ES2900031T3 - Variante de levadura oleaginosa y utilización de la misma para la producción de lípidos - Google Patents

Abstract

Levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus presentada el 17de mayo de 2017 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - Inhoffenstraße 7 B 38124 Braunschweig (Alemania), número de depósito DSM 32508.

Description

DESCRIPCIÓN

Variante de levadura oleaginosa y utilización de la misma para la producción de lípidos

La presente invención se refiere a una levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus según se define en las reivindicaciones.

Más particularmente, la presente invención se refiere a la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus, caracterizada por mutaciones que afectan a la síntesis de la pared celular que modifican la morfología de la misma con respecto a la cepa de tipo salvaje de la misma especie. En particular, gracias a dichas mutaciones, se forman agregados celulares que, con respecto a la cepa de tipo salvaje de la misma especie, reducen la viscosidad del caldo de cultivo, son más fácilmente separables del mismo y, de esta manera, facilitan su recuperación.

Dicha levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus se caracteriza además por rendimientos de biomasa celular oleaginosa y acumulación intracelular de lípidos que son similares o incluso superiores a los de la cepa de tipo salvaje.

Además, la presente invención se refiere al procedimiento para la producción de lípidos mediante el cultivo de dicha levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus.

Los lípidos obtenidos de esta manera pueden utilizarse ventajosamente como intermediarios de síntesis, particularmente en el sector denominado de "química verde", o en la producción de biocombustibles, tales como "biodiésel" o "diésel verde", que pueden utilizarse solos o mezclados con otros combustibles para el transporte.

La producción de lípidos mediante métodos microbiológicos se propone como una alternativa ventajosa a los métodos actuales de producción a partir de fuentes renovables. Con respecto a la extracción de los lípidos de las plantas, los procedimientos microbiológicos presentan una mejor relación coste/eficacia, ya que son más fácilmente escalables, requieren menos mano de obra y aprovechan la propiedad de los microorganismos de reproducirse rápidamente a expensas de sustratos de bajo coste, tales como, por ejemplo, derivados de la hidrólisis de los materiales lignocelulósicos. Además, son independientes de factores climáticos y no compiten con la explotación agrícola del suelo con fines alimentarios.

Resultan particularmente prometedores con este propósito las levaduras oleaginosas, es decir, levaduras que pueden, bajo condiciones de cultivo específicas, acumular lípidos, especialmente triglicéridos, en más de 25% de su peso seco. La utilización de levaduras oleaginosas para la producción de lípidos es parte de la técnica anterior, tal como se indica en, por ejemplo: Meng X. et al, "Renewable Energy" (2009), vol. 34, págs. 1-5; Galafassi S. et al., "Bioresource Technology" (2012), vol. 111, págs. 398-403. El documento n° WO 2017/021931 también describe la utilización de una levadura oleaginosa: Trichosporon oleaginosus cepa ATCC n° 20509, para la producción de lípidos.

Generalmente, dichos lípidos se obtienen mediante el cultivo de levaduras oleaginosas bajo condiciones aeróbicas en biorreactores. Las levaduras oleaginosas se cultivan utilizando soluciones de azúcares que pueden obtenerse de plantas amiláceas o frutas dulces y se definen como "azúcares de primera generación", o se obtienen preferentemente mediante el tratamiento y sacarificación de biomasas lignocelulósicas no comestibles y, por lo tanto, se definen como "azúcares de segunda generación". Las biomasas lignocelulósicas pueden ser, por ejemplo, residuos agrícolas, tales como paja de trigo o tallos de maíz, o plantas que no pueden utilizarse para el sector alimentario, tales como caña común, sorgo fibroso, Miscanthus o residuos de procesamiento de plantas no comestibles, tales como guayule, eucalipto, álamo o residuos forestales o residuos de procesamiento de la industria papelera. Dichas mezclas de azúcares de segunda generación, que se denominan hidrolizados, contienen azúcares con 5 (C5) y 6 (C6) átomos de carbono. Las levaduras oleaginosas pueden crecer naturalmente sobre azúcares C5, tales como xilosa y azúcares C6, tales como glucosa, produciendo biomasa celular y, bajo condiciones de crecimiento particulares, acumular lípidos en un porcentaje elevado con respecto al peso celular seco.

A partir del cultivo de dichas levaduras oleaginosas en el biorreactor, se obtiene un caldo de cultivo que incluye biomasa celular oleaginosa para la recuperación. Posteriormente, los lípidos acumulados dentro de las células deben extraerse y separarse del caldo de cultivo todavía presente y de los residuos celulares resultantes de técnicas de lisis o ruptura apropiadas.

Uno de los puntos críticos principales en relación a la producción de lípidos mediante métodos microbiológicos se refiere al hecho de que la productividad volumétrica (es decir, la cantidad de lípidos que se obtendrá por unidad de volumen de caldo de cultivo) es limitada y, en general, es inferior a 100 g/l. En consecuencia, la aplicación industrial de dichos procedimientos industriales contempla la utilización de volúmenes significativos de caldo de cultivo de dichos microorganismos. Dichos grandes volúmenes de caldo de cultivo deben, evidentemente, tratarse para recuperar la biomasa celular oleaginosa resultante y proceder con la extracción de los lípidos, en plantas grandes, con elevados costes de instalación y procesamiento.

Para el propósito de garantizar la relación coste/eficacia del procedimiento de producción de lípidos, el cultivo de levaduras oleaginosas debe alcanzar una elevada densidad celular, permitiendo por lo tanto incrementar la productividad de dicho procedimiento con el fin de minimizar el volumen de caldo de cultivo y el número de biorreactores utilizado. Al final del crecimiento, la biomasa celular oleaginosa obtenida debe concentrarse con el fin de reducir los volúmenes de material que debe tratarse en las etapas de extracción posteriores de los productos obtenidos (p.ej., aceites microbianos y lípidos) y optimizar el tamaño de los equipos y volúmenes de reactivos necesarios para la recuperación.

Las soluciones técnicas utilizadas actualmente para recuperar la biomasa celular oleaginosa a partir del caldo de cultivo al final del crecimiento de las levaduras oleaginosas anteriormente indicadas son principalmente de una naturaleza física o química.

Las levaduras oleaginosas utilizadas para la producción industrial de lípidos, especialmente en el caso en que alcanzan una densidad celular elevada, puede conducir a caldos de cultivo de elevada viscosidad en los que la biomasa celular oleaginosa obtenida resulta difícil de separar de la fase acuosa, debido a sus características morfológicas y la síntesis de sustancias con propiedades tensioactivas. Además, la viscosidad del caldo de cultivo provoca que el cultivo de las levaduras oleaginosas en el biorreactor resulte más difícil y costoso, debido a la menor mezcla y eficiencia de oxigenación del medio de cultivo. Dicho punto crítico resulta particularmente claro en el caso de que el procedimiento de producción de lípidos se lleve a cabo utilizando levaduras oleaginosas que sean elevados productores de lípidos, tales como, por ejemplo, los pertenecientes al género Trichosporon.

