UA127184C2 - Жирові дріжджі trichosporon oleaginosus та їх застосування для виробництва ліпідів - Google Patents
Жирові дріжджі trichosporon oleaginosus та їх застосування для виробництва ліпідів Download PDFInfo
- Publication number
- UA127184C2 UA127184C2 UAA202000379A UAA202000379A UA127184C2 UA 127184 C2 UA127184 C2 UA 127184C2 UA A202000379 A UAA202000379 A UA A202000379A UA A202000379 A UAA202000379 A UA A202000379A UA 127184 C2 UA127184 C2 UA 127184C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- range
- lipids
- carried out
- yeast
- production
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 114
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 86
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 89
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 74
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 claims description 48
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 23
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 23
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 13
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 62
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 34
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 abstract description 4
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000446 fuel Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 4
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 241000439394 Cutaneotrichosporon oleaginosum Species 0.000 abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- 108010020326 Caspofungin Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N caspofungin Chemical compound C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N3CC[C@H](O)[C@H]3C(=O)N[C@H](NCCN)[C@H](O)C[C@@H](C(N[C@H](C(=O)N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N2)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)CCCCCCCC[C@@H](C)C[C@@H](C)CC)[C@H](O)CCN)=CC=C(O)C=C1 JYIKNQVWKBUSNH-WVDDFWQHSA-N 0.000 description 6
- 229960003034 caspofungin Drugs 0.000 description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 6
- -1 for example Chemical class 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 102000005469 Chitin Synthase Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108700040089 Chitin synthases Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000004132 lipogenesis Effects 0.000 description 3
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 2
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 2
- 230000006372 lipid accumulation Effects 0.000 description 2
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 101710164537 Chitin synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710164540 Chitin synthase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000008169 Co-Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010060434 Co-Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 240000003433 Miscanthus floridulus Species 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 244000273256 Phragmites communis Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- SZFSLWMLMWUDEG-UHFFFAOYSA-N S(=O)(=O)(O)C(=O)C1=CC(OC)=C(OP(=O)=O)C=C1 Chemical compound S(=O)(=O)(O)C(=O)C1=CC(OC)=C(OP(=O)=O)C=C1 SZFSLWMLMWUDEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001591005 Siga Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002283 diesel fuel Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000010794 food waste Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Substances CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003520 lipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 102000004356 mRNA Cleavage and Polyadenylation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010042176 mRNA Cleavage and Polyadenylation Factors Proteins 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108020003068 nitronate monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 230000002352 nonmutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000858 peroxisomal effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується жирових дріжджів виду Trichosporon oleaginosus DSM 32508, що характеризується мутаціями, які впливають на синтез клітинної стінки, а також утворюють агрегати клітин, які знижують в'язкість бульйонної культури, легше відділяються від неї і, таким чином, полегшують їх відновлення. Жирові дріжджі виду Trichosporon oleaginosus DSM 32508 також характеризується вищим виходом жирової клітинної біомаси і внутрішньоклітинним накопиченням ліпідів. Крім того, даний винахід стосується способу виробництва ліпідів з допомогою зазначеного варіанта жирових дріжджів виду Trichosporon oleaginosus DSM 32508.
Description
Даний винахід стосується варіанта жирових дріжджів виду Г/іспо5рогоп оіІеадіпов5ив.
Більш конкретно, даний винахід стосується варіанта жирових дріжджів виду Г/лспо5рогоп оіІеадіпозих, що характеризується мутаціями, які впливають на синтез клітинної стінки, що змінюють її морфологію відносно штаму дикого типу того ж виду. Зокрема, завдяки цим мутаціям, з яких утворені агрегати клітин, відносно штаму дикого типу того ж виду, знижується в'язкість бульйонної культури, вони більш легко відокремлюють від неї і тим самим полегшується їх відновлення.
Зазначений варіант жирових дріжджів виду /пспов5рогоп оіІеадіпозив також характеризується виходами жирової клітинної біомаси і внутрішньоклітинного накопичення ліпідів, що подібні або навіть вищі, ніж у штаму дикого типу.
Крім того, даний винахід стосується способу виробництва ліпідів шляхом культивування зазначеного варіанта жирових дріжджів виду Г/спо5рогоп оіІеадіпов5ив.
Отримані таким чином ліпіди переважно можна застосовувати як проміжні продукти синтезу, зокрема у так званому секторі "екологічно безпечної хімії", або у виробництві біопалив, таких як "біодизельне паливо" або "зелене дизельне паливо", що можуть бути застосовані як такі або змішуються з іншими паливами для транспортування.
Виробництво ліпідів з допомогою мікробіологічних способів пропонується як вигідна альтернатива сучасним способам виробництва з відновлювальних ресурсів. Відносно виділення ліпідів з рослин, мікробіологічний процеси є більш економічними, оскільки їх легше масштабувати, вони потребують менших трудових затрат та експлуатують властивості мікроорганізмів, щоб швидко відтворюватися завдяки таким дешевим субстратам, як, наприклад, похідні після гідролізу лігноцелюлозних матеріалів. Більше того: вони не залежать від кліматичних факторів і не конкурують з сільськогосподарським застосуванням грунту для харчових потреб.
Зокрема перспективними для цієї мети є жирові дріжджі, тобто дріжджі, які можуть, при конкретних умовах культивування, накопичувати ліпіди, особливо тригліцериди, більше 25 95 від їх сухої маси. Застосування жирових дріжджів для виробництва ліпідів є частиною попереднього рівня техніки, як описано, наприклад, у: Мепа Х. єї аї, "Кепеулабіє Епегау" (2009), Мої. 34, рад. 1- 5; Сайагавзві 5. єї а), "Віогезоцгсе Тесппоіоду" (2012), Мої. 111, раяд. 398-403.
Зо Як правило, зазначені ліпіди отримують шляхом культивування жирових дріжджів при аеробних умовах у біореаторах. Жирові дріжджі вирощують, застосовуючи цукрові розчини, що можна отримати від рослин, які містять крохмаль, або цукровмісних фруктів, і вони визначені як "цукри першого покоління", або переважно отримують шляхом обробки і оцукрювання нехарчових лігноцелюлозних біомас, і тому вони визначені як "цукри другого покоління".
Лігноцелюлозні біомаси можуть бути, наприклад, сільськогосподарськими відходами, такими як пшенична солома або стебла кукурудзи, або рослинами, які не можуть бути застосовані для у галузі харчування, такими як очерет звичайний, технічне сорго, міскантус, або відходами виробництва нехарчових рослин, таких як гваюла, евкаліпт, тополя, або лісосічними відходами, або відходами переробки від паперового виробництва. Такі суміші цукрів другого покоління, які називають гідролізатами, містять цукри з 5 (С5) та 6 (Сб) атомами вуглецю. Жирові дріжджі зазвичай здатні рости на С5 цукрах, таких як ксилоза, і Сб цукрах, таких як глюкоза, виробляючи клітинну біомасу, та, при конкретних умовах росту, накопичувати ліпіди у високому процентному вмісті відносно сухої клітинної маси.
У результаті культивування зазначених жирових дріжджів у біореакторі отримують бульйонну культуру, яка містить жирову клітинну біомасу, яку потрібно відновити. Потім ліпіди, накопичені всередині клітин, повинні бути вилучені й відокремлені від бульйонної культури, яка все ще присутня, та від клітинного дебрису, отриманих в результаті відповідних методів лізису або розриву.
Одна з головних критичностей щодо виробництва ліпідів з допомогою мікробіологічних способів стосується того факту, що об'ємна продуктивність (тобто кількість ліпідів, яка має бути отримана на одиницю об'єму бульйонної культури) обмежена та, загалом, становить менше 100 г/л. Тому промислове застосування цих технологічних процесів передбачає застосування значних об'ємів бульйонної культури зазначених мікроорганізмів. Ці великі об'єми бульйонної культури повинні бути, звичайно, оброблені для відновлення жирової клітинної біомаси, що отримується в результаті, і виділяти ліпіди, у великих рослинах, з високими витратами для налагодження процесу і способу.
З метою забезпечення економічної ефективності способу отримання ліпідів культура жирових дріжджів повинна досягнути високої щільності клітин, отже, дозволяючи підвищити продуктивність зазначеного способу, щоб мінімізувати об'єм бульйонної культури і кількість бо використовуваних біореакторів. Вкінці вирощування отримана жирова клітинна біомаса повинна бути концентрована, для того щоб знизити об'єми матеріалу, який повинен бути оброблений, на подальших стадіях виділення отримуваних продуктів (наприклад, масла мікробного походження, ліпідів), та повинен бути оптимізований розмір обладнання й об'єми реагентів, необхідних для відновлення.
Сучасні технічні рішення, які застосовуються для відновлення жирової клітинної біомаси з бульйонної культури вкінці вирощування вищевказаних жирових дріжджів, мають переважно фізичний або хімічний характер.
Жирові дріжджі, що використовуються для промислового виробництва ліпідів, особливо у випадку, в якому вони досягають високої щільності клітин, можуть призводити до бульйонних культур з високою в'язкістю, в яких отримувану жирову клітинну біомасу складно відділити від водної фази, через її морфологічні характеристики і синтез речовин з властивостями поверхнево-активних речовин. Додатково, в'язкість бульйонної культури робить культивування жирових дріжджів у біореакторі більш складним і дорогим, через нижнє перемішування і ефективність окиснювання культурального середовища. Зазначена критичність особливо чітка у випадку, якщо спосіб отримання ліпідів здійснюється із застосуванням жирових дріжджів, які є високими виробниками ліпідів, таких як, наприклад, ті, що належать до виду ГПісНпов5рогоп.
Звичайно, для відділення жирової клітинної біомаси, отриманої вкінці способу отримання ліпідів, від бульйонної культури застосовують техніки, які передбачають різницю у густині між двома фазами бульйонної культури (тобто водна фаза і жирова клітинна біомаса), такі як центрифугування, мимовільне осідання, гідроциклони, фільтрування, віджимання на фільтр- пресі, мікрофільтрування, ультрафільтрування, іноді безперервно з'єднане з біореактором, в якому здійснюється зазначений процес. У випадку застосування жирових дріжджів, які належать до виду Т/спо5рогоп, ефективність зазначених технологій, однак, є дуже низькою, тому що отримана жирова клітинна біомаса має густину, дуже подібну до густини водної фази.
