BR112020000853A2

BR112020000853A2 - variante de levedura oleaginosa e seu uso para produção de lipídios

Info

Publication number: BR112020000853A2
Application number: BR112020000853-2A
Authority: BR
Inventors: Valentina Rodighiero; Giuliana Franzosi; Concetta COMPAGNO; Claudia Capusoni
Original assignee: Versalis S.P.A.
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2020-07-21
Also published as: HRP20211939T1; IT201700081383A1; PL3655521T3; WO2019016703A1; DK3655521T3; CN111655838A; EP3655521A1; ES2900031T3; HUE056868T2; UA127184C2; CN111655838B; US20200149076A1; RS62716B1; EP3655521B1; MY193244A; US11326192B2

Abstract

A presente invenção refere-se a uma variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus caracterizada por mutações que afetam a síntese da parede celular que altera a morfologia da mesma em relação à cepa de tipo selvagem da mesma espécie. Em particular, graças às referidas mutações, os agregados de células são formados os quais, com relação à cepa de tipo selvagem da mesma espécie, baixam a viscosidade do caldo de cultura, são mais facilmente separáveis do mesmo e, assim, tornam mais fácil a sua recuperação. A referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosustambém é caracterizada por rendimentos de biomassa celular oleaginosa e acumulação intracelular de lipídios que são semelhantes ou até mesmo superiores aos da cepa de tipo selvagem. Além disso, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de lipídios através da referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus. Os lipídios assim obtidos podem ser vantajosamente utilizados como intermediários de síntese, particularmente no chamado setor de "química verde", ou na produção de biocombustíveis, tais como, por exemplo, "biodiesel" ou "diesel verde", que podem ser usados como tal, ou misturados com outros combustíveis para o transporte.

Description

“VARIANTE DE LEVEDURA OLEAGINOSA E SEU USO PARA PRODUÇÃO DE LIPÍDIOS” DESCRIÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma variante de levedura oleaginosa das espécies Trichosporon oleaginosus.

[002] Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus, caracterizada por mutações que afetam a síntese da parede celular que altera a morfologia da mesma em relação à cepa de tipo selvagem da mesma espécie. Em particular, graças às referidas mutações, os agregados de células são formadas que, com relação à cepa de tipo selvagem da mesma espécie, baixam a viscosidade do caldo de cultura, são mais facilmente separáveis do mesmo e, assim, tornam a sua recuperação mais fácil.

[003] A referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus é também caracterizada por rendimentos de biomassa celular oleaginosa e a acumulação intracelular de lipídios que são semelhantes ou até mesmo superiores aos da cepa de tipo selvagem.

[004] Além disso, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de lipídios através do cultivo da referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus.

[005] Os lipídios assim obtidos podem ser vantajosamente utilizados como intermediários de síntese, particularmente no chamado setor de "química verde", ou na produção de biocombustíveis, como o "biodiesel" ou "diesel verde", que pode ser utilizado como tal, ou misturado com outros combustíveis para o transporte.

[006] A produção de lipídios por meio de métodos microbiológicos é proposta como uma alternativa vantajosa aos métodos atuais de produção a partir de fontes renováveis. No que diz respeito à extração de lipídios de plantas, processos microbiológicos são mais rentáveis, pois eles são mais facilmente escaláveis, exigem menos trabalho, e exploram a propriedade dos micro-organismos para rapidamente se reproduzirem à custa de substratos de baixo custo, tais como, por exemplo, derivados da hidrólise de materiais lignocelulósicos. Além disso, eles são independentes de fatores climáticos e não competem com a exploração agrícola do solo para fins alimentares.

[007] Particularmente promissoras para este fim são as leveduras oleaginosas, ou seja, as leveduras que podem, sob condições de cultura específica, acumular lipídios, especialmente triglicerídeos, para mais de 25% do seu peso seco. O uso de leveduras oleaginosas para a produção de lipídios é parte da técnica anterior, como descrito, por exemplo, em: Meng X. et al., "Renewable Energy" (2009), Vol. 34, pag. 1-5; Galafassi S. et al, "Tecnologia Bioresource" (2012), Vol. III, pág. 398-403.

[008] De um modo geral, os referidos lipídios são obtidos através da cultura de leveduras oleaginosas sob condições aeróbicas em biorreatores. Leveduras oleaginosas são cultivadas utilizando soluções de açúcares que podem ser obtidas a partir de plantas ricas em amido ou frutos açucarados e que são definidos como "açúcares de primeira geração", ou são de preferência obtidas através do tratamento e sacarificação de biomassas lignocelulósicas não comestíveis, e, por conseguinte, são definidas como "açúcares de segunda geração". Biomassas lignocelulósicas podem ser, por exemplo, resíduos agrícolas, tais como palha de trigo ou de milho dos caules, ou plantas que não podem ser utilizadas para o setor alimentar, tais como cana comum, fibra de sorgo, miscanthus ou resíduos de processamento de plantas não comestíveis, tais como o guaiule, eucalipto, álamo ou resíduos de processamento da indústria de fabricação de papel. Tais misturas de açúcares de segunda geração, que são ditos hidrolisados, contêm açúcares com 5 (C5) e 6 (C6) átomos de carbono. Leveduras oleaginosas são naturalmente capazes de crescer em açúcares C5, tais como xilose e açúcares C6 tais como glucose, produzindo biomassa celular e, sob determinadas condições de crescimento, acumulam lipídios em uma percentagem elevada no que diz respeito ao peso celular seco.

[009] A partir do cultivo das referidas leveduras oleaginosas no biorreator, um caldo de cultura é obtido incluindo a biomassa celular oleaginosa a ser recuperada. Subsequentemente, os lipídios acumulados dentro das células devem ser extraídos e separados do caldo de cultura ainda presente e dos detritos de células resultante de técnicas de lise ou ruptura apropriadas.

[010] Um dos principais pontos críticos em relação à produção de lipídios por meio de métodos microbiológicos refere-se ao fato de que a produtividade volumétrica (ou seja, a quantidade de lipídios a ser obtida por unidade de volume de caldo de cultura) é limitada e, em geral, é inferior a 100 g/L. Por conseguinte, a aplicação industrial destes processos de produção prevê o uso de grandes volumes de caldo de cultura dos referidos micro-organismos. Estes grandes volumes de caldo de cultura devem ser, é claro, tratados para recuperar a biomassa celular oleaginosa resultante e prosseguir com a extração dos lipídios, em grandes instalações, com configuração e custos de processo elevados.

[011] Para a finalidade de assegurar a eficácia de custo do processo de produção de lipídios, a cultura de leveduras oleaginosas deve alcançar uma densidade celular elevada, permitindo, por conseguinte, a produtividade do referido processo de ser aumentada a fim de minimizar o volume de caldo de cultura e o número de biorreatores usados. No final do crescimento, a biomassa celular oleaginosa obtida deve ser concentrada a fim de reduzir o volume de material a ser tratado nas etapas de extração subsequentes dos produtos obtidos (por exemplo, óleos microbianos, lipídios) e otimizar o tamanho do equipamento e volumes de reagentes necessários para a recuperação.

[012] As soluções técnicas atualmente utilizadas para a recuperação de biomassa celular oleaginosa a partir do caldo de cultura no final do crescimento das leveduras oleaginosas acima referidas são principalmente de natureza física ou química.

[013] As leveduras oleaginosas utilizadas para a produção industrial de lipídios, especialmente no caso em que elas atingem uma densidade celular elevada, podem levar a caldos de cultura com elevada viscosidade, em que a biomassa celular oleaginosa obtida é difícil de separar da fase aquosa, por causa da sua característica morfológica e da síntese de substâncias com propriedades surfactantes. Além disso, a viscosidade do caldo de cultura torna a cultura das leveduras oleaginosas no biorreator mais difíceis e dispendiosas, devido à eficiência de mistura e oxigenação inferior do meio de cultura. A referida criticalidade é particularmente evidente no caso em que o processo de produção de lipídio é realizado utilizando leveduras oleaginosas que são produtores elevados de lipídios, tais como, por exemplo, aqueles que pertencem ao gênero Trichosporon.

[014] Comumente, para separar a biomassa celular oleaginosa obtida no final do processo de produção de lipídios a partir do caldo de cultura, técnicas são usadas as quais implicam uma diferença de densidade entre as duas fases do caldo de cultura (isto é, fase aquosa e biomassa celular oleaginosa) tal como centrifugação, sedimentação espontânea, hidrociclones, filtração, filtro-prensa, microfiltração, ultrafiltração, por vezes continuamente acoplados ao biorreator em que o referido processo é realizado. No caso do uso de leveduras oleaginosas que pertencem ao gênero Trichosporon, a eficiência das referidas técnicas é, no entanto, muito baixa, porque a biomassa celular oleaginosa obtida tem uma densidade muito semelhante àquela da fase aquosa.