Comúnmente, para separar la biomasa celular oleaginosa obtenida al final del procedimiento de producción de lípidos respecto del caldo de cultivo, se utilizan técnicas que implican una diferencia de densidad entre las dos fases del caldo de cultivo (es decir, la fase acuosa y la biomasa celular oleaginosa), tales como la centrifugación, la sedimentación espontánea, los hidrociclones, la filtración, el filtro-prensado, la microfiltración, la ultrafiltración, en ocasiones acoplada continuamente con el biorreactor en el que se lleva a cabo dicho procedimiento. En el caso de que se utilicen levaduras oleaginosas pertenecientes al género Trichosporon, la eficiencia de dichas técnicas es, sin embargo, muy baja, debido a que la biomasa celular oleaginosa obtenida presenta una densidad muy similar a la de la fase acuosa.

Con el propósito de incrementar la eficiencia, pueden añadirse floculantes al caldo de cultivo, de manera que se creen agregados celulares que, debido a sus dimensiones, sedimentan más fácilmente que las células individuales. Sin embargo, la adición de floculantes en las proporciones prescritas en la técnica anterior no ha llevado a una mejora de la separación de la biomasa celular oleaginosa respecto de la fase acuosa. Además, la adición de floculantes puede ser incompatible con los posteriores procedimientos de extracción de lípidos, debido a la elevada afinidad de dichos floculantes con los solventes utilizados para la extracción. En la práctica, dichos floculantes podrían extraerse junto con los lípidos intracelulares y, por lo tanto, representar impurezas que deben eliminarse antes de la utilización de los lípidos mismos.

Otras metodologías utilizadas para la concentración de la biomasa celular oleaginosa se basan en técnicas de filtración. Sin embargo, las sustancias con propiedades tensioactivas frecuentemente producidas por las levaduras oleaginosas dificultan la permeación de la fase acuosa a través de la membrana utilizada para la filtración, provocando que el procedimiento resulte ineficiente.

También se conocen métodos que contemplan la evaporación del exceso de agua, tales como, por ejemplo, el calentamiento para inducir la evaporación, o el secado de la biomasa celular con técnicas tales como, por ejemplo, el secado por pulverización o la liofilización: sin embargo, dichos métodos resultan eficaces en la concentración de la biomasa celular, aunque requieren un gran consumo de energía y no son económicamente viables para un procedimiento industrial para la producción posterior de intermediarios de síntesis, particularmente en el sector denominado de "química verde", o en la producción de biocombustibles.

También se conocen métodos que contemplan tratamientos térmicos, a pH neutro o ácido, llevados a cabo generalmente después de drenar el caldo de cultivo del biorreactor utilizado en el procedimiento de producción de lípidos, al final de dicho procedimiento, de manera que resulte adecuado para la centrifugación/filtración y para facilitar la recuperación de la biomasa celular oleaginosa obtenida. Sin embargo, dichos métodos requieren además consumos energéticos adicionales y, al operar a pH ácido, la neutralización de los residuos acidificados.

Además, algunos de los métodos indicados anteriormente pueden conducir a la degradación de las estructuras celulares, que comprenden las características del producto final que debe obtenerse. Finalmente, los métodos indicados anteriormente no tratan el problema de la viscosidad del caldo de cultivo y el consecuente incremento de la energía requerida debido a la necesidad de mantener una buena mezcla y una buena oxigenación dentro del biorreactor utilizado.

Se han llevado a cabo estudios con el fin de superar las desventajas anteriormente indicadas.

Por ejemplo, la solicitud de patente internacional n° WO 2013/155050 describe un microorganismo oleaginoso para la producción de materiales a partir de fuentes renovables, en el que dicho microorganismo comprende una modificación genética no presente en el microorganismo no modificado, y en el que dicho microorganismo produce un caldo de fermentación que presenta una viscosidad inferior que la producida por el microorganismo no modificado. El microorganismo oleaginoso anteriormente indicado se afirma que presenta una síntesis reducida de polisacáridos exocelulares y que es capaz de producir lípidos con altos rendimientos.

Debido a que la producción de materiales a partir de fuentes renovables, particularmente lípidos, ventajosamente utilizables en la producción de intermediarios de síntesis en el denominado sector de la "química verde", o en la producción de biocombustibles, todavía resulta de gran interés, el estudio de nuevas levaduras oleaginosas capaces de producir lípidos con buenos rendimientos y que resulten más fácilmente recuperables a partir del caldo de cultivo también resulta de gran interés.

Por lo tanto, el Solicitante se ha centrado en resolver el problema de identificar una levadura oleaginosa capaz de producir lípidos con buenos rendimientos y que resulte más fácilmente recuperable a partir del caldo de cultivo.

El Solicitante ahora ha identificado una variante de levadura oleaginosa capaz de producir lípidos con buenos rendimientos y más fácilmente recuperable a partir del caldo de cultivo.

En particular, la invención se refiere a una levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus presentada el 17 de mayo, 2017 de acuerdo con el Tratado de Budapesten el Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - InhoffenstralJe 7 B 38124 Braunschweig (Alemania), número de depósito n° DSM 32508, caracterizada por mutaciones que afectan a la síntesis de la pared celular que modifican su morfología con respecto a la cepa de tipo salvaje de la misma especie. En particular, gracias a dichas mutaciones, se forman agregados celulares que, con respecto a la cepa de tipo salvaje de la misma especie, reducen la viscosidad del caldo de cultivo, son más fácilmente separables del mismo y, de esta manera, facilitan su recuperación. Además, dicha variante de levadura oleaginosa se caracteriza por rendimientos de biomasa celular oleaginosa y acumulación intracelular de lípidos que son similares o incluso superiores a los de la cepa de tipo salvaje.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al procedimiento para la producción de lípidos mediante el cultivo de dicha levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508.

Para el propósito de la presente descripción y las reivindicaciones siguientes, las definiciones de los intervalos numéricos siempre comprenden los extremos, a menos que se especifique lo contrario.

Para el propósito de la presente descripción y de las reivindicaciones siguientes, la expresión "que comprende" incluye además las expresiones "que consiste esencialmente en" o "que consiste en".

Para el propósito de la presente descripción y de las reivindicaciones siguientes, el término "biodiésel" se refiere a un combustible para motores diésel que comprende ésteres de alquilo (p.ej., metilo, propilo o etilo) de ácidos grasos de cadena larga derivados de fuentes biológicas.