З метою підвищення ефективності до бульйонної культури можуть додаватися флокулянти, щоб створити агрегати клітин, які, завдяки їхнім розмірам, легше осідають відносно окремих клітин. Однак, додавання флокулянтів у пропорціях, прописаних у попередньому рівні техніки, не призводить до покращення відділення жирової клітинної біомаси від водної фази. Крім того, додавання флокулянтів може бути несумісним із подальшими способами виділення ліпідів,
Зо через афінність зазначених флокулянтів із розчинниками, застосованими для виділення. На практиці, зазначені флокулянти можуть виділятися разом з внутрішньоклітинними ліпідами, а отже, являють собою домішки, які повинні бути видалені до застосування самих ліпідів.
Інші методи, що застосовуються для концентрації жирової клітинної біомаси, базуються на техніках фільтрування. Однак, речовини з властивостями поверхнево-активних речовин, що часто виробляються жировими дріжджами, перешкоджають проникненню водної фази через мембрану, яка застосовується для фільтрування, що робить процес неефективним.
Також відомі способи, які передбачають випаровування зайвої води, такі як, наприклад, нагрівання для викликання випаровування, або сушіння клітинної біомаси з допомогою таких технік, як, наприклад, сушіння розпиленням або ліофільне сушіння; однак, зазначені способи ефективні у концентрації клітинної біомаси, але потребують високого енергоспоживання та не є економічно доцільними для промислового процесу для подальшого виробництва проміжних продуктів синтезу, зокрема у так званому секторі "екологічно безпечної хімії" або для виробництва біопалив.
Також відомі способи, які передбачають термічні обробки при нейтральному або кислотному
РН, які, як правило, після того, як бульйонна культура була випущена з біореактора, застосовують у способі виробництва ліпідів, вкінці зазначеного способу, так щоб зробити її придатною для центрифугування/фільтрування і щоб полегшувати відновлення отриманої жирової клітинної біомаси. Однак, зазначені способи також потребують додаткових енергозатрат і, при роботі при кислому рн, - нейтралізації підкислених відходів.
Крім того, деякі з описаних вище способів можуть призводити до деградації клітинних структур, включно з характеристиками кінцевого продукту, який має бути отриманий. Нарешті, описані вище способи не вирішують проблему в'язкості бульйонної культури та подальшого збільшення енергії, необхідної через потребу підтримувати і добре помішування, і добре окиснювання у застосовуваному біореакторі.
Проведені дослідження з метою подолання вищезазначених недоліків.
Наприклад, Міжнародна заявка на патент УМО 2013/155050 описує жировий мікроорганізм для виробництва матеріалів з відновлювальних ресурсів, де зазначений мікроорганізм включає генетичну модифікацію, не присутню в немодифікованому мікроорганізмі, і де зазначений мікроорганізм виробляє ферментативний бульйон, який має нижчу в'язкість, ніж той, що бо виробляється немодифікованим мікроорганізмом. Вищезазначений жировий мікроорганізм, як кажуть, має знижений синтез екзоклітинних полісахаридів і здатний виробляти ліпіди з високими виходами.
Так як виробництво матеріалів із відновлювальних ресурсів, зокрема ліпідів, переважно застосовуваних у виробництві проміжних продуктів синтезу у так званому секторі "екологічно безпечної хімії" або у виробництві біопалив, все ще становить великий інтерес, дослідження нових жирових дріжджів, здатних виробляти ліпіди з добрими виходами і такі, що легше відновлюються з бульйонної культури, також становлять великий інтерес.
Тому Заявник мав намір вирішити проблему ідентифікації жирових дріжджів, здатних виробляти ліпіди з добрими виходами і такі, що легше відновлюються з бульйонної культури.
Тепер Заявник ідентифікував варіант жирових дріжджів, які здатні виробляти ліпіди з добрими виходами і легше відновлюються з бульйонної культури.
Зокрема, винахід стосується варіанта жирових дріжджів виду //іспо5рогоп о/еадіпов5ив, поданого 17 травня 2017 року, відповідно до Будапештського договору при Лейбніц-Інституті рЗМА-Оешвспе Заттішйипд моп Мікгоогдапізтеп ипа 2ейкКийитеп СітрН-Іппойепзігабе 7 В 38124
Вгаппзсопмеїд (Септапу), депозитний номер О5М 32508, що характеризується мутаціями, які впливають на синтез клітинної стінки, що модифікують її морфологію відносно штаму дикого типу того ж виду. Зокрема, завдяки цим мутаціям утворюються агрегати клітин, які відносно штаму дикого типу того ж виду знижують в'язкість бульйонної культури, легше відділяються від неї і, таким чином, полегшують їх відновлення. Крім того, зазначений варіант жирових дріжджів характеризується виходами жирової клітинної біомаси і внутрішньоклітинним накопиченням ліпідів, які подібні або навіть вищі до таких же штаму дикого типу.
Додатковий аспект даного винаходу стосується способу виробництва ліпідів шляхом культивування зазначеного варіанта жирових дріжджів виду /7іспо5рогоп оіеадіпозиз О5М з2508.
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, визначення числових діапазони завжди включають крайні значення, якщо не вказано інше.
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, термін "що складається" також включає терміни "що по суті складається" або "що складається з".
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, термін "біодизельне паливо" означає паливо для дизельних двигунів, яке включає алкілові складні ефіри (наприклад, метил, пропіл або етил) довголанцюжкових жирних кислот, які походять з біологічних джерел.
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, термін "зелене дизельне паливо" означає паливо для дизельних двигунів, яке включає продукти гідрогенізації або деоксигенування ліпідів, які походять з біологічних джерел, в присутності водню і щонайменше одного каталізатора.
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, визначення "культивування" і "культура" позначає процеси, за допомогою яких клітини мікроорганізму ростуть і розмножуються в контрольованих людиною умовах. Процеси, визначені за допомогою вищевказаних виразів, включають "культуру" жирових дріжджів, реалізовану у певних варіантах здійснення даного винаходу.
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, визначення "культуральне середовище" означає рідину або гель, надані для підтримання росту мікроорганізмів, наприклад клітин жирових дріжджів. Культуральне середовище може бути визначеного складу (наприклад, середовище "УЕРО", середовище "В" тощо) або може походити від обробки невибраних джерел, таких як, наприклад, рідкі відходи, продуктові відходи або гідролізований лігноцелюлозний матеріал.
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, визначення "джерело вуглецю", "джерело азоту", "джерело сірки" і "джерело фосфору" означають органічні або неорганічні речовини, або композиції зазначених речовин, на основі вуглецю, азоту, сірки (наприклад, сульфатів) і фосфору (наприклад, фосфатів), відповідно, які містяться у культуральному середовищі і які мікроорганізм може метаболізувати для отримання енергії.
Для цілей даного винаходу і подальшої формули винаходу, термін "біомаса" означає агрегат клітин, вироблений під час способу виробництва ліпідів відповідно до даного винаходу або в інших способах культивування.
Додаткові характеристики та переваги даного винаходу стануть зрозумілими з подальшого детального опису.
Отже, предмет даного винаходу складається з варіанта жирових дріжджів виду Гспо5рогоп оІеадіпозив, поданого 17 травня 2017 року відповідно до Будапештського договору при Лейбніц-
Інституті ОЗМ2-Оецівспе Заттішйпд моп МіКтоогдапізтеп ипа 2еїЇКийигтеп СтрН-ІппоПепзігаве 7 60 В 38124 Вгайпзспмєїд (Септапу), депозитний номер О5М 32508.
Генотип варіанта жирових дріжджів виду П/іспо5рогоп оіІеадіпозхиз ОМ 32508 характеризувався порівнянням послідовності його геномної ДНК з такою ж штаму дикого типу жирових дріжджів Пісповрогоп оіеадіпозхиз АТОС 20509, як описано у прикладі 4, що подається нижче.
Геном штаму дикого типу жирових дріжджів виду Г/споз5рогоп оіІгадіпозхих АТОС 20509 має розмір 19601063 пар основ (п.о.) і містить 8283 гени. Серед них 3621 ген був ідентифікований з відомою функцією та 4419 генів були помічені. З порівняння з геномом варіанта жирових дріжджів виду Г/пспо5рогоп оІеадіпозхиз ОМ 32508 загалом було виділено 647 мутацій, 228 з яких - гомозиготні, а 420 - гетерозиготні.
Нижче описані мутації, які впливають на кодуючі ділянки, які прямо чи непрямо призводять до модифікації амінокислотної послідовності білків, кодованих геном, в якому виявлена кожна мутація. Зокрема, аналізуються білки, залучені у процес синтезу клітинної стінки, чия модифікація може впливати на морфологію клітини, характеристики в'язкості бульйонної культури та полегшити осідання дріжджових клітин, присутніх у зазначеній бульйонній культурі.
Більш конкретно, загалом було 131 мутація кодуючих ділянок, що призводять до модифікації амінокислотної послідовності відповідного білка. З останніх 22 - шляхом делеції, 13 - шляхом інсерції, 89 - шляхом однонуклеотидної варіації (ЗММ), і З - шляхом багатонуклеотидної варіації (МММ). Було визначено 30 гомозиготних форм мутації (відкритих у генах, присутніх в унікальній копії). З них, зокрема, делеційна мутація призводить до гена, білок якого зв'язаний з компонентами стінки, зокрема хітином, і тому, не бажаючи посилатися на будь-яку теорію, можна порівняти з фенотипом різної морфології варіанта жирових дріжджів виду Гіспо5рогоп оІеадіпозхиз ВМ 32508 і визначити його більшу здатність до осідання (центрифугування).
Насправді, делеційна мутація викликає відсутність синтезу білка з активністю хітинсинтази (зазначається гомологією як хітин-синтаза 4 дріжджів засспаготусез сегемізіає), таким чином запобігаючи правильному виробленню хітину, необхідного для формування повної клітинної стінки. Насправді, варіанти дріжджів Засспаготусев5 сегемізіає, які представляють мутації в синтезі хітину, виявляють дефекти у відділенні дочірніх клітин від материнських клітин, отже, генеруючи групи нерозділених клітин. Крім того, клітини показують різні форму і розмір порівняно з такими штаму дикого типу, як повідомляється, наприклад, у: Вшауа С. Е., "Аппиаї!