[015] Para a finalidade de aumentar a eficiência, floculantes podem ser adicionados ao caldo de cultura, de modo a criar agregados de células que, devido às suas dimensões, sedimentam mais facilmente no que diz respeito a células individuais. No entanto, a adição de floculantes nas proporções estabelecidas pela técnica anterior não conduziu a uma melhoria da separação da biomassa celular oleaginosa a partir da fase aquosa. Além disso, a adição de floculantes pode ser incompatível com os processos de extração de lipídios subsequentes, por causa da alta afinidade dos referidos floculantes com os solventes utilizados na extração. Na prática, o referido floculante poderia ser extraído em conjunto com os lipídios intracelulares e, por conseguinte, representa as impurezas a serem removidas antes do uso dos próprios lipídios.

[016] Outras metodologias utilizadas para a concentração de biomassa celular oleaginosa são baseadas em técnicas de filtração. No entanto, as substâncias com propriedades surfactantes muitas vezes produzidas por leveduras oleaginosas impedem a permeação da fase aquosa através da membrana utilizada para a filtração, tornando o processo ineficaz.

[017] Os métodos são também conhecidos os quais prevêem a evaporação do excesso de água, tal como, por exemplo, aquecimento para induzir a evaporação, ou secagem da biomassa celular com técnicas tal como, por exemplo, secagem por pulverização ou liofilização: no entanto, os referidos métodos são eficazes na concentração de biomassa celular, mas requerem alto consumo de energia e não são economicamente viáveis para um processo industrial para a produção subsequente de intermediários de síntese, particularmente no chamado setor de "química verde", ou na produção de biocombustíveis.

[018] Os métodos são também conhecidos os quais prevêem tratamentos térmicos, a pH neutro ou ácido, geralmente realizados após o caldo de cultura ter sido drenado do biorreator usado no processo para a produção de lipídios, no final do referido processo, de modo a torná-lo adequado por centrifugação / filtração e para facilitar a recuperação da biomassa celular oleaginosa obtida. No entanto, os referidos métodos também requerem mais consumos de energia e, ao operar a pH ácido, a neutralização dos resíduos acidificados.

[019] Além disso, alguns dos métodos acima descritos podem levar à degradação das estruturas celulares, compreendendo as características do produto final a ser obtido. Finalmente, os métodos descritos acima não resolvem o problema da viscosidade do caldo de cultura e o consequente aumento da energia necessária devido à necessidade de manter tanto uma boa agitação quanto boa oxigenação, dentro do biorreator utilizado.

[020] Estudos têm sido realizados a fim de superar as desvantagens acima mencionadas.

[021] Por exemplo, pedido de patente internacional WO 2013/155050 descreve um micro-organismo oleaginoso para a produção de materiais a partir de fontes renováveis, em que o referido micro-organismo compreende uma modificação genética não presente no micro-organismo não modificado, e em que o referido micro-organismo produz um caldo de fermentação com uma menor viscosidade do que a produzida pelo micro-organismo não modificado. O micro-organismo acima referido oleaginoso é dito ter uma redução da síntese de polissacarídeos exocelulares e de ser capaz de produzir lipídios com altos rendimentos.

[022] Uma vez que a produção de materiais a partir de fontes renováveis, especialmente lipídios, vantajosamente utilizáveis para a produção de intermediários de síntese do chamado setor de "química verde", ou na produção de biocombustíveis, ainda é de grande interesse, o estudo de novas leveduras oleaginosas capaz de produzir lipídios com bons rendimentos e para serem mais facilmente recuperáveis do caldo de cultura também é de grande interesse.

[023] Por conseguinte, a Requerente propôs resolver o problema de identificação de um levedura oleaginosa capaz de produzir lipídios com bons rendimentos e mais facilmente recuperáveis a partir do caldo de cultura.

[024] O Requerente já identificou uma variante de levedura oleaginosa para poder produzir lipídios com bons rendimentos e mais facilmente recuperáveis a partir do caldo de cultura.

[025] Em particular, a invenção refere-se a variantes de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus depositada em 17 maio de 2017 de acordo com o Tratado de Budapeste no Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - InhoffenstraBe 7 B 38124 Braunschweig (Alemanha), o número de depósito DSM 32508, caracterizado por mutações que afetam a síntese da parede celular que modifica a sua morfologia em relação à cepa de tipo selvagem da mesma espécie. Em particular, graças às referidas mutações, os agregados de células são formados os quais, em relação à cepa de tipo selvagem da mesma espécie, baixam a viscosidade do caldo de cultura, são mais facilmente separáveis do mesmo e, assim, tornam mais fácil a sua recuperação.

Adicionalmente, a referida variante de levedura oleaginosa é caracterizada por rendimentos de biomassa celular oleaginosa e acumulação intracelular de lipídios que são similares ou mesmo superiores àqueles da cepa do tipo selvagem.

[026] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um processo para a produção de lipídios através do cultivo da referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508.

[027] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações seguintes, as definições das gamas numéricas sempre incluem os extremos, a menos que especificado de outra forma.

[028] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações seguintes, o termo "compreendendo" também inclui os termos "que consiste essencialmente em" ou “que consiste em”.

[029] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações seguintes, o termo "biodiesel" significa um combustível para motores a diesel que incluem alquil ésteres (por exemplo, metil, propil ou etil) de ácidos graxos de cadeia longa derivados de fontes biológicas.

[030] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações seguintes, o termo "diesel verde" significa um combustível para motores a diesel, compreendendo produtos de hidrogenação ou desoxigenação de lipídios que derivam de fontes biológicas, na presença de hidrogênio e de pelo menos um catalisador.

[031] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações que se seguem, as expressões "cultivo" e "cultura" indicam os processos através dos quais as células de um micro-organismo crescem e reproduzem-se sob condições controladas humanas. Os processos definidos através das expressões anteriores compreendem a "cultura" de levedura oleaginosa, realizada em algumas modalidades da presente invenção.

[032] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações anexas, a expressão "meio de cultura" significa um líquido, ou um gel, fornecido para suportar o crescimento dos micro-organismos, por exemplo, das células de levedura oleaginosos. O meio de cultura pode ser de uma composição definida (por exemplo, "meio YEPD", "meio B", etc.) ou pode derivar do tratamento de fontes não selecionadas, tais como, por exemplo, águas residuais, lixo de mercado, ou material lignocelulósico hidrolisado.

[033] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações que se seguem, as expressões "fonte de carbono", "fonte de nitrogênio", "fonte de enxofre" e fonte de fósforo" significam substâncias orgânicas ou inorgânicas médias, ou composições das referidas substâncias com base em carbono, nitrogênio, enxofre (por exemplo, sulfatos) e fósforo (por exemplo, fosfatos), respectivamente, contidos no meio de cultura e que um micro-organismo pode metabolizar para a obtenção de energia.

[034] Para efeitos da presente descrição e das reivindicações seguintes, o termo "biomassa" significa o conjunto de células produzidas durante o processo para a produção de lipídios de acordo com a presente invenção ou em outros modos de cultura.

[035] Outras características e vantagens da presente invenção se tornarão claras a partir da descrição detalhada que se segue.

[036] Portanto, o objeto da presente invenção é constituído por uma variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus depositada em 17 de maio, 2017 de acordo com o Tratado de Budapeste no Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - InhoffenstraBe 7 B 38124 Braunschweig (Alemanha), número de depósito DSM 32508.

[037] O genótipo da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 foi caracterizado por comparação da sequência do seu DNA genômico com a da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 tal como descrito no Exemplo 4 relatado abaixo.

[038] O genoma da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 tem um tamanho de 19601063 pares de bases (bps) e contém 8283 genes. Destes, 3621 genes foram identificados com uma função conhecida e 4419 genes foram anotados. A partir da comparação com o genoma da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, um total de 647 mutações foram destacadas, 228 das quais são homozigóticas e 420 heterozigóticos.