Para el propósito de la presente descripción y de las reivindicaciones siguientes, la expresión "diésel verde" se refiere a un combustible para motores diésel que comprende productos de hidrogenación o desoxigenación de lípidos derivados de fuentes biológicas en presencia de hidrógeno y por lo menos un catalizador.

Para el propósito de la presente descripción y de las reivindicaciones siguientes, el término "cultivo" indica los procedimientos mediante los que las células de un microorganismo crecen y se reproducen bajo condiciones controladas por el ser humano. Los procedimientos definidos por los términos anteriores comprenden el "cultivo" de levadura oleaginosa, realizado en algunas realizaciones de la presente invención.

Para el propósito de la presente descripción y de las reivindicaciones siguientes, la expresión "medio de cultivo" se refiere a un líquido, o a un gel, proporcionado para proporcionar soporte al crecimiento de los microorganismos, p.ej., de las células de levadura oleaginosa. El medio de cultivo puede ser de una composición definida (p.ej., medio "YEPD", medio "B", etc.) o puede derivarse del tratamiento de fuentes no seleccionadas, tales como, por ejemplo, agua residual, residuos de mercados o material lignocelulósico hidrolizado.

Para el propósito de la presente descripción y de las reivindicaciones siguientes, las expresiones "fuente de carbono", "fuente de nitrógeno", "fuente de azufre" y "fuente de fósforo" se refieren a sustancias orgánicas o inorgánicas, o composiciones de dichas sustancias basadas en carbono, nitrógeno, azufre (p.ej., sulfatos) y fósforo (p.ej., fosfatos), respectivamente, contenidos en el medio de cultivo y que un microorganismo puede metabolizar para obtener energía.

Para el propósito de la presente descripción y de las reivindicaciones siguientes, el término "biomasa" se refiere al conjunto de células producidas durante el procedimiento de producción de lípidos según la presente invención o en los demás métodos de cultivo.

Las características y ventajas adicionales de la presente invención resultan evidentes a partir de la descripción detallada siguiente.

Por lo tanto, la materia objeto de la presente invención está constituida por una levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus presentada el 17 de mayo, 2017 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - InhoffenstralJe 7 B 38124 Braunschweig (Alemania), número de depósito n° DSM 32508.

El genotipo de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 se caracterizó mediante la comparación de la secuencia de su ADN genómico con la de la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 tal como se indica en el Ejemplo 4, informado posteriormente.

El genoma de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 presenta un tamaño de 19601063 pares de bases (pbs) y contiene 8283 genes. De ellos, se han identificado 3621 genes con una función conocida y se han anotado 4419 genes. A partir de la comparación del genoma de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, se ha señalado un total de 647 mutaciones, 228 de las cuales son homocigóticas y 420, heterocigóticas.

Las mutaciones que afectan a las regiones codificantes se describen posteriormente, que directa o indirectamente conducen a una modificación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por los genes en los que se encuentra cada mutación. En particular, se analizan las proteínas que participan en el procedimiento de síntesis de la pared celular, cuya modificación puede afectar a la morfología celular, a las características de viscosidad del caldo de cultivo y a la facilidad de sedimentación de las células de levadura presentes en dicho caldo de cultivo. Más en particular, existe un total de 131 mutaciones de las regiones codificantes que conducen a una modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente. De los últimos, 22 son por deleción, 13 por inserción, 89 por variación de nucleótidos únicos (VNU) y 3 por variación de múltiples nucleótidos (VMN). Se identificaron 30 mutaciones homocigóticas (identificadas en genes presentes en una única copia). De ellos, en particular una mutación por deleción resulta en un gen cuya proteína está asociada a componentes de la pared, en particular la quitina, y que, por lo tanto, sin pretender referirse a ninguna teoría, podrían correlacionarse con un fenotipo de morfología diferente de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 y determinar su mayor facilidad de sedimentación (centrifugabilidad). De hecho, la mutación por deleción causa la falta de síntesis de una proteína con actividad de quitina sintasa (anotada por homología como quitina sintasa 4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae), impidiendo de esta manera la producción correcta de quitina, necesaria para la formación de una pared celular completa. De hecho, las variantes de la levadura Saccharomyces cerevisiae que presentan mutaciones en la síntesis de la quitina muestran defectos en la separación de las células hija respecto de las células madre, generando por lo tanto grupos de células no separadas. Además, las células muestran una forma y tamaño diferentes a los de la cepa de tipo salvaje, tal como se informa en, por ejemplo: Bulawa C. E., "Annual Review of Microbiology" (1993), vol.

47, págs. 505-534; Cabib E. et al., "Nature Reviews Microbiology" (2013), vol. 11, págs. 648-655.

Se identificaron 269 mutaciones heterocigóticas (identificadas en genes presentes en más de una copia) en regiones codificantes de proteínas, 92 de las cuales se encontraban presentes en genes codificantes de proteínas cuya función es desconocida. De ellas, tres mutaciones que afectan a genes cuya proteína está asociada a componentes de la pared o membrana celular, y por lo tanto, que potencialmente participan en alteraciones de sus características morfológicas y funcionales. En particular, una mutación por deleción se refiere al gen codificante de una lipoproteína membranal putativa. La segunda mutación, por variación de nucleótidos únicos (VNU) que produce el cambio de un solo aminoácido en la proteína, afecta a la codificación génica de un enzima que participa en la biosíntesis del N-acetilglucosaminil-fosfatidilinositol (GlcNAc-PI), el primer intermediario en la "ruta" del "anclaje GPI", es decir, el glicolípido que es necesario para anclar las proteínas a la pared celular. La tercera mutación, también por variación de nucleótido único (VNU), se refiere al gen que codifica para una proteína con actividad de quitina sintasa, y que por lo tanto participa en la síntesis de la quitina (anotada por homología como quitina sintasa 1 de la levadura Saccharomyces cerevisiae). También en dicho caso, sin pretender referirse a ninguna teoría, la totalidad de dichas mutaciones, incluso las heterocigóticas, aunque asociadas a mutaciones homocigóticas que afectan a la síntesis de la quitina, podrían estar correlacionadas con el fenotipo de diferente morfología de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 y determinar profundas alteraciones de la estructura de la pared celular, generando agregados celulares que resultan más fácilmente separables de la fase acuosa del caldo de cultivo.