Зо Веміем ої Місгобіоіоду" (1993), Мої. 47, рад. 505-534; Сабрі Е. єї а), "Майте Немівемв Містовіоіоду" (2013), Мої. 11, рад. 648-655.
Ідентифікували 269 гетерозиготних мутацій (знайдених у генах, присутніх у більше, ніж одній копії) у кодуючих ділянках для білків, 92 з яких були у генах, що кодують білки, функція яких відома. З них три мутації впливали на гени, чий білок зв'язаний з компонентами клітинної стінки або мембрани, і тому потенційно залучені до змін їх морфологічних та функціональних характеристик. Зокрема, делеційна мутація стосується гена, який кодує передбачуваний мембраний ліпопротеїн. Друга мутація, з допомогою однонуклеотидної варіації (ЗМУ), яка виробляє зміну однієї амінокислоти в білку, впливає на ген, що кодує ензим, залучений у біосинтез М-ацетилглюкозамініл-фосфатидилінозитолу (сІСМАсС-РІ), перший проміжний продукт на "шляху" "ГФіІ-якоря", тобто гліколіпід, необхідний для прикріплення білків до клітинної стінки.
Третя мутація, також з допомогою однонуклеотидної варіації (5ММ), стосується гена, який кодує білок з активністю хітин-синтази, і тому залучений у синтез хітину (зазначається гомологією як хітин-синтаза 1 дріжджів бЗасспаготусе5 сегемізіає). Також у цьому випадку, не бажаючи посилатися на будь-яку теорію, усі зазначені мутації, навіть гетерозиготні, але зв'язані з гомозиготною формою мутації, що впливає на синтез хітину, можуть співвідноситися з фенотипом різної морфології варіанта жирових дріжджів виду 77іспо5рогоп оіІеадіпозхиз ОЗМ 32508 і визначити глибокі зміни в структурі клітинної стінки, генеруючи агрегати клітин, які легше відокремлюються від водної фази бульйонної культури.
Подальші Таблиця 1 і Таблиця 2 показують мутації, виявлені у геномній ДНК варіанта жирових дріжджів виду Г/споврогоп оіеадіпозхиз ОМ 32508 (Мутант) відносно штаму дикого типу (Дикий тип), які призводять до зміни у послідовності білка. Для кожної мутації показане положення на так званій "зсайоїа", тобто на одній з суміжних ділянок геномної ДНК, яка, зібрана на основі їх нуклеотидної послідовності, дозволяє реконструювати геном. Таблиця 1 і Таблиця 2 також показують: тип мутації: 5ММ "однонуклеотидна варіація", тобто мутація одного нуклеотиду; МММ: "багатонуклеотидна варіація" тобто мутація різних нуклеотидів у послідовності; Інсерція одного або більше нуклеотидів; Делеція одного або більше нуклеотидів; кількість залучених нуклеотидів, нуклеотиди або модифіковані нуклеотиди (з допомогою мутації, інсерції або делеції) відповідно у геномі штаму дикого типу та в геномі варіанта жирових дріжджів О5М 32508. Гомозиготні форми мутації - це ті, що виявляються у генах, присутніх в єдиній копії у геномі (Таблиця 1); гетерозиготні мутації - це ті, які виявляються в генах, присутніх у різних копіях у геномі (Таблиця 2).
Таблиця 1
Зсано!й всапод102 5і2041 . зсаноїд1042 5і769 . . 903 тарріпа р процесинговий білок 45 11111111 1888 М нсерцяї її | - (с г 11111111 898 М нсерцяї її | - (а | гФ БФ 11111111 1899 | 5ММ| 1 | т А 11111111 884 | 85М| 1 ЇЇ т 1 с : РЕБ52 - Субодиниця 2 всапоЇїд1115 5і2е6 086 тарріпа 4180 ЗМУ 1 а т фактора поліаденілювання ; 5516 - Загальний всапоїд1135 5і264 и корепресор зсаноїд1157 5і764 . ССАТАСІ АС-І - Амінооксидаза
Зоттарра |ОО66 нен! 80000 ди . тата - Білок-5- зсайоійт25 5іге33! 8060 ||нсерціяї 1 то ізофенілцистеїн О- 269 тарріпд метилтрансфераза взсаноїд128 5і7627 . РОГ РРІ - Доліхол
Сеотарргя | дееци| 2000 фосфат зсаноїд13З3 5і72е33 71111111. | 624 |ДелецяЇ З | АСТ | - зсаноїд1330 5і762 КІр1 - Важкий ланцюг зсаноїд14 5і7е553 . 111111 8054 5М| 1 | А | с! зсаноЇїд1522 5і723 2-1 3- 11111111 2376 | З8ИМ| 1 | А | с ( 1111111 2388 5ММ| 1 | т 11111111 171697 | 5ММ| 1 | А | г « 11111111 1719307 | 5М| 1 | А | г «- 11111111 3055 особа | - Її 77777771 . изр3ЗО - Убіквітин- зсапо 54 З віге? 633 Інсерція 2 Та | |карбоксил-кінцева 681 тарріпа . гідролаза . Передбачувана зсаноїд1590 5і764 . . 460 тарріпо 1776 Делеція А сато що нітронат- монооксигеназа всапо!д1613 5і2е1 . РВРА - Регулятор зсаноїд1641 5і7е2 . ттатаат . . МІО1 - транспозон Сах зсаноїд1648 5і27е1 . татаста 7 стресостійкість зсаноїд176 5і7644 . ВРБ16-405 рибосомний
Таблиця 1 раає - Еноїл-СоА зсаноїд1772 5і762 . гідратаза, бета- 790 тарріпд 1425 Делеція ссесос окислення жирних кислот всапо!д1833 5і222 . Зігта4 - Сигнальна беотарря | нещи| 100019 рандущя 11111110 719323 |ДелецяЇї 1 | С 1 - | 77777777 77717171. | 982 |ДелецяЇ 6 |АССТОТ - всаноїд214. віге32 срсї - Субодиниця 1 099 тарріпа 542 Делеція 1 т впав язувального ілка . ЗА5б10 - залучений шт тент ЕЕ тарріпд 185 . МРВАЇ 2-2-подібний білок шт тт ЕНН тарріпд азоту . НПІБА - передбачувана 3- тарріпд огеназа . /ПІ-1 - Великий ланцюг шиті тон ЕНН тарріпд с атредуктази
Таблиця 2 62 тарріпо протеїнкізана 064 тарріпа подовження кінця клітини пер втоеня 015 ее 474 тарріпо 086 тарріпа фактора поліаденілювання 111 468 | 5ММ 1 ЇЇ т с 291 тарріпо протеїнкіназа 209 тарріпа 785 тарріпо РбОА 178 тарріпо Ретротранспозон 11111115 | 8ММ | 1 | с А г 71111111 1860 | 85ММ 1 | 9 |А 11111111 1986 | 5ММ | 1 | т | с Щ ФЩщГ ' 11111 в | 5ММ 1 т с 11111101 2778 | ЗМ 1 | т | А Її 11111111 2829 | З8ММ ЇЇ 1 | т | с Щщ 11111110 12370 Пнсерцяїї 1 | - | А Ї 11111111 485 | 5М| 1 | т | с г б
Таблиця 2 11111111 1486 | 5ММ | 1 | т | с 11111110 ло | 8ММ 1 1 1 т с 71111111 з063 | зм 1 | с | т щЩщЩщ г Ф 111111 1308 | 5ММ | 1 | т | с Щ Ф 575 тарріпо 74 тарріпо
Шов во ек г ОО оц 74 тарріпо топоіїзомераза З-альфа зсаноЇїд141 5і7626 21392 ММ 1 а т РХАЇ1 - пероксисомний довголанцюжкових жирних кислот 803 тарріпо
Шан вия ор 468 тарріпа 111110 281 | ММ 2 | СА | ас 17777771111111111117С72С 263 тарріпо комплексу ядерної пори 854 тарріпа Ретротранспозон 11111111 93276 | 8ММ ЇЇ 1 | А | 7 11111110 3219 | 8ММ | 1 ЇЇ т | с щЩщ ' 1111110 23мо | 5ММ і 1 ЇЇ т с 11111110 3536 | з8ММ ЇЇ 1 | с | т: Щщ 11111111 | за882 | ЗМ 1 | 6 | т щЩщ ' 11111111 2629 | ЗМ 1 | А | 7 11111111 3290 | 5ММ | 1 | А | в 11111111 30939 | зм 1 | т | с Щ ФЩщ 11111110 117399 | 5ММ | 1 ЇЇ т с щЩщ' 11111111 3542 | ЗМ 1 | А | в'Ї 11111111 | 3404 | 5ММ | 1 | 9 | А 11111110 320 | 8ММ 1 ЇЇ т с 11111110 зоб | 8ММ 1 ЇЇ т с 11111111 163 |85М 1 | с | а 8 Щ ДФ 11111100 1872 | ЗМ 1 | с | т 1 150 тарріпа 983 тарріпа РНК геліказа 538 тарріпд Ретротранспозон- похідний білок 720 тарріпо білок І.7 зсаноїд17 5і72517 43619 ММ 1 С т Мте!1 метал- ви они мембрана 1 шенні тові 1170 пооееннь 947 тарріпа амінокислоти 739 тарріпа актинового цитоскелету 323 тарріпо цукру
Таблиця 2 962 тарріпа транскрипцією 11111110 710347 | ЗМ 1 1 ЇЇ с 11 т 1111100 лю | 8ММ 1 1 ЇЇ т с 232 тарріпа 526 тарріпо 540 тарріпо 982 тарріпо 099 тарріпо зв'язувальний комплекс 536 ММ 1 С т (важливий під час
Ви стрес) 11111110 543 Пнсерцяї 4 | - || 77777СС7СсС7с7с7сСс2СшСуД 252 тарріпа 594 тарріпа трансляції 471 тарріпо ізомераза 448 тарріпа зсаноЇїд25 5і76496 20734 ММ 1 А а Вапди - Рилізинг- 12 тарріпа фактор гуанінових нуклеотидів зсаноЇїд252 5і7621 12958 Делеція 1 а МУМ51 - Компонент 098 тарріпд комплексу Сас48р, що залучений у контроль якості білків; проявляє цитозольну і ЕК мембранну локалізацію зсаноїд255 5і76е18 4684 ММ 1 А а РІС - біосинтез якоря 966 тарріпд фосфатидилінозитол- глікану зсаноїд260О0 5і7219 4761 Делеція 2 СА Передбачуваний 451 тарріпд анкірин-вмісний ліпопротеїн, залучений у цілісність мембрани 90 тарріпо (носій заліза)
Ше ви лен 71790 908 тарріпа шоку 11111111 6351 Делеця,! 1 | А | - /( 341 тарріпо субодиниця ГП Фази 1
ОЗ тарріпд Монокарбоксилат пермеаза 538 тарріпо 216 тарріпа
Таблиця 2 653 тарріпо 416 тарріпа дегідратаза 45 тарріпа полімерази 157 тарріпо мейозі 402 тарріпо рибосомної РНК 342 тарріпа дегідрогеназа
Ши и 151 ен 342 тарріпа деметилаза 372 тарріпо глюконеогенезу 357 тарріпо Рибонуклеопротеїн зсаноїд385 5і7614 13792 ММ 1 С А МЕНІ - 962 тарріпд Мітохондріальний фактор елонгації 14 тарріпо транспорт 428 тарріпо трансляції 28 тарріпа теплового шоку 321 тарріпа елонгації транскрипції
Модифікацію морфології клітин варіанта жирових дріжджів виду /споз5рогоп оіеадіповзив
ОМ 32508, порівняно зі штамом дикого типу, перевіряли у різних експериментах, деякі з яких описані в прикладах, поданих нижче, де зазначену модифікацію виявляли як під оптичним мікроскопом, так і з допомогою проточної цитофлуориметрії. До того ж, були визначені виробництво біомаси і кількість ліпідів, накопичених упродовж процесу отримання ліпідів відповідно до даного винаходу. Нарешті, були встановлені в'язкість і здатність до осідання (тобто, фактор концентрації) бульйонної культури, отриманої від зазначеного способу у різний час від інокуляції.