[039] As mutações que afetam as regiões codificantes são descritas abaixo que, diretamente ou indiretamente, conduzem a uma modificação da sequência de aminoácidos das proteínas codificadas pelo gene em que cada mutação é encontrada. Em particular, as proteínas envolvidas no processo de síntese da parede celular são analisadas, cuja alteração pode afetar a morfologia celular, as características de viscosidade do caldo de cultura e a facilidade de sedimentação das células de levedura presentes no referido caldo de cultura. Mais em particular, houve um total de 131 mutações das regiões de codificação que conduzem a uma modificação da sequência de aminoácidos da proteína correspondente. Destas últimas, 22 são por deleção, 13 por inserção, 89 por variação de nucleotídeo único (SNV) e 3 por variação de nucleotídeos múltiplos (MNV). Foram identificadas 30 mutações homozigóticas (descobertas em genes presentes em uma única cópia).

Destas, em particular uma mutação de deleção resulta em um gene cuja proteína está associada com componentes da parede, em particular, quitina, e que, por conseguinte, sem querer referir a qualquer teoria, pode ser correlacionada com o fenótipo de morfologia diferente da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 e determinar sua maior facilidade de sedimentação (capacidade de centrifugação). Na verdade, a mutação de deleção faz com que a falta de síntese de uma proteína com atividade de sintetase de quitina (anotada por homologia como quitina-sintase 4 da levedura Saccharomyces cerevisiae), impedindo assim a produção correta de quitina, necessária para a formação de uma parede de célula completa. De fato, variantes de levedura Saccharomyces cerevisiae que apresentam mutações na síntese dos defeitos mostram quitina na separação das células filhas das células mãe, por conseguinte, a geração de grupos de células não separadas. Além disso, as células mostram uma forma e tamanho diferente em comparação com as da cepa de tipo selvagem como relatado, por exemplo, em: Bulawa CE, “Annual Review of Microbiology” (1993), Vol 47, pág 505-534; Cabib E. et al.,"Nature Reviews Microbiology" (2013), Vol 11, pág 648-655.

[040] 269 mutações heterozigóticas (encontradas em genes presentes em mais do que uma cópia) foram identificadas em regiões que codificam para proteínas, 92 das quais sendo em genes que codificam proteínas cuja função é conhecida. Destas, três mutações afetaram genes cuja proteína está associada com componentes da parede celular ou da membrana, e, por conseguinte, potencialmente envolvidos na alteração das suas características morfológicas e funcionais. Em particular, uma mutação de deleção que se refere ao gene que codifica para uma lipoproteína de membrana putativa. A segunda mutação, por variação de um único nucleotídeo (SNV), que produz a mudança de um único aminoácido na proteína afeta o gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de N-acetilglucosaminil-fosfatidilinositol (GlcNAc-PI), o primeiro intermediário na "caminho" da "âncora GPI", ou seja, o glicolipídio que é necessária para ancorar as proteínas de parede celular. A terceira mutação, também por variação de um único nucleotídeo (SNV), refere-se ao gene que codifica para uma proteína com atividade de sintetase de quitina, e, portanto, envolvido na síntese de quitina (anotado por homologia como uma sintetase de quitina de Saccharomyces cerevisiae). Também neste caso, sem querer referir-se a qualquer teoria, todas as referidas mutações, mesmo heterozigóticas, mas associada com mutação homozigótica afetando a síntese de quitina, pode ser correlacionada com o fenótipo de morfologia diferente da variante de levedura oleaginosa das espécies Trichosporon oleaginosus DSM 32508 e determinam alterações profundas na estrutura da parede celular, gerando os agregados celulares que são mais facilmente separáveis da fase aquosa do caldo de cultura.

[041] As seguintes Tabelas 1 e 2 mostram mutações detectadas no DNA genômico da variante da levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 (mutante) com relação à cepa de tipo selvagem (de tipo selvagem), que levam à mudança nas sequência da proteína. Para cada mutação, a posição sobre o chamado "scaffold" é indicado, ou seja, em uma das regiões contíguas de DNA genômico que, montados com base na sua sequência de nucleotídeos, permitem a reconstrução do genoma. A Tabela 1 e na Tabela 2 indicam também: o tipo de mutação: "variação de um único nucleotídeo" SNV, ou seja, mutação de um só nucleotídeo; MNV: "variação de nucleotídeos múltiplos", ou seja, mutação de vários nucleotídeos de sequência; inserção de um ou mais nucleotídeos; deleção de um ou mais nucleotídeos; o número de nucleotídeos envolvidos, as sequências de nucleotídeos ou nucleotídeos variados (por mutação, inserção ou deleção), respectivamente, no genoma da cepa de tipo selvagem e no genoma da variante de levedura oleaginosa DSM 32508. As mutações homozigóticas são aquelas encontradas em genes presentes em uma única cópia no genoma (Tabela 1); mutações heterozigóticas são aquelas encontradas em genes presentes em várias cópias no genoma (Tabela 2). TABELA 1A Scaffold Pos Tipo Compr Tipo Mutant Anotação ição imento selvage e m scaffold102_tamanho 277 Del 4 GGTC - Fator de transcrição 41884 mapeamento 6 eçã o scaffold1042_tamanh 457 Del 2 GT - CHS4 – Sintase de quitina 4 o9002 mapeamento eçã o scaffold1067_tamanh 387 Inse 1 - C PRP45 Pré-mRNA-proteína o4903 mapeamento rção de processamento 45 388 Inse 1 - C rção 398 Inse 1 - G rção 399 SN 1 T A

V 384 SN 1 T C

V scaffold1115_tamanh 418 SN 1 G T PFS2 – Subunidade de fator o6086 mapeamento 0 V de poliadenilação 2 scaffold1135_tamanh 23 SN 1 G A ssn6 – Co-repressor o4105 mapeamento V transcricional geral scaffold1157_tamanh 386 Inse 9 - CCAT AO-I – Amina oxidase de o4327 mapeamento rção ACCC cobre 1

A scaffold125_tamanho 280 Inse 1 - T mam4 – Proteína-S- 33269 mapeamento 60 rção isoprenilcisteína O- metiltransferase scaffold128_tamanho 910 Del 2 CC - DOLPP1 – Dilicol difosfatase 1 27785 mapeamento eçã o scaffold133_tamanho 616 SN 1 G A SEC62

Scaffold Pos Tipo Compr Tipo Mutant Anotação ição imento selvage e m 33047 mapeamento V 624 Del 3 ACT - eçã o scaffold1330_tamanh 285 MN 3 TCG AGC klp1 - cadeia pesada de o2886 mapeamento 2 V quinesina scaffold14_tamanho5 805 SN 1 T C TOP3A - Topoisomerase 5374 mapeamento 8 V 805 SN 1 A C 4 V scaffold1522_tamanh 310 SN 1 A G Tf2-1_3 – elemento o3854 mapeamento 8 V retrotransponível 237 SN 1 A C 6 V 238 SN 1 T G 8 V 169 SN 1 A G 7 V 130 SN 1 A G 7 V 303 Del 5 GCGG - 5 eçã G o scaffold1543_tamanh 633 Inse 2 - TG usp30 - Ubiquitina carboxil- o2681 mapeamento rção terminal hidrolase scaffold1590_tamanh 177 Del 4 CGTC - nitronato monooxigenase o4460 mapeamento 6 eçã putativo o scaffold1613_tamanh 151 Del 1 G - PBP2 – regulador de o1563 mapeamento 8 eçã poliadenilação o scaffold1641_tamanh 153 Del 10 TTTGT - Anhidrase carbônica o2263 mapeamento 7 eçã GGTTA o scaffold1648_tamanh 710 Del 10 TGTTG - MID1 – Ca+ influxo, o10529 mapeamento 8 eçã GTGTT resistência ao estresse o scaffold176_tamanho 236 Del 5 AACGA - RPS16 - proteína ribossomal 44024 mapeamento 33 eçã 40S S16 o scaffold1772_tamanh 142 Del 6 CCGC - paaF - Enoil-CoA hidratase, o2790 mapeamento 5 eçã CC oxidação de ácido graxo beta o scaffold1833_tamanh 831 Inse 1 - G Strn4 – transdução de sinal o2599 mapeamento rção 132 Del 1 C - 3 eçã o 982 Del 6 ACCTG -