Las Tablas 1 y 2, posteriormente, muestran mutaciones detectadas en el ADN genómico de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 (mutante) con respecto a la cepa de tipo salvaje (Tipo salvaje), que conducen a un cambio en la secuencia de la proteína. Para cada mutación, se indica la posición del denominado "andamiaje", es decir, en una de las regiones contiguas del ADN genómico que, ensamblado basándose en su secuencia de nucleótidos, permite la reconstrucción del genoma. Las Tablas 1 y 2 también indican: el tipo de mutación: VNU "variación de nucleótido único", es decir, mutación de un único nucleótido; VMN: "variación de múltiples nucleótidos", es decir, mutación de diversos nucleótidos en la secuencia; inserción de uno o más nucleótidos; deleción de uno o más nucleótidos; el número de nucleótidos participantes; el nucleótido o nucleótidos modificados (por mutación, inserción o deleción), respectivamente, en el genoma de la cepa de tipo salvaje y en el genoma de la variante de levadura oleaginosa DSM 32508. Las mutaciones homocigóticas son las identificadas en los genes presentes en una sola copia en el genoma (Tabla 1); las mutaciones heterocigóticas son las identificadas en genes presentes en diversas copias en el genoma (Tabla 2).

TABLA 2

TABLA 2 (continuación)

TABLA 2 (continuación)

La modificación de la morfología celular de la variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, en comparación con la de la cepa de tipo salvaje, se verificó en diversos experimentos, algunos de los cuales se describen en los ejemplos proporcionados posteriormente, en los que dicha modificación se detectó bajo un microscopio óptico y mediante citofluorimetría de flujo. Además, se determinó la producción de biomasa y la cantidad de lípidos acumulada durante el procedimiento de producción de lípidos según la presente invención. Finalmente, se determinó la viscosidad y la centrifugabilidad (es decir, el factor de concentración) del caldo de cultivo obtenido de dicho procedimiento en diferentes tiempos desde la inoculación.

La levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 objeto de la presente invención se obtuvo mediante un procedimiento de mutagénesis realizado mediante la exposición de las células de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 a radiación ultravioleta (UV) con longitudes de onda comprendidas entre 230 nm y 260 nm. La mutagénesis por exposición a radiación UV puede llevarse a cabo según la técnica anterior tal como se indica en, por ejemplo, Winston F. et al, "Current Protocols in Molecular Biology" (2008), DOI:10.1002/0471142727.mb1302s82, John Wiley & Sons. Por ejemplo, dicha mutagénesis puede llevarse a cabo mediante la exposición de las células de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 aplicada en una placa Petri sobre medio solidificado con agar a una fuente de radiación UV (representada por como mínimo una lámpara con una potencia comprendida entre 8 vatios y 15 vatios, con longitudes de onda comprendidas entre 230 nm y 260 nm), situada a una distancia de la placa Petri comprendida entre 10 y 50 cm, durante un tiempo comprendido entre 5 segundos y 5 minutos.

Tal como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere al procedimiento para la producción de lípidos mediante el cultivo de dicha variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus.

Por lo tanto, una materia objeto adicional de la presente invención es un procedimiento para la producción de lípidos, que comprende:

- preparar un inóculo que comprende por lo menos una levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508;

- alimentar dicho inóculo a un dispositivo de cultivo, obteniendo un caldo de cultivo,

- someter dicho caldo de cultivo a separación, obteniendo una suspensión acuosa de una biomasa celular oleaginosa concentrada que comprende lípidos y una fase acuosa,

- extraer los lípidos intracelulares acumulados dentro de las células de levadura.

Para el propósito del procedimiento según la presente invención, dicho dispositivo de cultivo puede ser, por ejemplo, un biorreactor y dicha separación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante centrifugación.

Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento puede llevarse a cabo a una temperatura comprendida entre 10°C y 40°C, preferentemente comprendida entre 20°C y 35°C.

Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento puede llevarse a cabo durante un tiempo comprendido entre 40 horas y 200 horas, preferentemente comprendido entre 80 horas y 150 horas. Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas.

Dichas condiciones aeróbicas pueden conseguirse, por ejemplo, mediante insuflado de aire estéril en el dispositivo de cultivo y mediante agitación variable, en donde dicha agitación depende del tipo de dispositivo de cultivo utilizado. Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento puede llevarse a cabo a un pH comprendido entre 4,5 y 7,0, preferentemente comprendido entre 5,0 y 6,5. Para el fin de mantener el pH en los intervalos deseados, puede añadirse una solución acuosa al medio de cultivo de por lo menos una base inorgánica, por ejemplo, hidróxido sódico (NaOH), hidróxido potásico (KOH), dihidróxido cálcico [Ca(OH)2], hidróxido de magnesio [Mg(OH)2], o mezclas de los mismos, preferentemente hidróxido potásico (KOH), o una solución acuosa de por lo menos un ácido inorgánico, tal como, por ejemplo, ácido fosfórico (H3PO4), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl), o mezclas de los mismos, preferentemente ácido sulfúrico (H2SO4), en cantidades suficientes para obtener el pH deseado.

Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento puede llevarse a cabo partiendo de un inóculo en una cantidad comprendida entre 1% y 5% (v/v) del volumen total de medio de cultivo, obtenido de un cultivo anterior de dicha levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, realizado en el mismo medio de cultivo durante un tiempo comprendido entre 6 y 24 horas.

Dicho cultivo anterior puede, a su vez, inocularse con un cultivo anterior, o puede inocularse partiendo de una muestra de dicha levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, mantenida a -80°C en suspensión que contiene glicerol al 15% (v/v).

Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento puede llevarse a cabo en un medio de cultivo que comprende glucosa como fuente de carbono y sulfato amónico [(NH4)2SO4] como fuente de nitrógeno.

Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento puede llevarse a cabo alimentado por lotes.

Según una forma de realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento, tras un tiempo comprendido entre 15 y 25 horas posteriores a la inoculación, puede llevarse a cabo adicionalmente en modo alimentado por lotes, preferentemente durante un tiempo comprendido entre 25 y 175 horas, más preferentemente comprendido entre 65 y 125 horas, mediante la adición de una fuente de nitrógeno adicional, tal como, por ejemplo, licor de maceración del maíz, extracto de levadura, sulfato amónico y urea en cantidades suficientes para añadir al caldo de cultivo una cantidad total de nitrógeno comprendida entre 0,5 y 5 g/l.

Según una realización preferente de la presente invención, dicho procedimiento, tras un tiempo comprendido entre 15 y 25 horas posteriores a la inoculación, puede llevarse a cabo adicionalmente en modo alimentado por lotes, preferentemente durante un tiempo comprendido entre 25 y 175 horas, más preferentemente comprendido entre 65 y 125 horas, mediante la adición de una solución acuosa e glucosa, de manera que se disponga de una concentración constante de glucosa en el caldo de cultivo comprendida entre 25 y 50 g/l.

El crecimiento celular durante el cultivo puede medirse por medios espectrofotométricos, determinando la turbidez o la densidad óptica (DO) de una muestra de caldo de cultivo a 660 nm (DO660).