Варіант жирових дріжджів виду Г//спозрогоп оігадіпозхих ОЗМ 32508, об'єкт даного винаходу, отримували з допомогою процесу мутагенезу, що здійснюється шляхом піддавання клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду 77спо5рогоп оіеадіпохих АТСС 20509 впливу ультрафіолетового (УФ) випромінювання із довжиною хвилі у діапазоні від 230 нм до 260 нм.
Мутагенез з допомогою піддавання впливу УФ-випромінювання може здійснюватися відповідно до попереднього рівня техніки, як описано, наприклад, у М/іпеіоп ЕК. еї аїЇ, "Ситепі Ргоїосої5 іп
Моїесшіаг Віоіоду" (2008), 0О01:10.1002/0471142727.тр1302582, дойп УМПеу 4 боп5. Наприклад, зазначений мутагенез може бути здійснений шляхом піддавання клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду /лспо5рогоп оІеадіпогиз АТСС 20509, вміщених у чашу Петрі на середовище, отверджене агаром, впливу джерела Уф-випромінювання (представленого щонайменше однією лампою потужністю у діапазоні від 8 Ват до 15 Ват, з довжиною хвилі у діапазоні від 230 нм до 260 нм), розміщеного на відстані від чаші Петрі у діапазоні від 10 см до 50 см, протягом часу у діапазоні від 5 секунд до 5 хвилин.
Як зазначено вище, даний винахід також стосується способу виробництва ліпідів шляхом культивування зазначеного варіанта жирових дріжджів виду /спо5рогоп о!еадіпозив.
Тому додатковим об'єктом винаходу даного винаходу є спосіб виробництва ліпідів, який включає: отримання інокуляту, що містить щонайменше один варіант жирових дріжджів виду
Тпспозрогоп оівгадіпозиз ОМ 32508;
подавання зазначеного інокуляту до пристрою для культивування з отриманням бульйонної культури; піддавання зазначеної бульйонної культури відділенню з отриманням водної суспензії концентрованої жирової клітинної біомаси, яка містить ліпіди і водну фазу; вилучення внутрішньоклітинних ліпідів, накопичених всередині дріжджових клітин.
Для способу відповідно до даного винаходу, зазначений пристрій для культивування може бути, наприклад, біореактором, а зазначене відділення може здійснюватися, наприклад, шляхом центрифугування.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб може здійснюватися при температурі у діапазоні від 10 "С до 40 "С, переважно у діапазоні від 207 до 35 76.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб може здійснюватися протягом часу у діапазоні від 40 годин до 200 годин, переважно у діапазоні від 80 годин до 150 годин.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб може здійснюватися при аеробних умовах.
Зазначені аеробні умови можуть приводитися в дію, наприклад, з допомогою вдування стерильного повітря до пристрою для культивування і шляхом змінного перемішування, застосовується зазначене перемішування, яке залежить від типу пристрою для культивування.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб може здійснюватися при рН у діапазоні від 4,5 до 7,0, переважно у діапазоні від 5,0 до 6,5. З метою підтримування рН у бажаних діапазонах до культурального середовища може додаватися водний розчин щонайменше однієї неорганічної основи, наприклад, гідроксиду натрію (Ммаон), гідроксиду калію (КОН), дигідроксиду кальцію (СасОнН)гі, гідроксиду магнію МО(ОН)г| або їх суміші, переважно гідроксиду калію (КОН), або водний розчин щонайменше однієї неорганічної кислоти, такої як, наприклад, фосфорна кислота (НзРО4), сірчана кислота (Не5О54), хлористоводнева кислота (НСІ), або їх суміш, переважно сірчана кислота (Н25О4), у таких кількостях, щоб отримати бажаний рн.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб може здійснюватися, починаючи з інокуляту у кількості у діапазоні від 195 до 595 (об./06.) від загального об'єму культурального середовища, отриманого із попередньої культури зазначеного варіанта жирових дріжджів виду /спо5рогоп оІеадіпохихє ЮБМ 32508, може здійснюватися у тому ж самому культуральному середовищі протягом часу у діапазоні від 6 годин до 24 годин.
Зазначена попередня культура, своєю чергою, може бути інокульована з допомогою попередньої культури, або може бути інокульована, починаючи зі зразка зазначеного варіанта жирових дріжджів виду 77іспо5рогоп оІеадіпозхиз ОМ 32508, який утримували при -80 С у суспензії, яка містить 15 95 (об./об.) гліцерол.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб може здійснюватися у культуральному середовищі, що містить глюкозу як джерело вуглецю і сульфат амонію (МНа4)25054)| як джерело азоту.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб може здійснюватися при культивуванні з підживленням.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб, через певний час у діапазоні від 15 годин до 25 годин після інокуляції, може здійснюватися додатково при культивуванні з підживленням, переважно протягом часу у діапазоні від 25 годин до 175 годин, більш переважно у діапазоні від 65 годин до 125 годин, шляхом додавання додаткового джерела азоту, такого як, наприклад рідкий кукурудзяний екстракт, дріжджовий екстракт, сульфат амонію, сечовина, у такій кількості, щоб додати до бульйонної культури загальну кількість азоту у діапазоні від 0,5 г/л до 5 г/л.
Відповідно до переважного варіанта здійснення даного винаходу, зазначений спосіб, через певний час у діапазоні від 15 годин і 25 годин після інокуляції, може здійснюватися додатково при культивуванні з підживленням, переважно протягом часу у діапазоні від 25 годин до 175 годин, більш переважно у діапазоні від 65 годин до 125 годин, шляхом додавання водного розчину глюкози, так щоб мати незмінну концентрацію глюкози у бульйонній культурі у діапазоні від 25 г/л до 50 г/л.
Ріст клітин під час культивування може вимірюватися з допомогою спектрофотометричних методів, які визначають мутність або оптичну густину (00) зразка бульйонної культури при 660 нм (ОЮОвво). бо Вкінці вищезазначеного способу використовувані клітини варіанта жирових дріжджів виду
Тисповрогоп оІеадіпозих ОМ 32508 можуть бути відділені від бульйонної культури з допомогою таких способів, відомих у галузі техніки, як, наприклад, фільтрування, віджимання на фільтр- пресі, мікрофільтрування або ультрафільтрування, центрифугування, переважно з допомогою центрифугування. Переважно, зазначене центрифугування може здійснюватися протягом часу у діапазоні від 5 хвилин до 30 хвилин, переважно у діапазоні від 15 хвилин до 25 хвилин, зі швидкістю обертання у діапазоні від 3000 об./хв. до 9000 об./хв., переважно у діапазоні від 4000 об./хв. до 8000 об./хв. Потрібно зазначити, що експлуатаційні режими, показані для центрифугування, пов'язані з процесом, що здійснюється в лабораторних масштабах: у випадку промислового процесу, у якому, як правило, застосовуються центрифуги безперервної дії, спеціаліст у галузі техніки зможе адаптувати зазначені експлуатаційні режими.
Концентрація отриманої жирової клітинної біомаси може вимірюватися у грамах на літр бульйонної культури, що встановлює суху масу клітин жирових дріжджів зразка бульйонної культури відомого об'єму, взятого при заданих інтервалах і вкінці зазначеного способу. Зокрема, "суха маса" жирової клітинної біомаси означає масу клітин, вміщених у відомому об'ємі бульйонної культури, встановлену шляхом зважування вищезазначених клітин після видалення усього вмісту води шляхом термообробки у вентильованій печі при 105 "С до постійної маси (приблизно 24 години).
З метою відновлення ліпідів отримана жирова клітинна біомаса може піддаватися клітинному лізису відповідно до процесів, відомих у галузі техніки і описаних, наприклад, у
Міжнародній заявці на патент МЛО 2014/102254, включно, наприклад, з термообробкою у реакторі під тиском, механічною обробкою гомогенізатором, або мікрохвильовою обробкою.
Вкінці зазначеного клітинного лізису ліпіди можна відновити з отриманої суспензії з допомогою виділення полярними або неполярними органічними розчинниками, відповідно до процесів, відомих у галузі техніки та описаних, наприклад, у Міжнародній заявці на патент УМО 2014/102254.
Виробництво ліпідів з допомогою жирових дріжджів вкінці способу за даним винаходом може бути виміряне колориметричними способами, відомими у галузі техніки, безпосередньо у зразках суспензій дріжджових клітин, наприклад з використанням сульфо-фосфо-ваніліну, наприклад, набору "Тоїаї Ііріає - зирпо-рпо5рпо мапійпе", що продається Зріпгеасі 5.А.)О., Сіга.