Scaffold Pos Tipo Compr Tipo Mutant Anotação ição imento selvage e m eçã T o scaffold214_tamanho 542 Del 1 T - cbc1 – Cap-subunidade de 32099 mapeamento eçã proteína de ligação 1 o scaffold260_tamanho 186 Del 3 GGG - SAS10 – envolvido no 19451 mapeamento 50 eçã processamento nucleolar de o pré-18S scaffold261_tamanho 708 Del 5 CAGG - NPRL2 - Proteína tipo 19295 mapeamento eçã A regulador 2 de nitrogênio o permease scaffold265_tamanho 129 SN 1 T C NSP1_2 – Nucleoporina 18389 mapeamento 23 V scaffold306_tamanho 206 SN 1 N T hibA - 3-hidróxi-isobutirato 31322 mapeamento 0 V dehidrogenase putativa scaffold387_tamanho 235 Del 8 GGGC - rnr-1 – Cadeia grande de 17704 mapeamento 9 eçã TCGC difosfotado de ribonucleosídeo o TABLE 2 Scaffold Po Ti Com Tipo M Anotação siç po prim selv ut ão ento age an m te scaffold10_ta 17 S 1 T C nim-1 – Proteína quinase específica de G2 manho59962 91 N mapeamento 0 V scaffold105_ta 18 S 1 C T tea1 – Proteína aberrante de alongamento de manho30064 61 N ponta mapeamento V scaffold1069_t 20 Ins 1 - G HHT1 - Histona H3 amanho4474 70 er mapeamento çã o scaffold1115_t 41 S 1 C T PFS2 – Subunidade de fator de poliadenilação amanho6086 71 N mapeamento V 41 S 1 T C 68 N

V scaffold1201_t 43 S 1 T C oca2 – Proteína quinase serina/treonina amanho4291 4 N mapeamento V scaffold1270_t 18 S 1 A G scd2 amanho3209 95 N mapeamento V scaffold128_ta 18 S 1 G A Gene: Ca-P60A, CDS: Ca-P60A

Scaffold Po Ti Com Tipo M Anotação siç po prim selv ut ão ento age an m te manho27785 90 N mapeamento 0 V scaffold1296_t 14 S 1 C T Tf2-1_1 – Elemento retrotransponível amanho6178 12 N mapeamento V 59 S 1 C A 0 N

V 86 S 1 G A 0 N

V 19 S 1 T C 86 N

V 28 S 1 T C 41 N

V 27 S 1 T A 78 N

V 28 S 1 T C 29 N

V 23 Ins 1 - A 70 er çã o 48 S 1 T C 5 N

V 48 S 1 T C 6 N

V 12 S 1 T C 50 N

V 30 S 1 C T 63 N

V 13 S 1 T C 08 N

V scaffold1399_t 67 S 1 T C nuo-21_1 amanho2575 N mapeamento V scaffold14_ta 17 S 1 G A his-6 manho55374 42 N mapeamento 3 V

Scaffold Po Ti Com Tipo M Anotação siç po prim selv ut ão ento age an m te scaffold14_ta 80 Ins 1 - G TOP3A - DNA topoisomerase 3-alfa manho55374 60 er mapeamento çã o scaffold141_ta 21 S 1 G T PXA1 – proteína importante de ácido graxo de manho26007 39 N cadeia longa peroxissomal mapeamento 2 V scaffold145_ta 20 S 1 T C Etnppl manho25803 56 N mapeamento 8 V scaffold1450_t 22 Ins 1 - G dnaJ amanho3468 77 er mapeamento çã o 22 M 2 CA G 81 N C

V scaffold148_ta 99 S 1 T A NUP205 – proteína do complexo do poro nuclear manho25263 38 N mapeamento V scaffold1522_t 58 S 1 A G Tf2-1_3 – Elemento retrotransponível amanho3854 5 N mapeamento V 32 S 1 A T 76 N

V 32 S 1 T C 19 N

V 23 S 1 T C 10 N

V 35 S 1 C T 36 N

V 32 S 1 G T 82 N

V 26 S 1 A T 29 N

V 32 S 1 A G 90 N

V 30 S 1 T C 93 N

V 17 S 1 T C

Scaffold Po Ti Com Tipo M Anotação siç po prim selv ut ão ento age an m te 39 N

V 35 S 1 A G 42 N

V 34 S 1 G A 04 N

V 31 S 1 T C 20 N

V 30 S 1 T C 51 N

V 63 S 1 C G 3 N

V 18 S 1 C T 72 N

V scaffold160_ta 20 S 1 T C pom152 – Nucleoporina manho33150 20 N mapeamento 9 V scaffold162_ta 21 S 1 T A DBP10 - RNA helicase dependente de ATP manho23983 00 N mapeamento 6 V scaffold1620_t 11 S 1 T C PEG10_1 – proteína derivada de retrotransposon amanho1538 41 N mapeamento V scaffold1666_t 14 S 1 G A RPL7 – proteína ribossomal 60S L7 amanho3720 53 N mapeamento V scaffold17_ta 43 S 1 C T endopeptidase-tipo 1 de metal da membrana manho51795 61 N Mmel1 mapeamento 9 V scaffold189_ta 18 Ins 1 - G mtr_3 – transportador de aminoácido manho23947 52 er mapeamento 3 çã o scaffold1925_t 33 S 1 C T Elmo1 – organizador do citoesqueleto de actina amanho4739 9 N mapeamento V scaffold195_ta 19 S 1 T C LAC12_2 – permease de açúcar manho22323 54 N mapeamento 7 V scaffold197_ta 10 S 1 A G tra1 – proteína associada à transcrição manho21962 99 N mapeamento 8 V

Scaffold Po Ti Com Tipo M Anotação siç po prim selv ut ão ento age an m te 10 S 1 C T 34 N 7 V 14 S 1 T C 54 N 0 V scaffold201_ta 15 S 1 A G prp43 - RNA helicase manho22232 37 N mapeamento 9 V scaffold2026_t 32 S 1 G A HD-10 - homeo-box amanho1526 0 N mapeamento V scaffold205_ta 80 S 1 T C LIP4_2 – lipase manho21540 38 N mapeamento V scaffold209_ta 16 S 1 C T ADE2 – percurso de adenina manho21982 76 N mapeamento 5 V scaffold214_ta 53 S 1 C G cbc1 – complexo de ligação de CAP manho32099 3 N mapeamento V 53 S 1 C T (importante na resposta ao estresse osmótico) 6 N

V 54 Ins 4 - A 3 er C çã G o G scaffold215_ta 11 S 1 A G LAC – Laccase manho30252 09 N mapeamento 0 V scaffold217_ta 15 S 1 G A NCBP – Fator de iniciação de tradução manho20594 66 N mapeamento V scaffold220_ta 92 M 2 AG G RKI1 - Ribose-5P isomerase manho20471 93 N A mapeamento V scaffold222_ta 18 S 1 G A pkiA – piruvato quinase manho20448 98 N mapeamento 1 V scaffold25_ta 20 S 1 A G Rangrf – fator de regulação de nucleotídeo manho49612 73 N guanina mapeamento 4 V scaffold252_ta 12 De 1 G - VMS1 – Componente de um complexo Cdc48p manho21098 95 leç envolvido no controle de qualidade de proteína; mapeamento 8 ão exibe localização de membrana citosólica e ER scaffold255_ta 46 S 1 A G PIGS – biossíntese de âncora de fosfatidilinositol manho18966 84 N glicano

Scaffold Po Ti Com Tipo M Anotação siç po prim selv ut ão ento age an m te mapeamento V scaffold260_ta 47 De 2 GA - Lipoproteína contendo anquirina putativa manho19451 61 leç envolvida na integridade da membrana mapeamento ão scaffold27_ta 46 S 1 A G str3_5 – veículo de ferro sideróforo manho49090 38 N mapeamento 6 V scaffold280_ta 58 De 1 C - sks2 –proteína de choque térmico manho17908 17 leç mapeamento ão 63 De 1 A - 51 leç ão scaffold305_ta 63 S 1 T C lsg1 –GTPase 1 subunidade grande manho17341 13 N mapeamento V scaffold31_ta 35 S 1 G T MCH4_2 - Monocarboxilato permease manho47703 37 N mapeamento 5 V scaffold317_ta 97 S 1 T A CAND1 manho16538 19 N mapeamento V scaffold324_ta 92 S 1 C T cut6 manho16216 62 N mapeamento V scaffold341_ta 62 S 1 T G CHS1 – Sintase de quitina 1 manho15653 56 N mapeamento V scaffold347_ta 63 S 1 C T rfbB - Glucose 4,6 dehdratase manho15416 46 N mapeamento V scaffold35_ta 36 S 1 G A not2 – regulador de RNA polimerase manho48345 83 N mapeamento 1 V scaffold353_ta 15 S 1 T A mutS – recombinação meiótica manho15157 29 N mapeamento V scaffold354_ta 12 S 1 G C rrp14c – processamento de RNA ribossomal manho19402 60 N mapeamento 8 V scaffold370_ta 11 S 1 G A hdhA - Hidroxiesteróide dehidrogenase manho23342 27 N mapeamento 3 V scaffold370_ta 88 De 1 C - KDM3A – Lisina demetilase manho23342 84 leç mapeamento ão scaffold377_ta 11 S 1 T C ERT1_1 – Ativador de gluconeogênese manho14372 70 N