Al final del procedimiento anteriormente indicado, las células de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 utilizada pueden separarse del caldo de cultivo mediante métodos conocidos del estado de la técnica, tales como, por ejemplo, la filtración, el filtrado/prensado, la microfiltración o ultrafiltración o la centrifugación, preferentemente mediante centrifugación. Preferentemente, dicha centrifugación puede llevarse a cabo durante un tiempo comprendido entre 5 y 30 minutos, preferentemente comprendido entre 15 y 25 minutos, a una velocidad de rotación comprendida entre 3000 y 9000 rpm, preferentemente comprendida entre 4000 y 8000 rpm. Debe señalarse que las condiciones operativas indicadas para la centrifugación se refieren a un procedimiento llevado a cabo a escala de laboratorio: en el caso de un procedimiento industrial, en el que generalmente se utilizan centrífugas continuas, el experto en la materia podrá adaptar dichas condiciones operativas.

La concentración de biomasa celular oleaginosa obtenida puede medirse en gramos por litro de caldo de cultivo, determinando el peso seco de las células de levadura oleaginosa de una muestra de caldo de cultivo de un volumen conocido extraída a intervalos prefijados y al final de dicho procedimiento. En particular, "peso seco" de biomasa celular oleaginosa se refiere al peso de las células contenidas en un volumen conocido de caldo de cultivo, determinado mediante pesadas de las células anteriormente indicadas tras eliminar todo el contenido de agua mediante un tratamiento térmico en un horno ventilado a 105°C hasta peso constante (aproximadamente 24 horas).

Para el propósito de recuperar lípidos, la biomasa celular oleaginosa obtenida puede someterse a lisis celular según procedimientos conocidos del estado de la técnica y descritos en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional n° WO 2014/102254, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento térmico en un reactor presurizado, el tratamiento mecánico con un homogeneizador o el tratamiento de microondas.

Al final de dicha lisis celular, los lípidos pueden recuperarse de la suspensión obtenida, mediante extracción con solventes orgánicos polares o no polares, según procedimientos conocidos del estado de la técnica y descritos en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional n° W o 2014/102254.

La producción de lípidos mediante las levaduras oleaginosas al final del procedimiento objeto de la presente invención puede medirse con métodos colorimétricos conocidos del estado de la técnica, directamente en muestras de suspensiones de células levaduras, por ejemplo con sulfo-fosfovainillina utilizando, por ejemplo, el kit "Total lipids -sulpho-phospho vanilline", comercializado por Spinreact S.A.U., Ctra. Santa Coloma, 7 E-17176 St. Esteve d'en Bas (GI), España.

Además, la cantidad de lípidos producida puede determinarse con métodos gravimétricos en la fracción extraída con mezclas de solventes orgánicos, por ejemplo con cloroformo:metanol 2:1 v/v tal como se indica en Folch J. et al, "The Journal of Biological Chemistry" (1957), vol. 226, págs. 497-509; o extraídos con n-hexano:isopropanol 3:2 v/v tal como se describe en Hara A. et al, "Analytical Biochemistry" (1978), vol. 90, págs. 420-426, de muestras de biomasa liofilizada.

Por lo tanto, para evaluar el rendimiento en relación a la acumulación de lípidos, en el procedimiento objeto de la presente invención, de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, con respecto a la cepa de tipo salvaje, en los ejemplos siguientes, el peso seco de la biomasa (expresada en g/l) y la cantidad de lípidos (expresada en g/l) se determinaron con los métodos indicados anteriormente al final de dicho procedimiento y se calculó la relación de porcentajes entre dichos dos parámetros.

Debe señalarse que, operando según el procedimiento objeto de la presente invención, la variante de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, con respecto a la cepa de tipo salvaje de la misma especie, permite obtener un incremento de la productividad de hasta 50% y un incremento del título de lípidos de hasta 70%.

Debe señalarse además que, operando según el procedimiento objeto de la presente invención, el caldo de cultivo obtenido al final de dicho procedimiento con la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, con una concentración de células de levadura oleaginosa y contenido de lípidos equivalentes, presenta una viscosidad entre 2 y 10 veces inferior a la viscosidad del caldo de cultivo obtenido con la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509, realizado bajo las mismas condiciones operativas.

La fracción de lípidos se analizó mediante técnicas cromatográficas, por ejemplo, mediante cromatografía de gases o mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) según procedimientos conocidos de la técnica anterior.

Mediante dichos métodos analíticos se detectó que los lípidos acumulados en las células de levadura oleaginosa, tanto de la cepa variante como de la cepa de tipo salvaje, están representados al 90% por triglicéridos, preferentemente ésteres de glicerol con ácidos grasos que presentan 8 a 24 átomos de carbono, tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico y ácido a-linoleico.

Otros lípidos que pueden encontrarse presentes son: fosfolípidos, monoglicéridos, diglicéridos, ácidos grasos libres o mezclas de los mismos.

Los lípidos obtenidos según el procedimiento objeto de la presente invención pueden utilizarse ventajosamente como intermediarios de síntesis, particularmente en el sector denominado de "química verde". Además, pueden someterse a transesterificación en presencia de por lo menos un alcohol que presenta 1 a 4 átomos de carbono, preferentemente metanol o etanol, y por lo menos un catalizador ácido o básico, con el fin de producir glicerol y ésteres de alquilo, en particular ésteres de metilo o ésteres de etilo ("biodiésel").

Alternativamente, dichos lípidos pueden someterse a hidrogenación/desoxigenación en presencia de hidrógeno y por lo menos un catalizador con el fin de producir "diésel verde". Los procedimientos hidrogenación/desoxigenación son conocidos de la técnica anterior y se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente europea n° EP 1.728.844.

Para el propósito de poner en práctica la presente invención e ilustrarla más claramente, a continuación, se proporcionan algunos ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1 (obtención de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508)

Un ejemplo de la aplicación del método de obtención de variantes de la cepa de tipo salvaje de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 se proporciona posteriormente, que ha conducido a obtener la variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus presentada en el Leibniz-Institut DSMZ, con el número de depósito n° DSM 32508. En dicho ejemplo, se obtuvo la mutagénesis casual mediante radiación UV.

Para dicho propósito, se inoculó una muestra de células de una cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 en un matraz que contenía medio "YEPD" (extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l, glucosa 20 g/l): el matraz de introdujo en un incubador bajo agitación, a 30°C durante una noche. Seguidamente, se recogieron las células mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos, se lavaron en agua estéril; después, se diluyeron 1:10 en agua estéril y se sembraron sobre placas Petri que contenían un medio sólido "B" de lipogénesis (agar 20 g/l, glucosa 50 g/l, sulfato amónico [(NH4)2SO4] 1 g/l, extracto de levadura 1 g/l, dihidrogenofosfato potásico [KH2PO4] 1 g/L, sulfato de magnesio heptahidrato [MgSO4-7H2O] 0,05 g/l, cloruro sódico [NaCl] 0,01 g/l, dihidrato de cloruro cálcico [C a C h ^^O ] 0,01 g/l) de manera que se obtuviesen aproximadamente 100 colonias en cada placa.

