CN101955888B

CN101955888B - 高产油脂皮状丝孢酵母b3及其ems和紫外线复合诱变选育方法

Info

Publication number: CN101955888B
Application number: CN2010102102641A
Authority: CN
Inventors: 朱笃; 沈晓蜜; 颜日明; 张志斌; 曾庆桂
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-06-25
Also published as: CN101955888A

Abstract

本发明公开了一种高产油脂皮状丝孢酵母B3及其EMS和紫外线复合诱变选育方法。突变菌株皮状丝孢酵母B3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2010076，保藏日期为2010年4月9日。本发明以皮状丝孢酵母CYPJ06野生菌株为出发株，利用甲基磺酸乙酯和紫外线诱变方法进行复合诱变，结合磷酸香草醛法进行初筛以及索氏抽提法进行复筛和验证，选育出一株产油脂率高且遗传稳定的突变菌株-皮状丝孢酵母B3，利用这种方法可以有效的提高皮状丝孢酵母的产油脂能力，为利用其发酵生产单细胞油脂和转化生物柴油提供了优良菌种。

Description

高产油脂皮状丝孢酵母B3及其EMS和紫外线复合诱变选育方法

技术领域

本发明涉及利用甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变皮状丝孢酵母，并结合磷酸香草醛法初筛技术和索氏抽提法复筛技术，选育出产油脂率高且遗传稳定的皮状丝孢酵母B3(Trichosporon cutaneum B3)，属生物工程技术领域。

技术背景

皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)是一种半知菌酵母。该菌的细胞形态多样，有真菌丝和假菌丝，可以形成节孢子，对数生长期主要以长丝状存在。

微生物油脂又称为单细胞油脂(SCO)，其组成与植物油类似，主要为中性脂、游离脂肪酸、磷脂及不皂化物，因其特殊功能而具有潜在的工业开发价值。产油微生物(Oleaginousmicroorganisms)是指油脂含量能超过生物总量20％的微生物，主要包括酵母、霉菌、微藻和细菌，但以酵母菌和霉菌类真核微生物居多，如产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)等。产油微生物资源丰富，油脂含量高，能在多种培养条件下生长，可利用和转化废弃木质纤维素资源，保护环境，进行工业规模生产和开发有着巨大的潜力。微生物油脂通过与低碳醇进行转酯化反应可生产生物柴油，通过与多碳醇进行酯交换反应，可用于生产可生物降解的润滑油、溶剂油、油漆和油墨溶剂、表面活性剂、粘接剂等产品，高值化潜力大。部分微生物油脂含有多不饱和脂肪酸，是生产具有高附加值单细胞油脂的重要原料。

国外利用微生物生产油脂的研究始于20世纪40年代。20世纪80年代初，日本成功获得了发酵法生产长链二元酸技术，结束用蓖麻油裂解合成十三碳二元酸历史。最新文献报道在氮源缺陷型培养基中，深黄被孢霉表现出了显著的生长活性(其生物量达35.9g/L)和高糖摄入量，即使培养基的初始糖浓度很高(达100g/L)条件下亦是如此。氮源耗尽后，真菌菌体中大量积累脂肪(达菌体干重的50％～55％)。国内20世纪60年代就有霉菌和酵母产油脂的报导，20世纪90年代和21世纪初有较多研究。如2003年施安辉等进行了粘红酵母GRL513发酵生产油脂研究，结果表明其油脂含量达菌体干重的67.2％。清华大学吴庆余等通过异养转化细胞工程技术获得了脂类含量高达细胞干重55％的异养藻细胞。

为了获得更高产油率的微生物，紫外、EMS等物理和化学等诱变是常采用的手段。1993年，研究人员以深黄被孢霉As 3.3410为出发菌株，紫外诱变获得的突变株在10L罐中发酵生产GLA，其油脂含量达菌体干重的44.7％，其中GLA含量达9.44％。1998年，有人以拉曼被孢霉SM541为原始菌株，经过紫外线与氯化锂复合诱变获得突变株SM54129，其生物量由12.6g/L提高到28.8g/L，油脂含量由5.8g/L提高到15.7g/L，氨基酸含量由321mg/L增加到623mg/L，传代实验表明，SM54129具有良好的遗传稳定性。

发明内容

本发明目的在于提供一株高产油脂酵母-皮状丝孢酵母B3。

本发明所述的菌株皮状丝孢酵母B3，Trichosporon cutaneum B3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：中国武汉武汉大学，中国保藏号为CCTCC NO.M 2010076，保藏日期为2010年4月9日，摇瓶培养其油脂含量达53.52％，是野生菌株的1.78倍。