Scaffold Po Ti Com Tipo M Anotação siç po prim selv ut ão ento age an m te mapeamento V scaffold378_ta 78 S 1 T C smd2 – Ribonucleoproteína manho14357 92 N mapeamento V scaffold385_ta 13 S 1 C A MEF1 – fator de alongamento mitocondrial manho14962 79 N mapeamento 2 V scaffold39_ta 35 S 1 T G APL4 – Transporte vesicular manho43714 71 N mapeamento 5 V scaffold391_ta 25 S 1 A G sce3 – Fator inicial de tradução manho16428 75 N mapeamento V scaffold40_ta 33 S 1 G A HSP31 – Proteína de choque térmico manho47628 36 N mapeamento 2 V scaffold403_ta 69 S 1 C T IWS1 – Fator de alongamento de transcrição manho14321 58 N mapeamento V

[042] A modificação da morfologia das células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, em comparação com a cepa de tipo selvagem, foi verificada em vários experimentos, alguns dos quais são descritos nos exemplos fornecidos abaixo, em que a referida modificação foi detectada tanto sob um microscópio óptico quanto através de citofluorimetria de fluxo. Além disso, a produção de biomassa e a quantidade de lipídios acumulados durante o processo de produção de lipídio de acordo com a presente invenção foram determinadas. Finalmente, a viscosidade e capacidade de centrifugação (ou seja, o fator de concentração) do caldo de cultura obtido a partir do referido processo em diferentes momentos de inoculação.

[043] A variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, objeto da presente invenção foi obtida através de um processo de mutagênese efetuado pela exposição de células da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 à radiação ultravioleta (UV) com comprimentos de onda que vão de 230 nm a

260 nm. Mutagênese por exposição à radiação UV pode ser realizada de acordo com a técnica anterior, tal como descrito, por exemplo, em Winston F. et al., "Current Protocols in Molecular Biology" (2008), DOI: 10.1002/0471142727.mbl302s82, John Wiley & Sons. Por exemplo, a referida mutagênese pode ser realizada por exposição das células da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 colocadas em uma placa de Petri em meio solidificado com ágar a uma fonte de radiação UV (representada por, pelo menos, uma lâmpada com potência que varia de 8 a 15 Watt Watt, com um comprimento de onda variando de 230 nm a 160 nm), colocadas em uma distância da placa de Petri que varia de 10 cm a 50 cm, por um tempo variando de 5 segundos a 5 minutos.

[044] Como mencionado acima, a presente invenção refere-se também a um processo para a produção de lipídios através do cultivo da referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus.

[045] Portanto, outro objeto da presente invenção é um processo para a produção de lipídios compreendendo: - preparar um inóculo que compreende, pelo menos, uma variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508; - alimentar o referido inóculo em um dispositivo de cultura obtendo um caldo de cultura; - submeter o referido caldo de cultura à separação para obter uma suspensão aquosa de uma biomassa de células oleaginosas concentradas compreendendo lipídios e uma fase aquosa; - extrair os lipídios intracelulares acumulados no interior das células de levedura.

[046] Para efeitos do processo de acordo com a presente invenção, o referido dispositivo de cultura pode ser, por exemplo, um biorreator e a referida separação pode ser realizada, por exemplo, por meio de centrifugação.

[047] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo pode ser realizado a uma temperatura variando de 10 ºC a 40 ºC, de preferência variando entre 20 ºC a 35 ºC.

[048] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo pode ser realizado por um tempo que varia de 40 horas a 200 horas, de preferência variando de 80 horas a 150 horas.

[049] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo pode ser realizado sob condições aeróbicas.

[050] As referidas condições aeróbicas podem ser acionadas, por exemplo, por insuflação de ar estéril para dentro do dispositivo de cultura e através de agitação variável, a referida agitação, dependendo do tipo de dispositivo de cultura utilizado.

[051] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo pode ser realizado a um pH na faixa de 4,5-7,0, de preferência, variando de 5,0 a 6,5. Para a finalidade de manter o pH nas faixas pretendidas, uma solução aquosa pode ser adicionada ao meio de cultura de pelo menos uma base inorgânica, por exemplo, hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de potássio (KOH), di-hidróxido de cálcio [Ca(OH)2], hidróxido de magnésio [Mg(OH)2], ou suas misturas, de preferência hidróxido de potássio (KOH), ou uma solução aquosa de pelo menos um ácido inorgânico, tal como, por exemplo, ácido fosfórico (H3PO4), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorídrico (HCl), ou suas misturas, de preferência ácido sulfúrico (H2SO4), em quantidades de modo a obter o pH desejado.

[052] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo pode ser realizado a partir de um inóculo em uma quantidade que varia entre 1% e 5% (vol/vol) do volume total do meio de cultura, obtido a partir de uma cultura prévia da referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, realizada no mesmo meio de cultura durante um tempo variando desde 6 horas até 24 horas.

[053] A referida cultura anterior pode por sua vez ser inoculada por uma cultura anterior, ou pode ser inoculada a partir de uma amostra da referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, mantida a -80 ºC em suspensão contendo 15% (vol/vol ) de glicerol.

[054] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo pode ser realizado em um meio de cultura que compreende a glucose como fonte de carbono e de sulfato de amônio [(NH4)2SO4] como fonte de nitrogênio.

[055] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo pode ser realizado em batelada alimentada.

[056] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo, depois de um tempo que varia de 15 horas a 25 horas após a inoculação, pode ser adicionalmente realizado em batelada alimentada, de preferência, por um tempo que varia de 25 horas a 175 horas, mais de preferência variando de 65 horas a 125 horas, por adição de uma outra fonte de nitrogênio tal como, por exemplo, licor de milho, extrato de levedura, sulfato de amônio, ureia, em uma quantidade tal como adicionar ao caldo de cultura uma quantidade total de nitrogênio variando a partir de 0,5 g/L a 5 g/L.

[057] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o referido processo, depois de um tempo compreendido entre 15 horas e 25 horas após a inoculação, pode ainda ser realizado em batelada alimentada, de preferência, por um tempo que varia de 25 horas a 175 horas, mais de preferência variando de 65 horas a 125 horas, por adição de uma solução aquosa de glucose, de modo a ter uma concentração constante de glucose no caldo de cultura variando de 25 g/L a 50 g/L.

[058] O crescimento das células durante a cultura pode ser medida por métodos espectrofotométricos determinando a turbidez, ou densidade óptica (OD) de uma amostra de caldo de cultura a 660 nm (OD 660)

[059] No final do processo anteriormente mencionado, as células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 usada, podem ser separadas do caldo de cultura através de métodos conhecidos no estado da técnica tais como, por exemplo, filtração, filtro-prensa, ou microfiltração ultrafiltração, centrifugação, de preferência por centrifugação. Preferivelmente, a referida centrifugação pode ser realizada durante um tempo que varia entre 5 minutos e 30 minutos, de preferência variando entre 15 minutos e 25 minutos, a uma velocidade de rotação que varia entre 3000 rpm e 9000 rpm, preferivelmente na faixa de 4000 rpm a 8000 rpm. Deve ser notado que as condições de funcionamento indicadas por centrifugação referem-se a um processo realizado em escala laboratorial: no caso de um processo industrial, em que centrífugas geralmente contínuas são utilizadas, o versado na técnica será capaz de adaptar-se às referidas condições.

[060] A concentração de biomassa celular oleaginosa obtida pode ser medida em gramas por litro de caldo de cultura, a determinação do peso seco das células de levedura oleaginosa de uma amostra de caldo de cultura de um volume conhecido tomada em intervalos predefinidos e no final do referido processo. Em particular, "peso seco" de biomassa celular oleaginosa significa o peso das células contido em um volume conhecido de caldo de cultura, determinado por pesagem das células acima mencionadas depois de retirar todo o conteúdo de água através de um tratamento térmico em um forno ventilado a 105 ºC até peso constante (cerca de 24 horas).

[061] Para a finalidade de recuperar lipídios, a biomassa celular oleaginosa obtida pode ser submetida à lise celular de acordo com os processos conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional WO

2014/102254, incluindo, por exemplo, tratamento térmico em um reator pressurizado, com um tratamento mecânico homogenizador, ou tratamento por micro-ondas.