Las placas se expusieron a una fuente de radiación ultravioleta, representada por una lámpara de UV de 15 vatios (longitud de onda: 254 nm), situada a una distancia de 10 cm durante un tiempo igual a 40 segundos, de manera que se obtuviese una tasa de vitalidad residual de 10%. Seguidamente, se incubaron las placas a 30°C durante 4 días, hasta que las colonias habían alcanzado un tamaño suficiente para el recuento. Tras la mutagénesis, se seleccionó una colonia con bordes irregulares y dentados correspondiente a una variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 que se sembró nuevamente sobre placas Petri que contenían el medio sólido "B" de lipogénesis anteriormente indicado.

Con fines comparativos, algunas placas no se expusieron a mutagénesis.

La figura 1 muestra:

(A) : una foto de una placa Petri que no había sido expuesta a mutagénesis en la que puede observarse que las colonias de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 presentan una forma redonda y una apariencia brillante y mucosa,

(B) una foto de una placa Petri en la que puede observarse que las colonias de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus Ds M 32508 presenta bordes irregulares y dentados y una apariencia no brillante.

EJEMPLO 2 (modificación de la morfología celular de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508; observación bajo el microscopio óptico).

La diversidad morfológica entre células de una cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 y las células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 se evaluó utilizando un microscopio óptico.

Para dicho propósito, se inoculó una muestra de células de una cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 y una muestra de células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 en dos matraces diferentes, en medio "YEPD" (extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l, glucosa 20 g/l): los matraces se introdujeron en un incubador bajo agitación, a 30°C durante una noche. Seguidamente, de cada matraz, se obtuvo una alícuota de caldo de cultivo, se aplicó sobre un portaobjetos y se observó bajo el microscopio óptico con una magnificación de 400X (figura 2).

En la figura 2 puede observarse que:

(A) : las células de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 son de forma ovalada o ligeramente alargada, se encuentran en la etapa de reproducción activa y las gemas se separan correctamente al final del proceso de gemación,

(B) : las células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 son muy alargadas y no concluyen correctamente el proceso de gemación y tienden a formar agregados.

Seguidamente, se transfirió una alícuota de células procedentes de cada uno de los cultivos anteriores, en dos matraces diferentes, en medio liquido "B" de lipogénesis (glucosa 50 g/l, sulfato amónico [(N H ^S O 4] 1 g/l, extracto de levadura 1 g/l, dihidrogenofosfato potásico [KH2PO4] 1 g/l, heptahidrato de sulfato de magnesio [MgSO4-7H2O] 0,05 g/l, cloruro sódico [NaCl] 0,01 g/l, dihidrato de cloruro cálcico [C a C h ^^O ] 0,01 g/l), de manera que se obtiene una densidad celular de 0,1 DO660/ml: los matraces se introdujeron en un incubador bajo agitación, a 30°C, durante 96 horas. Seguidamente, de cada matraz, se obtuvo una alícuota de caldo de cultivo, se aplicó sobre un portaobjetos y se observó bajo el microscopio óptico con una magnificación de 400X (figura 3).

En la figura 3 puede observarse que:

(A) : las células de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 presentan una forma redondeada y presentan la apariencia de células individuales,

(B) : las células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 son muy alargadas y tienden a formar dobletes y agregados.

EJEMPLO 3 (modificación de la morfología celular de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508; estudio mediante citofluorimetría de flujo).

La diversidad morfológica entre células de una cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 y las células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 se evaluó cualitativa y cuantitativamente a nivel de células individuales mediante citofluorimetría de flujo. Dicho análisis se llevó a cabo tal como se indica en: Gunasekera T. S. et al., "International Journal of Food Microbiology" (2003), vol. 85, número 3, págs. 269-279; Cronin U. P. et al, "Journal of Applied Microbiology" (2010), vol. 108, número 1, págs. 1-16. El citofluorímetro de flujo utilizado (BD Accuri C6 plus) se dotó de un láser de argón ionizado que emite a 488 nm. Las mediciones se llevaron a cabo en un total de 20000 sucesos con un flujo de adquisición de la muestra igual a 35 pl/min.

Para dicho propósito, se inoculó una muestra de células de una cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 y una muestra de células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 en dos matraces diferentes, en medio "YEPD" (extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l, glucosa 20 g/l) y se recogieron al alcanzar la etapa de crecimiento exponencial (10 DO660). Antes de la adquisición de los parámetros indicados posteriormente, las células se diluyeron en agua filtrada a una concentración de 106 células/ml: se analizaron las muestras diluidas de esta manera.

Los parámetros considerados para el propósito eran de "Dispersión frontal" (FSC, por sus siglas en inglés) y "Dispersión lateral" (SSC). El parámetro FSC permite caracterizar la población basándose en la dimensión y estado de agregación de las células individuales, mientras que el parámetro SSC indica su granularidad intracelular/densidad: este último parámetro resulta influido por la presencia de gránulos al nivel citoplasmático y por el tamaño de las membranas celulares.

Mediante el análisis de los gráficos de dispersión, proporcionados en la figura 4, pueden observarse las diferencias de distribución de la población de la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 (A.) y en la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 (C.) tanto en términos del valor FSC como del valor SSC. En detalle, los gráficos histogramas subrayan que la distribución de la población de la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 (B.) es más homogénea en términos de tamaño, mientras que en el caso de la variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, la distribución es más heterogénea (D.). En la comparación de los gráficos proporcionados en B. y D., también puede observarse un "desplazamiento" en el valor FSC de la población hacia la derecha, que indica no sólo un mayor tamaño celular de la variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 con respecto a la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509, aunque también la presencia de agregados celulares. La presencia de dichos agregados también resulta confirmada por las imágenes recogidas bajo el microscopio [Figura 2 (B.)].

Los valores medios de los parámetros FSC y SSC se muestran en la Tabla 3 y se indican en unidades arbitrarias (u.a.). A partir de la comparación de los valores del parámetro FSC, puede deducirse que la variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 presenta tamaños mayos que la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509. También se observa un incremento de la granularidad intracelular/densidad indicada por el parámetro SSC. En correspondencia con los valores FSC y SSC, también se proporciona el coeficiente de variación (CV) (entre paréntesis): este parámetro indica la dispersión de los valores dentro de la población, indicando por lo tanto el grado de uniformidad de la misma.