所述的皮状丝胞酵母有以下微生物学特征：

1.形态学上特征为：

①细胞形态呈圆形、椭圆形或者柱形的，对数生长期主要以长丝状存在；②大小为3～6×4～30μm；③菌落为白色，呈奶酪状，光滑；

2.该菌株的生理生化特征为：

①本菌株可以利用合成培养基生长；②培养时间：5～7天；③对氧气的需求：好气；④生长pH范围：5.5～6.5；⑤生长最适宜温度：28～30℃；⑥生成生物油脂主要成份：C16、C18系饱和和不饱和脂肪酸，为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、棕搁油酸中的一种或几种。

本发明还提供皮状丝孢酵母菌B3的选育方法，即利用甲基磺酸乙酯和紫外线诱变方法进行复合诱变、结合磷酸香草醛法进行初筛以及索氏抽提法进行复筛和验证、选育出一株产油脂率高且遗传稳定的突变菌株。

本发明所述选育方法包括如下步骤：

①菌悬液的制备

将保存的菌种转接到马铃薯斜面培养基上，28℃培养3天后，在装有玻璃珠的三角瓶内无菌水洗活化菌种，尽可能洗下菌体，将少量菌丝打碎制成菌悬液，浓度控制在约100-1000cfu/mL。

②甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变

③初筛：通过磷酸香草醛法对高产油脂皮状丝孢酵母进行初筛。

④复筛：用索氏抽提法抽提出油脂，通过比较单位菌体油脂量的多少来进行复筛。

⑤验证高产菌株

将复筛后得到的高产菌株传代培养4次，每次都用与复筛一样的方法——索氏抽提法，对菌株产油率稳定性进行验证。

⑥高产菌株的保藏

将筛选出的一株高产油脂和遗传性稳定的皮状丝孢酵母B3采用甘油管法和冷冻干燥法进行保藏。

本发明所述方法的具体步骤为：

①取马铃薯培养基(PDA)上培养3～4天的皮状丝孢酵母出发菌株，用pH6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液，经10～15倍系列稀释达到浓度100～1000cfu/mL备用；

②用EMS溶液诱变处理①中培养的皮状丝孢酵母出发菌株0.5～5小时后，加入1～10mL25％硫代硫酸钠终止剂，5～30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；

③取0.1mL经②步骤处理的培养液均匀涂布于PDA平板上，黑暗培养6～24小时，然后置于28～30℃培养箱中正常培养3～4天；

④将步骤③中培养出的菌落挑出，接入液体培养基中培养5～7天，控制相同的培养条件，收集菌体，稀释到660nm下相同的OD值；

⑤用硫酸-磷酸香草醛反应分析经④步骤培养及稀释的菌体中油脂含量，并挑出含油量高的菌株进行复筛；

⑥将初筛中挑选出来的菌株，接入液体培养基中培养5～7天，控制相同的培养条件，离心收集菌体用蒸馏水洗三次，再将菌体在60±5℃下干燥24小时，待其恒重后，用索氏抽提法进行油脂的提取，计算单个细胞的含油率，挑选出高产产油的菌株；

⑦将复筛后得到的高产菌株扩大培养5～8次，每次采用⑥的方法对菌株的稳定性进行验证，筛选得到高产、稳定的突变菌株。

本发明EMS和紫外线复合诱变处理的出发菌株培养物处于对数生长期。

本发明所述化学诱变剂EMS的诱变浓度为1％～8％。

本发明紫外照射诱变采用15W或30W紫外灯，提前预热20～30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20～30cm处进行紫外照射60～120秒。

本发明所述的液体培养基为改良后的合成培养基：葡萄糖30～100g/L，NH₄NO₃0.2～0.6g/L，酵母浸粉0.5～4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为5.5～6.5，余量为水。

本发明所述诱变后菌株B3的摇瓶培养条件为温度28～30℃、摇床转速200～300转/分钟。

本发明利用皮状丝孢酵母对化学和物理诱变比较敏感，生命力比较顽强，有较大的产油脂潜力，提出了利用EMS和紫外线复合诱变手段，结合磷酸香草醛反应初筛技术和细胞油脂索氏抽提法复筛技术，选育出产油脂率高且遗传稳定的皮状丝孢酵母突变株B3，利用这种方法可以有效的提高皮状丝孢酵母的产油脂能力，为利用其发酵生产单细胞油脂和转化生物柴油提供了优良菌种。突变菌株皮状丝孢酵母B3可用于单细胞油脂及生物柴油的生产。