Запіа Соіота, 7 Е-17176 51. Евієме ФЧеп Ваз (СІ), Іспанія.
Крім того, кількість вироблених ліпідів може визначатися з допомогою гравіметричних способів на фракції, екстрагованій сумішами органічних розчинників, наприклад з допомогою хлороформ:метанол 2:1, об./об. як описано у Еоїсп 4. еї аЇ, "Те Удошгпаї ої Віоіодіса! Спетівігу" (1957), мої!. 226, рад. 497-509; або екстрагують з допомогою п-гексан:ізопропанол 3:2 об./об., як описано у Нага А. еї аї, "Апаїуїїса! Віоспетівігу" (1978), МоІ. 90, рад. 420-426, зі зразків ліофілізованої біомаси.
Тому, щоб оцінити виконання щодо накопичення ліпідів, у процесі за даним винаходом, варіанта жирових дріжджів виду Т//спозрогоп оіеадіпозиз ОМ 32508, відносно штаму дикого типу, у подальших прикладах вкінці зазначеного способу встановлювали суху масу біомаси (виражену у г/л) і кількість ліпідів (виражену у г/л) з допомогою способів, перерахованих вище, і обчислювали процентне відношення між цими двома параметрами.
Потрібно зазначити, що, відповідно до об'єкту способу за даним винаходом, варіант виду
Тисповрогоп оІеадіпозхиз ОМ 32508, відносно штаму дикого типу того ж виду, дозволяє підвищити продуктивність до 50 95 та підвищити титр ліпідів, які повинні бути отримані, до 70 9.
Потрібно зазначити, що, відповідно до об'єкту способу за даним винаходом, бульйонна культура, отримана вкінці зазначеного способу з допомогою варіанта жирових дріжджів виду
Тпспозрогоп оІеадіпозхих ОМ 32508, з еквівалентною концентрацією клітин жирових дріжджів і вмістом ліпідів, має в'язкість від 2 до 10 разів нижчу відносно в'язкості бульйонної культури, отриманої з допомогою штаму дикого типу жирових дріжджів виду Т7споз5рогоп оіеадіпо5ив
АТСС 20509, здійсненої при тих же експлуатаційних режимах.
Ліпідну фракцію аналізували з допомогою технологій хроматографії, наприклад з допомогою газової хроматографії або з допомогою високоефективної рідинної хроматографії («НРІС) відповідно до способів, відомих у галузі техніки.
З допомогою зазначених аналітичних методів було виявлено, що ліпіди, накопичені у клітинах жирових дріжджів, обидва, і варіант, і штам дикого типу, 9095 представлені тригліцеридами, переважно складними ефірами гліцеролу з жирними кислотами, які мають від 8 до 24 атомів вуглецю, такими як, наприклад, пальмітинова кислота, стеаринова кислота, олеїнова кислота і а-лінолева кислота.
Інші ліпіди, які можуть бути присутніми, є: фосфоліпіди, моногліцериди, дигліцериди, вільні бо жирні кислоти, або їх суміш.
Ліпіди, отримані відповідно до об'єкту способу даного винаходу, переважно можуть застосовуватися як проміжні продукти синтезу, зокрема у так званому секторі "екологічно безпечної хімії". Крім того, вони можуть піддаватися переетерифікації в присутності щонайменше одного спирту, який має від 1 до 4 атомів вуглецю, переважно метанолу або етанолу, і щонайменше одного кислотного або основного каталізатора, щоб виробляти гліцерол і алкілові складні ефіри, зокрема метилові складні ефіри або етилові складні ефіри ("біодизельне паливо").
Альтернативно, зазначені ліпіди можуть піддаватися гідрогенізації/деоксигенуванню в присутності водню і щонайменше одного каталізатора, щоб виробляти "зелене дизельне паливо". Процеси гідрогенізації/деоксигенування відомі у попередньому рівні техніки та описані, наприклад, у Європейській заявці на патент ЕР 1,728,844.
Для того, щоб реалізувати даний винахід на практиці та проілюструвати його більш чітко, нижче наведено кілька необмежувальних прикладів.
ПРИКЛАД 1 (отримання варіанта жирових дріжджів виду 7/спов5рогоп оіІеадіпозиз ОМ
З2508)
Приклад застосування способу отримання варіантів штаму дикого типу виду Т/спозрогоп оІеадіпозгиз АТОСС 20509 наданий нижче, що призводить до отримання варіанта жирових дріжджів виду Т/спо5рогоп оІеадіпозих, поданого при Лейбніц-Інституті ОЗМА, з депозитним номером ЮО5М 32508. У цьому прикладі, випадковий мутагенез був отриманий шляхом УФф- випромінювання.
Для цієї мети зразок клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду гіспо5рогоп оІеадіпозхиз АТСС 20509 інокулювали у колбу, що містить середовище "УМЕРО" (дріжджовий екстракт 10 г/л, пептон 10 г/л, глюкоза 20 г/л): колбу вміщували в інкубатор з перемішувальним механізмом, при 30 "С, на одну ніч. Потім, клітини збирали шляхом центрифугування при 4000 об./хв. упродовж 5 хвилин, відмивали у стерильній воді, тоді розбавляли 1:10 у стерильній воді і висівали на чаші Петрі, що містять тверде поживне середовище "В" для ліпогенезу (агар 20 г/л, глюкоза 50 г/л, сульфат амонію ((МНа4)2504| 1 г/л, дріжджовий екстракт 1 г/л, дигідрофосфат калію (КНегРОзі 1 г/л, гептагідрат сульфату магнію |ІМаЗО»:7НгО) 0,05 г/л, хлорид натрію (масі) 0,01 г/л, кальцію хлорид дигідрат (СасСі»:2Н2О1 0,01 г/л), щоб мати близько 100 колоній на чашу.
Зо Чаші піддавали впливу джерела ультрафіолетового випромінювання, представленого 15
Ват УФ-лампою (з довжиною хвиль 254 нм), розміщеного на відстані 10 см, протягом часу, що дорівнює 40 секунд, так щоб отримати залишковий рівень життєздатності 10 95. Потім, чаші інкубували при 30 "С, впродовж 4 днів, поки колонії не досягали достатнього розміру для підрахунку. Після мутагенезу була вибрана колонія з нерівними та зубчастими краями, що відповідають варіанту жирових дріжджів виду Гспо5рогоп оІеадіпохиє ОМ 32508, яку знову висівали на чаші Петрі, які містять вищезазначене тверде поживне середовище "В" для ліпогенезу.
Для порівняльних цілей, деякі чаші не піддавали мутагенезу.
Фігура 1 показує: (А): фото чаші Петрі, яку не піддавали мутагенезу, у якій можна побачити, що колонії штаму дикого типу жирових дріжджів виду Г/спо5рогоп оІеадіпохих АТОС 20509 мають круглу форму і блискучі та слизисті на вигляд; (В) фото чаші Петрі, на якому можна побачити, що колонії варіанта жирових дріжджів виду
Тисповрогоп оігегадіпозих О5М 32508 мають нерівні та зубчасті краї та не-блискучі на вигляд.
ПРИКЛАД 2 (модифікація морфології клітин варіанта жирових дріжджів виду Гспо5рогоп оІвадіпозиз О5М 32508: спостереження під оптичним мікроскопом)
Морфологічне різноманіття між клітинами штаму дикого типу жирових дріжджів виду
Тпспозрогоп оІеадіпозхих АТСС 20509 і клітинами варіанта жирових дріжджів виду Тлспо5рогоп оІвеадіпозиз О5М 32508 оцінювали, застосовуючи оптичний мікроскоп.
Для цієї мети зразок клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду гіспо5рогоп оіІеадіпохиз АТСС 20509 і зразок клітин варіанта жирових дріжджів виду спо5рогоп оІеадіпозхиз ЮЗМ 32508 інокулювали у двох різних колбах, у середовищі "ТЕРО" (дріжджовий екстракт 10 г/л, пептон 10 г/л, глюкоза 20 г/л): колби вміщували в інкубатор з перемішувальним механізмом, при 30 "С, на одну ніч. Потім, з кожної колби забирали аліквоту бульйонної культури, вміщували на предметне скло та спостерігали під оптичним мікроскопом зі збільшенням 400Х (Фігура 2).
З Фігури 2 можна бачити, що: (А): клітини штаму дикого типу жирових дріжджів виду Г/іспоз5рогоп оІєадіпозиз АТОС 20509 овальної форми або трохи видовжені, знаходяться у фазі активного відтворення і бруньки бо відокремлюються правильно вкінці процесу брунькування;
(В): клітини варіанта жирових дріжджів виду /спо5рогоп оІеадіпохиз ЮЗМ 32508 дуже видовжені та неправильно завершують процес брунькування і мають тенденцію утворювати агрегати.
Потім, аліквоту клітин, що походять з кожних попередніх культур, переносили у дві різні колби, у рідке середовище "В" для ліпогенезу (глюкоза 50 г/л, сульфат амонію (МН.)2504 1 г/л, дріжджовий екстракт 1 г/л, дигідрофосфат калію ІКНгРОЗ| 1 г/л, гептагідрат сульфату магнію
ІМа5О»4:7НгО 0,05 г/л, хлорид натрію (Масі| 0,01 г/л, кальцію хлорид дигідрат (Сасі»:2Н2О1 0,01 г/л), так щоб отримати густину клітин 0,1 ОЮвво/мл: колби вміщували в інкубатор з перемішувальним механізмом, при 30 "С, на 96 годин. Потім, з кожної колби брали аліквоту бульйонної культури, вміщували на предметне скло і спостерігали під оптичним мікроскопом зі збільшенням 400Х (Фігура 3).
З Фігури З можна бачити, що: (А): клітини штаму дикого типу жирових дріжджів виду Г/іспоз5рогоп оІєадіпозиз АТОС 20509 мають округлу форму і виглядають як окремі клітини; (В): клітини варіанта жирових дріжджів виду 77/спов5рогоп оІеадіпозхиз ЮЗМ 32508 більш видовжені та схильні утворювати дублети та агрегати.