[062] No final da referida lise celular, os lipídios podem ser recuperados da suspensão obtida, através de extração com solventes orgânicos polares ou não polares, de acordo com os processos conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional WO 2014/102254.

[063] A produção de lipídios pelas leveduras oleaginosas no final do processo objeto da presente invenção pode ser medida com métodos colorimétricos conhecidos no estado da técnica, diretamente em amostras de suspensões de células de levedura, por exemplo, com vanilina sulfo-fosfo usando, por exemplo, o kit "total de lipídios - sulpho-fosfo vanilina" vendido por Spinreact S.A.U., Ctra. Santa Coloma, 7 E-17176 St. Esteve d'en Bas (GI), Espanha.

[064] Além disso, a quantidade de lipídios produzidos pode ser determinada com métodos gravimétricos sobre a fração extraída com misturas de solventes orgânicos, por exemplo, com clorofórmio:metanol 2:1, vol/vol, tal como descrito em Folch J. et al., "The Journal of Biological Chemistry"(1957), vol. 226, pag. 497-509; ou extraído com n-hexano: isopropanol a 3:2 v/v, tal como descrito em Hara A. et al,.

"Analytical Biochemistry" (1978), Vol. 90, pág. 420-426, a partir de amostras de biomassa seca por congelação.

[065] Por isso, para avaliar o desempenho em relação à acumulação de lipídios, no processo objeto da presente invenção, da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, em relação à cepa do tipo selvagem, nos exemplos que se seguem, o peso seco de biomassa (expressa em g/L) e a quantidade de lipídios (expressos em g/L) foram determinados com os métodos indicados acima, no final do referido processo e a relação percentual entre estes dois parâmetros foram calculados.

[066] Deve ser notado que, operando de acordo com o processo objeto da presente invenção, a variante da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, em relação com a cepa de tipo selvagem da mesma espécie, permite um aumento de produtividade de até 50% e um aumento na titulação de lipídio de até 70% a ser obtido.

[067] Deve também ser notado que, operando de acordo com o processo objeto da presente invenção, o caldo de cultura obtido no final do referido processo, com a variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, com uma concentração equivalente de células de levedura oleaginosa e teor de lipídios, tem uma viscosidade de 2 a 10 vezes menor, em relação à viscosidade do caldo de cultura obtido com a cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509, realizada sob as mesmas condições de operação.

[068] A fração de lipídios foi analisada através de técnicas cromatográficas, por exemplo, por cromatografia de fase gasosa ou por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de acordo com processos conhecidos na técnica anterior.

[069] Através dos referidos métodos analíticos detectou-se que os lipídios acumulados nas células de levedura oleaginosos, ambos da variante e da cepa de tipo selvagem, são 90% representados por triglicerídeos, de preferência os ésteres de glicerol com ácidos graxos tendo de 8 a 24 átomos de carbono, tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico e ácido α-linoleico.

[070] Outros lipídios que podem estar presentes são: fosfolipídios, monoglicerídeos, diglicerídeos, ácidos graxos livres, ou suas misturas.

[071] Os lipídios obtidos de acordo com o processo objeto da presente invenção podem ser vantajosamente utilizados como intermediários de síntese, particularmente no chamado setor de "química verde". Além disso, eles podem ser submetidos à transesterificação na presença de pelo menos um álcool tendo de 1 a

4 átomos de carbono, de preferência metanol ou etanol, e, pelo menos, um catalisador ácido ou básico, a fim de produzir glicerol e alquil ésteres, em particular metil ésteres ou etil ésteres ("biodiesel").

[072] Alternativamente, os referidos lipídios podem ser submetidos à hidrogenação / desoxigenação na presença de hidrogênio e pelo menos um catalisador de modo a produzir "diesel verde". Os processos de hidrogenação / desoxigenação são conhecidos na técnica anterior e estão descritos, por exemplo, na patente de invenção europeia EP 1.728.844.

[073] Para a finalidade de colocar a presente invenção em prática e ilustrando-a mais claramente, abaixo estão alguns exemplos não limitativos.

EXEMPLO 1 (obtenção da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508)

[074] Um exemplo da aplicação do método de obtenção de variantes da cepa de tipo selvagem da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 é fornecido abaixo, o que levou à obtenção da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus depositada na Leibniz-Institut DSMZ, com o número de depósito DSM 32508. Neste exemplo, mutagênese ocasional foi obtida através de radiação UV.

[075] Para este efeito, uma amostra de células de uma cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 foi inoculada em um frasco contendo meio "YEPD" (10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 20 g/L de glucose): o frasco foi colocado em um incubador agitado, a 30 ºC, durante uma noite. Subsequentemente, as células foram recolhidas através de centrifugação a 4000 rpm durante 5 minutos, lavadas em água esterilizada, em seguida diluídas 1:10 em água estéril e colocadas em placas de Petri contendo um meio "B" de lipogênese sólida (20 g/L de ágar, 50 g/L de glucose, 1 g/L de sulfato de amônio [(NH4)2SO4], 1 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de di-

hidrogenofosfato de potássio [KH2PO4], 0,05 g/L de sulfato de magnésio hepta- hidratado [MgSO4·7H2O], 0,01 g/L de cloreto de sódio [NaCl], 0,01 g/L de cloreto de cálcio di-hidratado [CaCl2·2H2O]) de modo a ter cerca de 100 colônias por placa.

[076] As placas foram expostas a uma fonte de radiação ultravioleta, representada por uma lâmpada de 15 watt de UV (comprimento de onda de 254 nm), colocada a uma distância de 10 cm, por um tempo igual a 40 segundos, de modo a obter uma taxa de vitalidade residual de 10 %. Subsequentemente, as placas foram incubadas a 30 ºC, durante 4 dias, até que as colônias atingiram um tamanho suficiente para ser contada. Após a mutagênese uma colônia foi escolhida com bordas pontiagudas e irregulares correspondentes a uma variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 que foi plaqueada de novo em placas de Petri contendo o meio "B" de lipogênese sólida acima referido.

[077] Para fins comparativos, algumas placas não foram expostas à mutagênese.

[078] A Figura 1 mostra: (A): uma fotografia de uma placa de Petri que não tinha sido exposta à mutagênese em que nela pode ser visto que as colônias da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa das espécies de Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 têm uma forma redonda e uma aparecimento lustrosa e mucosa; (B) uma fotografia de uma placa de Petri em que pode ser visto que as colônias da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 têm bordas irregulares e pontiagudas e uma aparência sem brilho.

EXEMPLO 2 (modificação da morfologia celular da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508: observação ao microscópio óptico)

[079] A diversidade morfológica entre as células de uma cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC

20509 e células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 foi avaliada usando um microscópio óptico.

[080] Para este efeito, uma amostra de células de uma cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 e uma amostra de células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 foram inoculadas em dois frascos diferentes, em meio "YEPD" (10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 20 g/L de glucose): os frascos foram colocados em uma incubadora agitada, a 30 ºC, durante uma noite. Subsequentemente, a partir de cada frasco uma alíquota de caldo de cultura foi feita, colocada sobre uma lâmina e observada ao microscópio óptico com uma ampliação de 400X (Figura 2).

[081] A partir da Figura 2 pode-se observar que: (A): as células da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa das espécies Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 são de forma oval ou ligeiramente alongadas, estão na fase de reprodução ativa e os botões separados corretamente no final do processo de brotamento; (B): as células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 são muito alongadas e não concluem corretamente o processo de brotamento e tendem a formar agregados.

[082] Subsequentemente, uma alíquota de células provenientes de cada uma das culturas anteriores foi transferida, em dois frascos diferentes, em meio "B" de lipogênese líquida (50 g/L de glucose, 1 g/L de sulfato de amônio [(NH4)2SO4], 1 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de di-hidrogenofosfato de potássio [KH2PO4], 0,05 g/L de sulfato de magnésio heptahidratado [MgSO4·7H2O], 0,01 g/L de cloreto de sódio [NaCl], 0,01 g/L de cloreto de cálcio hi-hidratado [CaCl2·2H2O]), de modo a obter uma densidade de células de 0,1 OD660/mL: os frascos foram colocados em uma incubadora agitada, a 30 ºC, durante 96 horas. Subsequentemente, a partir de cada frasco, uma alíquota de caldo de cultura foi feita, colocado sobre uma lâmina e observada ao microscópio óptico com uma ampliação de 400X (Figura 3).