附图说明：

图1为本发明方法流程图；

图2所示为野生出发菌株CYPJ06的生长与产油特性图；

图3所示为诱变菌株皮状丝孢酵母B3生长与产油特性图；

具体实施方式：

以下结合实施实例对本发明进行详细说明。

实施例1：

皮状丝孢酵母的甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变：

①取马铃薯固体培养基上培养3天的皮状丝孢酵母CYPJ06，用pH为6.0的无菌磷酸缓冲液制成菌悬液，经10倍系列稀释达到浓度为100-1000cfu/mL备用。

②取2mL化学诱变剂EMS与3mL无水乙醇和15mL pH为6.0的磷酸缓冲液配成10％的浓度，在每支装有5mL皮状丝孢酵母菌悬液的试管中加入2mL浓度为10％的化学诱变剂稀释液，最终配成3％的诱变溶液。

③诱变混合液放在振荡仪中振荡1小时，使菌与诱变试剂充分的混合，取出后加入1mL终止剂(25％硫代硫酸纳溶液)。

④硫代硫酸钠溶液终止反应5分钟之后，将反应液置于无菌培养皿中，使之成为1mm厚的薄层，培养皿放于磁力搅拌器上，再置于紫外灯下(预先已经灭过菌)进行紫外照射，用15W紫外灯(提前预热30分钟)，距离30cm进行紫外照射90s。

⑤在装有马铃薯固体培养基的平板中加入0.1mL的上述诱变过的菌悬液，进行涂布处理，使菌能够均匀分布在平板上，黑暗处理6小时后，放入28℃培养箱内培养3天。凡碰到EMS试剂的器具放浓度为2％硫代硫酸钠溶液中浸泡1天去毒后使用。

皮状丝孢酵母诱变后的初步筛选：

①将诱变后在马铃薯培养基中生长起来的菌落挑出，另取野生出发菌作为对照，接入150mL三角瓶中，每瓶装液量为50mL，液体培养基成分(葡萄糖40g/L、酵母粉1g/L、KH₂PO₄0.75g/L、NH₄NO₃0.5g/L、CaCl₂·2H₂O 0.4g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、余量为水，pH自然)，在摇床上控制相同的培养条件，条件为28℃、200转/分钟，培养6天。

②离心收集菌体，用蒸馏水洗三次，再统一稀释到660nm下相同的OD值，以便控制相同浓度。

③取10mL菌悬液，于4000转/分钟的条件下，离心10分钟，去上清液，用蒸馏水定容至2mL，充分振荡使之成为悬浮液。

④取100μL菌悬液(对照去蒸馏水)，加入一带塞试管中，加入2mL的浓度为18mol/L的浓H₂SO₄，置于沸水浴中孵化10min。

⑤取出试管，置于常温条件下水浴5min，加入5mL磷酸-香草醛试剂(0.12g香草醛溶解于20mL蒸馏水中，用85％的磷酸定容至100mL)，37℃条件下保温15分钟。

⑥取出置于常温条件下水浴10分钟，于530nm的波长下测反应液的OD值。通过比较OD的大小来判别含油量多少，OD越大，表明油脂量越多。对照野生出发菌，计算产率的提高，将含油量高的挑出进行保藏。

皮状丝孢酵母诱变后的复筛：

①菌体的收集

a.将初筛中挑选出来的菌株，另取野生出发菌作为对照，接入马铃薯固体培养基上扩大培养3天。

b.将扩大培养的菌株接入150mL三角瓶中，每瓶装液量为50mL，液体培养基成分(葡萄糖40g/L、酵母粉1g/L、KH₂PO₄0.75g/L、NH₄NO₃0.5g/L、CaCl₂·2H₂O 0.4g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、余量为水，pH自然)，在摇床上控制相同的培养条件，条件为28℃、200转/分钟，培养6天。

c.离心收集菌体，用蒸馏水洗三次，再将菌体在60℃下干燥24小时，待其恒重后，用索氏抽提法进行油脂的提取。

②油脂的抽提：用索氏抽提法抽提油脂

a.将干燥好的菌体用研钵研磨，使细胞尽可能破碎。

b.将取磨碎后的干菌体全部移入重为M1的滤纸包内，称滤纸和菌体的总重记为M2。

c.将滤纸包放入索氏提取器的抽提管内，连接干净的接收瓶，加入石油醚，于75℃水浴加热回流6h。

d.6小时后，将抽提好的接收瓶接于旋转蒸发仪上，回收溶剂。

e.待接收瓶蒸完溶剂后，用少量石油醚试剂将留在瓶底的油脂洗下，重复洗五次，以尽可能全部的洗下，清洗液装于衡重为M3的EP管中。

f.将装有油脂的EP管开口放于干燥箱中60℃烘干，使石油醚挥发，24小时后取出，置于60℃烘箱中烘至恒重称量。称得油脂和EP管的总重量记为M4，计算油脂得率。

菌体量＝M2-M1

产油率＝[(M4-M3)/(M2-M1)]×100

g.对照野生出发菌，计算产率的提高，将含油量高的挑出进行保藏。

筛选所得高产、稳定的突变菌株B3经摇瓶培养，其油脂含量达53.52％，是野生菌株的1.78倍，具体见图2和3。

实施例2：

①取马铃薯培养基(PDA)上培养3～4天的皮状丝孢酵母出发菌株，用pH 6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液，经10～15倍系列稀释达到浓度500cfu/mL备用；