TABLA 3

En conclusión, los análisis realizados mediante citofluorimetría de flujo muestra que la morfología y la estructura intracelular de la variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 son muy diferentes de los de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 a partir de la que deriva.

EJEMPLO 4 (caracterización genotípica de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508)

En el presente ejemplo, se describe el procedimiento de caracterización de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, mediante secuenciación del ADN genómico y análisis bioinformático de las mutaciones presentes en comparación con la secuencia de ADN genómico de la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 a partir de la que deriva.

Con ese propósito, se extrajo el ADN genómico a partir de los cultivos de ambas cepas (la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 y la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509) obtenidos en medio "YEPD" (extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l y glucosa 20 g/l) durante una noche y se purificaron con el kit comercial DNeasy Blood & Tissue de Quiagen (n° de cat. 69504) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La plataforma utilizada para la secuenciación era el sistema Illumina HiSeq2500. Se generaron las secuencias FASTQ con el sistema Illumina Casava, versión 1.8.3. La calidad de la secuenciación se comprobó con Illumina Chastity y seguidamente con FASTQC versión 0.10.0. La calidad de la secuenciación se mejoró utilizando "Trim sequences", versión 8.5.1. Los fragmentos generados de esta manera se ensamblaron en regiones contiguas ("contig") utilizando la opción "Ensamblaje de novo" del programa CLS Genomics Workbench, versión 8.5.1, y se revisaron con Pilon versión 1.8, tal como indican Walker B. J. et al., en: "Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement", "PLoS One" (2014), nov. 19, 9(11), e112963; DOI: 10.1371/journal.pone.0112963.

Los "contigs" se ensamblaron en "supercontigs" utilizando SSPACE Premium scaffolder versión 2.3, tal como se indica en Boetzer M. et al., en: "Scaffolding preassembled contigs using SSPACE", "Bioinformatics" (2011), feb. 15, 27(4):578-9, doi:10.1093/bioinformatics/btq683, publicación electrónica: 12 de dic., 2010.

Los "huecos" se cerraron utilizando GapFiller versión 1.10, tal como indican Boetzer M. et al., en: "Toward almost closed genomes with GapFiller", "Genome Biology" (2012), 25 de junio, 13(6):R56, DOI:10.1186/gb-2012-13-6-r56.

La anotación del genoma se llevó a cabo con Database Prokka Genome System (http://vicbioinformatics.com/) y con la base de datos AUGUSTUS v3.0.1

El análisis de las secuencias permitió la identificación de 2177 regiones contiguas ("contig") de dimensiones que variaban entre 119195 y 301 pares de bases (pb), para un total de 19.601.063 pares de bases (pb). Dicho valor concuerda con el tamaño del ADN genómico de levaduras filogenéticamente similares al género Trichosporon, por lo tanto, se considera que las bibliotecas obtenidas representan el genoma completo de la variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, y la cepa de tipo salvaje correspondiente de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 a partir de la que deriva. Las secuencias de los dos ADN genómicos se compararon entre sí utilizando el software "Map Reads to Reference" y "Quality-based Variant Detection" de CLCbio.

Las mutaciones identificadas se confirmaron mediante la comprobación de la existencia en ambas direcciones de secuenciación y determinando la precisión mediante el valor de "phred".

En total, en el ADN genómico de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, se subrayaron 647 mutaciones (que comprendían sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos): 131 mutaciones conducían a un cambio en la secuencia de la proteína correspondiente y se muestran en las Tablas 1 y 2.

EJEMPLO 5 (sensibilidad de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 al antibiótico caspofungina)

En el presente ejemplo, se evaluó la sensibilidad de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 al antibiótico caspofungina. De hecho, tal como se indica en: Garcia L. et al., "BMC Genomics" (2015), DOI:10.1186/s12864-015-1879-4, los mutantes de los hongos defectuosos en la síntesis de quitina muestran una mayor sensibilidad al antibiótico caspofungina. A la luz de los resultados del análisis genómico de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, que subrayaban la presencia de mutaciones que afectaban a los genes codificantes de una proteína con actividad de quitina sintasa, por lo tanto, se evaluó la sensibilidad a dicho antibiótico.

Para dicho propósito, se inoculó una muestra de células de una cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 y una muestra de células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 en dos matraces diferentes, en medio "YEPD" (extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l y glucosa 20 g/l): los matraces se introdujeron en un incubador bajo agitación, a 30°C durante una noche. Seguidamente, se recogieron las células mediante centrifugación a 1500 g durante 5 minutos, se lavaron en agua estéril, después se resuspendieron en 1 ml de agua estéril, obteniendo una suspensión que se sembró en placas Petri que contenían un medio sólido "YEPD" (agar 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l y glucosa 20 g/l) que contenía diferentes concentraciones de caspofungina: 30 ng/ml, 60 ng/ml, 90 ng/ml y 120 ng/ml. Sobre dichas placas, se sembraron puntos de 10 pl de dicha suspensión, diluidos en agua estéril de manera que contuviesen aproximadamente 105, 104, 103, 102y 10 células. Las placas se incubaron durante 3 días a 30°C para permitir el crecimiento de las células.

Los resultados de la diferente sensibilidad eran mucho más apreciables en el medio "YEPD" con 120 ng/ml de caspofungina (figura 5). La variante de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, al igual que lo que ocurre con las cepas de hongos defectuosos en la síntesis de quitina, es más sensible a la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509, mostrando una menor capacidad de crecimiento en presencia de caspofungina, y confirmando por lo tanto su defecto en la síntesis de quitina.

EJEMPLO 6 (cultivo para la producción de lípidos en un biorreactor)

En el presente ejemplo, se evaluó el crecimiento y la acumulación de lípidos de células de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 y de las células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508.

Para dicho propósito, se inoculó una muestra de células de una cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 y una muestra de células de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 en dos matraces de 500 ml diferentes, en 100 ml de medio "YEPD" (extracto de levadura 10 g/l, peptona 10 g/l y glucosa 20 g/l): los matraces se introdujeron en un incubador bajo agitación, a 30°C durante una noche.

Las suspensiones celulares obtenidas se utilizaron para inocular por separado biorreactores de 20 litros en los que se introdujeron 6 l de medio líquido de lipogénesis (glucosa 100 g/l, licor de maceración del maíz 50 g/l, extracto de levadura 2 g/l, dihidrogenofosfato potásico [KH2PO4] 6 g/L, heptahidrato de sulfato de magnesio [MgSO4'7H2O] 0,3 g/l, cloruro sódico [NaCl] 0,06 g/l y dihidrato de cloruro cálcico [C a C h ^^O ] 0,06 g/l).