ПРИКЛАД 3 (модифікація морфології клітин варіанта жирових дріжджів виду ГПспо5рогоп оіІеадіпозхих ОМ 32508: вивчення з допомогою проточної цитофлуорометрії)
Морфологічне різноманіття між клітинами штаму дикого типу жирових дріжджів виду
Тисповрогоп оІєадіпозиз АТОС 20509 і клітинами варіанта жирових дріжджів виду 7//спозрогоп оІеадіпозиз ОМ 32508 аналізували якісно та кількісно на рівні окремих клітини з допомогою проточної цитофлуорометрії. Зазначений аналіз проводився, як зазначено в: Сипазекега Т. 5. єї а), ""піегпайопаї! дошгпаї ої осад Місторіоіоду" (2003), Мої. 85, Із5це 3, раа. 269-279; Стопіп ). Р. еї а!ї, "«"дитаї ої Арріїєд Місторіоіоду" (2010), Мої. 108, І55йе 1, рад. 1-16. Застосовуваний проточний цитофлуориметр (ВО Ассигі Сб ріи5) був оснащений аргоново-іонним лазером, який випромінює при 488 нм. Вимірювання здійснювалися в цілому на 20000 подій з потоком вибірки зразка, що дорівнює 35 мкл/хв.
Для цієї мети зразок клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду гіспо5рогоп оіІеадіпохиз АТСС 20509 і зразок клітин варіанта жирових дріжджів виду спо5рогоп
Зо оІеадіпозхиз Ю5БМ 32508 інокулювали у дві різні колби, у середовище "МЕРО" (дріжджовий екстракт 10 г/л, пептон 10 г/л, глюкоза 20 г/л) і збирали після досягнення експоненційної фази росту (10 ОЮвво). До набуття параметрів, зазначених нижче, клітини розбавляли у відфільтрованій воді при концентрації 105 клітин/мл: зразки, розбавлені таким чином, аналізували.
Для цієї мети були взяті до уваги параметри "Пряме розсіювання" (ЕС) та "Бічне розсіювання" (5502). Параметри ЕС дозволяють охарактеризувати популяцію на основі розмірів і стану агрегації окремих клітин, оскільки параметр 55 позначає їх внутрішньоклітинну гранулярність/щільність: на останній параметр впливає наявність гранул на цитоплазматичному рівні і розмір клітинних мембран.
Аналізуючи графіки дисперсії, надані на Фігурі 4, можна відзначити відмінності розподілу популяції штаму дикого типу жирових дріжджів виду 7гіспо5рогоп оІеадіпозиз АТОС 20509 (А.) і варіанта жирових дріжджів виду Т//сповзрогоп оІеадіпохиз ЮБМ 32508 (С), як з точки зору значення ЕЗС, так і значення 55(С2. Детально, графіки гістограми підкреслюють, що розподіл популяції штаму дикого типу жирових дріжджів виду /гіспо5рогоп оігадіпозиз АТОС 20509 (В.) більш гомогенний, маючи на увазі розмір, оскільки у випадку варіанта жирових дріжджів виду
Тисповрогоп оІвгадіпозхиз ОМ 32508 розподіл є більш гетерогенним (0.). Порівнюючи графіки, надані у В. та О0., можна також відзначити "зсув" вправо у значенні Е5С популяції, що означає не лише більший розмір клітин варіанта жирових дріжджів виду Т/іспо5рогоп оіІеадіпозиз О5М 32508 відносно штаму дикого типу жирових дріжджів виду 7гіспо5рогоп оівгадіпозхиз АТОС 20509, а й присутність агрегату клітин. Наявність цих агрегатів підтверджується також зображеннями, зібраними під мікроскопом |Фігура 2 (В).
Середні значення параметрів Е5С і 55Х показані у Таблиці З та показані як довільні одиниці (а.ш.). Порівнюючи значення параметра ЕЗС, можна зробити висновок, що варіант жирових дріжджів виду Т/іспо5рогоп оІеадіпозхиз Ю5БМ 32508 має більші розміри порівняно зі штамом дикого типу жирових дріжджів виду 77/спо5рогоп оіеадіпозих АТОС 20509. Також спостерігається збільшення внутрішньоклітинної гранулярностілцільності, позначене параметром 5565.
Відповідно до значень ЕС і 55С, також наданий Коефіцієнт варіації (СМ) (у дужках): цей параметр позначає розкидання значень у популяції, а отже, позначає ступінь її однорідності.
Таблиця З 11111117 АТОСгоБОЮЄ | 77 о5М 32508
На завершення, аналізи, проведені з допомогою проточної цитофлуорометрії, показують, що морфологія і внутрішньоклітинна структура варіанта жирових дріжджів виду Гспо5рогоп оІвеадіпозиз ОМ 32508 дуже відрізняються від таких штаму дикого типу жирових дріжджів виду
Тпспозрогоп оівадіпозиз АТСС 20509, з яких він походить.
ПРИКЛАД 4 (генотипічна характеристика варіанта жирових дріжджів виду /іспо5рогоп оІеадіпозих ОМ 32508)
У цьому прикладі описаний процес характеризації варіанта жирових дріжджів виду
Тисповрогоп оІеадіпохих ЗМ 32508 з допомогою секвенування геномної ДНК та біоїінформаційного аналізу присутніх мутації порівняно з послідовністю геномної ДНК штаму дикого типу жирових дріжджів виду Г/спо5рогоп оІеадіпозиз АТСС 20509, з якого він походить.
Для цієї мети геномну ДНК витягували з культур обох штамів (варіанта жирових дріжджів виду ТПисповрогоп оіІеадіпозхиз ОМ 32508 і штаму дикого типу жирових дріжджів виду
Тпсповрогоп оІєадіпозиз АТОС 20509), залишали у середовищі "ТЕРО" (дріжджовий екстракт 10 г/л, пептон 10 г/л, глюкоза 20 г/л) на одну ніч, і очищували з допомогою комерційного набору
ОМеавзу Віоса 8. Тізвце КИ Бу Оціадеп (саї. Мит 69504), слідуючи інстукціям виробника.
Системою, що застосовувалася для секвенування, є ПШитіпа Нізед2500. Послідовності
ЕАБТО генерували з допомогою системи Шитіпа Савзама, версії 1.8.3. Якість секвенування перевіряли з допомогою Шитіпа Спавзійу, а потім - з допомогою ЕА5ТОС версії 0.10.0. Якість секвенування покращували, застосовуючи "Тгіт зедиепсез" версії 8.5.1. Фрагменти, згенеровані таким чином, збирали у суміжні ділянки ("контиг"), застосовуючи параметр "Ое помо аззетрбіу" програми СІ 5 Сепотіс5 УмМогКкрепсі версії 8.5.1, та переглядали з допомогою Ріїоп версії 1.8, як вказано у УмаїКег В. 5. еї аї, у "Ріїоп: ап іпієдгаїесй 00! ог сотргепепвіме тістобіа! магіапі аеїтесійп апа депоте аззетбріу ітргометепі"» "Ріоб5 Опе" (2014), Мом. 19, 9(11), е112963; 0О1:10.1371/Лоцтпаї.ропе.0112963. "Контиги" збирали у "суперконтиги", застосовуючи 55РАСЕ Ргетішчт 5сапоїдег версії 2.3, як вказано у Воеєїгег М. еї аї, у "Зсаноїдіпд рге-аззетбрієй сопіїдв ибзіпа 55РАСЕ", "Віоіптоптаїйісв" (2011), Реб. 15, 27(4):578-9, доі:10.1093/ріоіпгоптпаїіс5/01д683, Ериб 2010 Оес. 12.
Зо "Гепи" закривали, застосовуючи Саргіїег версії 1.10, як вказано у Воєїгег М. еї аї, у "Тожага аітові сіобей депотев5 мйй СарЕйег, "Сбепоте Віоюду" (2012), дип. 25, 13(6):А85б6, рО110.1186/д90-2012-13-6-г56.
Анотація геному зроблена з допомогою Юаїаразе РгтокККа Сепоте Зувіеєт (пер://місбіоіптогтаїйіс5.сот/) і з допомогою бази даних ЛОСИЗТИЗ м3.0.1
Аналіз послідовностей дозволяв ідентифікувати 2177 суміжних ділянок ("контиг") розмірів, які варіюються між 119195 та 301 пар основ (п.о.), загалом 19,601,063 пар основ (п.о0о.). Це значення відповідає розміру геномної ДНК дріжджів, філогенетично схожих до виду
Тисповрогоп, тому вважається, що отримані бібліотеки представляють повний геном варіанта жирових дріжджів виду Ггіспо5рогоп о!Іеадіпозиз ЮОМ 32508, і які відповідають штаму дикого типу жирових дріжджів виду /7спо5рогоп о/Іеадіпохиз АТСС 20509, з якого походять.
Послідовності двох геномних ДНК порівнювали одна з одною, застосовуючи програмне забезпечення "Мар Кеадз іо Кеїегепсе" та "Оцаїйу-базей Магіапі Оегесіоп" від СІ Сбіо.
Ідентифіковані мутації підтверджувалися шляхом перевірки існування в обох напрямках секвенування та, внаслідок цього, визначення точності через значення "рпгеа".
Загалом, у геномній ДНК варіанта жирових дріжджів виду /пспо5рогоп оІеадіпозхиз ОМ 32508 були підкреслені 647 мутацій (що містять заміни, делеції та інсерції нуклеотидів): 131 мутація призводить до зміни у послідовності відповідного білка, і вони показані у Таблиці 1 і
Таблиці 2.
ПРИКЛАД 5 (чутливість варіанта жирових дріжджів виду 77іспо5рогоп оіеадіпозиз ОМ 32508 до антибіотика каспофунгіну)
У цьому прикладі оцінювали чутливість варіанта жирових дріжджів виду лспо5рогоп оІеадіпозиз Ю5М 32508 до антибіотика каспофунгіну. Насправді, як описано у Сагсіа |. еї аї, "ВМО Сепотісв" (2015), 0О01:10.1186/512864-015-1879-4, мутанти дефектного грибка у синтезі хітину показують більшу чутливість до антибіотика каспофунгіну. Тому, у світлі результатів геномного аналізу варіанта жирових дріжджів виду //спов5рогоп оіеадіпозхих ОМ 32508, який підкреслив присутність мутацій, які впливають на гени, що кодують білок з активністю хітинсинтази, була оцінена чутливість до цього антибіотика.