②用浓度为5％的EMS溶液诱变处理①中培养的处于对数生长期的皮状丝孢酵母出发菌株0.5～5小时后，加入5mL25％硫代硫酸纳终止剂，5～30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；用15W紫外灯，提前预热20～30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20～30cm处进行紫外照射60～120秒。

④将步骤③中培养出的菌落挑出，接入液体培养基中培养5～7天，控制相同的培养条件，收集菌体，稀释到660nm下相同的OD值，所述的液体培养基为改良后的合成培养基：葡萄糖60g/L，NH₄NO₃0.5g/L，酵母浸粉3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为5.5～6.5，余量为水。

⑦将复筛后得到的高产菌株摇瓶培养5～8次，每次采用⑥的方法对菌株的稳定性进行验证，筛选得到高产、稳定的突变菌株B3。诱变后菌株B3的摇瓶培养条件为温度28～30℃、摇床转速200～300转/分钟。

筛选得到突变菌株B3形态学上特征为：细胞形态呈圆形、椭圆形或者柱形的，对数生长期主要以长丝状存在；大小为3～6×4～30μm；菌落为白色，呈奶酪状，光滑；生理生化特征为：本菌株可以利用合成培养基生长；培养时间：5～7天；对氧气的需求：好气；生长pH范围：5.5～6.5；生长最适宜温度：28～30℃；菌体生成生物油脂主要成份：C16、C18系饱和和不饱和脂肪酸，为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、棕搁油酸中的一种或几种。

实施例3：

①取马铃薯培养基(PDA)上培养3～4天的皮状丝孢酵母出发菌株，用pH 6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液，经10～15倍系列稀释达到浓度100cfu/mL备用；

②用浓度为5％的EMS溶液诱变处理①中培养的处于对数生长期的皮状丝孢酵母出发菌株0.5～5小时后，加入10mL25％硫代硫酸纳终止剂，5～30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；用15W紫外灯，提前预热20～30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20～30cm处进行紫外照射60～120秒。

④将步骤③中培养出的菌落挑出，接入液体培养基中培养5～7天，控制相同的培养条件，收集菌体，稀释到660nm下相同的OD值，所述的液体培养基为改良后的合成培养基：葡萄糖30g/L，NH₄NO₃0.6g/L，酵母浸粉0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为5.5～6.5，余量为水。

经显微形态观察和油脂成分分析，突变菌株B3形态学特征和菌体生物油脂成分同于实施例2。

实施例4：

①取马铃薯培养基(PDA)上培养3～4天的皮状丝孢酵母出发菌株，用pH 6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液，经10～15倍系列稀释达到浓度1000cfu/mL备用；

②用浓度为5％的EMS溶液诱变处理①中培养的处于对数生长期的皮状丝孢酵母出发菌株0.5～5小时后，加入10mL25％硫代硫酸纳终止剂，5～30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变；用30W紫外灯，提前预热20～30分钟后，将菌液置于距离紫外灯20～30cm处进行紫外照射60～120秒。

④将步骤③中培养出的菌落挑出，接入液体培养基中培养5～7天，控制相同的培养条件，收集菌体，稀释到660nm下相同的OD值，所述的液体培养基为改良后的合成培养基：葡萄糖100g/L，NH₄NO₃0.2g/L，酵母浸粉4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，KH₂PO₄0.75g/L，CaCl₂·2H₂O 0.4g/L，pH为5.5～6.5，余量为水。

经显微形态观察和油脂成分分析，突变菌株B3形态学特征和菌体生物油脂成分同于实施例3。

Claims

1.皮状丝孢酵母B3是从土壤中分离得到的皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)CYPJ06野生菌株突变而来，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2010076，保藏日期为2010年4月9日，其是由所述野生菌株经甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变筛选得到的具有产油脂率高和遗传稳定的特性。

2.根据权利要求1所述的皮状丝孢酵母B3，其特征在于：

形态学上特征为：细胞形态呈圆形、椭圆形或者柱形的，对数生长期主要以长丝状存在；大小为3～6×4～30μm；菌落为白色，呈奶酪状，光滑；

生理生化特征为：本菌株可以利用合成培养基生长；培养时间：5～7天；对氧气的需求：好气；生长pH范围：5.5～6.5；生长最适宜温度：28～30℃。