El volumen del inóculo de cada cepa era el necesario para obtener aproximadamente 6 l de suspensión celular con 0,5 DO600.

El crecimiento tuvo lugar bajo condiciones aeróbicas mediante el insuflado de aire y agitación variable entre 600 rpm y 900 rpm modulada con flujo de aire de manera que se mantuviese una concentración de oxígeno disuelto (DO2) igual a 30% del valor de saturación y a un pH de aproximadamente 5,0, mantenidos mediante la adición, en caso necesario, de algunas gotas de una solución de KOH 5 M o de H2SO4 al 10% (v/v).

El procedimiento se llevó a cabo en modo por lotes durante las primeras 20 horas. Seguidamente, y hasta las 24 horas, se proporcionó una alimentación de nitrógeno, es decir, licor de maceración del maíz (1,25 g/l) y sulfato amónico (5,5 g/l). Desde las 24 horas hasta el final del procedimiento, se alimentó una solución de glucosa 600 g/l, de manera que se mantuviese constante la concentración de glucosa en aproximadamente 30 g/l durante todo el procedimiento (90 horas en total).

Tras 90 horas de crecimiento, se extrajo una muestra de caldo de cultivo de ambos biorreactores y se determinaron los valores siguientes, operando tal como se ha indicado anteriormente:

- la cepa de tipo salvaje de la levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509 había alcanzado una concentración celular de 89 g/l (es decir, una cantidad de biomasa expresada en peso seco de células en g por litro de cultivo), que contenía 47% en peso de lípidos (es decir, una cantidad de lípidos acumulados expresada como relación de porcentaje entre el peso de los lípidos y el peso seco total) igual a un total de 42 g/l (es decir, la cantidad de lípidos acumulados expresada como una concentración de lípidos en g/l); la productividad máxima era de 0,52 g/l/h de lípidos, con un rendimiento total de 0,17 g de lípidos por g de glucosa consumida,

- la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 había alcanzado una concentración celular de 111 g/l (es decir, una cantidad de biomasa expresada en peso seco de células en g por litro de cultivo), que contenía 60% en peso de lípidos (es decir, una cantidad de lípidos acumulados expresada como relación de porcentaje entre el peso de los lípidos y el peso seco total) igual a un total de 67 g/l (es decir, la cantidad de lípidos acumulados expresada como una concentración de lípidos en g/l); la productividad máxima era de 0,77 g/l/h de lípidos, con un rendimiento total de 0,20 g de lípidos por g de glucosa consumida.

EJEMPLO 7 (medición de la viscosidad y la centrifugabilidad del caldo de cultivo).

En los cultivos obtenidos tal como se ha indicado anteriormente, en el Ejemplo 6, se midió la viscosidad y la densidad (mediante un microviscosímetro Stabinger SVR 3000 Anton Paar, tasa de cizalla: 1/1000, a 30°C) y la centrifugabilidad (mediante prueba de centrifugación utilizando una centrífuga Thermo Scientific IEC CL31R Multispeed con rotor de ángulo fijo AC 100.10A) en diferentes tiempos de inoculación.

En particular, las pruebas de centrifugación se llevaron a cabo mediante centrifugación de alícuotas del caldo de cultivo, igual a 10 ml, a 5000 rpm, durante 10 minutos y mediante medición del factor de concentración con respecto al caldo de cultivo mismo.

Los resultados obtenidos se informan en las Tablas 4 y 5.

TABLA 4

90 89 47 119 1,040 1.2X.

TABLA 5

A partir de los datos informados en las Tablas 4 y 5, puede deducirse que el caldo de cultivo obtenido de la variante de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508. presenta una viscosidad inferior y una mayor centrifugabilidad que la obtenida de la cepa de tipo salvaje de levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus ATCC 20509.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus presentada el 17de mayo de 2017 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - InhoffenstralJe 7 B 38124 Braunschweig (Alemania), número de depósito DSM 32508.

2. Procedimiento para la producción de lípidos, que comprende:

- preparar un inóculo que comprende por lo menos una levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508 según la reivindicación 1,

- alimentar dicho inóculo a un dispositivo de cultivo, obteniendo un caldo de cultivo,

- someter dicho caldo de cultivo a separación, obteniendo una suspensión acuosa de una biomasa celular oleaginosa concentrada que comprende lípidos y una fase acuosa,

- extraer los lípidos intracelulares acumulados dentro de las células de levadura.

3. Procedimiento para la producción de lípidos según la reivindicación 2, en el que dicho procedimiento:

- se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 10°C y 40°C, preferentemente comprendida entre 20°C y 35°C, y/o

- se lleva a cabo durante un tiempo comprendido entre 40 horas y 200 horas, preferentemente comprendido entre 80 horas y 150 horas, y/o

- se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas, y/o

- se lleva a cabo a un pH comprendido entre 4,5 y 7,0, preferentemente comprendido entre 5,0 y 6,5.

4. Procedimiento para la producción de lípidos según la reivindicación 2 o 3, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo partiendo de un inóculo en una cantidad comprendida entre 1% y 5% (v/v) del volumen total de medio de cultivo, obtenido de un cultivo anterior de dicha levadura oleaginosa de la especie Trichosporon oleaginosus DSM 32508, realizado en el mismo medio de cultivo durante un tiempo comprendido entre 6 y 24 horas.

5. Procedimiento para la producción de lípidos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho procedimiento puede llevarse a cabo en un medio de cultivo que comprende glucosa como fuente de carbono y sulfato amónico [(NH4)2SO4] como fuente de nitrógeno.

6. Procedimiento para la producción de lípidos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo en modo alimentado por lotes.

7. Procedimiento para la producción de lípidos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho procedimiento, tras un tiempo comprendido entre 15 y 25 horas posteriores a la inoculación, puede llevarse a cabo adicionalmente en modo alimentado por lotes, preferentemente durante un tiempo comprendido entre 25 y 175 horas, más preferentemente comprendido entre 65 y 125 horas, mediante la adición de una fuente de nitrógeno adicional, tal como, por ejemplo, licor de maceración del maíz, extracto de levadura, sulfato amónico y urea en cantidades suficientes para añadir al caldo de cultivo una cantidad total de nitrógeno comprendida entre 0,5 y 5 g/l.

8. Procedimiento para la producción de lípidos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que dicho procedimiento, tras un tiempo comprendido entre 15 y 25 horas posteriores a la inoculación, puede llevarse a cabo adicionalmente en modo alimentado por lotes, preferentemente durante un tiempo comprendido entre 25 y 175 horas, más preferentemente comprendido entre 65 y 125 horas, mediante la adición de una solución acuosa de glucosa, de manera que se disponga de una concentración constante de glucosa en el caldo de cultivo comprendida entre 25 y 50 g/l.