대조군 세포(Mock)의 상대적인 생장을 나타내는데 사용되었다. 액체 TAP 배지에서 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 배양물의 세포 밀도는 엑스선 또는 감마선을 조사한 후 2일 째 또는 5일 동안 연속적으로 OD750을 측정하여 도출하였다.
생존율(survival rate)의 경우, 각각 1×104의 방사선이 조사된 세포 및 조사되지 않은 대조군 세포(Mock)를 고체 TAP 배지 플레이트에 펴고, 대략 90~100 μmol photons/m2/s의 일정한 백색광 조건 하에 25 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 이후, 가시적인 콜로니 수를 측정하고, 방사선 조사된 세포와 대조군 간의 상대적 생존율을 계산하였다.
1.4. 세포사멸 분석
세포자멸(apoptosis) 및 세포괴사(necrosis)에 의한 세포사멸 세포의 정량 분석은 Muse™ Annexin V and Dead Cell Assay Kit (MCH100105; Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 유세포분석기인 Muse™ Cell Analyzer (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 통해 수행하였다. 방사선 조사된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 또는 조사되지 않은 대조군 세포는 엑스선 조사 후 6, 24 및 48 시간 째에 수확하였고, DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 2회 세척하였으며, Muse™ Annexin V 및 7-AAD(7-Aminoactinomycin D)로 염색한 후, 각 샘플에 대한 세포사멸 분석을 수행하였다. 세포사멸 분석은 Muse™ Cell Analyzer's software (Muse 1.1.2, Merck Millipore)를 이용하여 살아있는 세포(live cells), 초기/후기 세포사멸 세포(early/late apoptotic cells), 및 죽은 세포(dead cells)의 비율로 나타내었다.
1.5. 엽록소(Chlorophyll) 및 단백질 함량의 분석
클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에서의 엽록소 및 단백질 함량 분석은 기존에 공지된 방법을 변형하여 수행하였다 (Kim et al., Environmental and Experimental Botany 67, 363-371, 2009). 수확 및 동결된 세포 (1×108)는 엽록소 추출을 위해 500 μl의 100 %(v/v) 차가운 아세톤(ice-cold acetone)을 넣은 후 격렬하게 볼텍싱하였고, 세포 파괴물(cell debris)는 4 ℃, 21,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. 엽록소의 농도는 다음의 Lichtenthaler (1987) 공식으로 계산하였다: chlorophyll a = 11.24 × A661.6 - 2.04 × A644.8; chlorophyll b = 21.13 × A644.8 - 4.19 × A661.6; 및 total chlorophyll = 18.09 × A644.8 + 7.05 × A661.6.
단백질 추출은 수확된 세포 (1×108)를 300 μl의 용해완충액(lysis buffer: 60 mM DTT, 60 mM Na2CO3, 2% (w/v) SDS 및 12% (w/v) sucrose가 포함됨)에 재부유시킨 후 상온에서 20분 동안 진탕하여 수행하였다 (Ferrante et al., BMC Plant Biology 11, 22, 2011). 단백질 추출물은 4 ℃, 10,000 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 수득하였고, 5배 부피의 100 %(v/v) 차가운 아세톤(ice-cold acetone)을 혼합하였다. 혼합물은 단백질 침전을 촉진시키기 위해 -20 ℃에서 2시간 동안 유지한 후 4 ℃, 5,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하였다. 단백질 펠릿은 100 %(v/v) 차가운 아세톤(ice-cold acetone)로 2회 세척한 후 아세톤의 완전한 건조를 위해 흄 후드에 유지하였다. 건조된 단백질 펠릿은 증류수에 녹인 후, Bradford (1976) 방법을 근거로 Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)의 매뉴얼에 따라 단백질 농도를 측정하였다.