[083] A partir da Figura 3 pode-se observar que: (A): as células da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa das espécies Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 têm um formato arredondado e aparecem como células individuais; (B): as células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 são mais alongadas e tendem a formar agregados e dupletos. EXEMPLO 3 (modificação da morfologia das células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508: estudo através de citofluorimetria de fluxo)

[084] A diversidade morfológica entre as células de uma cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 e células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, foi analisada qualitativamente e quantitativamente em nível de célula única através de citofluorimetria de fluxo. A referida análise foi realizada como indicado na: TS Gunasekera et al., "International Journal of Food Microbiology" (2003), Vol. 85, Edição 3, pág. 269-279; Cronin UP et al., "Journal of Applied Microbiology" (2010), Vol. 108, Questão 1, pág. 1-16. O citofluorímetro de fluxo utilizado (BD Accuri C6 plus) foi equipado com um laser de íons de argônio que emite a 488 nm. As medições foram realizadas em um total de 20000 eventos com um fluxo de aquisição da amostra igual a 35 μl/min.

[085] Para este efeito, uma amostra de células de uma cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 e uma amostra de células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 foram inoculadas em dois frascos diferentes,

em meio "YEPD" (10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 20 g/L de glucose) foram recolhidas ao alcançar a fase exponencial de crescimento (10 OD660). Antes da aquisição dos parâmetros indicados abaixo, as células foram diluídas na água filtrada em uma concentração de 106 células/ml: as amostras assim diluídas foram analisadas.

[086] Os parâmetros tomados em consideração para efeitos foram "Forward Scatter" (FSC) (“Dispersão Frontal”) e “Side Scatter” (SSC) (“Dispersão Lateral”). O parâmetro FSC permite que a população seja caracterizada com base na dimensão e no estado de agregação das células individuais, enquanto o parâmetro SSC indica a sua granularidade / densidade intracelular: o último parâmetro é influenciado pela presença de grânulos no nível citoplasmático e pelo tamanho das membranas celulares.

[087] Ao analisar os gráficos de dispersão, fornecidos na Figura 4, as diferenças na distribuição da população da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 (A.) e na variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 (C.) podem ser notadas, tanto em termos do valor de FSC quanto em valor de SSC. Em detalhe, os gráficos do histograma destacam que a distribuição da população da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 (B.) é mais homogênea em termos de tamanho, ao passo que no caso da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 a distribuição é mais heterogênea (D.). Comparando os gráficos fornecidos em B. e D.

um "deslocamento" também pode ser observado no valor de FSC da população para à direita, o que indica não só um tamanho de célula maior da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 com relação à cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509, mas também a presença de agregados de células. A presença destes agregados também é confirmada pelas imagens recolhidas sob o microscópio [Figura 2 (B.)].

[088] Os valores médios dos parâmetros FSC e SSC são mostrados na Tabela 3 e indicados como unidades arbitrárias (a.u.). Comparando os valores do parâmetro FSC, pode deduzir-se que a variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 tem tamanhos maiores, em comparação com a cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509. Um aumento é também observado na granularidade / densidade intracelular indicado pelo parâmetro SSC. Em correspondência com os valores de FSC e SSC, o Coeficiente de Variação (CV) é também fornecido (entre parêntese): este parâmetro indica a dispersão dos valores dentro da população, por conseguinte, indicando o grau de uniformidade da mesma.

TABELA 3 ATCC 20509 DSM 32508 FSC (a.u.) 1257 (49%) 6380 (76%) SSC (a.u.) 105 (80%) 876 (132%)

[089] Em conclusão, as análises realizadas por meio de citofluorimetria de fluxo demonstram que a morfologia e a estrutura intracelular da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 são muito diferentes das da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 a partir da qual ela deriva.

EXEMPLO 4 (caracterização genotípica da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508)

[090] Neste exemplo, o processo de caracterização da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 é descrito, por meio de sequenciamento de DNA genômico e análise bioinformática das mutações presentes em comparação com a sequência de DNA genômico da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 a partir do qual ela deriva.

[091] Para esse efeito, o DNA genômico foi extraído a partir de culturas de ambas as cepas (a variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 e a cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509) realizado em meio "YEPD" (10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 20 g/L de glucose) durante uma noite, e purificado com o kit DNeasy Blood & kit Tissue comerciais por Quiagen (cat. Num 69504) seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.

[092] A plataforma utilizada para sequenciamento é o sistema Illumina HiSeq2500. As sequências FASTQ foram geradas com o sistema Illumina Casava, versão 1.8.3. A qualidade de sequenciamento foi verificada com Illumina Chastity e, subsequentemente, com FASTQC versão 0.10.0. A qualidade de sequenciamento foi melhorada utilizando sequências "Trim", versão 8.5.1. Os fragmentos assim produzidos foram montados em regiões contíguas ("contig") usando a opção "De novo assembly" do programa CLS Genomics Workbench versão 8.5.1 e revisado com Pilon versão 1.8, como indicado por Walker BJ et al., em “Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement”, “PLoS One” (2014), 19 de Nov., 9(11), e112963; DOI:10.1371/journal.pone.0112963.

[093] Os "contigs" foram montados em "supercontigs" usando SSPACE premium scaffolder versão 2.3, como indicado por Boetzer M. et al., em “Scaffolding pre-assembled contigs using SSPACE”, “Bioinformatics” (2011), 15 de Fev., 27(4):578-9, doi:10.1093/bioinformatics/btq683, Epub 12 de dez de 2010.

[094] As "lacunas" foram fechadas usando GapFiller versão 1.10, como indicado por Boetzer M. et al, in “Toward almost closed genomes with GapFiller”, “Genome Biology” (2012), 25 de jun., 13(6):R56, DOI:10.1186/gb-2012-13-6-r56.

[095] A anotação do genoma foi feito com o banco de dados Prokka Genome System (http://vicbioinformatics.com/) e com o banco de dados AUGUSTUS v3.0.1

[096] A análise das sequências permitiu a identificação de 2177 regiões contíguas ("contig") de dimensões que variam entre 119195 e os 301 pares de bases (bps), para um total de 19,601,063 pares de bases (bps). Este valor está de acordo com o tamanho do DNA genômico de leveduras filogeneticamente semelhantes ao gênero Trichosporon, portanto, considera-se que as bibliotecas obtidas representam o genoma completo da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, e a cepa de tipo selvagem correspondente de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 a partir da qual ela deriva. As sequências dos dois DNAs genômicos foram comparadas entre si usando o software “Map Reads to Reference” e “Quality-based Variant Detection” (“Leituras de Mapa para Referência” e “Detecção de Variante baseada em Qualidade”) por CLCbio.

[097] As mutações identificadas foram confirmadas através da verificação da existência de sequenciamento em ambas as direções e, por conseguinte, determinam a precisão através do valor de "phred".

[098] No total, no DNA genômico da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, 647 mutações foram destacadas (compreendendo substituições, deleções e inserções de nucleotídeos): 131 mutações levam a uma alteração na sequência da proteína correspondente e elas são mostrados na Tabela 1 e Tabela 2.

EXEMPLO 5 (sensibilidade da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 para o antibiótico caspofungina)

[099] Neste exemplo, foi avaliada a sensibilidade da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 para o antibiótico caspofungina. De fato, tal como descrito em Garcia L. et al., "BMC Genomics"

(2015), DOI: 10.1186/s12864-015-1879-4, mutantes de fungos com defeito na síntese de quitina mostram sensibilidade maior para o antibiótico caspofungina. À luz dos resultados da análise genômica da variante da levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, que evidenciou a presença de mutações que afetam os genes que codificam uma proteína com atividade de sintetase de quitina, a sensibilidade a este antibiótico foi, portanto, avaliada.

[0100] Para este efeito, uma amostra de células de uma cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 e uma amostra de células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 foram inoculadas em dois frascos diferentes, em meio "YEPD" (10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 20 g/L de glucose): os frascos foram colocados em uma incubadora agitada, a 30 ºC, durante uma noite. Subsequentemente, as células foram recolhidas através de centrifugação a 1500 g durante 5 minutos, lavadas em água esterilizada, em seguida, ressuspensa em 1 ml de água estéril obtendo uma suspensão que foi semeada em placas de Petri contendo um meio sólido "YEPD" (ágar 20 g/L, 10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 20 g/L de glucose) contendo diferentes concentrações de caspofungina: 30 ng/ml, 60 ng/ml, 90 ng/ml, 120 ng/ml. Nas referidas placas, pontos de 10 µL da referida suspensão foram plaqueados, diluídos em água estéril de modo a conter cerca de 5, 104, 103, 102 e 10 células. As placas foram incubadas durante 3 dias a 30 ºC para permitir o crescimento das células.