Для цієї мети зразок клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду гіспо5рогоп оіІеадіпохиз АТСС 20509 і зразок клітин варіанта жирових дріжджів виду спо5рогоп оІеадіпозхиз Ю5БМ 32508 інокулювали у дві різні колби, у середовище "МЕРО" (дріжджовий екстракт 10 г/л, пептон 10 г/л, глюкоза 20 г/л): колби вміщували в інкубатор з перемішувальним механізмом, при 30 "С, на одну ніч. Потім клітини збирали шляхом центрифугування при 1500 г упродовж 5 хвилин, відмивали у стерильній воді, тоді ресуспендували у 1 мл стерильної води, отримуючи суспензію, яку висівали на чаші Петрі, що містить тверде поживне середовище "МЕРО" (агар 20 г/л, дріжджовий екстракт 10 г/л, пептон 10 г/л, глюкоза 20 г/л), яке містить різні концентрації каспофунгіну: 30 нг/мл, 60 нг/мл, 90 нг/мл, 120 нг/мл. На зазначені чаші наносили краплі 10 мкл зазначеної суспензії, розбавляли у стерильній воді так, щоб вони містили приблизно 105, 107, 103, 102 ї 10 клітин. Чаші інкубували протягом З днів при 30 "С, щоб дозволити ріст клітин.
Результати різної чутливість були значно більш помітними у середовищі "«ЕРО" з 120 нг/мл каспофунгіну (Фігура 5). Варіант жирових дріжджів виду Г/спо5рогоп оіеадіпозхих ОМ 32508, як і те, що відбувається зі штамами дефектного грибка при синтезі хітину, більш чутливий до штаму дикого типу жирових дріжджів виду Г/іспо5рогоп оІеадіпохих АТСС 20509, показуючи нижчу здатність до росту в присутності каспофунгіну, а отже, підтверджуючи його дефект при синтезі хітину.
ПРИКЛАД 6 (культура для виробництва ліпідів у біореакторі)
У цьому прикладі оцінювали ріст та накопичення ліпідів клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду Т/спо5рогоп оІеадіпозиз АТОС 20509 і клітин варіанта жирових дріжджів виду
Тпспозрогоп оівадіпозиз ОМ 32508.
Для цієї мети зразок клітин штаму дикого типу жирових дріжджів виду гіспо5рогоп оіІеадіпохиз АТСС 20509 і зразок клітин варіанта жирових дріжджів виду спо5рогоп оІеадіпозхиз ОЗМ 32508 інокулювали у дві різні 500 мл колби, у 100 мл середовища "УЕРО" (дріжджовий екстракт 10 г/л, пептон 10 г/л, глюкоза 20 г/л): колби вміщували в інкубатор з перемішувальним механізмом, при 30 "С, на одну ніч.
Зо Отримані клітинні суспензії застосовували, щоб окремо інокулювати 20 літрові біореактори, в які розміщували 6 л рідкого середовища для ліпогенезу (глюкоза 100 г/л, рідкий кукурудзяний екстракт 50 г/л, дріжджовий екстракт 2 г/л, дигідрофосфат калію І(КНегРОЗ4)і 6 г/л, гептагідрат сульфату магнію |Ма95О»: 7НегО) 0,3 г/л, хлорид натрію ІМасі| 0,06 г/л, кальцію хлорид дигідрат
ІСасСі»:2Н2О1 0,06 г/л).
Об'єм інокуляту для кожного штаму є таким, який необхідний для отримання приблизно 6 л клітинної суспензії, яка має 0,5 ОЮвво.
Ріст відбувався при аеробних умовах завдяки нагнітанню повітря і змінного перемішування між 600 об./хв. і 900 об./хв., модульованого потоком повітря так, щоб підтримувати концентрацію розчиненого кисню (0О2), що дорівнює 30 905, значення насичення, і при рн приблизно 5,0, що підтримується з допомогою додавання, коли потрібно, кількох крапель розчину КОН 5 М або Нг50» 10 95 (об./о6.).
Спосіб здійснювали у режимі періодичного культивування протягом перших 20 годин. Потім і аж до 24 годин забезпечували подавання азоту, тобто рідкого кукурудзяного екстракту (1,25 г/л) і сульфату амонію (5,5 г/л). З 24 години до завершення способу подали 600 г/л розчину глюкози, щоб підтримувати константу концентрації глюкози при приблизно 30 г/л впродовж усього процесу (загалом, 90 годин).
Після 90 годин росту зразок бульйонної культури відбирали з обох біореакторів і визначали наступні значення, як описано вище: - штам дикого типу жирових дріжджів виду Г/спо5рогоп оіІеадіпозхиз АТСОС 20509 досягнув концентрації клітин 89 г/л (тобто кількість біомаси, виражена як суха маса у клітинах, у г на літр культури), що містить 47 956 за масою ліпідів (тобто кількість накопичених ліпідів, виражена як процентне відношення між масою ліпідів і загальною сухою масою), що дорівнює загалом 42 г/л (тобто кількість накопичених ліпідів, виражена як концентрація ліпідів у г/л)у; максимальна продуктивність становила 0,52 г/л/год. ліпідів, із загальним виходом 0,17 г ліпідів на г витраченої глюкози; - варіант жирових дріжджів виду /гіспо5рогоп оіеадіпохих О5М 32508 досягнув концентрації клітин 111 г/л (тобто кількість біомаси, виражена як суха маса у клітинах, у г на літр культури), що містить 60 95 за масою ліпідів (тобто кількість накопичених ліпідів, виражена як процентне відношення між масою ліпідів і загальною сухою масою), що дорівнює загалом 67 г/л (тобто бо кількість накопичених ліпідів, виражена як концентрація ліпідів у г/л); максимальна продуктивність становила 0,77 г/л/год. ліпідів, із загальним виходом 0,20 г ліпідів на г витраченої глюкози.
ПРИКЛАД 7 (вимірювання в'язкості і здатності до осідання бульйонної культури)
На культурах, отриманих як описано вище у прикладі 6, вимірювали в'язкість та щільність (з допомогою мікровіскозиметра 5іабіпдег ЗМК 3000 Апіоп Рааг, швидкість зсуву 1/1000, при 30 С) і здатність до осідання (з допомогою випробування центрифугуванням, застосовуючи мультишвидкісну центрифугу Тпегто зЗсіепійс ІЕС СІ З1К із кутовим ротором АС 100.10А) з різними періодами інокуляції.
Зокрема, випробування центрифугуванням проводилися шляхом центрифугування аліквот бульйонної культури, що дорівнюють 10 мл, при 5000 об./хв. упродовж 10 хвилин та вимірювання фактора концентрації відносно бульйонної культури як такої.
Отримані результати представлені у Таблиці 4 і Таблиці 5.
Таблиця 4
Штам дикого типу жирових дріжджів виду /споврогоп оігадіпозиз АТОС 20509
Час (год.) Суха маса (г/л)| Ліпіди (95) В'язкість (СП) Концентрація 1,044 765 | 8 | 4 | 86 | Той 1.25Х 80. 89 | 47 | 119 | 1040
Таблиця 5
Варіант жирових дріжджів виду Гіспо5рогоп оіеадіпозхихз ОБМ 32508
Час (год.) Суха маса (г/л) Ліпіди (95) В'язкість (СП) Концентрація 1,041 765 | ющ9 | 48 | з0 | 1040 8077111 17716017 477 77771028
Із даних, представлених у Таблицях 4 і 5, можна зробити висновок, що бульйонна культура, отримана від варіанта жирових дріжджів виду 7/спо5рогоп оІеадіпохих ОМ 32508, мала нижчу в'язкість і більшу здатність до осідання, аніж бульйонна культура, отримана від штаму дикого типу жирових дріжджів виду Піспо5рогоп оІєадіпозиз АТОС 20509.
Claims (11)
1. Жирові дріжджі виду Г//лспов5рогоп оіІеадіпозив, задепоновані 17 травня 2017 року в Інституті Лейбніца О5М2 з депозитарним номером ЮО5М 32508, при цьому зазначені жирові дріжджі призначені для виробництва ліпідів.
2. Спосіб виробництва ліпідів, який включає: - отримання інокуляту, який містить щонайменше одні жирові дріжджі виду Тлспо5рогоп оІеадіпозих ОМ 32508; - подавання зазначеного інокуляту до пристрою для культивування з отриманням бульйонної культури; - піддавання зазначеної бульйонної культури відділенню з отриманням водної суспензії концентрованої жирової клітинної біомаси, яка містить ліпіди і водну фазу; - вилучення внутрішньоклітинних ліпідів, накопичених всередині дріжджових клітин.
3. Спосіб виробництва ліпідів за п. 2, де зазначений спосіб: - здійснюють при температурі у діапазоні від 10 до 40 "С, переважно у діапазоні від 20 до 35 С; імабо - здійснюють протягом часу у діапазоні від 40 до 200 годин, переважно у діапазоні від 80 до 150 годин; і/або - здійснюють у аеробних умовах; і/або - здійснюють при рН у діапазоні від 4,5 до 7,0, переважно у діапазоні від 5,0 до 6,5.
4. Спосіб виробництва ліпідів за п. 3, де зазначений спосіб: - здійснюють при температурі у діапазоні від 20 до 35 "С; і/або
- здійснюють протягом часу у діапазоні від 80 до 150 годин; і/або - здійснюють у аеробних умовах; і/або - здійснюють при рН у діапазоні від 5,0 до 6,5.
5. Спосіб виробництва ліпідів за будь-яким із пп. 2-4, де зазначений спосіб здійснюють, починаючи з інокуляту у кількості у діапазоні від 1 до 5 95 (06./06.) від загального об'єму культурального середовища, отриманого від попередньої культури зазначених жирових дріжджів виду Г/спов5рогоп оІеадіпохих ОМ 32508, здійснюють у тому самому культуральному середовищі протягом часу у діапазоні від 6 до 24 годин.
6. Спосіб виробництва ліпідів за будь-яким із пп. 2-5, де зазначений спосіб здійснюють у культуральному середовищі, яке містить глюкозу як джерело вуглецю і сульфат амонію КМНА» ЗО як джерело азоту.
7. Спосіб виробництва ліпідів за будь-яким із пп. 2-6, де зазначений спосіб здійснюють при культивуванні з підживленням.