1.6. 통계 분석
모든 실험은 방사선(엑스선 또는 감마선) 조사 후 수득된 생물학적 복제물을 이용하여 3회 이상 반복하여 수행하였다. 데이터는 two-sample independent t-test 또는 Tukey's HSD(Tukey's honestly significant difference test) 검정을 통한 ANOVA(one-way analysis of variance)로 유의성을 분석하였고, RStudio 2022.02.3+492 (RStudio Team, 2022, Integrated Development Environment for R. PBC, Boston, MA, USA)에서 R 4.2.0 (R Core Team, 2022, A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)의 통계 기능을 이용하여 이를 수행하였다. p-값이 0.05 미만이면 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 2. 방사선 조사에 따른 세포 생장률(cell growth rate) 측정 결과
기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 3 내지 100 Gy의 엑스선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하면서 5일 동안 세포 생장률을 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 3 또는 6 Gy의 엑스선이 조사된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포는 엑스선이 조사되지 않은 대조군(Mock)에 비해 2일 째부터 세포 생장률이 증가하였고, 3일 째에 가장 큰 차이로 세포 생장률이 증가하였으며, 5일까지 세포 생장률의 증가가 유지되었음을 확인하였다 (도 1). 다만, 12 또는 25 Gy의 엑스선이 조사된 세포에서는 대조군(Mock)에 비해 세포 생장률이 낮아지는 경향을 보였고, 50 또는 100 Gy의 엑스선이 조사된 세포에서는 대조군(Mock)에 비해 세포 생장률이 현저히 낮아졌음을 확인하였다.
동일하게, 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 3 내지 100 Gy의 감마선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하면서 5일 동안 세포 생장률을 조사하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 엑스선 조사에 따른 결과와 유사하게, 3 또는 6 Gy의 감마선이 조사된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포는 감마선이 조사되지 않은 대조군(Mock)에 비해 2일 째부터 세포 생장률이 증가하였고, 3일 째에 최대치로 생육 활성이 증가하였으며, 5일까지 세포 생장률의 증가가 유지되었음을 확인하였다 (도 2). 다만, 엑스선 조사에 따른 결과에서와 마찬가지로, 12 내지 100 Gy의 감마선이 조사된 세포에서는 대조군(Mock)에 비해 세포 생존률이 낮아졌음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에서는 10 Gy 이하, 바람직하게는 6 Gy 이하의 방사선을 조사하여 미세 조류의 생육 증진 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 방사선 조사에 따른 세포사멸(apoptotic cell death) 및 생존율(survival rate) 분석 결과
기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 또는 50 Gy의 엑스선을 조사한 후 6, 24 및 48 시간 째에 세포를 수확하여 유세포분석기를 통해 세포사멸을 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 6 Gy의 엑스선에 조사된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포에서는 엑스선이 조사되지 않은 대조군(Mock)과 비교하여 엑스선 조사 후 6, 24 및 24 시간 모두에서 세포사멸이 거의 발생하지 않았음을 확인하였다 (도 3A). 반면, 50 Gy의 엑스선이 조사된 세포에서는 엑스선 조사 후 6 시간 째에 세포사멸이 현저히 증가하였고, 이후 48 시간까지 세포사멸이 감소하는 경향을 보였다.
또한, 기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 또는 50 Gy의 엑스선을 조사한 후 고체 TAP 배지 플레이트에서 7일 동안 배양하고 세포 생존율을 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 상기 세포사멸 분석 결과와 유사하게, 6 Gy의 엑스선에 조사된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포에서는 엑스선이 조사되지 않은 대조군(Mock)과 유사한 세포 생존율을 나타낸 것을 확인하였다 (도 3B). 반면, 50 Gy의 엑스선이 조사된 세포에서는 대조군에 비해 세포 생존율이 약 30% 감소하였음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에서는 10 Gy 이하, 바람직하게는 6 Gy 이하의 낮은 방사선을 조사하여 미세 조류의 세포 생존율을 유지하고 세포사멸을 유도하지 않음으로써 미세 조류의 생육 증진에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 4. 방사선 조사의 단일 또는 반복에 따른 세포 생장률(cell growth rate) 측정 결과
기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 3 또는 6 Gy의 엑스선을 2일 간격으로 2회 또는 3회 조사하여 최종 6, 12 Gy 또는 9, 18 Gy의 엑스선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하면서 엑스선 조사 후 각 2일 째에 세포 생장률을 조사하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 3 또는 6 Gy의 엑스선을 1회 조사한 세포에서는 엑스선이 조사되지 않은 대조군(Mock)에 비해 약 10%로 세포 생장률이 증가하였고, 1회 조사 후 2일 후에 엑스선을 추가 조사하여 엑스선을 총 2회 조사한 세포에서는 대조군(Mock)에 비해 약 19%로 세포 생장률이 증가하였음을 확인하였다 (도 4). 특히, 2회 엑스선을 조사한 경우는 총 6 또는 12 Gy의 방사선이 조사된 것으로서, 도 1에서와 같이 12 Gy의 엑스선을 1회 조사한 세포에서는 대조군에 비해 세포 생장률이 감소하였으나, 6 Gy의 엑스선을 2회로 반복 조사하여 총 12 Gy의 엑스선을 조사한 세포에서는 세포 생장률이 현저히 증가하였다는 점에 의미가 있다. 또한, 2회 조사 후에 추가 조사하여 총 3회의 엑스선을 조사한 세포에서도 대조군에 비해 약 21% 세포 생장률이 증가하였다 (도 4).