[0101] Os resultados da sensibilidade diferente eram muito mais apreciáveis no meio "YEPD" com 120 ng/ml de caspofungina (Figura 5). A variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, tal como acontece com as cepas de fungos com defeito na síntese de quitina, é mais sensível à cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509, mostrando capacidade de crescimento inferior na presença de caspofungina, portanto, confirmando o seu defeito na síntese de quitina.

EXEMPLO 6 (cultura para a produção de lipídios em um biorreator)

[0102] Neste exemplo, o crescimento e a acumulação de lipídios de células da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 foram avaliados e de células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508.

[0103] Para este efeito, uma amostra de células de uma cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 e uma amostra de células da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 foram inoculados, em dois diferentes frascos de 500 mL, em 100 ml de meio "YEPD" (10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 20 g/L de glucose): os frascos foram colocados em uma incubadora agitada, a 30 ºC, durante uma noite.

[0104] As suspensões celulares obtidas foram usadas para separadamente inocular biorreatores de 20 litros em que 6 L de meio de lipogênese líquida foram arranjados (100 g/L de glucose, 50 g/L de licor de infusão de milho, 2 g/L de extrato de levedura, 6 g/L de di-hidrogenofosfato de potássio [KH2PO4], 0,3 g/L de sulfato de magnésio heptahidratado [MgSO4·7H2O], 0,06 g/L de cloreto de sódio [NaCl], 0,06 g/L de cloreto de cálcio di-hidratado [CaCl2·2H2O]).

[0105] O volume de inóculo para cada cepa é aquele necessário para a obtenção de cerca de 6 L de suspensão de células tendo 0,5 OD660.

[0106] O crescimento ocorreu sob condições aeróbicas por meio da insuflação de ar e agitação variável entre 600 rpm e 900 rpm modulados com o fluxo de ar de modo a manter a concentração de oxigénio dissolvido (DO2) igual a 30% do valor de saturação, e a um pH de cerca de 5,0, mantido através da adição, quando necessário, de algumas gotas de uma solução de KOH a 5 M ou de H2SO4 a 10% (vol/vol).

[0107] O processo foi realizado no modo em batelada para as primeiras 20 horas. Subsequentemente e até 24 horas uma alimentação de nitrogênio foi fornecida, isto é, água de infusão de milho (1,25 g/L) e sulfato de amônio (5,5 g/L). A partir de 24 horas até ao final do processo, uma solução de 600 g/L de glucose foi alimentada, de modo a manter constante a concentração de glucose a cerca de 30 g/L ao longo de todo o processo (90 horas no total).

[0108] Após 90 horas de crescimento, uma amostra de caldo de cultura foi feita a partir de ambos os biorreatores e os seguintes valores foram determinados, operando como descrito acima: - cepa do tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 alcançou uma concentração celular de 89 g/L (ou seja, a quantidade de biomassa expressa em peso seco em células em g por litro de cultura), que contém 47% em peso de lipídios (isto é, uma quantidade de lipídios acumulados expressa como uma relação percentual entre o peso de lipídios e peso total seco), igual a um total de 42 g/L (ou seja, a quantidade de lipídios acumulados expressa como uma concentração de lipídios em g/L); a produtividade máxima foi de 0,52 g/L/h de lipídios, com um rendimento total de 0,17 g de lipídios por g de glucose consumida; - variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 alcançou uma concentração de células de 111 g/L (ou seja, a quantidade de biomassa expressa em peso seco em células em g por litro de cultura), que contém 60% em peso de lipídios (ou seja uma quantidade de lipídios acumulados expressa como uma relação percentual entre o peso de lipídios e peso total seco), igual a um total de 67 g/L (ou seja, a quantidade de lipídios acumulados expressa como uma concentração de lipídios em g/L); a produtividade máxima foi de 0,77 g/L/h de lipídios, com um rendimento total de 0,20 g de lipídios por g de glucose consumida.

EXEMPLO 7 (medição da viscosidade e capacidade de centrifugação do caldo de cultura)

[0109] Em culturas obtidas como descrito acima no Exemplo 6, a viscosidade e densidade foram medidas (por meio de um microviscosímetro Stabinger SVR 3000 Anton Paar, taxa de cisalhamento 1/1000, a 30 ºC) e a capacidade de centrifugação (por meio do teste de rotação usando uma centrífuga IEC Thermo Scientific CL31R Multivelocidade com rotor de ângulo fixo AC 100.10A) em momentos diferentes de inoculação.

[0110] Em particular, os testes de rotação foram realizados por meio de alíquotas de centrifugação de caldo de cultura, igual a 10 mL, a 5000 rpm, durante 10 minutos e medindo o fator de concentração em relação ao caldo de cultura como tal.

[0111] Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4 e na Tabela 5.

TABELA 4 Cepa de tipo selvagem da levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 Tempo Peso seco Lipídios Viscosidade Densidade Concentração (h) (g/L) (%) (cP) (g/cm3) 40 62 25 50 1.044 2X 65 83 41 86 1.041 1.25X 90 89 47 119 1.040 1.2X TABELA 5 Variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 Tempo Peso seco Lipídos Viscosdade Densidade Concentração (h) (g/L) (%) (cP) (g/cm3) 40 71 19 17 1.041 2X 65 99 48 30 1.040 2X

90 111 60 47 1.028 2X

[0112] A partir dos dados apresentados nas Tabelas 4 e 5 pode-se deduzir que o caldo de cultura obtido a partir da variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 possui uma viscosidade mais baixa e maior capacidade de centrifugação do que o obtido a partir da cepa de tipo selvagem de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Variante de levedura oleaginosa CARACTERIZADA pelo fato de ser da espécie Trichosporon oleaginosus depositada em 17 maio de 2017 de acordo com o Tratado de Budapeste no Leibniz -Institute DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - Inhoffenstraße 7 B 38124 Braunschweig (Alemanha), número de depósito DSM 32508

2. Processo para a produção de lipídios, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: - preparar um inóculo que compreende, pelo menos, uma variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508; - alimentar o referido inóculo para um dispositivo de cultura obtendo um caldo de cultura; submeter o referido caldo de cultura à separação para obter uma suspensão aquosa de uma biomassa celular oleaginosa concentrada compreendendo lipídios e uma fase aquosa; - extrair os lipídios intracelulares acumulados no interior das células de levedura.

3. Processo para produção de lipídios de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido processo: é realizado a uma temperatura variando de 10 ºC a 40 ºC, de preferência variando de 20 ºC a 35 ºC; e/ou - é realizado por um tempo que varia de 40 horas a 200 horas, de preferência variando de 80 horas a 150 horas; e/ou é realizado em condições aeróbias; e/ou é realizado a um pH no intervalo 4,5-7,0 de preferência, variando de 5,0 a 6,5.

4. Processo para produção de lipídios de acordo com a reivindicação 2 ou 3,

CARACTERIZADO pelo fato de que o referido processo é realizado a partir de um inóculo em uma quantidade que varia entre 1% e 5% (vol/vol) do volume total do meio de cultura, obtido a partir de um cultura anterior da referida variante de levedura oleaginosa da espécie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, realizada no mesmo meio de cultura durante um tempo variando de 6 horas até 24 horas.

5. Processo para produção de lipídios de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido processo é realizado em um meio de cultura compreendendo glucose como fonte de carbono e sulfato de amônio [(NH4)2SO4] como fonte de nitrogênio.

6. Processo para produção de lipídios de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido processo é realizado em batelada alimentada.

7. Processo para produção de lipídios de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido processo, depois de um tempo que varia de 15 horas a 25 horas após a inoculação, é adicionalmente realizado em batelada alimentada, de preferência, por um tempo que varia de 25 horas a 175 horas, mais preferivelmente variando de 65 horas a 125 horas, adicionando, pelo menos, uma outra fonte de nitrogênio tal como licor de infusão de milho, extrato de levedura, sulfato de amônio, ureia, em uma quantidade tal como adicionar uma quantidade de nitrogênio variando a partir de 0,5 g/L a 5 g/L, ao caldo de cultura.

8. Processo para produção de lipídios de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido processo, depois de um tempo que varia de 15 horas a 25 horas após a inoculação, é adicionalmente realizado em batelada alimentada, preferivelmente por um tempo que varia a partir de 25 horas a 175 horas, mais preferivelmente variando de 65 horas a 125 horas, adicionando uma solução aquosa de glucose, de modo a ter uma concentração constante de glucose no caldo de cultura variando de 25 g/L a 50 g/L.