8. Спосіб виробництва ліпідів за будь-яким із пп. 2-6, де зазначений спосіб через період часу в діапазоні від 15 до 25 годин після інокуляції додатково здійснюють при культивуванні з підживленням протягом часу в діапазоні від 25 до 175 годин, з додаванням щонайменше додаткового джерела азоту, такого як рідкий кукурудзяний екстракт, дріжджовий екстракт, сульфат амонію, сечовина, у такій кількості, щоб додати кількість азоту у діапазоні від 0,5 до г/л, до бульйонної культури.
9. Спосіб виробництва ліпідів за п. 8, де зазначений спосіб через період часу в діапазоні від 15 до 25 годин після інокуляції додатково здійснюють при культивуванні з підживленням протягом часу в діапазоні від 65 до 125 годин, з додаванням щонайменше додаткового джерела азоту, такого як рідкий кукурудзяний екстракт, дріжджовий екстракт, сульфат амонію, сечовина, у такій кількості, щоб додати кількість азоту у діапазоні від 0,5 до 5 г/л, до бульйонної культури.
10. Спосіб виробництва ліпідів за будь-яким із пп. 2-9, де зазначений спосіб через період часу в діапазоні від 15 до 25 годин після інокуляції додатково здійснюють при культивуванні з підживленням протягом часу в діапазоні від 25 до 175 годин, з додаванням водного розчину глюкози, так щоб мати незмінну концентрацію глюкози у бульйонній культурі у діапазоні від 25 до 50 г/л.
11. Спосіб виробництва ліпідів за п. 10, де зазначений спосіб через період часу в діапазоні від до 25 годин після інокуляції додатково здійснюють при культивуванні з підживленням протягом часу в діапазоні від 65 до 125 годин, з додаванням водного розчину глюкози, так щоб мати незмінну концентрацію глюкози у бульйонній культурі у діапазоні від 25 до 50 г/л. Іра аа о о о Де о СВ М ви она ан 5 М о її г У и и и В НН НН С НН и с М и о о и и НИ о кп по І: НН ОО о о : 5 ВН. МОВ о о НК МАННЯ ЕКО ва у Я. 5 ян. о 0 Б г ОП охо ОО МОМ ВН В НН НН КК г ах с о с с її. Б. кий В М М с с ПН о Я с ПОВ нео ан с ВО с С З и и в о ОВ с ки НН а НЕ М (Аз (8)
Фіг. 1 вм ж М і КН КН НК КН єм Мт Мн ць М ОХ ВО Я ОО КО По В я ші ОО УК ОО ОХ ОО МУ ОО ОО ОК и. с си М М ОА п М КО КН ОО МВА МО ОК СОКИ ОХ СОУ ОКУ ОККО КН с с УМХ а КА КО КО Са п. ПОД МАК А ОКО я У ВОК КО А А и КО ОО ММ М ОМ ОА ПК и ОК я ОК в и Я МО М Я ОО В М ОК ОО КК
5. с УМО ОО М У ОО М ОК, ОКО ОХ ОО М с с ох ОКО ОО ОА УМХ ОО У ГА (8)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102017000081383A IT201700081383A1 (it) | 2017-07-18 | 2017-07-18 | Variante di lievito oleaginoso e suo utilizzo per la produzione di lipidi. |
| PCT/IB2018/055301 WO2019016703A1 (en) | 2017-07-18 | 2018-07-17 | VARIANT OF OLEAGINOUS YEAST AND ITS USE FOR THE PRODUCTION OF LIPIDS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA127184C2 true UA127184C2 (uk) | 2023-05-31 |
Family
ID=60990908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA202000379A UA127184C2 (uk) | 2017-07-18 | 2018-07-17 | Жирові дріжджі trichosporon oleaginosus та їх застосування для виробництва ліпідів |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11326192B2 (uk) |
| EP (1) | EP3655521B1 (uk) |
| CN (1) | CN111655838B (uk) |
| BR (1) | BR112020000853A2 (uk) |
| DK (1) | DK3655521T3 (uk) |
| ES (1) | ES2900031T3 (uk) |
| HR (1) | HRP20211939T1 (uk) |
| HU (1) | HUE056868T2 (uk) |
| IT (1) | IT201700081383A1 (uk) |
| MY (1) | MY193244A (uk) |
| PL (1) | PL3655521T3 (uk) |
| RS (1) | RS62716B1 (uk) |
| UA (1) | UA127184C2 (uk) |
| WO (1) | WO2019016703A1 (uk) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111690587B (zh) * | 2019-03-13 | 2022-10-25 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用 |
| EP4204540A1 (en) * | 2020-08-26 | 2023-07-05 | ENI S.p.A. | Oleaginous yeast strain and use thereof for the production of lipids |
| CN112391421A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-02-23 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种通过调节酿酒酵母发酵液总盐含量提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及高产油酿酒酵母 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101434912B (zh) * | 2008-12-12 | 2011-01-19 | 华东理工大学 | 一种产油酵母菌株及其制备生物油脂的方法 |
| CN101955888B (zh) * | 2010-06-25 | 2012-09-26 | 朱笃 | 高产油脂皮状丝孢酵母b3及其ems和紫外线复合诱变选育方法 |
| ITUB20152958A1 (it) * | 2015-08-06 | 2017-02-06 | Eni Spa | Metodo per concentrare una sospensione cellulare comprendente una biomassa mucillaginosa di lieviti oleaginosi. |
-
2017
- 2017-07-18 IT IT102017000081383A patent/IT201700081383A1/it unknown
-
2018
- 2018-07-17 UA UAA202000379A patent/UA127184C2/uk unknown
- 2018-07-17 MY MYPI2020000223A patent/MY193244A/en unknown
- 2018-07-17 RS RS20211545A patent/RS62716B1/sr unknown
- 2018-07-17 WO PCT/IB2018/055301 patent/WO2019016703A1/en unknown
- 2018-07-17 HU HUE18755320A patent/HUE056868T2/hu unknown
- 2018-07-17 ES ES18755320T patent/ES2900031T3/es active Active
- 2018-07-17 PL PL18755320T patent/PL3655521T3/pl unknown
- 2018-07-17 CN CN201880047838.2A patent/CN111655838B/zh active Active
- 2018-07-17 BR BR112020000853-2A patent/BR112020000853A2/pt unknown
- 2018-07-17 EP EP18755320.1A patent/EP3655521B1/en active Active
- 2018-07-17 DK DK18755320.1T patent/DK3655521T3/da active
- 2018-07-17 US US16/631,188 patent/US11326192B2/en active Active
- 2018-07-17 HR HRP20211939TT patent/HRP20211939T1/hr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL3655521T3 (pl) | 2022-02-07 |
| CN111655838A (zh) | 2020-09-11 |
| HRP20211939T1 (hr) | 2022-03-18 |
| BR112020000853A2 (pt) | 2020-07-21 |
| MY193244A (en) | 2022-09-27 |
| HUE056868T2 (hu) | 2022-03-28 |
| US20200149076A1 (en) | 2020-05-14 |
| IT201700081383A1 (it) | 2019-01-18 |
| RS62716B1 (sr) | 2022-01-31 |
| EP3655521B1 (en) | 2021-11-03 |
| EP3655521A1 (en) | 2020-05-27 |
| ES2900031T3 (es) | 2022-03-15 |
| US11326192B2 (en) | 2022-05-10 |
| WO2019016703A1 (en) | 2019-01-24 |
| DK3655521T3 (da) | 2021-12-13 |
| CN111655838B (zh) | 2023-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lee et al. | Basic culturing and analytical measurement techniques | |
| Back et al. | High-throughput fermentation screening for the yeast Yarrowia lipolytica with real-time monitoring of biomass and lipid production | |
| US10889841B2 (en) | Oleaginous yeast variant, method for obtaining thereof and use thereof for lipid production | |
| Manzoor et al. | Mixotrophic cultivation of Scenedesmus dimorphus in sugarcane bagasse hydrolysate | |
| CN101861395A (zh) | 使用细菌生产生物能 | |
| UA127184C2 (uk) | Жирові дріжджі trichosporon oleaginosus та їх застосування для виробництва ліпідів | |
| Tanadul et al. | EMS-induced mutation followed by quizalofop-screening increased lipid productivity in Chlorella sp. | |
| JP2013545491A (ja) | バイオマス加水分解物培地中でのキシロース資化性ザイモモナス・モビリスによるエタノール産生の向上 | |
| JP6446774B2 (ja) | 緑藻の脂質蓄積変異体およびその利用 | |
| Li et al. | Creating a synthetic lichen: Mutualistic co-culture of fungi and extracellular polysaccharide-secreting cyanobacterium Nostoc PCC 7413 | |
| WO2015174588A1 (ko) | 감마선 조사에 의해 바이오매스, 전분 및 지질 함량이 증진된 미세조류 클라미도모나스 레인하드티 변이체 및 이의 용도 | |
| CN109576163A (zh) | 具有增强的β-葡糖苷酶活性的高产里氏木霉菌株 | |
| CN102807958B (zh) | 一种可分泌纤维素酶的菌株及其纤维素酶提取方法与应用 | |
| Deng et al. | Effects of selective medium on lipid accumulation of chlorellas and screening of high lipid mutants through ultraviolet mutagenesis | |
| Nugroho et al. | Isolation and characterization of Botryococcus braunii from a freshwater environment in Tenggarong, Kutai Kartanegara, Indonesia | |
| EP2633026A2 (fr) | Nouvelles souches de microalgues du genre botryococcus et procede de culture en mode mixotrophe desdites microalgues | |
| Pienasthika et al. | A study of the effect of calcium chloride (CaCl2) and pH on the flocculation ability of Saccharomyces cerevisiae (NCYC 1195) | |
| US20230303962A1 (en) | Oleaginous yeast strain and use thereof for the production of lipids | |
| Schlembach | Investigations on the use of defined co-cultures for the consolidated bioprocessing of cellulose to itaconic acid | |
| BR112017013917B1 (pt) | Variante de levedura oleaginosa, método para obtenção desta e uso desta para a produção de lipídeos | |
| CN115287205A (zh) | 一种高耐酸能力的粟酒裂殖酵母菌及其构建方法 | |
| Rasul et al. | Mixotrophic cultivation of Scenedesmus dimorphus in sugarcane bagasse hydrolysate | |
| Viniegra-Gonzalezf | Pectinase-hyperpr oducing mut ants of Aspergillus niger C28B25 for solid-state fermentation of coffee pulp |