상기 결과로부터, 본 발명에서는 10 Gy 이하, 바람직하게는 6 Gy 이하의 낮은 방사선을 다회 반복 조사하여 미세 조류의 생육 증진에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. 방사선 조사에 따른 엽록소 및 단백질 함량 분석 결과
기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 Gy의 엑스선을 2일 간격으로 3회 조사하여 최종 18 Gy의 엑스선을 조사한 후 세포를 희석(OD750 = 0.05)하여 배양하고, 동일한 세포수를 기준으로 엽록소 및 단백질 함량을 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 6 Gy의 엑스선을 총 3회 조사한 세포에서는 엑스선이 조사되지 않은 대조군(Mock)에 비해 동일한 세포수를 기준으로 엽록소가 약 19% 정도로 유의하게 증가하였고, 단백질 함량이 약 15% 정도로 유의하게 증가하였음을 확인하였다 (도 5).
상기 결과로부터, 본 발명에서는 10 Gy 이하, 바람직하게는 6 Gy 이하의 낮은 방사선을 조사하여 다회 반복 조사하여 엽록소나 단백질과 같은 개별 세포의 대사산물 생산을 현저히 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6. 방사선 조사 및 탄소원 공급에 따른 세포 생장률 측정 결과
기본 영양배지(TAP)에서 혼합 영양조건의 회분식 배양(mixotrophic batch culture)으로 배양된 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)에 6 Gy의 엑스선을 1회 조사한 후 탄소원인 5 mM 또는 10 mM의 탄산수소나트륨(NaHCO3)이 포함된 TAP 배지를 이용하여 세포를 5일 동안 배양하면서 세포 생장률을 조사하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 기본 TAP 배지에 탄소원인 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 첨가하여 배양한 세포에서는 첨가되지 않은 배지에서 배양된 대조군(Mock)에 비해 3일 째에 약 37% (5 mM NaHCO3) 또는 약 42% (10 mM NaHCO3)로 미세 조류의 생육이 현저히 증가하였음을 확인하였다 (도 6). 그런데, 탄소원의 추가 및 6 Gy의 엑스선을 복합적으로 처리한 세포에서는 대조군(Mock)에 비해 3일 째에 약 55% (5 mM NaHCO3 + 6 Gy X-ray) 또는 약 84% (10 mM NaHCO3 + 6 Gy X-ray)로 미세 조류의 생육이 더욱 현저하게 증가하였음을 확인하였다 (도 6).
상기 결과로부터, 본 발명에서는 기본 배지에 탄소원의 추가뿐만 아니라 10 Gy 이하, 바람직하게는 6 Gy 이하의 낮은 방사선을 조사하여 미세 조류의 생육 증진에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 미세 조류에 저선량 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 생육 증진 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세 조류는 회분식 배양(batch culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 및 연속식 배양(continuous culture)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 배양하는 것인, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사선은 이온화 방사선인 것인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 이온화 방사선은 엑스선, 감마선, 알파선, 베타선(전자선) 및 중성자선으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사선은 10 Gy 이하의 방사선을 조사하는 것인, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사선은 6 Gy 이하의 방사선을 조사하는 것인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사선은 5회 이하로 반복 조사하는 것인, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사선은 미세 조류의 유전자 돌연변이를 유발하지 않는 것인, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사선은 미세 조류의 세포사멸을 유도하지 않는 것인, 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세 조류는 기본 영양배지에 탄소원이 추가된 배지에서 배양되는 것인, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 탄소원은 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산수소칼륨(KHCO3), 탄산수소칼슘(Ca(HCO3)2), 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산칼슘(CaCO3) 및 탄산수소염(HCO3 -)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  12. 미세 조류에 저선량 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 미세 조류의 대사산물 생산 증진 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 대사산물은 광합성 색소, 단백질, 지질 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 광합성 색소는 엽록소 a, 엽록소 b, 카로티노이드 및 피코빌린으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.

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